Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Фотомодифицированная аутогемохимиотерапия в комплексном лечении местнораспространенного рака легкого

На правах рукописи

БЕЛАН Ольга Сергеевна

ФОТОМОДИФИЦИРОВАННАЯ АУТОГЕМО-ХИМИОТЕРАПИЯ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ МЕСТНОРАСПРОСТРАНЕННОГО РАКА ЛЕГКОГО

14.00.14,-онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 8 !1!01! 2003

Ростов-на-Дону 2009

003473281

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ФЕДЕРАЛЬНОМ ГОСУДАРСТВЕННОМ УЧРЕЖДЕНИИ «РОСТОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНОЙ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук C.B. Григоров

- доктор медицинских наук профессор С.З. Карташов

- доктор медицинских наук профессор И.И. Кательницкий

Ведущая организация: - Волгоградская государственная

медицинская академия

Защита диссертации состоится « 2009 г. в ^^ ""часов

на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.208.083.01 при Федеральном государственном учреждении «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» (344037, г. Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт»

Автореферат разослан « ^ 2009 г.

Ученый секретарь совета по защите у

докторских и кандидатских диссертаций, /

член-корреспондент РАМН у/ Г.А. Неродо

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Злокачественные опухоли легких представляют одну из наиболее распространенных форм рака, трудности диагностики и малоудовлетворительные результаты лечения которых определяют высокую актуальность проблемы (Аксель Е.М., 2003; Напалков Н.Л., 2004; Петрова Г.В. и соавт., 2005; Мерабишвили В.М., 2007, Арсеньев А.И., Барчук A.C., Кана-ев C.B., 2008). Ежегодно в мире регистрируется 1,04 млн. новых заболеваний (12,8% от всех вновь выявленных) и 921 тыс. смертей (17,8% от общего числа злокачественных новообразований) (Аксель Е.М., Давыдов М.И., 2002; Чис-сов В.И. и соавт., 2007). Только своевременно выполненная операция позволяет рассчитывать на стойкое излечение (Харченко В.П., Кузьмин И.В., 1994; Давыдов М.И. и соавт., 1996, 2000; Трахтенберг А.Х., Чиссов В.И., 2000; Моисеен-ко В.М., 2006). Однако подавляющее большинство больных с данной локализацией не может быть подвергнуто радикальному хирургическому лечению. Это объясняется тем, что на сегодняшний день среди заболевших до 60% составляют больные с местнораспространенными формами рака с поражением внеле-гочных анатомических образований и обширным метастазированием в лимфоузлы средостения (Saijo N., 1998; Cullen M., 2006). Более чем у двух третей больных диагностируются III—IV стадии рака легкого (37,7 и 31,6% соответственно) (Зырянов Б.Н., 1997; Айтаков З.Н. и соавт., 1998; Акопов А.Л., 2001; Давыдов М.И., 2003; Hansen H.H., Bann P.A., 2005).

Данный факт требует выбора технологически сложных способов лечения, что заставляет исследователей пересматривать сложившиеся стереотипы в поиске новых методик лучевой и лекарственной терапии в комбинированном и комплексном лечении (Харченко В.П. и соавт., 2003; Немкова Е.В., Мус В.Ф., 2008).

Надежду на повышение эффективности лечения местнораспространенно-го рака легкого связывают с разработкой многокомпонентных программ с использованием полихимиотерапии в качестве неоадъювантного или индукционного компонента комплексного лечения (Переводчикова Н.И., 2005). Вместе с

тем, при применении современных схем системной неоадъювантной химиотерапии, включающих препараты платины, таксанов, вепезида, гемцитабина и др., объективный противоопухолевый эффект достигает уровня лишь 20-30% (Belani С.Р. et al., 1998; Masters G.F., 2000), что не позволяет достичь операбельного состояния больных местнораспространенным раком легкого.

Патогенетически обоснованные методы лекарственного лечения, разработанные в Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте в рамках концепции академика РАН и РАМН Ю.С. Сидоренко (1982, 2008 гг.) по использованию естественных жидких сред организма в качестве биологического носителя химиопрепаратов и индуктора адаптивных клеточных и системных защитно-компенсаторных реакций, значимо расширили спектр воздействия на опухолевый процесс.

Метод аутогемополихимиотерапии, заключающийся в экстракорпоральной преинкубации цитостатиков с аутокровью и внутривенной реинфузией в организм больного, хорошо себя зарекомендовал в лечении различных злокачественных новообразований в качестве неоадъювантной, адъювантной и самостоятельной химиотерапии (Левченко Н.В., 2002; Зинькович С.А., 2005; Серго-стьянц Г.З., 2005; Чилингарянц С.Г., 2006). У значительного количества больных с нерезектабельным местнораспространенным раком легкого (68% случаев) проведение одного курса лечения обеспечивает стабилизацию опухолевого процесса, а многокурсовая аутогемохимиотерапия позволяет достигнуть полной и частичной регрессии опухоли и повысить возможности хирургического лечения до уровня 50,2% (Айрапетова Т.Г., 2006).

Однако, несмотря на явные преимущества многокурсовой аутогемохи-миотерапии над системной химиотерапией возникает необходимость поиска новых подходов, позволяющих оптимизировать сроки неоадъювантного лечения, ограничивая токсические проявления, сохраняя уровень противоопухолевого эффекта и резектабельности первично неоперабельных или условно операбельных больных. В этом отношении представляется целесообразным потен-циирование биоадаптивного эффекта аутокрови.

