Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Анализ структурных изменений некоторых генов в индуцированных минеральными волокнами мезотелиомах крыс

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 618. 14- 006 - 092.9

Апалт структурных тменепий некоторых генов в индуцированных минеральными волокнами метотелномах крыс

(Специальность 14.00.14)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Клейменова Елена Вячеславовна

МОСКВА 1995

Работа выполнена в лаборатории природных канцерогенов НИИ канцерогенеза Онкологического Научного Центра РАМН (директор - академик РАМН Н. Н. Трапезников)

Научные руководители - доктор медицинских наук, профессор

Л. Н. Пылев

кандидат биологических наук В. П. Шелепов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Б. П. Копнил

доктор медицинских наук, профессор В. С. Журков

Ведущая организация Московский научно - исследовательский

онкологический институт им. П.А.Герцена МП РФ

Загцита диссертации состоится "--" 1995 г.

в " " часов на заседании Специализированного Ученого Совета (К. 001.17.01) по присуждению ученой степени кандидата наук в в Онкологическом I Ьучном Цешре РАМН по адресу: г. Москва, 115478, Каширское шоссе, д. 24

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Онкологического Научного Центра РАМН.

Автореферат разослан "16" октября 1995 г.

Ученый секретарь

Специализированного Ученого Совета

доктор медицинских наук, профессор В.С.Турусов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Асбест используют при производство болэв 3000 видов громышленных продуктов, применяют для дорожных покрытий и в :троительной индустрии как звуко- и термоизолятор. [рофессионалышй или бытовой контакт с асбестом мокэт вызывать (эрматиты, флброз, злокачественные опухоли . легких, желудка, ичников, а такке мезотелиомы, развитие которых является :арактерным признаком асбестовой экспозиции. Помимо асбеста, юзникновениэ мезотвлиом вызывает экспозиция с алюмосиликатным инэралом эрионитом, также относящимся к природным волокнистым ¡инервлам (ПВМ).

Мезотелиомы - редкие опухоли, происходящие из клеток мезотвлшг глевры или брюшины. Методов ранней диагностики этих опухолей но :уществ1ет, длительность выживания больных с верифицированным; ¡иагнозом мезотелиомы как прсле хирургического вмешательства, так ¡без такового, не превышает двух лет и ни о Дин из современных ютодов лечения. не способен изменить течение болезни, пепифические генетические или биохимическти мзркерц мезотелиом :еловека (МЧ) не $1звестны.

. Теоретически обоснованные представления о механизмах ндуцированной ПВМ злокачественной трансформации мэзотелия в ;астоящее ,.. время отсутствуют. Ответ на вопрос, какие юлекулярно-генетические повреждения индуцируются ПВМ, поможет ;онять природу' канцерогенеза, индуцируемого волокнистыми мнералами. Определение таких повревденкй макет обеспечить ¡ысокочуЕствителькув ' диагностику плевральных мезотелиом,

гистология которых одинакова с гистологией плевральных метастазов и сарком стонки грудной клетки и, в будущем, позволит приступить к- разработке генотерапии индуцированных ПВМ злокачественных новообразований. Раскрытие молекулярных механизмов индуцируемого минеральными волокнами процесса злокачественной трансформации мезотелия позволит устаношть связь между физико-химическими свойствами минеральных волокон и их канцерогенной активностью, и, следовательно, создать неканцерогенные заменители асбеста.

Работ, посвященных изучению молакулярно-генетических событий, происходящих при трансформации мезотелия, и, в частности, при развитии мезотелиом, мало. Это объясняется частично тем, что мезотелиомы - редко оперируемые опухоли. В основном, исследования проводятся с использованием клеточных линий МЧ и не ясно, характерны ли обнаруженные изменения для развития МЧ ir, vivo или они являются результатом культивирования трансформированного мезотелия. Крысы являются наиболее широко используемым еидом как для исследования заболеваний человека, связанных с экспозицией с ПВМ, так и для тестирования канцерогенности природных и синтетических минеральных волокон. Существенно, что индуцированные ПВМ мезотелиомы крыс (МК) имеют схожую с МЧ локализацию и гистологию. Данные литературы свидетельствуют, что структурные и функциональные изменения геноЕ-супрессороЕ опухоли Вильмса (wt-1), нейрсфкброматозв 2 (HF-2), р53 и протоонкогенов семейства ras могут являться причинными для генеза мезотелиомы. Информация о состоянии этих генов в МК отсутствует, что не позволяет провести сравнение МЧ и модельных мезотелиом крыс с

\яп ТШХГТГ Г7/Ю М7 ТТгП í-í.-i !) t íí i ГГ:Л irtít Г. flr\nivr\airrtrjt

nnJtlt^ íwj Itui L¿i2 W i. UiiUlhluUtkiAA 1|иыЛЦ11«1 < A 4 ' '....... • * ^ V> UUWiUMlUlH

указанных генов в модельных опухолях расширят, информацию о типах

молекулярно-генэтических повреждений, индуцируемых ПВМ, а также позволят глубже понять природу молекулярных повреждений, характерных для генов , от-г, р5Э, гав при неопластичэской трансформации.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось исследование генов-супрессоров

, -НГ-2, р53 и протоонкогенов семейства гае в модельных мезотелиомах крыс.

