Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Изыскание ускоренного метода определения общей бактериальной обсеменности сырого молока

/

99- К/¿Г

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ САНИТАРИИ , ГИГИЕНЫ И ЭКОЛОГИИ

БАБУНОВА ВЕРОНИКА СЕРГЕЕВНА

ИЗЫСКАНИЕ УСКОРЕННОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ОБСЕМЕНЕННОСТИ СЫРОГО

МОЛОКА.

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научные руководители : Заслуженный деятель науки РФ, профессор, д.в.н. Карташова В.М. В.н.с. лаборатории биоконверсии энергии Химфака МГУ, д.х.н. Бровко Л.Ю.

Москва, 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

I. ВВЕДЕНИЕ 4

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Основные показатели, характеризующие качество сырого молока • (технологические, физико-химические, биологические,

санитарно-гигиенические). 9

2. Факторы, влияющие на качество молока и изменение его бактериального состава в зависимости от общего

состояния организма и молочной железы коров. - 16

3. Современные методы определения общей бактериальной обсемененности (ОБО) сырого молока : 20

3.1. Прямые методы (подсчет КОЕ и бактериальных клеток); 22

3.2. Непрямые (косвенные) методы. 30

4. Биолюминесцентные методы определения

общей бактериальной обсемененности 38

5. Государственные стандарты на качество молока при

сдаче-приемке его на молокоперерабатывающие предприятия. 48

III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Организация опытов и методы проведения исследований 54

2. Сравнительное изучение наиболее распространенных,

ускоренных методов по определению ОБО молока 67

3. Разработка биолюминесцентного метода определения

ОБО сырого сборного молока. 79

3.1 Изыскание метода дифференциальной химической

обработки пробы для устранения небактериального

АТФ при биолюминесцентном методе определения ОБО молока; 79

3.2 Изучение влияние различных ПАВ на целостность бактериальных и соматических клеток с учетом

их количественного содержания; 90

4. Анализ проведенных экспериментальных исследований по разработке ускоренного метода определения ОБО

сырого сборного молока. 93

5. Разработка биолюминесцентного метода с применением фильтрации через бактериальные мембранные фильтры, обеспечивающей его высокую чувствительность и

стабильность при определении ОБО сырого сборного молока. 98 6. Разработка методических рекомендаций по определению ОБО сырого сборного молока, их апробация в полупроизводственных условиях и проведение комиссионных испытаний. 116

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 127

V. ВЫВОДЫ 136

VI. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ 138

VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 139

VIII. ПРИЛОЖЕНИЯ 159

ВВЕДЕНИЕ

Молоко й молочные продукты занимают значительное место в пищевом рационе людей. Они служат основной пищей для детей раннего возраста и входят в состав лечебных диет при многих заболеваниях (42).

Молоко содержит все питательные вещества : полноценные белки, углеводы, минеральные вещества, в том числе микроэлементы, а также витамины, ферменты. Усвояемость питательных веществ молока высокая : белков - 96%, жира - 95%, углеводов - 98%. Молоко стимулирует усвоение питательных веществ из других пищевых продуктов. И.И.Павлов писал : "Между сортами человеческой еды в исключительном положении находится молоко . . . как пища, приготовленная самой природой". Такая высокая оценка академиком И.И.Павловым справедлива лишь к молоку высокого качества, получаемому с соблюдением санитарно-гигиенических правил (45).

Молоко - скоропортящийся продукт, его химические и физические свойства не стабильны и могут меняться под воздействием различных факторов. К таким факторам относятся порода и возраст животных, стадия лактации, условия кормления и содержания, техника доения, состояние здоровья, индивидуальные особенности, ферменты, находящиеся в молоке, бактерии, а также механические примеси и другие факторы из-за нарушения санитарно-гигиенических правил в помещениях, где содержат скот и где производится доение коров, нарушение условий первичной обработки и хранения молока.