Для повышения биоадаптивного влияния аутокрови при проведении ау-тогемохимиотерапии показана целесообразность применения физических факторов электромагнитной природы (Лисутин А.Э., 2002; Старжецкая М.В., 2002; Аушева Т.В., 2005). В этом аспекте представляет интерес влияние низкоэнергетических квантовых излучений, волновая природа которых эволюционно связана с высокочувствительными клеточными механизмами световосприятия крови - ферментами, белками, нуклеиновыми кислотами. Наличие светоакцепторных систем в крови создает возможность фотомодификации аутогемохимиотерапии при неоперабельном местнораспространенном раке легкого, что может способствовать ингибированию роста опухоли не только прямым, но и опосредованным путем через системы клеточных коммуникаций.

Цель исследования. Улучшить непосредственные результаты лечения больных с первично неоперабельным местнораспространенным раком легкого путем применения аутогемохимиотерапии в сочетании с экстракорпоральной оптической обработкой крови.

Поставленная цель достигалась решением следующих задач:

1. Разработать методику экстракорпорального электромагнитного воздействия оптического излучения в красном (длина волны 630 нм.) и синем (длина волны 470 нм.) диапазоне на аутокровь для проведения фотомодифици-рованной аутогемохимиотерапии больным местнораспространенным раком легкого и изучить в эксперименте ее влияние на культуру опухолевых клеток и перевитых опухолей у животных.

2. Изучить непосредственные результаты и возможности хирургического лечения больных местно-распространенным раком легкого после проведения фотомодифицированной аутогемохимиотерапии.

3. Изучить токсические проявления в процессе проведения фотомодифицированной аутогемохимиотерапии.

4. Изучить влияние фотомодифицированной аутогемохимиотерапии на иммунный статус больных местнораспространенным раком легкого и метаболическое состояние клеток иммунной системы.

5. Изучить влияние оптического излучения на состояние ключевых ферментов митохондриальной энергетики лимфоцитов крови и уровень катионных белков нейтрофильных гранулоцитов.

6. Исследовать структуру фаций сыворотки крови у больных местнорас-пространенным раком легкого до и после проведения фотомодифицированной аутогемохимиотерапии.

Научная новизна исследования. В диссертационной работе впервые

- разработана и применена в клинике Ростовского научно-исследовательского онкологического института методика химиотерапии на аутокрови, облученной оптическим излучением красного света в качестве неоадьювантного компонента комплексного лечения больных местнораспространенным раком легкого;

- изучен клинический объективный эффект нового метода фотохромоау-тогемохимиотерапии и определен сравнительный уровень токсичности и функциональной состоятельности клеточных систем крови, в том числе нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов;

- определены некоторые метаболические и иммунологические клеточные механизмы биологического влияния фотомодифицированной аутогемохимиотерапии на противоопухолевую резистентность организма-опухоленосителя;

- изучена морфология сыворотки крови у больных с местнораспространенным нерезектабельным раком легкого для диагностики контроля эффективности неоадъювантной аутогемохимиотерапии;

- изучено влияние экспериментальной фотомодифицированной аутогемохимиотерапии на опухолевый рост (на модели культуры клеток и перевивных опухолей крыс).

Практическая значимость работы

- Ценность исследования для клиники определяется возможностью достижения высокой противоопухолевой эффективности метода фотомодифицированной аутогемохимиотерапии при сокращении числа курсов неоадьювантного лечения до одного, реже - двух и перевода больных с первично нерезекта-бельной формой рака легкого в резектабельное состояние.

- Метод фотомодифицированной аутогемохимиотерапии характеризуется низкой токсичностью, высокой степенью регресса клинических симптомов заболевания, что позволяет проводить лечение без вынужденных отказов и назначения вспомогательных средств.

- Предлагаемый метод относительно прост, экономичен и эффективен, что обусловливает доступность к использованию в различных отделениях онкологического профиля.

Внедрение результатов исследования в практику. Методика аутогемохимиотерапии с фотомодификацией внедрена в практическую деятельность отделения торакальной пластической хирургии Ростовского научно-исследовательского онкологического института. На рабочем месте методике обучено 4 специалиста.

Основное положение, выносимое на защиту

Неоадъювантная аутогемохимиотерапия в сочетании с экстракорпоральной оптической обработкой крови - высокоэффективный и доступный метод, позволяющий значительно улучшить результаты лечения первично нерезекта-бельных больных местнораспространенным раком легкого, способствуя регрессии опухоли и выполнению оперативного лечения, активации метаболических и функциональных свойств иммунокомпетентных клеток крови и повышению неспецифической противоопухолевой резистентности.

Апробация диссертации состоялась 14 мая 2009 г. на заседании Ученого Совета ФГУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Росмедтехнологий».

Публикации. Опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 212 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала, методов исследования и лечения, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 183 отечественных и 60 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 40 таблицами и 67 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика материала, методов исследования и лечения

Материалом для исследования послужили данные о 60 первичных больных местнораспространенным раком легкого ША-ШБ стадий в возрасте от 38 до 77 лет, находившихся на лечении в отделении торакальной пластической хирургии Ростовского научно-исследовательского института с 2006 по 2008 годы.

Основная группа - 30 пациентов, которым проводилась фотомодифици-рованная аутогемохимиотерапия; контрольная группа - 30 пациентов, которым проводилась аутогемохимиотерапия.

Сравнительную характеристику групп больных проводили согласно следующим критериям: полу, возрасту, распространенности опухолевого процесса, гистологической структуре опухоли, выраженности клинического течения и сопутствующей патологии.

