Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Ретроспективная диагностика респираторно-синцитиальной вирусной инфекции у овец

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ им.Я.Р.КОВАЛЕНКО

На правах рукописи

ВАСИН АЛЕКСАНДР ДАВИДОВИЧ

РЕТРОСПЕКТИВНАЯ ДИАГНОСТИКА РЕСНИРАТОРНО-СИНИИТИАЛЬН'. -И ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У ОВЕН

16.00.03-ветеринарная микробиология,вирусология. эпизоотология.микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата . ветеринарных наук

МеекЕа -1У94

i'hOuTci выполнена в лаборатории эпизоотологии,диагностики и проф1 лактики вирусных и анаэробных болезней овец Всероссийского научно-исс ледовательского института экспериментальной ветеринарии им .Я.P.Kobe ленко.

Научный руководитель- кандидат ветеринарных наук М.Н. СОКОЛОВ

Официальные оппоненты:

1. Доктор ветеринарных наук,профессор В.А.БУРЛАКОВ (МВД)

2. Кандидат ветеринарных наук А.Ф.ШУЛЯК (ВИЭВ)

Ведущее учреждение - Северо-Кавказский ■ научно-исследовательски ветеринарный институт

Защита диссертации состоится " & " ОЪ _1994 г. в ! ^часс

на заседании специализированного совета К 020.28.01 по защите диссег таций на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском Н£ учно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имеь Я.Р.Коваленко по адресу 109472,Москва,Кузьминки,ВИЭВ.

(■ диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан " Я " iOjj,_____1994 г.

Ученый секретарь

специализированного совета,

кандидат ветеринарных наук ФЛ'.Терешкоь

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Заболевания респираторного тракта одна из основных причин,препятствующих интенсивному развитию овцеводства: повышению продуктивности и улучшению сохранности полноценного взрослого поголовья и молодняка. Ущерб может быть прямо связан с гибелью овец вследствие развития пневмонии или косвенно обусловливаться медленным ростом .замедленным развитием и затратами на лечение (Lea Master 1983) [86]. Залогом успешного ведения отрасли является своевременная постановка диагноза. Трудности дифференциальной диагностики респираторных заболеваний заключаются в полиэтиологичности последних. На характер проявления респираторных заболеваний,вызываемых бактериями, вирусами, (Сюрин В.Н. и др.1974, Соколов М.Н.1978,1980,Караваев Ю.Д. и др.1980,Писаренко Н.И. и др.1982,Мурзалиев И.Д.1990,Gilmor N.S.et.al. 1979,Howard D.et.al.1979) влияют также и стрессовые факторы:нарушение санитарных норм содержания,неполноценное кормление,перевозки на большие расстояния. Среди других респираторных заболеваний,относительно хорошо изученных у человека,а в ветеринарной практике у крупного рогатого скота,респираторно-синцитиальная инфекция имеет важное эпидемиологическое и эпизоотологическое значение. Обнаружение у овец антител к респираторно-синцнтнальнону вирусу (PCB) крупного рогатого скота (Berthiaume et.al. в 1973 и Smith et.al. в 1975 гг) позволили сделать предположение о циркуляции у овец вируса, антигенно родственного,но отличного от PCB крупного рогатого скота. Дальнейшие исследования ряда зарубежных ученых позволили выявить серопозитивное поголовье овец и коз в Канаде (31%).Великобритании (55%),в США (84,5%), Болгарии (83,3%). В нашей стране,за исключением единственного сообщения Глухова М.с соавт.(1988) об обнаружении титров антител к PCB у овец в РДП,данных о циркуляции и диагностике респираторно-синцитиальной вирусной инфекции среди овец доступной нам литературе не обнаружено.В целом респираторно-синцитиальная инфекция остается недостаточно изученной,что связано со сложностью выделения и культивирования PCB. Особенности культивирования ,в свою очередь,затрудняют получение вирусного сырья в достаточном количестве и с необходимой инфекционной активностью для изговления диагностических препаратов и средств специфической профилактики. Возможность диагностики респираторно-синцитиальной вирусной инфекции и установление роли PCB в респираторной патологии овец позво-тяет дифференцировать сложный комплекс заболеваний респираторного ракта.

