Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Ускоренные редуктазные методы определения общей бактериальной обсемененности и ингибирующих веществ в молоке

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО ¡СРЛСНОГО ЗНАШШ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ ЛКАДООШ ИМЕНИ В. И. ЛЕНИНА

ВСЕООЮ2ШЯ ОРДЕНА ДРУЖШ НАРОДОВ НАУЧНО-ИССЛВДЭВАТЕПШМ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ САНИТАРИИ

На правах рукописи

ТШШ Анатолий Иванович УДК 619:637.127:578.807

УСКОРЕННЫЕ РЕЩУКТАЗШ МЕГТОДИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОЩЕй БАКЕЕРИАЛЫЮЙ ОБШЕНШЮСТИ И ИНШ-ЕИЕУЩИХ ВЕЩЕСТВ В. МОЛОКЕ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология, и иммунология

А в т ореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1990

«

Работа выполнена во Всесоюзном ордена Дружбы народов научно-исследовательской институте ветеринарюй санитарии.

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор В.М.Карташова; доктор ветеринарных наук Н.К.Оксамитный

Официальные опдоненты: Заслуженный деятель науки РСФСР, доктор сельскохозяйственных наук, профессор Н.В.Барабанщиков (ТСХА); кандидат ветеринарных наук Л.С.ГУсева (ВНИШС)

Ведущая организация - Иосковская ордена Трудового Красного Знамени ветеринария академия им. К.И.Скрябина

Защита состоится • 1990 года в^ ча-

сов на заседании специализированного Ученого совета Д.120.45.01 при Всеоовзном ордена Дргуяби народов научно-исследовательском институте ветеринаркой санитарии (123022, Москва^ Звенигородское косое, б).

С диссертацией можно • ознакомиться в библиотеке ШКИВС

Автореферат разослдн н ¿-е 1990 г.

Ученый секретарь специализированного Ученого

совета, кандидат биологических наук Л.П.Пименова

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА PAEOTU

Актуальность теш. В "Основных направлениях экономического и социального развития на 1986-1990 годы и на период до 2000 г." указывается на необходимость увеличения производства продуктов . животноводства с тем, чтобы обеспечить потребности населения. Рост количества потребляемого молока на душу населения можно рассматривать как один из факторов роста благосостояния народа. К 1990 году предусмотрено довести производство молока.в нашей стране до IG6-II0 млн. тонн. . • "

Наряду с увеличением валового производства молока имеет важное значение и повышение eco санитарно-гигиенического качества, для характеристики которого используют бактериальную обсеме-ненность молока, содержание в кем некоторых патогенных микроорганизмов, сощтических клеток, примеси молока от коров, больных маститом, а также температуру, кислотность, степень чистоты, наличие посторонних веществ (И.й. Архангельский, В.М.Карт&шоза, 1966; Д» 1976; H;B.Éaipatoj4HKOB¿'. ко, 1980;' В.М.Карташова,, 1960; К;. К.^с^л-.й-и ,1951);

Основными показателями санитарно-гигиенического состояний молока являются общая бактериальная-обсемененность и нйлйчие ингибируюцих веществ в нем. По этим показателя).! главным образом ■ определяют качество молока при его сдаче-Приемке.! Поэтому быстрое й достоверное определение общей бактериальной обсемененности и наличия ингибиторов в яабораторно-пройзводственных условиях является актуальным. Успешное решение указанной задачи нбвозмож-

Но без применения простых, быстрых и чувствительных методов

• * •

контроля. Из всего арсенала "Вуществугацих методов самыми быстрыми, цростымн, доступными и наиболее рамфоотранейными фи сда-: '. че-Нриемке молока являются редуЮТазные'пробы, в основе которых '

использована биохимическая активность микроорганизмов.

Однако применяемые в нашей стране редуктазные методы с метиленовым голубым и резазурином не полностью отвечают современным требованиям. Метод определения общей бактериальной об-семененности с.мотиленовым голубым достаточно длителен и данный индикатор в нашей стране не выпускается. Проба с резазури-ном часто дает необъективные результаты из-за нестабильности выпускаемого ¡препарата по оптической плотности, неспецифичности реакции и широкой цветовой гаммы при восстановлении индикатора.

В связи с этим большую значимость приобретает разработка быстрого и надежного по своей специфичности и чувствительности метода определения микробных редуктаз сборного молока, с применением новых окислительно-восстановительных индикаторов.

Вопросы группового'состава микрофлоры сборного молока, поступающего на молокоперерабативащив предприятия, биохимической активности отдельных видов микроорганизмов, их окислительно-восстановительного потенциала недостаточно освещены в литературе. Поэтому изучение биохимических свойств микроорганизмов сборного.молока имеет вашое научное и практическое значение.

Показатель общей бактериальной обсемененности молока тесно связан с наличием ингибируицих веществ в нем. Попавшие в мо; локо ингибиторы искажает достоверность редуктазпых проб, так как они задерживают рост и развитие микрофлоры молока (Н.И.Маш-кин и соавт., 1977; . В.М.Карташова, А.С.Гусева, Л.Д.Демидова, 1983; В.П.Шидловская, 1985; В.И.Хоменко, 1985).