Большинство пациентов находились в возрастной группе 50-70 лет. Наблюдались 59 мужчин и 1 женщина. У подавляющего большинства больных отмечались выраженные симптомы рака легкого: кашель - у 44 пациентов (73%), кровохаркание - у 11 (18%), боли в грудной клетке-у 19 (32%), одышка -у 32 ( 53%), у 7пациентов (11%) - синдром сдавления верхней полой вены. Слабость, потливость, снижение веса, потеря аппетита наблюдалась более чем у трети больных. Среди сопутствующих заболеваний чаще всего наблюдался хронический бронхит и сердечно-сосудистая патология.

Из 60 пациентов, поступивших в клинику с раком легкого, ША стадия диагностирована у 12 пациентов (38,7%) основной группы и 10 пациентов (33,3%) контрольной, ШБ - у 18 (62,3%) и 20 (66,7%) пациентов соответственно. Все больные были с сомнительной резектабельностью опухоли или первично нерезектабельными вследствие местной распространенности процесса.

Всем больным проводилась крупнокадровая флюорография и продольная томография. Для уточненной оценки распространенности злокачественной опухоли выполнялась компьютерная томография органов грудной клетки (при необходимости с контрастированием сосудов малого круга кровообращения и

средостения) или магнитно-резонансная томография, как объективные критерии вовлеченности опухолевый процесс окружающих органов и структур средостения, диссеминации по плевре и взаимоотношений с грудной клеткой.

Верификация процесса имела место во всех случаях: плоскоклеточный рак обнаружен у 30 (50%) пациентов железистый - у 6 (10%), мелкоклеточным рак наблюдался у 24 (40%) больных (табл. 1).

Таблица 1

Гистологическая структура опухоли легкого в исследуемых группах, абс. ч. (%)

Гистотип раковой опухоли Группа

основная(п=30) контрольная (п=30)

Не мел кок л сточный: плоскоклеточный аденокарцинома 18 (60,0±8,9) 16 (53,3±12,4) 2 (6,7± 17,6) 18 (60,0±8,9) 14 (46,7±13,3) 4 (13,3±16,9)

Мелкоклеточный 12 (40,0±14,1) 12 (40,0±14,1)

В обеих группах неоадъювантная химиотерапия проводилась по аналогичным схемам идентичными препаратами. Введение химиопрепаратов на ау-токрови осуществлялось 2 раза в неделю с интервалом 3 дня на протяжении 2 недель, т.е. курс аутогемохимиотерапии (АГХТ) состоял из 4-х процедур. Инкубация крови с химиопрепаратом осуществлялась при температуре 37°С в течение 30 минут. Разовая доза цисплатина составляла 100 мг/м2, доксорубицина - 25 мг/м2, циклофосфана - 500 мг/м2. Средние курсовые дозы цитостатиков составляли соответственно: для цисплатина - 200 мг, доксорубицина - 100 мг, циклофосфана - 2000 мг. Интервал между курсами составлял 1 месяц. После проведения 1 курса неоадъювантной АГХТ в зависимости от непосредственного результата проводили либо 2-й курс АГХТ, либо оперативное лечение.

Методика неоадъювантной фотомодифщированной аутогемохимиотерапии Осуществление методики включает 3 этапа:

1. Забор крови по стандартной схеме, во время которого к капельнице фиксируется насадка для экстракорпорального облучения крови, подключенная к аппарату «Спектр-ЛЦ-02». Насадка представляет собой пластиковый желоб 13x4 см с расположенными по боковым стенкам с внутренней стороны свето-

диодами (по 8 светодиодов с обеих сторон), в который вставляется капельница. Таким образом происходит равномерное освещение крови светом в участке капельницы, проходящем в желобе. В сосуд с глюгициром попадает уже обработанная светом кровь. Насадка накрывается крышкой, которая предотвращает рассеивание света.

2. Инкубация уже облученной светом крови с химиопрепаратом осуществлялась в термостате при температуре 37°С в течение 30 минут.

3. Реинфузия облученной светом крови с химиопрепаратом.

Методика выполнения аутогемохимиотерапии с фотомодификацией схематически представлена на рисунке 1.

Фотомодификацию крови проводили методом экстракорпоральной обработки некогерентным монохромным излучением красного света Х=630 нм, полученным от аппарата «Спектр-ЛЦ-02». Скорость потока крови через установку была 100 мл/мин, доза облучения составила \у=3,06 ДжУсм2; свет подавался в непрерывном режиме в течение 3 мин.

Рис. 1. Схема проведения аутогемохимиотерапии с фотомодификацией

Методика исследования иммунологических показателей Пролиферативную активность лимфоцитов определяли по реакции бласт-трансформации лимфоцитов - РБТЛ (Новиков Д.К., Новикова В.И., 1979).

Цитотоксическую активность естественных киллерных клеток (ЕКК) определяли в цитотоксическом тесте (ЦТТ) при соотношении эффектор:мишень 40:1. В качестве кпеток-мишеней использовали культуру клеток эритромиелоб-ластного лейкоза человека К562 (Рахмилевич АЛ., Рахимова М.С., 1988), вычисляли индекс цитотоксичности (ИЦ) (Чекнев С.Б., Горожанина Е.С., 2005), рассчитывали индекс апоптоза (%).

Количественное содержание Т- и B-лимфоцитов оценивали в реакции спонтанного розеткообразования (РСРО) с эритроцитами барана и мыши (Прикладная иммунология, 1984). Моноцитарно-макрофагальное звено оценивали по показателю макрофагапьной трансформации моноцитов (ПМТМ), NK-клеточное звено - по содержанию больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ) в мазках крови, окрашенных по Паппенгейму.

Для оценки синтетической активности лимфоцитов использовали метод В.Н. Карнаухова для люминесцентно-спектрального анализа с применением в качестве красителя акридинового оранжевого. (Карнаухов В.Н., 1979).