Цель и задачи исследований. Цель нашей работы заключалась в разработке метода ретроспективной диагностики респираторно-синцитиальной инфекции овец.

В соответствии с этим, в наши исследования входило решение следующих задач:

1. Отработать параметры и условия постановки реакции непрямой ге-магглютинации (РИГА) для диагностики респираторно-синцитиальной вирусной инфекции (РСВИ) у овец.

2. Изучить широту циркуляции РСВИ в ряде овцехозяйств Ставропольского края и Молдавии,используя разработанный серологический метод .

.3. Изучить патогенные свойства штамма "N0MI"PCB крупного рогатогс скота для овец различных возрастных групп при экспериментальном заражении.

Научная новизна. Разработана методика постановки РИГА для диагностики РСВИ у овец. Впервые в овцехозяйствах Ставропольского края и Молдавии изучена широта циркуляции РСВИ среди овец и течение РСВИ в экспериментальных и полевых условиях.

Практическая ценность работы. Разработаны и утверждены ГУЕ (20.09.91 г)"Методические указания по выявлению антител к респиратор-но-синцитиальному вирусу крупного рогатого скота, овец и коз в реакции непрямой гемагглютинации" и "Временное наставление по применению набора эритроцитарного диагностикума для выявления антител к РС-вирусу крупного рогатого скота, овец и коз в РИГА" совместно с сотрудниками MB А.

Апробация результатов исследований. Материалы диссертационной работы доложены на научной конференции молодых ученых ВИЭВ (1988 г.),межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (28 июня 1993 г) и опубликованы в трех научных работах .

Объем работы. Диссертация изложена на/^страницах машинописного текста и состоит из введения .обзора литературы,собственных исследований, обсуждения и выводов. Работа иллюстрирована ? рисунками и 3S таблицами. Список цитируемой литературы содержит '82 источников,в том числе -/</0 иностранных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнялась в лаборатории эпизоотологии,диагностики и профилактики вирусных и анаэробных болезней овец ВИЭВ,на опытной базе ВИЭВ ( г.Вышний Волочек), лаборатории вирусологии МВА,лаборатории вирусологии Молдавского НИИ животноводства и ветеринарии,овцеводческих хозяйствах Молдавии и Ставропольского края.

Для выполнения поставленных задач использованы материалы отчет-

ности ветеринарной службы Туркменского района Ставропольского края.

Для проведения опытов и серологических исследований использовали овцепоголовье остфриэской,цигайской пород и их помесей .каракульской, романовской, мериносов из Ставропольского края,Центрального Нечерноземья,Молдавии.

В виду отсутствия возможности использования для исследований рес-пираторно-синцитиального вируса (РСВ) выделенного от овец (LeaMaster D.R. ,1983) в работе были использованы антигеннородственгше штамм "RANDALL" РСВ человека из "Набора по диагностике РСВИ крупного рогатого скота в РСК,РДП,ИФ" Приволжской биофабрики и штамм "ШМГ'РСВ крупного рогатого скота, любезно предоставленный нам доктором биологических наук Осидзе Н.Г.

Для культивирования РСВ и идентификации выделенного вируса в реакции нейтрализации (РН) использовали первично-трипсинизированные культуры и субкультуры клеток легкого эмбриона коровы (ЛЭК) и почки эмбриона коровы (ПЭК), полученные в отделе культур тканей, питательных сред и клеточной биотехнологии ВИЭВ.