Поскольку на молочных предприятиях при приемке закупаемого молока, как правило, общая бактериальная обсемененность определяется одновременно с выявлением ингибиторов, мы также

:поставили перед собой задачу изучить возможность разработки болев быстрого и чувствительного метода определения шгибирунцих веществ в молоке с применением новых окислительно-восстановительных индикаторов. •

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлась разработка ускоренных редуктазных методов определения общей бактериальной обсемененности и ингибирувдих веществ в сборном молоке, изучен..а механизма редукции индикаторов микрофлоро{ молока.

В связи с этим на разрешение были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительное изучение существуицих методов определения общей бактериальной обсемененности молока.

2. Разработать ускоренный редуктаэный метод определения общей бактериальной обсемененности молока. ,

• 3. Изучить биохимическую активность и'редуцирующие сбойст ва наиболее часто встречающихся микроорганизмов, ведёленных из сырого молока.

4. Разработать новый ускоренный микробиологический метод определения ингибиторов в молоке.

' 5. Ведать методические указания по определению общей бак териальной обсемененности молока и ингибируицих веществ.. , Научная новизна. Разработан ускоренный редуктазный метод тетразолиевым синим для определения общей бактериальной обсеме ненности сборного молока, позволяющий за короткое время и .объективно (по двум цветам) определить класс молока. Метод признан изобретением и защищен авторским свидетельством № 1306322 от 22.12.1986 г.

. ' Впервые в стране изучен механизм взаимодействия между ра: 'личными группами микроорганизмов молока, их биохимической ак-

тивностыэ, онислителыю-восстановительным потенциалом и редук- " цией некоторых индикаторинх красителей.

Разработан новый ускоренный редуктазный метод определения ингибирующих веществ в молоке с тетразолиевым синим, обладающий высокой чувствительностью, объективностью и простотой исполнения. Метод признан изобретением и защищен авторским свидетельством 1,5 1493949 от 15.03.1989 г.

Практическая ценность. Использование предлагаемых ускорен-ньк редуктазных методов определения общей бактериальной обсеме-ненности и ингибирующих веществ в молоке позволит своевременно и с высокой точностью определять санитарно-гигиеническое качество заготовляемого молока.

Данине методы вошли в следующие нормативное документа: "Временные методические указания по определении общей бактериальной сбсемекенности" сборного молока, ускорении* методом с тетразолиевым синим", утгверзденнке .Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР 16.II. 1988 г.-,. "Методические рекомендации по получению высококачественного молока на фермах и промышленных комплексах", утверждеачые Главным управлением ветеринарии Госагропрома УССР 30.05.1989- г., "Мйтодические указания по определению ингибирукцих- веществ б. молоке с' терлофилышм стрептококком и тетразолиевьм синим",.утвержденные Государствен-ней комиссией Совета Мишстроз ' СССР по продовольствию п закупкам'23.10.1989 г.. ■

Апробация работы, ь'лтериалы диссертации были долокены на:

- заседашга Президиума Центрального агропромышленного научно-технического общества (Москва, 1989);

- Всесоюзной конференции'молодых ученых и специалистов (Рига, 1990);

- Всесоюзном координационном совещании по зоогигиене

- б -

(Львов, 1990).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы (тезисы докладов). Получено два авторских свидетельства (в соавторстве.) на способ определения бактериальной обсемененности молока (A.c. I? 1306322) и на способ определения ингибируыцих веществ в молоке (A.c. № 1493949).

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, списка использованной литературы, включающей 311 источников, в том числе 176 иностранных. Работа изложена на 178 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы, II рисунков, 5 фотографий.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал и методы исследования. Работу проводили на молочных заводах Киевской (Киевские № I и № 2, Броварский) и Московской (Мытищинский, Подольский) областей, а также хозяйствах- совхозе "Совки" Киево-Святошинского района Киевской области и колхозе "Большевик" Домодедовского района Московской области.

Комплексные лабораторные исследования при выделении культур микроорганизмов, изучении их биохимических свойств, разработке методов индикации бактериальной загрязненности и наличия ингибирурцих веществ проводили в лаборатории санитарии молока и профилактики мастита Всесоюзного научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, отделе ветсанэкспертизы Украинского . научно-исследовательского ветеринарного института, Институте микробиологии и вирусологий АН УССР.

При разработке редуктазного метода определения общей бактериальной обсемененности проводили сравнительное испытание метод oiß, применяемых;в нашей стране и за рубежом: редуктазных -

С резазурином (ГОСТ 9225-64), метиленовш голубым (ГОСТ 922584), трифенил-'тетразолиум хлористым (США) и инструментального -•биокалориметрического (ГОСТ 27930-88). В качестве контрольного служил метод посева в чашки Петри (ГОСТ 9225-84).