В соответствии с этим:были поставлены следующие задачи:

- изучение структуры генов и ИР-г в образцах МК,

.I

включающих индуцированные хризотил-асбестом первичные опухоли и клеточные линии, происходящие из индуцирова;шых асбестом МК. В качестве контроля исследовались ткани интэктных крыс.

- поиск точечных мутаций в кодирующей последовательности генов ОТ-2 и р53, а также в 12 и 61 кодонзх генов На- и Кл-гаа Е индуцированных эриош{том и асбестом первичных опухолях и клеточных линиях мэзотелиом крыс.

- исследование РНК-изоформ гена ИР-2'и' экспресии белка р53 в указанных образцах МК.

- . анализ возможного использования полученных данных для определения дальнейших путей исследования заболеваний, связанных с воздействием минеральных волокон.

Научная новизна

Впервые в . мезотелиомах крыс . обнаружено характерное гиперметилирование гена-супре ссора .

Впервые обнаружен феномен закдаты ке тлеющего мутаций сайта для рестриктазы ЕсоР. I, находящегося е интроне I гена \rt-i и

определен механизм его защиты. Установлено, что причиног защищенности этого сайта является метилирование Еходящего в сайт остатка дезоксицитозина, а демэтилирование ДНК с помощыс 5-азо-2-дезоксицитозина возвращает этот сайт в нормальное состояние.

Показано, что структурные изменения гена-супрессора ю?-2, характерные для мезотелиом человека," отсутствуют в мезотелиомах крыс- Определен характер сплайсинга изоформ гена КР-2 в мезотелиомах и в нормальных тканях крыс.

Показано, что для Ш характерно отсутствие мутаций в кодирующей последовательности гена р53 и в 12 и 61 кодонах генов На- и К1-гав.

Впервые расшифрована кодирующая нукпеотидная последовательность размером 1762 пары оснований гена ир-2, нуклеотидные последовательности вставки, создащей изоформу II гена N7-2 крысы, интрона 2 и выборочных участков интрона I гена \irt-l крысы.

Научно-практическая значимость работы Работа имеет теоретическое значение для понимания молекулярных механизмов индуцированного минеральными Еолокнами канцерогенеза. Теоретическая значимость работы заключается в получении новых данных о генах-супрессорах , да-2,- р53 и протоонкогенов семейства гавв мезотелиоме крыс.. Эти данные позволяют сравнить молекулярные механизмы повреждений этих . генов в МЧ и индуцированных ПВМ модельных НК. Показанное отсутствие структурных изменений исследованных геноЕ к обнаруженное характерное гиперметялироваше гена >1-1 в мезотелиомах подтверждает гипотезу

iÖ впигеномном механизме индуцированного минеральными волокнами :анцерогенеэа. Обнврукен ранее не опиоанный в литературе феномен (ащиты оайта для рестриктазы EcoR i, расположенного в интронэ I ■енв wt-1, установлена его природа и показана характерность для юзотвлиом крыс.

Практическая значимость работы заключается в том, что 1бнаруженное характерное гиперметилирование гена wt-1 в модельных [езотелиомах позволяет предложить исследование степени ютилирования этого гена в мезотелиомах человека и в опухолях левры другой гистологии для разработки высокочувствительного ;етода подтвервдения диагноза плевральных мезотелиом.

пробация работы. Материалы диссертации были доложены и редставлялись на семинаре СИТ, Research Itiangle Park, NC, USA, 992, на Ученом Совете НИИ канцерогенеза, Москва, 1994, на еминаре UT MD Anderson Cancer Center, Auls tin, USA, 1995, на "48 nnual Symposium on Fundamental Cancer Research 'Genetic echanisms of Cancer" Huston, USA, 1995, Ha "Annual Meeting of ociety of Toxicology USA", Reston, USA, 1995. В целом работа пробирована на объединенной конференции лабораторий природных внцерогенав, методов скриннинга канцерогенов, канцерогенных еществ и биологии опухолевых вирусов НИИ канцерогенеза ОНЦ РАМН, Э95. v

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 5 работах, I эходатся в печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текога и соатоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, собственные исследования, обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Список литературы содержит 131 ссылку на отечественные и

ч

зарубежные источники. Диссертация иллюстрирована 18 рисунками, содержит 7 твблиц и 2 приложения.