В выдоенном молоке происходят различные процессы : окисление и гидролиз, биохимические изменения (реакции ферментов и антител),

микробиологические изменения (использование кислорода и питательных веществ, увеличение углекислого газа и других продуктов обмена, общего количества бактерий) (56).

А если молоко станет благоприятной средой для развития болезнетворной микрофлоры (например, Е. coli, S. dublin, М. tuberculosis, Br. bovis и др.), то это может оказаться причиной не только пищевого отравления, но и вызвать тяжелое заболевание.

Из всего комплекса санитарно-гигиенических мероприятий, обеспечивающих получение молока высокого санитарного качества, особая роль принадлежит методам контроля. Безусловно, анализ на содержание белка, жира, Сахаров важен для определения полноценности молока, но для санитарного контроля при разделении молока по сортам большое значение имеет определение следующих показателей : органолептические свойства, содержание соматических клеток, степень чистоты, наличие посторонних веществ, кислотность, общая бактериальная обсемененность, содержание в нем некоторых патогенных микроорганизмов, а так же микрофлоры, опасной с точки зрения технологии производства молочных продуктов (4, 36, 21, 8).

Для получения молока высокого качества необходимо строгое соблюдение на молочно-товарных фермах санитарных и ветеринарных правил, технологии доения, санитарного состояния доильного оборудования и молочной посуды, первичной обработки и хранения молока, а также необходимо иметь горячую воду, молокоприемные помещения и осуществлять контроль за качеством молока со стороны руководителей и специалистов хозяйств.

По бактериальной обсемененности молока можно судить о санитарно-гигиенических условиях его получения, первичной обработки, хранения и

транспортировки. Уровень общей бактериальной обсемененности определяет не только санитарное качество молока, но и его стойкость при хранении. Этот показатель является одним из наиболее распространенных в нормировании санитарно-гигиенического качества молока. В настоящее время в большинстве стран мира существуют национальные нормы микробиологического качества заготовляемого молока.

Так, в рекомендациях специальной комиссии стран общего рынка отмечено, что молоко, подлежащее пастеризации, не должно содержать более 500 тысяч КОЕ/ см3 .

Высокая, бактериальная обсемененность молока и наличие в нем

и о и 1

посторонней, не свойственной ему микрофлоры, делают его малопригодным для производства полноценных молочных продуктов (21).

Таким образом, ключевым звеном в цепи санитарно-гигиенических показателей является общая бактериальная обсемененность (ОБО), от которой зависит санитарное состояние молока. Это главный показатель, по которому определяют его качество при сдаче-приемке на молзаводе. Поэтому очень важно своевременное и достоверное определение данного показателя в лабораторно-производственных условиях. Успешное решение данной задачи невозможно без применения простых, быстрых и чувствительных методов контроля данного показателя.

Из всего арсенала существующих методов самыми быстрыми, простыми, доступными и наиболее распространенными являются редуктазные пробы. Однако данные методы не полностью отвечают современным требованиям в силу ряда недостатков.

Разделение молока на высший и первый сорта согласно ГОСТу 13264-88 по бактериальной обсемененности (т.е. до 300 тыс. КОЕ/см3 и от 300 до 500

тыс. КОЕ/см3) является не совсем целесообразным, поскольку в настоящее время достоверно установить данную разницу редуктазным методом, да и чашечным тоже, не представляется возможным. К тому же редуктазная проба с резазурином часто дает необъективные результаты из-за нестабильности выпускаемого препарата по оптической плотности и широкой цветовой гаммы при восстановлении индикатора. Низкая обеспеченность лабораторий индикаторами для данной пробы так же ограничивает ее применение, что является одной из причин изыскания более доступных и эффективных методов контроля.

В связи с этим большую значимость преобретает разработка быстрого и надежного по своей специфичности и чувствительности метода определения ОБО молока. Это и стало целью нашей работы.

Вышеизложенное обосновывает поставленную нами цель по разработке ускоренного метода определения ОБО сырого молока, соответственно которой на разрешение были поставлены следующие необходимые задачи:

1. Изучить в сравнительных исследованиях современные, ускоренные методы определения ОБО молока.