В работе изучались показатели активности ферментов энергетического метаболизма лимфоцитов: сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и альфа-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) по методу Р.П. Нарциссова в модификации Ю.М. Зарецкой (1983).Проводили исследование содержания катионных белков (КБ) в нейтрофильных гранулоцитах периферической крови с определением среднего цитохимического коэффициента (ЦХК) по формуле Астольди и Верга (Мазинг Ю.А., 1990,1991).

Для исследования твердотельных пленок сыворотки крови применяли метод клиновидной дегидратации (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 2001). Исследование морфоструктуры фаций проводили на микроскопе LEICA DM SL2 с компьютерным обеспечением.

Экспериментальные исследования

С целью обнаружения наиболее эффективных режимов воздействий оптического излучения на цельную кровь, полученную из локтевой вены 28 первичных больных местнораспространенным раком легких стадий IIIA-ШБ и у 10

практически здоровых доноров, забирали утром, натощак в силиконизирован-ные пробирки, содержащие раствор гепарина из расчета 20 ЕД/мл и экстракорпорально облучали в различных режимах. Воздействие оптического излучения на цельную кровь осуществляли с помощью световых карандашей (с >.=630 и Х=470 нм соответственно) от светодиодного комплекса «Спектр ЛЦ-02». Контрольные пробы подвергали темновой инкубации при аналогичных условиях без облучения СДИ.

На модели перевивной саркомы 45 изучали эффективность фотомодифи-цированной аутогемохимиотерапии. Перевивку осуществляли путем инъекции опухолевого материала, полученного из РОНЦ РАМН (г. Москва), традиционно под кожу спины и эктопически - в подключичную вену для воспроизведения опухоли (метастатических узлов) в ткани легкого крысы.

Кровь забирали у крыс при пункции хвостовой вены в пробирки, содержащие гепарин, затем облучали оптическим излучением в непрерывном режиме с дозой \У=3,06 Дж/см2 красного света (>.=0,67 мкм). После фотообработки в кровь добавляли циклофосфан 50 мг/кг, инкубировали при 1=37°С в течение 30 мин., затем реинфузировали крысам в реинфузировали крысам в подключичную вену. Процедура осуществлялась дважды с интервалом 5 дней. Суммарная доза препарата составила 30 мг.Противоопухолевый эффект оценивали по проценту торможения (Т%), индексу эффективности (ИЭ), индексу роста опухоли (ИР), продолжительности жизни животных.

Для морфологического исследования опухоли, эктопически растущей в легком, животных забивали на 40 сутки от момента перевивки С-45. Фиксацию материала проводили в растворе 10% нейтрального формалина с последующей стандартной проводкой через спирты восходящей концентрации и заключали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином по Ван-Гизону.

Статистическая обработка клинических и лабораторных данных проводилась с помощью параметрических (по критерию Стьюдента) и непараметрических (по точному критерию Фишера; по парному критерию Вилоксона) мето-

дов (Гублер Е.В. и соавт., 1973; Федорова Э.Г., Случанко И.С., 1977). Различие считалось статистически достоверным при вероятности прогноза р<0,05.

Результаты исследования

Достижение поставленной цели могло быть реализовано только после экспериментальной разработки методики и режимов экстракорпорального оптического воздействия на клеточные системы крови, обладающие высоким защитным потенциалом, к числу которых, безусловно, относят нейтрофилы и лимфоциты.

Так, было испытано несколько видов воздействия in vitro оптического излучения красного света с длинной волны А.=630 нм и синего с А.=470 нм в непрерывном режиме и импульсном с дискретными значениями частот Н=3,5 Гц, Н=7,8 Гц, Н=15 Гц, относящихся к резонансной области собственных частот аутоколебательных систем организма. Учитывая, что коридор активности энергетических доз оптического излучения составляет 0,19-4,0 Дж/см2, при которых кровь воспринимает квантовую энергию без повреждений биологических структур, нами применялись разные дозы оптического воздействия, образующие ряд значений - W=0,22 Дж/см2, W=0,31 Дж/см2, W=3,06 Дж/см2 и W=3,86 Дж/см2.

С помощью лизосомально-катионного теста были получены значения цитохимического коэффициента (ЦХК), которые в дозе СДИ 0,22 Дж/см2 красной полосы света увеличились в 2,8 раза при непрерывном режиме (Ki). При этом зерна катионных белков нейтрофилов укрупнялись и располагались глыбками по всей поверхности гранулоцитов. В остальных пробах в этом дозе при импульсной подаче сигнала достоверных отличий не было получено ни в красной, ни в синей полосах света.

Дальнейшее увеличение дозы оптического излучения характеризовалось нелинейностью эффекта стимуляции катионных белков нейтрофилов. Так при дозе 0,31 Дж/см2 в режиме К, наблюдался относительный спад уровня ЦХК до значений 1,6 у.е., а на этапе использования дозы облучения 3,06 Дж/см2 значения ЦКХ максимально возросли только в режиме К] (непрерывное излучение),

и

в отличие от импульсных режимов красного (К2-К4) и синего (С2-С4) излучения с частотой 3,5 Гц, 7,8 Гц, 15 Гц, которые привели к снижению ЦХК. Увеличение дозы оптического воздействия до 3,8 Дж/см2 характеризовалось менее выраженной активацией катионных белков, о чем свидетельствовали значения ЦХК, повышение которых было менее выраженным и в режиме Kj, и при остальных видах некогерентного излучения (рис. 2).

Проведя экспериментальную апробацию режимов оптического воздействия in vitro на кровь больных местнораспространенным раком легкого, нам удалось установить различия в эффективности а) по длине волны с приоритетом красного света, б) по режиму подачи сигнала - импульсному (с различной частотой импульса) и непрерывному, в пользу последнего и, наконец, в) по дозе облучения, определившей нелинейность эффекта с оптимумом при 3.06 Дж/см2.