Работа выголнена в лаборатории природных канцерогенов НИИ канцерогенеза ОНЦ РАМН. Зав. лаб. и руководитель - профессор, д.м.н. Л.Н.Пылев. Со-руководителем является с.н.с. лаборатории биохимии, к.б.н. В.П. Шелепов. Молекулярно-генетические исследования также проводились в лаборатории молекулярной токсикологии Института токсикологии химической промышленности, США, зав. Dr. J.PreBton, Ph.D., лаборатории 3 отдела канцерогейза М.Д.Андерсон Онкологического Центра, США, зав. Associated Professor, Dp. C.Walker, Ph. D.

Содержание работы Материалы и методы.

Объект исследования.

Для получения репрезентативных образцов первичных мезотелиом были проведены хронические опыты на крысах В качестве

индукторов мезотелиом использовались образцы асбеста и эрионита, канцерогенность которых была установлена ранее. Суспензия эрионита в физиологическом растворе была введена внутрибрпнинно 30 самкам и

ЯП г*а»'I!Я1* фги^*л*\аптигл п г-ганатмэа ппи в Т ма/^атт /лттигмтатмтаа тглаа

Ои иши^ин Ч^ ^ Л. ^

¡оставляла 20 мг, суммарная - 60 мг. Суспензия хризотил-асбеста !ыла введена внутрибршинно 58 самкам однократно в дозэ 60 мг. )пухоли определялись пальпацией и в случае наличия, животные, гаслв наркотизации эфиром, забивались. Вырезанные опухоли делили la несколько частей, одни из которых помещали в формалин, в футиа замораживали в жидком азоте. Зафиксированные в формалине >бразцы опухолей использовались для морфологического и ммуногистохимического анализа. Было отобрано 15 индуцированных »рионитом и 10 индуцированных асбестом мезотелиом, имевших достаточную для молекулярно-Оиологических исследований массу. Слеточные линии . XI 14, IX 45, III 2, происходящие из тдуцированных асбестом перитонеальных мезотелиом крыс, были побезно предоставлены Dr. J. Crairihead (США), клеточные линии Т08 I TI0, происходящие из плевральных индуцированных асбестом «эзотелиом были любезно предосталены Dr. D.Coffin (США), клеточные шнии МЧ Н28 и Н2052 были любезно предоставлены Dr. A. Gazdar (США).

Молекулярно-биологические методы . Для экстракции ДНК и РНК все замороженные ткани были измельчены в жидком азоте пестиком в фарфоровой ступке. Для голучения ДНК измельченные ткани,' суспендированные в лизирующем 5уфере, инкубировали в течение ночи с протешазой К, з затем фоводили экстракцию фенолом и хлороформом. Для получения РНК тзмельчешше ткани суспендировали в ' растворе

танидинизотиоцианата, наслаивали на 5,7 H раствор ceci и пробы

о

дентркфупфСЕЗли 18 часов при IS С и 35000 эб/мкя.

t/TTOTÎ огштоотштио nont lia "DUTf—»»aurwrrfa о гтг\»*г\тс1л nrtnoTanft

WUi^ UUJi^WUUtflUUU UU iiUb 14kj 1 ^ИЦУ ......

транскрипции. Праймары для PCR-ашлификации фрагментов, содержащих 12 и 61 кодоны На и Ki-гав, и яДНК р53 были получены от Dr. L. ReBBio (США), кДНК NF-2 - от Dr. A. Bianchi (США). Праймеры для гена wt-1 и клонв wki.4 по нашему заказу были синтезированы фирмой Оеповув (США) . PCR проводили за 30-40 циклов. Температура отжига праймеров зависела от их составе, температура синтеза составляла 72 С, время отжига и синтеза поддирались эмпирически. Размер и количество продуктов определяли, проводя электрофорез совместно с маркерами молекулярного веса в I % геле агарозы, окрашенном бромистым этидием, с последующей визуализацией распределения фрагментов в ультрафиолетовом свете. Поиск точечных мутаций проводили методами определения мутации в двух аллелях одного гена И сиквенирования по Sanger.