2. Разработать биолюминесцентный метод определения ОБО сырого сборного молока с изысканием отечественных реагентов.

3. Изучить влияние различных ПАВ на целостность бактериальных и соматических клеток сырого молока в зависимости от их количественного содержания.

4. Разработать условия для постановки биолюминесцентного метода, обеспечивающие стабильность, чувствительность и специфичность в сравнении с классическим методом прямого подсчета КОЕ/см3.

5. Разработать методические рекомендации по определению ОБО биолюминесцентным методом, апробировать их в полупроизводственных условиях и провести комиссионные испытания.

В результате проведенных исследований нами был разработан усовершенствованный метод определения ОБО сырого молока, с помощью которого можно определять молоко высшего сорта согласно ГОСТ 13264-88 "Молоко коровье. Требования при закупках."

На основании предложенного метода были разработаны "Методические рекомендации по определению общей бактериальной обсемененности сырого молока биолюминесцентным методом". Данный метод определения ОБО сырого сборного молока с помощью фильтрации пробы через бактериальные мембранные фильтры имеет существенные преимущества по сравнению с тестированными методами по своей специфичности (определяется только АТФ всех живых бактериальных клеток, исходно присутствующих в молоке), чувствительности (позволяет определять бактериальное качество молока с ОБО в 0,5х104 КОЕ/см3) и скорости получения результатов (30-35 мин для одной пробы, 1,5 ч. для 10 проб). Предлагаемый метод прошел комиссионные испытания. В настоящее время "Методические рекомендации по определению общей бактериальной обсемененности сырого молока биолюминесцентным методом" утверждены академиком-секретарём РАСХН, академиком А.М.Смирновым.

II.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ОСНОВНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИЕ КАЧЕСТВО СЫРОГО МОЛОКА ( ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ, САНИТАРНО-ГИГИЕНИЧЕСКИЕ)

Молоко и молочные продукты употребляет в пишу повседневно все население. Это основная пища для детей раннего возраста. Из молока готовят различные полезные продукты : кефир, простоквашу, варенец, сливки, масло, сметану, сыр, творог, сгущенное молоко, мороженное и т.д.

Поэтому к качеству молока и молочных продуктов предъявляются особые требования. Они должны быть не только вкусными, питательными, красиво оформленными, но и безопасными для здоровья, то есть их употребление не должно вызывать заболеваний человека (42).

Молоко - сложный продукт не только из-за того, что оно содержит около 250 отдельных компонентов, но также вследствие изменчивости относительного содержания этих компонентов.

Химические, физические, биологические и функциональные свойства молока многообразны и сложны ввиду множества компонентов молока, биологической изменчивости их содержания и типов обработки, которым оно подвергается при производстве, переработке, доставке и реализации. Биологическая изменчивость является причиной того, что молоко любой

коровы отличается по свойствам от молока другой коровы и даже от собственного молока от дойки к дойке (47).

Питательная ценность молока иллюстрируется тем фактором, что ежедневное потребление 1 литра удовлетворяет в среднем всю суточную потребность взрослого человека в жире, кальции, фосфоре и рибофлавине, 50 % потребности в протеине, 33 % потребности в витамине А, аскорбиновой кислоте и тиамине, 25 % потребности в энергии (калориях) и, за исключением железа, меди и магния, удовлетворяет всю потребность во всех минеральных веществах. Молоко содержит также значительное количество никотиновой кислоты и холина (47).

Белки молока состоят, главным образом, из казеина, лактальбумина и лактглобулина. На свойстве казеина свертываться под воздействием ферментов и молочно-кислых микроорганизмов основано производство творога и сыра.

Альбумин молока играет важную роль в обеспечении процессов роста, глобулин - в образовании иммунных (защитных) тел.

Белки молока относятся к биологически наиболее полноценным, так как содержат все жизненно необходимые аминокислоты, в том числе полный комплекс незаменимых. Особенно благоприятно в молоке соотношение лизина, метионина и триптофана; хорошо представлены содержащие серу аминокислоты - метионин и цистин, играющие важную роль в профилактике атеросклероза.