Разработку ускоренного редуктазного метода определения общей бактериальной обсемененности молока вели на основе наиболее подходящего для этих целей метода - с метиленовш голубым (ГОСТ 9225-84) с испытанием в дальнейшем новых окислительно-вос-становительних индикаторов. Разработанный метод с тетразолиевым синим был испытан в сравнительных исследованиях на 138 пробах сборного молока.

Для выяснения механизма редукции некоторых индикаторных красителей основными. группами микроорганизмов молока проводили изучение группового состава микрофлоры. На селективных средах было ввделено 8 основных груш микроорганизмов - молочнокислые стрептококки (кокки), бактерии -группы кишечной палочки (БГКП), энтерококки, микрококки, стафилококки,' коринебактерии, псевдз-монады, дрозкжи.

Определение'биохимической активности выделенных групп микроорганизмов проводили по их способности утилизировать лактозу и восстанавливать 0,1 %-иый раствор метиленового голубого ("метиленовое .молоко"). Были установлены минимальные значения окислительно-восстановительного'потенциала каждой из выделенных культур микроорганизмов. Непосредственное влияние различных микроорганизмов на восстановление испытуемых индикаторных 1сра-сок определяли экспериментально на пробах стерильного сборного молока.

Разработку ускоренного редуктазного метода определения ингибирутацих веществ в молоке пели в направлении повышения чувствительности метода и. сокращения времени реакции. Исследова-

ния проводили с молоком, в которое искусственно вносили антибиотики и некоторые ингибирующие зещества в различных концентрациях.

Для изучения пригодности .разработанного редуктазпого метода определения ингибирующих веществ в молоке было проведено его сравнительное испытание с общепринятыми гостированнши методами с метиленовым голубым и резаэурином (ГОСТ 23454-79). Параллельные исследования проводили на 168 пробах сборного молока, поступающего на молочные заиоды из Киевской и Московской .областей.

Всего при разработке ускоренных редуктазных методов определения общей бактериальной обсемененности и наличия ингибиторов было использовано и исследовано 1224 пробы сборного молока иороо.

Статистическая обработка результатов исследований проведена по методике Н.В.Садовского (1975). Коэффициент.корреляции расчитывали по стандартной методике (Н.А.Плохинский, 1969; В.И.Дьяконов, 1986). Расчеты проводили с использованием программируемого микрокалькулятора МК-52 по алгоритму, предложенному С. А. Андреевым '( 1989 ) .

• РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка ускоренного редуктазного метода определения общей бактериальной обсемененности молока. Перед нами была поставлена задаЧа - разработать ускоренный редуктазный метод опре деления;общей бактериальной обсемененности молока, обладающий

высокой специфичностью, объективностью и скоростью получения

* ■

результатов. С этой целью нами было проведено сравнительное изучение существующих редуктазных методов определения бактериальной контаминации молока, а также недавно разработанного

в нашей стране био1салоршетрического метода. Проведенные опыты показали, что наиболее приемлемым из редуктазных методов для определения общей бактериальной обссмененности молока является метод с метила ювым голубил, который показал лучшие результаты с контрольным чашечным методом по совпздаемости классов - ЕЛ'% и коэффициенту корреляции 0,715. Метод с резазурином хотя и.показал более высокие результаты по некоторым классам (I и Ш), но слабее коррелировал с контролем ( % = 0,644) и имел совпа-даемость по всем классам только 58 %.

В связи с тем, что метод с метиленовым голубым является длительным и так как выпуск данного индикатора в нашей стране прекращен, дальнейшие наш: исследования были направлены на испытание различных окислительно-восстановительных индикаторов с • целью разработки ускоренного редуктазного метода определения бактериальной обсемененности молока. Нами были испытаны: о-хлор-индофенолят натрия, натрий-2,6-диброминдофенолят, тетра-золиевый синий, штротетразолиевый синий, натрий-2,6-дихлориндо-феноляг, индигокармин, лакмоид. Наиболее подходящим для достижения поставленной цели оказался тетразолиевый синий. •

Вначале была отработана оптимальная" концентрация индикатора. Критерием служила скорость получения.результатов редуктаз-ной реакции.Минимальное значение времени проявления окрашивания молока в серо-сгашй цвет отйечено при использовании тетра-золиевого синего в 0,001 $-ной концентрации.

Для ускорения. протекания редуктазной реакции и получения более четкой и нагдядной окраски молока.при восстановлении индикатора испытали различные активаторы роста микроорганизмов -глюкозу, пептон, сукцикат натрия. Добавление раствора пептона в 0,3-0,5^-ной концентрации сокращало продолжительность редуктазной реакции в среднем на 5-10 минут. При этил окраска

воестановленного индикатора была более отчетливой.

Таким образом,были определены оптимальные количества в ■ молоке индикатора (тетразолиевого синего) - 0,001 % и активатора роста микроорганизмов (пептона) - 0,4 % для разработки редуктазной реакции определения общей бактериальной обсеменен-" ности молока. Соотношение индикаторно-активаторной смеси и исследуемого молока составило 1:10.