Епотт-гибридизацию ДНК-ДНК и РНК-ДНК проводили при 42°С в течении ночи, гибридизационный раствор содержал 50 % формамида. В качества пробы использовались меченные с помощью 32-Р-дезоксицитозина продукты PCR. Ыечение проводили с использованием фрагмента Кленова и не специфического праймера. 15 мкг гДНК обрабатывали необходимой рестриктазой, проводили электрофорез продуктов рестрикции в I. Ж геле агарозы, ДНК в геле денатурировали, нейтрализовали и переносили на нитроцэллюлозные фильтры методом капилярного переноса в растворе 2QxSSG. Для Nothern-анализа 5 мкг поли+А фракции РНК электрофоретически разделяли в денатурирующем 0,8 Ж геле агарозы и переносили на нитроцеллюяозную мембрану с помощью I5xssc. После гибридизации фильтры отмывали и экспонировали с рентгеновской пленкой для получения автографов. Дэметклкрованке - клеточной линии МК II45

птлппп,тттг тт ттл itx. a warn. ^-oqoттаошгптгггтдтр/лоттио»/ фра пттпатта пашла

ii^WMW/V^'Ul f С UUU UWiWJiUrli Л iiiww •

фэктивной концентрации втого соединения Сылв получена 1виоимооть скорости роста клеток при его различных >нцентрациях. Б-аза-2-дезоксицитозин вносили в культуру, когда гетки покрывали 20 % поверхности флакона и инкубировали их в 1чэние 120 часов. Подсчет клеток проводили каждые 24 часа шубирования. Концентрация 4мкМ вызывала 45 % замедление темпа >ста клеток, но не приводила к быстрой их гибели в связи с общим ¡метилироввнием. Для получения ДНК для рестриктного анализа ютки инкубировали с 5-аза-2-дезоксицитозином в концентрации мкМ в течение 72 часов, затем из них экстрагировали ДНК фенолом хлороформом.

Собственные исследования.

Исследование гена-супрессора опухоли Вильмса (wt-1) в ыазотелиомах крыс.

Для прь^рки гипотезы о возможных структурных альтерациях ша wt-1 в Ш была проведена Southern-блотт гибридизация геномной Ж 6 клеточных линий МК и 6 индуцированных асбестом первичных 1ухолей. Использовались рестриктазы Вага hi, Sac I, pst I, Pvu II, га' I, Rea I, EcoR I. Только при обработке ДНК рестриктазой Eco RI 1йи выявлены структурные изменения ДНК мезотелиом по сравнению с зрмальными: тканями крысы. На автографах, полученных в результате йридизацшг ДНК* обработанной рестриктазой Ecor i, с пробой,-шатывающей .кодирующую последовательность гена wt-1, было 5нарухено различив между фрагментами ДНК нормальной печени и

линиях MR, за исключением Ш 4, и в присутствовал дополнительный- фрагмент

(фрагмент Д) размером 3,5 тысячи пар оснований, отсутствовавший препаратах ДНК печени и клеточной линии II 14 (рис. 2).

Последующая гибридизация о пробами, охватывающими различи вкзоны гена wt-1; показала гомологию фрагмента Д с пробо! включающей экзоны 1-3. Фрагмент Д, выделенный из препарата да клеточной линии МК II 45, был клонирован фирмой lark (США), клс назван wki.4. На рис. I приведена схема клона wk 1.4 и гена wt-1 Проведенный нами анализ нуклеотидной последовательности использованием праймеров, синтезированных на основе векторнс последовательности, показал, что клон содержит нормально последовательность экзона 2 гена wt-1, фланкированну последовательностями, не имеющими реальной гомологии с имевыимис в базе данных Gene Bank. Последующий анализ с использование праймеров, синтезированных на основе первого сиквенса* показал что в последовательности клона на расстоянии 300 пар оснований о одного из отграничивающих клон KcoRl сайтов (сайт 2 на рис. I имеется последовательность еще одного сайта для Eco ri (сайт 3).

Дополнительный электрофорез в течении 4 часов и последующа Southern-блотт гибридизация ДНК, обработанной рестриктазой EcoRi при использовании кодирующей последовательности гена Wt-1 качестве пробы, выяеияз присутствие фрагмента размерам в 300 п.о (малый фрагмент ) в препаратах ДНК печени и в образцах ЫК, которых отсутствовал фрагмент Д. В тех образцвх МК, где бы обнаружен фрагмент Д, малый фрагмент отсутствовал. Пр использовании клона wk 1.4 в качестве пробы на автографах бы обнаружен новый фрагмент размером в 3,2 тыс. п.о., доминирующий препаратах ДНК нормальной печени и кя. линии II 14 : слабовыразйккый в остальных препаратах ДНК мезотелиом. В эти

к s 7 \

I

о>

W

ь.