Рис. 2. Влияние различных режимов воздействия оптического излучения in vitro на уровень катионных белков в нейтрофилах крови больных раком легких

Выбрав параметры излучения, мы изучили их влияние на функциональную активность лимфоцитов. Было установлено, что воздействие красным светом в дозе W=3,06 Дж/см2 статистически достоверно повышает пролиферативную активность лимфоцитов. Об этом свидетельствовали показатели спонтанной (18,0±0,44 против 12,0±1,7 в контроле; р<0,05), а также ФГА- (32,5±2,5 против

25,6±1,7 в контроле; р<0,05) и ЛПС-индуцированной (34,8±3,0 против 27,6±1,1 в контроле; р<0,05) реакции бласттрансформации, экспрессии мембранных рецепторов Т-лимфоцитов (СД4, СД8) и ЕК- (СД16, СД56) клеток (р<0,05).

Результаты взаимодействия культуральных опухолевых клеток человека (К562) с фотомодифицированными лимфоцитами показали достоверно высокий процент гибели К562 по отношению к контролю (40,0±1,2 против 6,4±0,8; р<0,05). На фоне увеличения процента гибели клеток-мишеней установлено значимое повышение индекса цитотоксичности лимфоцитов, облученных монохромным СДИ, по сравнению с необлученными лимфоцитами (5,4±0,1 против 3,65±0,1; р<0,05).

Значения индекса апоптоза превышали показатели влияния необлученных лимфоцитов на опухолевые клетки до начала лечения в 4 раза(с 6,1% до 24,3%), а после окончания - в 7,9 раза(с 11,3%до 88,8%), что демонстрирует возрастание проапоптогенного потенциала, как одного из механизмов повреждающего эффекта на культуру клеток (рис. 3).

излучение

Рис. 3. Влияние оптического излучения на индекс апоптоза К562 Примечание * - статистически достоверные различия после лечения от исходных данных (р<0,05)

Далее нами было проведено 2 серии экспериментов с применением фото-модифицированной аутогемохимиотерапии на животных с опухолями: 1 - на модели перевитой под кожу белых беспородных крыс-самцов саркомы-45; 2 - на модели эктопического роста саркомы 45 в ткани легкого.

Сравнивая показатели объема С-45 в первой серии опытов на разных этапах исследования, оказалось, что максимальные межгрупповые различия обнаруживались уже на 12 сутки после проведения 2-х воздействий фотомодифици-рованной АГХТ. В данной группе значения объема опухолей были самыми низкими, что свидетельствовало об ингибирующем влиянии, выраженном в более высокой степени, чем воздействие только АГХТ (рис. 4).

Рис. 4. Сравнительная динамика роста саркомы 45 на различных этапах воздействия с применением фотомодифицированной аутогемохимиотерапии

Дополнительную информацию о различиях в темпах роста опухоли удалось получить при расчете процента торможения (Т%) и индекса эффективности (ИЭ), которые к 24-м суткам роста опухоли в группе фотомодифицированной АГХТ были в 1,4 раза и в 3 раза соответственно выше, чем в группе АГХТ без облучения крови красным светом.

Важным обстоятельством было увеличение максимальной продолжительности жизни до 110 суток против 80 в контроле. При АГХТ эти данные были ниже, но также значительно превышали контрольный уровень.

Гистологический контроль эктопического роста С-45 в легком показал, что опухолевая инвазия, обнаруживаемая не только в межальвеолярных перегородках, но и основных респираторных структурах, сохраняет черты типичные для клеток этой опухоли: веретеновидную, реже овальную форму клеток с мно-

гочисленными фигурами патологического митоза. Опухолевые конгломераты сливались в крупные узлы, образуя мультифокальный рост с элементами некроза, кровоизлияний, дистелектаза (рис. 5).

Рис. 5. Эктопический рост С-45 в легком у крыс: А в контроле; Б - регрессия опухоли в легком у крыс под влиянием фотомодифицированной аутогемохимиотерапии

После применения фотомодифицированной аутогемохимиотерапии наблюдались дегенеративные изменения опухолевых клеток со снижением патологических митозов, лимфоцитарной инфильтрацией, развитием молодой соединительной ткани и замещением ею ткани опухоли.

Полученные экспериментальные данные аргументировали возможность использования фотомодифицированной аутогемохимиотерапии в клинических условиях. Оценка непосредственных результатов лечения проводилась нами на основании анализа объективных и субъективных критериев.

Уже к концу I курса фотомодифицированной АГХТ у большинства пациентов отмечалось снижение выраженности болевого синдрома, уменьшение

кровохарканья. Больные указывали на улучшение общего состояния, снижение утомляемости и общей слабости. Необходимо отметить, что наиболее частые симптомы, характеризующие клиническую манифестацию заболевания (кашель, кровохарканье, одышка) у больных основной группы регрессировали в 3 раза чаще по сравнению с пациентами контрольной группы (табл. 2).

Таблица 2

Динамика симптомов рака легкого после проведения химиотерапии в исследуемых группах больных, абс. ч. (%)

Симптом рака легкого Группа больных

АГХТ+ФХТ, п=30 АГХТ, п=30

до лечения после леч. до лечения после леч.