Следующей этап нашей работы заключался в отработке контрольных значений интервалов времени учета редуктазной реакции с целью определения классности молока. Для этого мы отбирали пробы молока и исследовали их классическим редуктазным мето-.•; дом с метиленовым голубым (ГОСТ 9225-84), а'также производили .'..посев на чашки Петри для определения количества микроорганиз-.. мов в данных пробах. Эти два метода служили в качестве контро-,ля. Параллельно отбирали по 10 см3 каждой пробы и добавляли : I см3 0,01 % тетразолиевого синего, приготовленного на 4^-ном

растворе пептона. После установления температуры пробы молока 37-38 °С, мы через каждые 5 минут в течение 2 часов вели наблюдения за изменением цвета молока. Появление хорошо видимого серо-синего (синего) окрашивания исследуемой пробы молока считалось положительной реакцией. При этом регистрировали, время изменения цвета индикатора и определяли количество микроорганизмов в пробах.

Данные по количеству бактерий сравнивали с аналогичными параметрами ГОСТов 9225-84 и 13264-88. Результаты представлены в таблице I.

. ' ' Таблица I

Данные среднего значения времени цроявления редук-тазной реакции с тетразолиевым синим относительно общего количества микроорганизмов

Класс молока cor- '.Допустимое !Фактическое ко- ¡Время прояв-ласно ГОСТ 9225-84¡количество бак-!лкчество бакте- ¡л'ения (мкн.) и ГОСТ 13264-88 !терий в I см3 !рий в I см3 мо- !серо-синего ¡согласно ГОСТ ¡лога ¡окрашивания ¡9225-84 и ! (млн) ¡по пробе с ¡ГОСТ 13264-88 ! (м + ,л ^ ¡тетразолие-i (гллн) ! 41 ' ¡вым синим _ ! _!__I Ш Г m )

Высший сорт(В/С) До 0,3 0,170±0,0184 102,4*3,10

I От 0,3 до 0,5 0,386*0,0138 87,1±2 02

П От 0,5 до 4'0 .I,919*0,1147 58 3±1 75

Ш От 4 0 до 20,0 7!885=Ю'4660 18,54,34

1У__Более 20.0 32.019±3.8700 6,3^0,89

. Из таблицы I видно, что полученные количества микроорганизмов входят в общепринятые пределы, которые расчитаны для существующих редуктазных методов (ГОСТ 9225-84 и ГОСТ 13264-88).

На основании данных таблицы I составлена табл. 2, позволяющая проводить оценку бактериального качества молока;

Таблица 2

Оценка бактериального качества сборного молока по редуктазному методу с тетразолиевым синим

Класс ! Оценка качества' • ! молока ! ! ! Время проявления ¡Допустимое ко! серо-синего ок- ¡личество бакте-I рашивания (мин) 1рий в I см3 мо! 1лока (млн)

В/С I п ш 1У Очень хорошее •Хорошее Удовлетворительное Плохое Очень плохое Более 90,0 От 60,0 до 90,0 От 20.0 до 60,0 От 5,0 до 20,0 До 5 0 ■ До 0,3 От 0 3 до 0,5 От 0 5 до 4'0 От 4,0 до 20,0 Более 20.0

Таким образом разработанный редуктазный метод с тетразолиевым синим позволяет наравне с розазуриновым методом определять молоко первого класса в течение I часа, при этом учитывается только два цвета - белый и синий, что упрощает учет ре-

зультатов и позволяет получить более объективные данные, тогда как при использовании .резазуриновой пробы отмечаются переходные цвета и оттенки, затрудняющие правильный учет реакции. При помощи разработанного метода можно также определять бактериальное качество исследуемого молот высшего сорта в течение 1,5 часа.

Для изучения пригодности разработанного метода при определении общей бактериальной обсемененности молока провели сравнительные испытания его с другими редуктазнкми пробили. Контролем служил чашечный метод по ГОСТ 9225-84. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Распределение проб молока по классам при сравнительных испытаниях различных редуктазных методов

Методы исследований! Кол-во ■! • Классы молока ■ ___

с: ■ !исслед. ! й !й ЕГ~*ТУ

!прсб ! 1 | П. ! I .

!М0Л0Ка }Кол—| „ |Кол—1 ^ 'Кол-' {Кол-} - |во \ % во % во. \ % во \ %

| ¡проб] |Проб| |Проб| ¡проб)

Метиленовым голубым (ГОСТ 9225-84) 138 , 57 .41,3 41 29,7 29 21,0 II 8,0

Резаэурином (ГОСТ 9225-64) 138 35 25,4- 48 34,8 ' 34 24,6 21 "15,2

Тетразолиевым синим (предлагаемый) 138 - 66 40,5 45 32,6 25 18,1 II . 8,0 .

Посев на'чашки Петри (ГОСТ 9225-84) (контроль) 138 29 21,0 74 53,6 27 19,6 8 5,8

Из таблицы 3 видно", что наиболее близкими результатами к контрольному, методу обладают: по первому классу - резазуриновая проба; по второму - резазуриновая проба и метод с тетразолиевым синим; по.третьему и четвертому классам - пробы с тетразолиевым синим и метиленовым голубым. Полученные, результаты свидетельствуют об отсутствии полной совпадаемости между редуктазныш и

контрольным методом по отдельным классам. Совпадаемость по всем классам между пробой с метиленовым голубым и посевом на модифицированный ША отмечалась в В8 цробах из 138 ( 63,8 %); между резазуриковым и контрольным чашечным методом в 80 пробах, или 58,0 %. Наивысший процент совпадаомости с контролем отмечен у метода с тетразолиевш синим - 67,4'%, что соответствует 93 исследуемым. пробам молока.