•а

? я>

-s

и

«lis

II

г

ч

I

I

J

t «о

IS

s

О p*1*

i

-iJ

3 i

? M

•S«* a .о

! I

S

ч

К v

Ȕ

о »

«о

a.

т

*

о

*

I i S¡

з

cd и <в и

-bí. 3 сЗ № О

g

О

Д-

фрагмент i Д —

-8-1 Okb

-1.7кЬ

Рис. 2. Автограф блотт-гибридизации ДНК, обработанной респштазс Eco r I с пробой 4581 - 4857. Источник ДКК: I. кл. линия МК И 14 2. кл. линия МК II 45; 3. кл. линия ЫК III 2; 4. первичная МК 50; 5. первичная мезотелиома крысы ЫКХ 68; 6. первичная мезотели-ома крысы МЮС 72; 7. печень крысы; 8. семенники крысы.

—9 kb - 7,2 кЬ

- 3,6 kb

- 2,5 kb

- 0,8 kt

Рис. 3. Автограф блотт-гибридизации ДКК, обработанной рестриктаза ми: на дорожках I, 3, 5, 7 - Msp I; на дорокках 2, 4, 6, 8 - НраХ. Проба 4581 - 48Б7. Источник ДНК: 1,2 - печень крысы; 3,4 - кл линия МК II 45; 5,6 - кл. линия МК II 14; 7,8 - кл. линия МК III

образцах, наоборот, преобладающим был фрагмент размером в 3,5 тыс п.о., олвбовырвженный в препаратах ДНК печени и кл..линии II 14.

Таким образом, сопоставление автографов, полученных яри гибридизации с кодирующей последовательностью гена и клоном «к 1.4 позволило выявить существование скрытого фрагмента ЕооИ I рестрикции, не определяемого при гибридизации с кодирующей последовательностью гена Мьг предположили, что клон »к 1.4

мог быть либо нормальной последовательностью генв , но содержать интронные последовательности, либо быть фрагментом другого гена, в который транслоцирован экзон 2 гэна wt-1.

Проведенный нами сиквенс интрона и выборочных участков интрона I гена показал идентичность заштрихованных на рис. 1. фрагментов, обозначенных как фрагменты А, В, С. На основании проведенного анализа нуклеотидной последовательности мы считаем, что клон як 1.4 является нормальной последовательностью гена захватывающей частично интрон I, экзон 2 и частично интрон г, расположенной между двумя Есои I сайтами, отстоящими друг от друга на 3,5 тыс. п. о., В препаратах ДНК мвзателиом, где присутствовал фрагмент Д, расположенный на этом участке4 гена сайт для Есой I, является недоступным для действия рестриктазы. Сравнение-полученных нами нуклеотндных последовательностей клона ик 1.4, интрона I гена «1-1 клеточной. линии ЫК II 45 и печени крысы показало, что защищенный свйт Есоы не имеет мутаций ни в клоне, ни в препарате ДНК кл. линии II 45. Мы предположили, что в тех образцах МК, где присутствовал фрагмент Д, Есой I сайт защищен либо труднодиссоциируемой третичной структурой, либо метилзрсванием остатка 2-дезоксицитсзЕка, входящего в этот сайт.

Для определения, является ли метилирование дезоксицитозина

причиной защищенности интронного сайта Есо ш баг проведен опыт по деметилированию ДНК клеточной линии МК XI 45. гДНК, экстрагированная из клеток линии МК II 45, инкубировавшихся с 5-аза-дезоксицитозинам в течение 72 часов, была обработана ЕсоК I и использована для Слотт-гибридизации с пробой, содержащей экзон 2 гена wt-1. Денсятомегрироваше автографа показало, что интенсивность фрагмента размером 300 п.о.; была одинакова для препаратов ДНК печени и деметилироввнных клеток МК II 45. Фрагмент Д в ДНК клеточной линии ЫК II 45 после демонтирования практически исчез. Полученный результат был интерпретирован как снижение защищенности сайта ЕооР, I в интроне I гена линии МК II 45 вследствие деметилирования дезоксицитозина, входящего в . состав этого сайта. ДенсигометрироЕание также выявило слабое, присутствие фрагмента Д в шчени крысы. , Видимо, частичное метилирование остатка дезоксицитозина гена присуще и нормальным тканям

крысы. Проведенный рестрикционный анализ ДНК 12 /образцов ''МК с использованием рестриктаз нра и и Ывр I, с последующей блотт-гибридизацией с пробой, охватывающей . кодирующую последовательность гена wt-1, позволил установить большую степень метилирования дезоксицитозиновых остатков гена ли в мезотелиомах по сравнению с печенью (рис. 3) и мезотелием крыс. Одинаковый размер фрагменте Д и показанное для всех образцов Щ гиперметилирование гена позволяет предполагать, что не только в препарате ДНК, выделенном . из клеток . линии1 II 45, ' но и в препаратах других образцов МК, где обнаружен фрагмент Д, его появление' обусловлено метилированием • дезоксицитозина в сайте для рестркктазы Есо Р. I.