Молочные жиры отличаются от других животных жиров особым вкусом и высокой усвояемостью. Используются как самостоятельный пищевой продукт - сливки и масло. Витамин А впервые был открыт именно в молочном жире. Роль данного витамина, которого в молочном жире много, в улучшении остроты зрения хорошо известна.

Углевод молока - лактоза, или молочный сахар, легко подвергается различным формам брожения, что используют в технологии производства молочнокислых продуктов, сыров. Интересно, что молоко является единственным источником лактозы в природе. Лактоза усиливает всасывание кальция, фосфора, магния и бария из кишечника. Благодаря этому уникальному свойству лактозы молоко является также превосходным антирахитическим продуктом питания, который предотвращает заболевание рахитом, если даже содержание витамина В в молоке низкое. Благодаря лактозе микроорганизмы кишечника синтезируют никотиновую кислоту. Поэтому молоко - превосходный антипеллагрический продукт.

Минеральные вещества находятся в виде солей органических и неорганических кислот. В золу молока входят Са, Р, К, М§, Б, С1 и другие. Высокое содержание легкоусвояемого кальция делает молоко особенно ценным продуктом питания, так как большинство других продуктов бедно кальцием. К микроэлементам молока относятся Хп, Со, Си, Мп, I, Бе, А1, Сг, РЬ, Тх, А§ и др. Ценность минерального состава молока - сбалансированность элементов, обеспечивающая нормальное развитие костной и других систем, особенно детского организма.

В молоке содержится большинство известных витаминов, которыми наиболее богато летнее молоко. Особенно богато молоко рибофлавином. В состав молока входит свыше 60 ферментов (лактоза, протеаза, липаза, амилаза, каталаза), способствующих пищеварению и играющих важную роль в процессах переработки молока в молочные продукты. В молоке содержатся гормоны (окситоцин, пролактин, фолликулин, адреналин, инсулин и др.), иммунные тела, способствующие созданию иммунитета к заболеваниям (антитоксины, агглютинины, опсонины и др.).

Молоко обладает буферной способностью, которая поддерживает его pH около 6,5-6,7. Свежее молоко имеет кислотность 16-18°Т. При 28-30°Т молоко сквашивается. Вязкость нормального молока колеблется от 1,5 до 2,0 сантипауз при 20°С. Казеин - основной компонент молока, влияющий на его вязкость.

В целом наличие в молоке клеточных компонентов нежелательно. Клеточные компоненты состоят, главным образом, из лейкоцитов и бактерий. Однако если бы лейкоциты в молоке не проявляли фагоцитарной активности, то инфекционные микроорганизмы заполнили весь организм коровы (47).

Различные отклонения вкуса, цвета, запаха и консистенции молока от нормальных критериев классифицируются как пороки. Причем причины пороков могут быть разнообразными : скармливание недоброкачественных кормов (например, большая примесь на пастбище дикого лука придаст молоку луковый вкус), обсеменение молока микроорганизмами (затхло-мыльный вкус от размножения психрофильных микроорганизмов Pseudomonas, Achromobacter, Alealigens, Serratia), заболевания животных (например, гнойный или кровянистый осадок при мастите, или своеобразный запах ацетона при ацетонемии), нарушение правил получения, хранения и транспортировки молока и т.д. (2, 33).

Таким образом, молоко обладает многочисленными свойствами: технологическими, физико-химическими, биологическими. В то же время одним из главных показателей качества молока является его санитарно-гигиеническое состояние, связанное с процессом выдаивания, дальнейшей переработки и хранения молока.

К примесям, имеющим значение с точки зрения охраны здоровья человека и обнаруживаемым в молоке, относятся антибиотики, пестициды, радиоактивные изотопы, механические примеси и различные другие

ингибирующие. вещества. Причиной загрязнения молока антибиотиками, например, обычно является неправильное их употребление