При расчете коэффициента корреляции установлено, что все три редуктазньк глет ода обладают высокой корреляционной связью с контрольным чашечным методом. Однако наиболее тесная связь отмечена у методов с тетразолиевш синим и метиленовым голубым ■

t = 0,803 и г = 0,798 соответственно. Несколько ниже значение этого показателя установлено для метода с резазурином >с = 0,777.

Корреляция между предлагаемым и тестированными редуктазными методами составила: для тетразолиевого синего и метиленового голубого- . - 0,899, а для тетразолиевого синего и резазурина

{г = 0,859. Все засчитанные количественные зависимости для дан-■ных исследований статистически достоверны с уровнем доверительной вероятности более 0,999, ,

Анализируя полученные данные,можно сделать вьтод о том, что метод с тетразолиевым синим не уступает общепринятым редук-тазным методам с метиленовым голубым и резазурином, а высокая корреляционная связь разработанного метода с общим количеством " микроорганизмов по чашечному методу ( ^ = 0,8) указывает на пригодность применения дащюго метода в широкой лабораторной практике. Преимуществом метода с тетразолиевым синим по сравнению с резазурином является то, что предлагаемый индикатор образует при восстановлении только один цвет - синий, тогда как резазуринат натрия дает целый год переходных цветов и оттенков, что сущест-

1венно затрудняет объективный учет реакции и отрицательно сказывается на получении достоверных результатов при исследовании проб молока во время сдачи-приемки.

В связи с тем, что нами была разработана методика, где в качестве индикатора окислительно-восстановительных ферментов микрофлоры молока впервые применен тетразолиевый синий, следующий этап нашей работы состоял в изучении механизма редукции индикаторов при определении общей бактериальной обсемененности молота. Для этого в первую очередь необходимо было изучить групповой состав микрофлоры путем выделения чистых культур.микроорга- ' низмов с целью дальнейшего исследования их биохимических свойств.

Изучение группового состава микроорганизмов сборного молока коров. Для изучения группового состава и получения чистых культур микроорганизмов сборного молока, поступающего на молоко-перерабатьтающйе. предприятия, проводили культивирование проб на - ' селективных питательных средах с последующей микроскопией мазков выделенных культур. Полученные результаты свидетельствовали о том, что количество вьщеленных мезофильных и психрофильных мик-' роорганизмов находится в соотношении 3:1. Около половины (48,77 % зеей психрофильной микрофлоры составляли псевдомонады. Из мезофильных микроорганизмов больше «всего выявлено молочнокислых кокков - 54,69 % и бактерий группы кишечной палочки -' 12,49 %. Остальные. из вьщеленных груш составили: кордаебактерии - 5,13 %, дрожжи - 2,26 %, микрококки - 2,15 %, стафилококки.- 1,89 % и энтерококки - 0.70 %.

Таким образом, мшфофлора сборного молока коров, полученного в традиционных условиях и прошедшего все этапы первичной обработки, в основном представлена мезофильными микроорганизмами, среди которых большинство составляют молочнокислые кокки и бакте рии группы кипечной палочки (65-70 %).

Изучение -биохимической активиооти некоторых групп микроорганизмов. выделенных из сырого сборного молока. Из данных литературы известно, что редуктазные реакции в молоке во многом зависят от биохимической активности микроорганизмов. Изучение данного показателя проводили по двум тестам: способности ввделш-ных культур микроорганизмов к утилизации лактозы и восстановлению 0,1 %"метиленового молока" то есть тех биохимических реакций, которые непосредственно характеризуют окислительно-восстановительные процессы, в молоке. |

В результате проведенных исследований установлено, что эн- ' терококки, бактерии группы кишечной палочки и молочнокислые кокки по двум тестам имели положительную реакцию, что указывает на высокую их биохимическую активность. Стафилококки, коринебакте-рии и микрококки сбраживали лактозу, но не восстанавливали 0,1 % "метиленовое молоко". Псевдомонады; и дрожжи по двум реакциям показали отрицательные результаты.

Таким образом, выделенные группы микроорганизмов имеют различную биохимическую активность: - высокую - бактерии группы кишечной палочки, энтерококки и молочнокислые кокки; низкую - кори-небактерии, микрококки и стафилококки. Биохимически пассивными по данным тестам .оказались псевдомонады и дрожжи.

Изучение влияния микроорганизмов на снижение редокс-потен-циала молока и восстановление отдельных окислительно-восстановительных индикаторов. Восстановление индикаторов в редуктазных реакциях происходит в результате изменения окислитёльно-восстано-вительйого потенциала ( ОВИ, ЁЬ ).который обуславливается биохимической деятельностью микроорганизмов молока. Поэтому при изучении механизма редукции красителей важно знать, как изменяется окислительно-восстановительный потенциал молока под воздействием той Ш* иной, группы микроорганизмов. Помимо изменения ЕЬ микро- ..