1. Кашель 28 (93,3±4,6) 5 (16,7±6,8)* 26 (86,7±6,1) 11 (36,7±8,8)

2. Кровохарканье 6 (20±7,3) 1 (3,3±3,26)* 8 (26,7±8,1) 4 (13,3±6,2)

3. Боли в грудной клетке 9 (30±8,36) 1 (3,3±3,3)* 11 (36,7±8,7) 4 (13,3±6,2)

4. Одышка: в покое 6 (20±7,3) 1 (3,3±3,3)* 4 (13,3±6,2) 2 (6,7±4,5)

после физической нагрузки 17 (56,7±9) 4 (13,3±6,2)* 19 (63,3±8,7) 10 (33,3±8,6)

5. Синдром сдавления верхней полой вены 3 (10±5,5) 0* 4 (13,3±6,2) 2 (6,7±4,5)

6. Осиплость голоса 3 (10±5,5) 1 (3,3±3,3) 2 (6,7±4,5) 1 (3,3±3,3)

7. Лихорадка 11 (36,7±8,7) 2 (6,7±4,5)* 9 (30±8,4) 3 (10±5,4)

8. Общая слабость 15 (50±9,1) 5 (16,7±6,8)* 17 (56,7±9) 6 (20±7,3)

9. Снижение веса 8 (26,7±8,1) 2 (6,7±4,5)* 6 (20±7,3) 1 (3,3±3,3)

10. Потливость 6 (20±7,3) 3(10±5,5) 9 (30±8,4) 5 (16,7±6,8)

11. Потеря аппетита 8 (26,7±8,1) 2(6,7±4,5)* 10 (33,3±8,6) 5 (16,7±6,8)

Примечание. * - статистически достоверные различия частоты симптомов после лечения от исходных данных (р<0,05)

Данная тенденция в динамике лечения наблюдаемых групп больных подтверждалась и результатами объективных методов исследования: при выполнении рентгенограмм органов грудной клетки и фибробронхоскопии в динамике, а также после лечения. Так, после лечения частота выявления функционально значимых признаков инволюции опухолевого процесса, таких, как регрессия опухолевого узла, гиповентиляция, освобождение просвета главного бронха увеличилась в основной группе в 3 раза по сравнению с результатами группы сравнения (табл. 3).

Таблица 3

Динамика рентгенологических симптомов рака легкого после химиотерапии в исследуемых группах больных, абс. ч. (%)

Симптом Группа больных

АГХТ+ФХТ, п=30 АГХТ, п=30

до лечения после лечения до лечения после лечения

Ткань легкого:

ателектаз 3(10±5,4) 0 4 (13,3±6,2) 2(6,7±4,5)*

эмфизема 1 (3,3±3,26) 1 (3,3±3,26) 2 (6,7±4,5) 2 (6,7±4,5)

гиповентиляция 6 (20±7,3) 1 (3,3±3,26) 7 (23,3±7,7) 4 (13,3±6,2)

норма 20 (66,7±8,6) 28 (93,4±4,5)* 17 (56,7±9,0) 22 (73,3±8,1)*

Просвет бронха:

«культя» 5(16,7±6,8) 1(3,3±3,26)* 7(23,3±7,7) 4(13,3±6,2)

сужение 23(76, 6±7,7) 5(16,7±6,8)* 19(63,4±8,7) 9(30±8,2)

Размеры опухолевого узла в легком:

8 см и более 5 (16,7±6,8) 0 3 (10±5,4) 1 (3,3±3,26)

5-7 см 15 (50±9,1) 3(10а=5,4)* 16 (53,3±9,1) 13 (43,3±9,05)

менее 4 см 10 (33,3±8,6) 23 (76,7±7,7)* И (36,7±8,7) 16 (53,4±9,1)

Лимфоузлы в корне и средостении:

+ 30 (100,0) 18 (60,0±8,9) 30(100,0) 22 (73,3±8)

- 0 12 (40,0±8,9) 0 8 (26,7±8,1)

Примечание. * - достоверность различий в основной группе по сравнению с фоном (р<0,05)

Иными словами, обратное развитие опухоли способствовало полному или частичному восстановлению структуры и функции легкого, что приобретало более частый характер после фотомодифицированной аутогемохимио-терапии.

К числу наиболее важных непосредственных результатов АГХТ с фотомодификацией мы относим наличие объективного эффекта в основной группе у 66,7% пациентов, в то время как в группе сравнения он составил 43,3%. Эффект полной регрессии опухоли при использовании одного курса фотомодифицированной аутогемохимиотерапии был достигнут у 4 (13,3%) пациентов, в то время как в группе сравнения не наблюдался ни в одном случае (рис. 6).

регрессия

Рис. б. Непосредственные результаты лечения больных раком легких Примечание * - достоверность различий в исследуемых группах (р<0,05)

Существенные межгрупповые отличия были выявлены при анализе токсичности проводимой терапии. У больных основной группы отмечено достоверное снижение в 1,5 раза частоты проявления миелосупрессии по сравнению с контрольной группой (45% и 30% соответственно), также не отмечалось высокой интенсивности гастро-интестинального синдрома, что позволило проводить лечение без вынужденных отказов от терапии и назначения дополнительных гемостимулирующих препаратов.

Основным аспектом доказательной части противоопухолевого влияния фотомодифицированной АГХТ были результаты перевода местнораспростра-ненного неоперабельного рака легкого в операбельное состояние и осуществление хирургического лечения. Преимущественным объемом радикальной операции в основной группе была расширенная и расширенно-комбинированная пневмонэктомия, которая произведена у 18 пациентов (60%), лобэктомия выполнена у 1 больного (3,3%). У 2 больных (6,7%) мы вынуждены были ограничиться пробной торакотомией (рис. 7).

В группе сравнения оперативное лечение проведено у 14 (46,7%) пациентов: радикальные операции - у 12 (40%), пробная торакотомия выполнена у 1 больного (3,3%).