Исследование гена нейрофиброматоза 2 (NF-2) в мезотелиомах крыс.

Для проверки гипотезы о структурных изменениях гена Ш-2 в модельных МК,методами sscp, сиквенирования и Southern-анализа были исследованы 6 клеточных линий МК и IQ индуцированных асбестом МК. sscp- анализ не выявил структурных альтераций ни в одаом из исследованных образцов. Сравнение полученных наш методом сиквенирования по Sanger нуклеотидннх последовательностей кодирующей области гена NF-2 размером 1762 п.о. нормальных тканей крысы и 5 образцов клеточных линий МК подтвердило отсутствие мутаций, показанное методом sscp.

Для решения вопроса о. существовании изоформ и характере сплайсинга гена nf-2 в мезотелиомах мы провели RE-PCR для 6 перекрывающихся фрагментов, охватывающих полную последовательность кДНК гена NF-2 и последующий анализ нуклеотидной последовательности обнаруженных изоформ. На рис. 4 представлены продукты PCR, полученные при амшпфпсации 3'-участка гена. При сравнении нуклеотидннх последовательностей этих фрагментов мы установили, что фрагмент 6-2 содержит вставку размером в 45 п.о. Данные литературы свидетельствуют, что изоформа II гена nf-2 человека и мыши содержит вставку такого же размера между I74Q и 1741 нуклеотцдами. При сопоставлении результатов вашего исследования и литературных данных мы пришли к выводу, что фрагмент 6-1- входит в состав изоформы 1, а фрагмент 6-2 - в состав изоформы II гена да-2 крысы. Проведенный анализ нуклеотидной последовательности встоеки позволил установить ее Ьолнув идентичность со естзекой изоформы II гена kf-2 человека и мыши и показал, что изоформы гена NF-2 нормальных тканей и образцов

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Рис. 4. РЖ-изоформн гена 2 . Источник ДНК: '

а) I. кл. линия МК II 14; 2. кл. линия МК II 45; 3. первичная мезотелиома ЖХ 50; 4. первичная мезогелиоьса МКХ 70; Г

; 5. негативный контроль ЯТ-РСЯ ; 6.. печень крысы; 7. легкие крысы; 8.; перитонеальный мезотелий крысы; 9. маркеры мол. веса

б) I. кока; 2, сзмешаки; 3. колудок; 4. печень; 5. сердце; 6. легкие; 7. почки; 8. негативный контроль ЙТ-РСЙ

9. маркеры мол. веса. Все препараты. РНК получены из тканей кнтактных крыс.

мэзотелиом не имеют различий нуклеотидного состава. Хотя проведеннвя кг-гси не являлвоь количественной методикой, мошо видеть, что в МК обе изоформы экспрессируются в равных количествах, а в нормальном мезотелии доминирует только изоформа XI. Следует отметить, что обе изофэрмы также присутствуют в тканях легких и . почек. ' В семенниках и коже преимущественно экспрессируется изоформа II, . а в печени, сердце и желудке -изоформа I.

Исследование гена р53 в мезотелиомах крыс.

С целью выявления возможных мутаций гена р53 мы проанализировали кодирующую последовательность размером 800 и.о., включающую экзоны с 5 по 8 для 16 образцов МК (10 индуцированных эрионитом опухолей и 6 клеточных линий). Дополнительно, для 3 из 6 линий и 3 из 10 первичных опухолей была проанализирована вся кодирующая последовательность гена р53 размером в 1176 п.о. Первичные опухоли, исследованные нами, представляли опухоли следующих типое: 4 имели смешанный тип, I являлась эпителиальной и 5 имели саркомоподобное строение. Только нормальная нуклеотидная последовательность была зарегистрирована во всех первичных опухолях и клеточных линиях.

Иммуногистохимическое исследование, "проведенное для б индуцированных эрионитом МК, для которых была получена нуклеотидная последовательность гена р53, и для дополнительных 5 индуцированных эрионитом МК, не выявило иммунореактивности к мутэкткому белку р 53.Среди исследованных..были 2 эпителиальных, 3 смешанных к Б сарксмсподсбкых опухолей. Показанное методами

сиквенирования и иммуногистохимии отсутствие мутаций, и в пэрвичнык опухолях, и в клеточных линиях свидетельствует о том, что изменения структуры гена р53 не являются механизмом инактиваций этого генв в мезотелиомах крыс.