организмами также изменяется и рН среды, на что реагируют некоторые окислительно-восстановительные индикаторы, в частности, резазурин. Исходя из этого, необходимо .было провести одновременное изучение динамики изменения этих двух показателей. Полученные результаты в виде'максимальных и минимальных значений ЕЬ и рН, а также их амплитуд представлены в табл. 4.

Таблица 4

Данные ЕЬ и рН некоторых культур микроорганизмов молока

Культуры !ЕЬ ,мВ!ЕЬ ,мВ!ДЕЬ,мВ! pIL, ! plL !Др}1

микроорганизмов ! ! I • I "' f 1

Энтерококки +300 -200 500 6,30 5,65 0,45

ВГКП +335 . -325 660 6,22' 5,92 0,30

Молочнокислые кокки +290 -170 . i 460 6,25 5,95 0,30

Микрококки • +270 +170 100 6,20 6,05 0,15

Стафилококки ■ +270 +105 • 165 6,20 6*05 0,15

Коринебактерии' +270 +135 135 6,22 6,10 0,12

Псевдомонады +285 +110 175 6,25 6,15 . 0,10

Дрожжи . +280 +140 140 , 6,30 6,20 0,10

Примечание: Eh - исходный показатель; Eh к> - конечный показатель; й - амплитуда (разница между' исходным и конечным). ■■'''■

Из таблицы 4.видно, что все исследованные культуры микроорганизмов по полученным показателям амплитуд Eh и рН можно.условно разделить на две подгруппы. Первая - энтерококки, БГКП и мо-'лочнокислыо кокки имеют амплитуду изменения ОВП - 500; 660 и 460 ыВ соответственно. Это биохимически активные микроорганизмы, которые, по всей вероятности, и играют основную роль в редукции • ртндикятпрпп. Вторая — микрококки,.стафилококки, Коринебактерии, псевдомонады и дрожки показали значительно меньшие значения амплитуд ОВП - ICO; 165; 135; 175; 140 мВ соответственно. Данные

микроорганизмы, вероятно, имеют меньшее влияние на восстановле-~ ние красок. Аналогичные результаты наблюдали и для показателей pH. Энтерококки, БГКП и молочнокислые кокки имели амплитуду изменения pH в два и более раза выше, чем у остальных групп микроорганизмов, Это указывает на прямую зависимость между показателями ЕЬ и pH.

Таким образом, мокно заключить, что исследованные культуры микроорганизмов по разному влияют на изменение ОВП молока, а, следовательно, и неодинаково восстанавливают индикаторы. Максимально изменяют показатель Eh-БГКП, энтерококки, молочнокислые кокки. Каждая исследованная культура микроорганизмов в данной 'среде (стерильное молоко) показала определенное минимальное значение ОВП, которое составило для БГКП —325 мВ; энтерококков --200 мВ; молочнокислых кокков —170 мВ; микрококков - +170 мВ; стафилококков - +105 мВ; коринебактерий - +135 мВ; псевдомонад - +110 мВ; дрожжей - +140 мВ.

Для определения воздействия вьщеленных групп микроорганиэ- . мов молока на различные индикаторы мы провели сравнительные ис-•следования методов.с метиленовым голубым и реэазурином, по ГОСТ 9225-84 и предлагаемого метода с тетразолиевым синим. В пробы стерильного.молока с ОВП - +270 - +350 мВ вносили бульонные культуры микроорганизмов из расчета 0,3-0,7 млн/см3; 4-10 млн/см3 и более 20 млн/см3 в пробах молока. Учет результатов реакции проводили согласно соответствующим методикам.' Каждым методом было исследовано 8 культур с вйййуказшшыми концентрациями микроорганизмов в 10-кратной повтйрШзти (всего 720.проб).

В результате проведенных иссйёДбёаний было установлено, что БГКП, молочнокислые кокки и MiTéptíkóHrilt по всем трем метода».!, по. классам . бактериальной контаминаДйй 'Ь'бказали близкие результаты: для метиленового'голубого I кл. - 29 проб, П.кл. - 19, Ш кл. -

42; для резазурина I кл. - 29 проб, П кл. - 16, Ш кл. - 45; для тетразолиевого сшего I кл. - 30 проб, П кл. - 17, Ш кл. - 43. Полученные результаты можно объяснить выроним значением Е/| данных культур, проявляемого в молоке при их развитии. Распределение проб молока по классам для микрококков, стафилококков, кори-небактерий, псевдомонад и дрожжей исследуемыми методами было иным. Так, для метиленового голубого I кл. - 126 проб, П кл. -9, Ш кл. - 5; для резазурина I кл. - 66 проб, П кл. - 42, Ш кл. - 32; для тетразолиевого синего I кл. - 117 проб, П кл. - 22, Ш кл. - II, что можно объяснить различной чувствительностью самих индикаторов к низким значениям ОВП данных культур.