%

□ Пневмонэктомия

40

70-

20

30

50-

60-

10

0

□ Лобэктомия

□ пробная торакотомия

АГХТ

АГХТ+ФХТ

Рис. 7. Объем оперативного вмешательства в исследуемых группах Примечание * - достоверность различий в исследуемых группах (р<0,05)

Процент резектабельности в основной группе составил 63,3%, что в 1,6 раза выше аналогичного показателя контрольной группы - 40%.

Важно отметить, что 19 пациентов основной группы прооперированы уже после 1-го курса АГХТ с фотомодификацией, двум больным выполнены операции после 2-х курсов. В контрольной группе пять больных прооперированы после 2-х курсов АГХТ и 7 пациентов - после 3-х курсов АГХТ.

Фактически, мы впервые столкнулись с возможностью перевода в операбельное состояние после проведения всего лишь одного курса АГХТ с фотомодификацией. Это обстоятельство логически определяло не только клинический, но и биологический смысл проводимой терапии, а именно роль квантового воздействия на аутокровь, ее клеточные элементы и плазму.

Подтверждением этому стало проведенное нами изучение энергетического метаболизма лимфоцитов периферической крови. Оказалось, что наиболее выраженные различия митохондриальной энергетики лимфоцитов проявились между показателями содержания опустошенных гранулами СДГ клеток: 10 в лимфоцитах после фотомодифицированной АГХТ уменьшилось относительно исходного уровня настолько, что это отразилось на соотношении с пулом клеток с высоким насыщением СДГ, т.е. К*ао7.1о, увеличился в 1,9 раза.

Это говорит об усилении активности сукцинатдегидрогеназной системы, базирующейся на наиболее энергетически выгодном пути работы митохондрий - янтарнокислом окислении. В ответ на воздействие оптического излучения наблюдалось изменение и гликолитических процессов, о чем свидетельствовали показатели а-ГФДГ как по средним значениям, так и по коэффициентам 1акт.Л0, снижение которых было более глубоким, чем в контроле.

Поскольку при фотомодифицированной АГХТ воздействию света подвергались не только клеточные элементы, но и сыворотка крови, нами было предпринято изучение изменений морфологической структуры.

Как показали исследования фаций сыворотки крови до лечения, процессы структурирования грубо нарушались как на I уровне самоорганизации, демонстрируя аморфизированные поля без упорядоченных круговых концентрационных волн, отсутствие радиальной симметрии и формирование трещин, секторов, отдельностей и конкреций.

Обращало внимание обилие локальных аномалий, функционально связанных с различными видами патологии: воспалением, интоксикацией, гипоксией, склерозированием. Обращало внимание скопление кристаллов белков, особенно жиджидкокристалпической природы в виде нематических (трубкооб-разных), холестерических и «застеклованных» форм. Эти морфоструктуры указывали на поломки клеточных мембран, выход в жидкие среды продуктов незавершенного метаболизма, шлаков, токсинов, распространение грибов на фоне снижения процессов биоминерализации.

При проведении фотомодифицированной АГХТ в сравнении с исходным состоянием повысилось формирование ауторитма концентрационных аутоволн, с 7,5%до 70% увеличилось формирование физиологических типов фаций, хотя сохранялся их неустойчивый характер структурирования. Заметно сократилась частота появления маркеров патологических процессов, таких, как воспалительные, гипоксические, интоксикационные, склеротические. Выявляемые до лечения признаки глубоких нарушений липидного обмена и дисфункции печени были выражены значительно слабее.

Рис. 8. Структура фаций сыворотки крови больных раком лёгкого до (А) и после (Б) проведения фотомодифицированной аутогемохимиотерапии.

Таким образом, отображая через системы клеточного энергообеспечения и структуру сывороточного состава белков механизм восприятия и передачи оптического излучения, можно объяснить противоопухолевое влияние фотомодифицированной АГХТ не только за счет усиления процессов связывания цитостатиков и повышения их туморотропного влияния, но и благодаря включению систем неспецифической клеточной и организменной противоопухолевой резистентности. Данная технология может стать эффективным вспомогательным фактором повышения результативности противоопухолевого лечения, расширяя подходы оперативного лечения и, вместе с тем, определяя перспективу органо-сохраняющего влияния.

Нам удалось разработать в эксперименте и применить в клинических условиях новую методику лечения местнораспространенного рака легких, показать ее высокую эффективность и хорошую переносимость. На основании объективных статистически достоверных данных можно заключить о целесообразности и перспективности использования фотомодифицированной аутогемохимиотерапии в онкопульмонологии.

24

ВЫВОДЫ

1. В экспериментах in vitro и in vivo установлен режим монохромного светодиодного излучения в красной полосе света, оказывающий стимулирующее влияние на механизмы клеточной резистентности крови с достоверным повышением уровня катионных белков с 1,13±0,01 до 2,73±0,03 у.е. в 100% ней-трофильных гранулоцитов крови, увеличением синтетической активности лимфоцитов и мембранной экспрессией их рецепторов СД4+, СД8+, СД16+, СД56+ (р<0,05), возрастанием проапоптогенного потенциала натуральных киллеров в отношении культуры опухолевых клеток К562 в 7,9 раза, а также ингибирова-нии роста саркомы 45, перевитой подкожно и в легкое крыс.

2. Клинически доказано, что фотомодифицированная аутогемохимиоте-рапия является высокоэффективным неоадьювантным методом комплексного лечения местно-распространенного первично неоперабельного рака легкого ША-ШБ стадии, реализующим противоопухолевый эффект уже после 1-го курса лечения: объективный эффект в основной группе, составил 66,7%, что в 1,5 раза выше, чем в контрольной (43,3%) (р<0,05). Это позволило повысить ре-зектабельность опухоли в 1,6 раза (63,3%) по сравнению с аналогичным показателем в группе пациентов (40%)(р<0,05), где проводилась аутогемохимиотера-пия по стандартной схеме.