Анализ точечных мутаций в 12 и 61 кодонах геноЕ Ha-ras, Ki-гав в мезотелиомах крыс.

Для выявления известных актиЕщзующих гав мутаций мы исследовали первичную структуру 12 и 61 кодонов На- и Ki-гав в 6 клеточных линиях, 10 индуцированных асбестом и 10 индуцированных эрионитом Ш. Используя метода сиквенирования и рестриктного анализа, мы не выявили точечных мутаций ни в клеточных линиях, которые практически представляют собой моноклон, ни в первичных опухолях с различным гистологическим строением,, индуцированных как эрионитом, ' так и асбестом. Ыы полагаем,-что отсутствие мутаций не является следствием ограниченного выбора образцов, а свидетельствует о том, что активирующие газ мутации Е 12 и 61 кодонах не являются характерными для мезотелиом крыс.

Совокупные данные анализа генов wt-1, nf-s, р53 и ras представлены в таблице I. В ходе проведенного исследования мы обнаружили гиперметилирование гена wt-1 во всех изученных образцах' мезотелиом. Это, на наш взгляд, наиболее характерная особенность, этого гена з МК, т.к. гагаркетилирование было отмечено лишь в. 2

г* п ;т с. a v т*1э ЪО тдг»г» псптгтотллгг nrnrlmmaf* Utxvúur\& ТГоихтт ггтт^оп^ТЧГп«

V.tj *. U|№ uu WiijAUKjUi. . ^UiUUÍA .A.» A i J ,

свидетельствующих о ро.пи пшерметилирования как возможного

Таблица I. Результаты исследования генов (¿t-1,A/F-2fp53 Ha-ras,Kt-№* мезотелиомах крга.

1ot-i A/F-2 pS3

образцы. I мезотелиом защищенный сайт EcoRI различия Ира a /lisp/ структурные изменения ЗЗСРсиквено экспрессия \т-рсю «EtS мутации гена иммунореактивность к мутантным антителам мутации Иа-гаг KI-kw кодон кодон 12 61 12 61

•II 45 2

II 14°

III 2 ■ ME 10

Т 08 о

Т 10°

МКХ 50 МКХ 51

МКХ 64 МКХ 68 МКХ 69 МКХ 70 МКХ 72 МКХ 81

МКЭ 15. МКЭ 18® МКЭ 20 МКЭ 21 МКЭ 22 МКЭ 23„ МКЭ 24е МКЭ 27с МКЭ 31с МКЭ 33 МКЭ 40„ МКЭ 41е МКЭ 42 МКЭ 44 МКЭ 46

+ + + +

+ + + + + + + + +

+

+ + + + + + + + + + + + + + +

+ + + +

■ь

+

+ + + + + + + + + +

JS "х

- исследована воя кодирующая последовательность с - 12 и 61 кодоны исследованы методом сиквенарования

механизма изменения структуры или функций генов при индуцированном волокнистыми минералами канцерогенезе мы не обнаружили.

Альтернативный сплайсинг рассматривается в качестве одного иа механизмов тонкой регулировки деятельности белков оеМейства радиксин-моэзин, к которому принадлежит белок мерлин, кодируемый геном №-2. Выявленное нами в Ж, но не, в нормальном мезотелии присутствие пропорциональных количеств двух РНКнизоформ гена НР-2 может изменять регуляцию, осуществляемую мерянном. Не исключено, однако, что присутствие двух изоформ в МК является указанием на существование уже измененного цитоскэлета клеток мезотелиомы и не играет причинной роли в неопластической трансформации, так как в тканях лв1'ких и почек мы также обнаружили две РНК-изоформы.

Применяя различные метода анализа , мы не наши изменений структуры гена да-2 в исследованных образцах мезотелиом. Это свидетельствует о том, что для модельных МК, в отличие от И, структурные повреждения этого гена не характерны.

Используя метода сиквэнироваяия и иммуногистохимии, мы изучили 21 образец мезотелиомы крыс (15 индуцированных эрионитом опухолей и 6 клеточных линий). Мы не обнаружили ни мутаций в гене-супрессоре р53, ни полиморфизма белка рБЗ. Отсутствие структурных изменений в гене р53 и его продукте свидетельствует о том, что нарушения структуры не является механизмом инактивации рБЗьЫКЭто заключение согласуется с результатами исследований, которые показали, что структурные изменения гена р53 не характерны для мезотелиом человека.