Исходя из полученных результатов, все три индикатора обладают высокой чувствительностью к микроорганизмам с высоким показателем ЕЬ - молочнокислым коккам, энтерококкам и ЕГНП. К биохимически малоактивны.! микроорганизмам более высокую чувствительность проявил метод с резазурином (I кл. - 66, П кл. - 42, Ш кл. - 32 пробы), что связано с высоким показателем ОВП и химической структурой индикатора. Эти два показателя обуславливают чувствительность резазурина не только к микроорганизмам с низкой биохимической активностью, но и к неспецифическим факторам молока (наличию СО^,'лейкоцитов, рН-и др.), что в комплексе цриводит к искажению достоверности получаемых результатов.

Таким образом, в механизме редукции индикаторов при определении общей бактериальной обсемененности молока, согласно полученным результатам, основную роль играют биохимически активные микроорганизмы, которые имеют высокий окислительно-восстановительный потенциал. Важное значение имеет также количество бактерий, чувствительность и специфичность к ни редокс-красителей.

Разработка ускоренного тедуктазного метода определения ин-гибирушгпх ьезеств в молоке. На цринципе редуктазной реакции,

помимо определения общей бактериальной обсемененности, также базируются микробиологические методы индикации ингибирующих веществ в молоке. Поэтому перед нами была поставлена задача испытать тетраэолиевий синий в качестве индикатора редуктазных реакций при выявлении ингибиторов в молоке. Работу вели в направлении подбора оптимальной концентрации индикатора, повышении чувствительности и сокращения времени анализа. С этой целыо были испытаны различные концентрации тетразолиевого синего, а тагске активаторы роста тест-культуры - пептон и глюкоза. В результате проведенных экспериментов установлено, что тетразолиевьгй синий в рабочей концентрации 0,01 %, приготовленный на 4 % растворе пептона, при взаимодействии с 0,3 см3 культуры термофильного стрептококка способен в течение 90 минут образовывать хорошо видимое серо-синее (синее) окрашивание пробы молока при отсутствии в ней ингибирующих веществ. При этом была изменена сама методика внесения реагируемых компонентов. Внесение тест-культуры и индикатора- производят раздельно, поочередно, то есть после внесения культуры . Sit. {tn.-Li.^dUut, сразу же добавляют индикаторно-ак-тиваторную смесь, после чего пробу инкубируют.

Учет результатов производят по изменению цвета молока- серо -синяя окраска свидетельствует об отсутствии ингибиторов, белая - наличии.

Для определения чувствительности разработанного метода в долоко, не содержащее ингибирующих веществ, в различных концентрациях вносили пенициллин, стрептомицин, окситетрациклин, формальдегид и перекись водорода. Чувствительность предлагаемого ютода определяли в сравнительных исследованиях с резазуриновым гетодом (ГОСТ 23454-79).

В результате установлено, что метод с тетразолиевым синим юзволяет определить в молоке 0,01 E/I/см3 пенициллина, 2-5 мгг/см3

стрептомицина, 0,5-1,0 мкг/см3 окситетрациклина, 0,001-0,002 %' формальдегида и 0,01 % перекиси водорода. Полученные результаты свидетельствуют о высокой чувствительности разработанного метода к ингибиторш.ь

Для определения пригодности метода с тетразолиевым синим при индикации ингибкруюцих веществ было проведено сравнительное исследование проб сборного молока, поступающего на молочные заводы Московской и Киевской областей, параллельно с тестированными методами с резазуринсм и метиленовым голубым (ШСГ 23454-79). Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Результаты сравнительного исследования проб молока на наличие ингибиторов различными редуктазньми методами

В7\ Методы исследований !■ Иэ положите£|но_

11/11 | ' 1проб ¡Количество}

1.

2. 3.

Из таблицы' видно, что предлагаемый метод с тетразолиевым синим не уступает по чувствительности общепринятым гостированньм методам с резазурином и метиленовым голубым.

Таким образом, разработанный редуктазный метод с .тетразолиевым синим позволяет объективно (по двум цветам) и быстро (в течение 1,5 часа) определить наличие ингибиторов в молоке, что указывает на пригодность данного метода для использования его в . широкой лабораторной практике. __.

С тетразолиевым синим . (предлагаемый)

С^езаз^ином (РОСЛ.'1

С метиленовым голубым ' (ГОСТ 23454-79)

166 40 . 23,8

168 39 ; 23,2

168 • <36 ■ 21 >4

- 21 -

эюномичешя аышивносгь

Внедрение в практику разработанного метода с тетразолиевым синим для определения ингибиррирсс веществ в молоке по сравнению с резазуриновым методом по ГОСТ 23454-79 позволит получить экономический эффект в размера 0,2 руб. на 100 исследуемых проб молока. Внедрение метода также будет иметь важное социальное значение.

вывода

1. Разработан редуктазныД метод определения общей бактериальной обсеменекности молока с тетразолиевымсиним, который имеет существенные прегофоцества по сравнению с тестированными Методами по своей специфичности, информативности и скорости получения результата; он позволяет определить бактериальное качество сборного молока высшего сорта в течение 90 мин, и первого -

60 мин.'.