3. Применение аутогемохимиотерапии с фотомодификацией позволило снизить частоту основных токсических проявлений. У больных основной группы отмечено достоверное снижение в 1,5 раза частоты проявления миелосу-прессии по сравнению с контрольной группой (45% и 30% соответственно), что позволило проводить лечение без вынужденных отказов от терапии и назначения дополнительных гемостимулирующих препаратов

4. Проведение фотомодификации крови больных местнораспространён-ным раком лёгкого характеризуется статистически значимым повышением уровня естественных киллеров (с 2,78±0,13% до 3,38±0,18; р<0,05), усилением спонтанной (с 12,4±0,9% до 18,4±1,5%) и индуцированной (с 25,1±0,8% до 32,2±2,1%; р<0,05) пролиферативной активности лимфоцитов, повышением

экспрессии диффереицировочиых клеточных рецепторов по сравнению не только с исходным фоном, но и с показателями контрольной группы, что свидетельствует о позитивных изменениях иммунного статуса.

5. Ингибирующее рост опухоли влияние фотомодифицированной аутоге-мохимиотерапии реализуется на фоне изменений энергетического метаболизма лимфоцитов крови, связанного с преодолением дефицита янтарной кислоты и дисбаланса процессов дыхания и фосфорилирования , определяемого по активности дегидрогеназ лимфоцитов Ракт.=226 у.е. против 125 у.е. в контроле) (р<0,05), что подтверждается увеличением в 1,8 раза соотношения пулов клеток, обогащенных сукцинатдегидрогеназой, к числу клеток-«нуллеров» и доказывает связь энергопродукции с фотохромным излучением.

6. При топографическом исследовании фаций сыворотки крови больных раком легкого в сравнении с исходным состоянием установлено позитивное системообразующее влияние фотомодифицированной АГХТ, заключающееся в восстановлении с 7,5 % до 70% случаев системных (концентрационные волны, трещины), подсистемных (отдельности и конкреции) признаков структуропо-строения, а также снижении частоты выявления маркеров патологических процессов: воспаления - в 6 раз, интоксикации - в 8,9 раза, гипоксии - в 5,2 раза, подавлении кандидоза и ограничении выхода жидкокристаллических структур из тканей организма.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В случаях выявления местнораспространенных первично неоперабельных форм рака легкого целесообразно проведение фотомодифицированной ау-тогемохимиотерапии в качестве первого этапа лечения.

2. Проведение аутогемохимиотерапии с фотомодификацией обеспечивает купирование большинства клинических симптомов, вызывает регресс опухоли и метастатических компонентов уже после одного, реже двух курсов, что сокращает длительность неоадъювантной терапии и позволяет выполнить операции части пациентов в максимально короткие сроки.

3. В связи с отсутствием необходимости многокурсового лечения предла-

гаемая методика позволяет сократить объем вводимых препаратов, обладает низкой токсичностью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белан О.С. Воздействие оптического светодиодного излучения красного и синего спектра на кровь больных раком лёгкого в экспериментальных исследованиях in vitro / Е.А. Шейко, А.И. Шихлярова, Г.З. Сергостьянц, О.С. Белан // Материалы XII Междунар. научной конф. - Эйлат, Израиль, 2008. - С. 422.

2. Белан О.С. Возможность использования фотомодификации крови для иммунокоррекции у больных раком лёгкого / Е.А. Шейко, Е.Ю. Златник, Г.И. Закора, О.С. Белан // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т.9. - №4. -С. 472-473.

3. Белан О.С. Усиление функциональной активности некоторых факторов клеточного иммунитета онкологических больных путём экстракорпоральной фотомодификации крови /Е.А. Шейко, Е.Ю. Златник, Г.И. Закора О.С. Белан //Рос. биотерапевтич. журнал.-2008.-Т.7. -№1. - С. 26.

4. Белан О.С. Влияние некогерентного монохроматического излучения красного света на продукцию цитокинов мононуклеарных клеток крови онкологических больных / Е.Ю. Златник, Е.А. Шейко, О.С. Белан, Г.И. Закора // Ци-токины и воспаление. - 2008. - Т.7. - №3. - С. 46.

5. Белан О.С. Новый метод лечения первично неоперабельного местно-распространённого рака лёгкого / О.С. Белан, А.И. Шихлярова, Е.А. Шейко, Г.З. Сергостьянц, Т.Г. Айрапетова, С.В. Оськин, К.С. Саркисьянц, П.А. Анист-ратов // Сибирский онкологич. журнал. Приложение №1. — 2009. — С. 46.

6. Белан О.С. Влияние низкоинтенсивного красного светодиодного излучения на величину противоопухолевого эффекта циклофосфана, введённого на аутокрови в эксперименте / Е.А. Шейко, О.С. Белан, Т.А. Куркина, Д.В. Леонтьева // Материалы V съезда онкол. и радиол. СНГ. - Ташкент, - 2008. - С. 198.

7. Белан О.С. Квантовые эффекты и энергетический профиль лимфоцитов крови при аутогемохимиотерапии рака лёгкого / А.И. Шихлярова, Л.П. Барсукова, Г.Я. Марьяновская, Е.А. Шейко, О.С. Белан, Д.В. Леонтьева // Рос. биотерапевтич. журнал. - 2009. - Т.8. - №1. - С. 24.

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1,0 уч.-изд.-л. Заказ № 1309. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88