Поиск точечных мутаций в "критических колонах" протоонкогенов На- и К1-газ был проЕеден в 26 образцах МК. Полученные данные согласуются с результатами тестирования К1-газ в кезотелиомзх

человека и свидетельствуют о том, что мутационная активация гае не является необходимым для генеза мезотелиомы событием.

Таким образом, полученные в результате проведенной работы данные и известные из литературы данные о редких мутациях в генах тирозин-киназы, р53, утЬ--:, к1-гав отражают, видимо, тот факт, что ПВМ не индуцируют генных мутаций при трансформации мезотелия, что является свидетельством эпигенетического механизма канцерогенеза, индуцированного волокнистыми минералами. Обнаруженное з мезотелиомах крыс характерное гиперметилирование гена также указывает на то, что для этого евды канцерогенеза причинными могут быть' функциональные, а не структурные изменения генов. Не исключено, однако, что минеральные волокна индуцируют мутации в иных, некели исследованные, генвх. В совокупности с имеющимися в литературе данными, полученные результаты свидетельствуют, что в некоторых случаях (ген от-г) структурные изменения генов а мезотелиоме могут быть Еидоспецифическими. Эти -данные важны, поскольку они указывают на то, что в индуцированных ПВМ модельных мезотелиомах и МЧ на молекулярном уровне могут существовать различия механизмов повреадения генов.

Вывода

1. Впервые показано, что ' ген-супрессор опухоли Вильмс гиперметилирован в модельных мезотелиомах крыс.

2. Вперше обнаружено, что в мезотелиомах крыс в области интрона гена-супрессора wt-1 существует не шеющий истинной мутации, н недоступный для дейстшя рестриктазы Eco R. I сайт. Показано, что клетках линии мезотелиомы крыс II 45 причиной залдаденност 1штронного Eco ri сайта является модификация, также вследстви метилирования, дезоксицитозина, входящего в этот сайт.

3. Установлено отсутствие структурных изменений гена-супрессор нейрофиброматоза 2, повреждения которого характерны дл

.мезотелиом человека, во всех исследованных образцах мезотелио крыс, включавших 6 клеточных . линий и 10 шздуцированных • хризотил-асбестом опухолей.

'4. Впервые обнаружено, что ген-супрессор нейрофиброматоза 2 имое две РНК-изоформы в пропорциональных количествах в мезотелиома: крыс, в отличие, от нормального мезотелкя, где доминирует одн РНК-изоформа.

5. Показано, что мутации в кодирующей последовательности гена р5 и активирующие протоонкогены На-гав и Ki-ras мутации в 12 и 6 кодонах не характерны для индуцированных природными волокнистым минералами мезотелиом крыс.

6.Впервые расшифрованы кодирующая нуклеотидаая последоветельност: размером 1762 пары оснований, гена ÎC-2 крысы, нуклеотидны последовательности встзеки, создающей изоформу II гена nf-г крысы

гена wt-1 крысы. Впервы!

интрона 2 и выборочных участков интрона I

nrrpû тта паи 7'

VAl^^fitlrallt^n Al

тканях крысы

определен характер спдайсиягз кзоформ гена к?-2 в нормальны:

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

I. Клейменова Е.В., Хоресовский Г., Васильева Л. А., кубоЕская М.Г., Палев Л.Н.. Протоонкогены с-мус, На- и И- газ в кспериментэльной мезотелиоме крыс. // Бюл.эксперим. биол. и мед., 995 - т.11 -18-21.

2.. Kleimenova Е., Yuan X., Everltt J.,* Walker С.Protection of IcoEI site lokated In the lntron 1 of wt-1 gene through lethalatlon. // In: 48 International Symposium on Fundamental !aneer Rasearch "Genetic Mechanisms of Cancer", Houston, USA, Lbstracts, - 1995,- p. 64.

3. Пылев JI.H. .Стэдникова H.M..Клейменова E.B., Гранкина Е.П., (ибисоЕЗ M.A.. Состав асбестовой шля и канцерогенез у крыс. // Зестник ОНЦ РАМН -1994- 4- с.14-17.

4. Клейменова Е.В., Васильева Л.А., Якубовская М.Г., Пылев /1.Н. .Протоонкогены с-мус и К1- газ в мезотелиомах крыс. //Тез. докл. на научной конференции "30 лат ЦНИЛ Уральского мед. инст.", Екатеринбург, Россия, 1994, с. 149-150.

5. Pylev. L.N.,. Stadnlkova. N.M., Kletoenova E.V.. Role of asbestos dust regime injection for carcinogenesis. In: MEDICHEM, Poland. Abstracts, 1991, p. 34.-