2. Предлагаемый редуктазныЯ метод в сравнительных исследованиях показал высокую степень корреляции с контрольным чашечным и гостированными редуктазными методами с резазурином и метилено-выи голубил -• £ = 0,803; 0,859 и 0,899 соответственно.

3. Установлено, что 70-75 % микрофлоры сборного молока относится к мезофйльным, а 25-30 % - психрофильным микроорганизмам. Подавлягадёе большинство меэофильных микроорганизмов (6570 %) составляют молочнокислые кокки и БГШ1. Коринсбактерии, дрожжи, микрококки, стафилококки и энтерококки составляют 10-12 % мезофильньх бактерий.

4. Изучение биохгалической активности, окислительно-посстано-вительного потенциала (ОВП, ЕЬ ) микроорганизмов и редукции индикаторов позволило' выяснить механизм взаимодействия магду' данными показателями. При этом установлено, что в.редукции тетразолиевого синего и других исследованных индикаторов основную роль

играют биохимически активные микроорганизмы с высок™ ОВП. - мо- . лочнокислые кокки и БГКП; энтерококки, имеющие также высокое значение Eh , не оказывают существенного.влияния на восстановле-• ние индикаторов в связи с их незначительным количеством в сыром молоке (0,7 %).

5. При изучении динамики Eh и биохимической активности других родов микроорганизмов - стафилококков, псевдомонад, корине-бактерий, дрожжей и микрококков установлено их низкое значение ОВП, чем и объясняется слабое влияние последних на редукцию тет-раэолиевого синего и метиленового голубого. При восстановлении резазурина в молоке под воздействием микроорганизмов с низкой биохимической активностью и уровнем Eh установлена его высокая чувствительность, что в комплексе с неспецифическими факторами цриводит, в ряде случаев, к получений Недостоверных результатов при оценке качества молока..

6. Разработан ускоренный метод определения ингибиругацих веществ в молоке с помощью тетразолиевого синего. Применение данного индикатора.в оптимальной концентрации (0,001 %) и изменение постановки реакции сократило время определения ингибиторов до

I ч 30 мин., повысило.чувствительность и специфичность.реакции.

7. Предложенный ускоренный метод с тётразолиевым синим■ об-. ладает высокой чувствительностью к ряду испытанных антибиотиков и других ингибирущих веществ: 0,01 ВД/см^ пенициллина, 2-5 . мкг/см3 стрептомицина, 0,5-1,0 мкг/см3 окситетрациклина, 0,0010,002 % формальдегида, 0,01 % перекиси водорода.

8. Применение ускоренного метода определения ингибиругацих веществ в молоке при помощи тетразолиевого синего по сравнению с реэазуриновым методом позволит получить расчетный экономический о&Ьект 0,2 руб. на 100 исследуемых проб молока. Предлагаемый

метод имеет вг.лое социально-экономическое значение, так как поз-

волит получить молоко и молочные продукты высокого качества.

пщжшш дяя■ практики

На основании проведенной работы разработали:

1. "Временные методические указания по определению общей бактериальной обсемененности сборного молока ускорошшм методом с тетраэолиевым синим", утвержденные Госагропромом СССР 16 ноября 1988 г.

2. "Методические рекомендации по получению высококачественного молока на фермах и прошшенных комплексах", утвервденные Госагропромом УССР 50 мая 1989 г.

3. • "Методические указания по определению ингибйрующих веществ а молоке о термофмьным стрептококком и тетразолиевым си-тш", утвериденннб 23 октября 1989 г. Государственной комиссией Совета Министров СССР по продовольствию и закупкам. ;

■ 'спиоок опуёпиювлнных работ ю. теме диссертации .

1. Тюти Л.И. .Влияние основных групп микроорганизмов на изменение окислительно-восстановительного потенциала молока /Дез. докл. Всесоюзн. нонф.-£Мга, 1990.-С. .133-134.

2. Карташова. В.М.у.Тютюн Л.Й. Иетода определения ингибирую-Щих веществ в молоке //Гез.докл. Всесоюзн. коорд.совещ.-Львов, 1990.-Ч.1.-С. 8-10. ;

3. Тютюн А.Й. Усовершенствований редуктазнкй метод индикации микрофлор»! в молоке .//Тез.докл. Всесоюзн. совсц.-Львов, 1990.-Ч.1.-С. 10-12.

4. Тютюн' А.И., Оксамитный Н.К. Способ определения бактериальной обсемененности. молока: А.о. № 1306322 (СССР); УкрНИВИ - 22Л2.1986. ' ..Л'л--

5. Тютш А.И., Оксамитный H.K., Дементьева С.А. Способ определения наличия ингибирущкх веществ в молоко. A.c. » 1493949 (СССР){ УкрЛИВИ - 15.03.1989.

h-

JS/S JO» п.я,- Тир. У£>0.

Рогд !,-::v;t jpeora "Оргдорстрой'' Мкнцорсороя УССР