Серологические исследования проводили в реакциях непрямой гемагг-лютинации (РИГА) с эритроцитарным диагностикумом в нашей модификации (РНГА-1) и в модификации МВА (РНГА-2), иммунодиффузии (РИД), агглютинации целлюлозы (РАЦ) по методу Макаряна Э.с сотр.(ин-т иммунологии, г. Москва) , ИФА по методу Бостанджиевой Р. (ЦНИВМИ, София,Болгария). Иммунологические исследования проводили в РИД в лаборатории иммунологии и биотехнологии ЕИЗВ.

Патологоморфологические исследования проводили в лаборатории па-томорфологии ВИЭВ .

Для проведения ИФА использовали набор для иммуноферментного анализа, разработанный и любезно предоставленный нам научным сотрудником ЦНИВМИ P.M.Бостанджиевой для обнаружения антител к РСВ. Для постановки реакции использовали клеточно-культуральный антиген РСВ крупного рогатого скота и реагенты гамма-глобулин против РСВ и коньюгат (антивидовые антитела меченые пероксидазой). В лунки 96-луночных полистеро-ловых микропанелей вносили по 100 мкл раствора гамма-глобулина против РСВ в концентрации 10 мкг/мл в 0,01 М фосфатно буферном растворе рН 7,2 (ФБ). Затем проводили инкубацию 18 часов при температуре +4°С,после чего промывали фосфатно-буферным раствором содержащим 0,05 X твин-20.

Исследуемые и контрольные сыворотки перед внесением в подготовленные таким образом планшеты титровали на больших планшетах ( предназначенных для РСК) в двукратном разведении с начальным титром 1:10. ^ лунки с раститрованными сыворотками вносили 4 ГАЕ антигена РСВ в бъеме 100 мкл. Затем проводили 2-х часовую инкубацию при 37 °С.

- б -

После промывки в лунки вносили конъюгат в рабочем разведении и инкубировали 1,5 часа при температуре +37 °С. Затем после тщательной отмывки добавляли субстратную смесь (ОФД + перекись водорода). Смесь инкубировали при комнатной температуре до пожелтения раствора в лунках с контролем.

Результаты учитывали по оптической плотности на автоматическом 8-каналъном фотометре "Мультискан" (Финляндия) при длине волны 492 нм. За диагностический титр сывороток принимали разведение, в котором оптическая плотность была в 1,5 раза меньше значения отрицательного контроля (фетальная сыворотка) (ОП 0,150) .

При постановке реакции агглютинации целлюлозы (РАЦ) в модификации сотрудников лаборатории препаративной биохимии института иммунологии антигенов Э. Макаряна с соавт. использовали целлюлозные диагностикумы: антительный /"Вироцелл"-вирус/ и антигенный /"Вироцелл"-антитело/. РАЦ применяли в качественном и количественном вариантах на предметных стеклах.

При постановке качественной РАЦ на обезжиренные сухожаром предметное стекло наносили 40-50 мкл исследуемого и контрольного образцов с последующим добавлением антигенного или антительного диагностикума в равном объеме.Положительные результаты РАЦ учитывали через 3-5 минут по морфологии агглютината в крестах по 3-х бальной системе.

При проведении количественной РАЦ титрование исследуемых образцов на предметных стеклах проводили поэтапно:

1.Нанесение фосфатно-буфферного раствора( ФБР 7,2-7,4 ) на шесть предметных стекол по две капли объемом 40-50 мкл на одно предметное стекло;

2.Разведение в ФБР исследуемого образца в объеме 40-50 мкл с первой капли по шестую в log2 ;

3.Внесение антигенного или антительного диагностикума в объеме 40-50 мкл во все разведения и тщательное их перемешивание;

4.Учет результатов РАЦ :

по максимальному разведению образца в котором отмечали агглютинацию.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Анализ статистических данных по заболеваемости падежу и вынужденному убою овец от болезней органов дыхания в Ставропольскому краю (по материалам ветеринарной отчетности ).

Анализ ветеринарной отчетности по Ставропольскому краю за 5 лет (1985-1989.) свидетельствует о возрастании общей заболеваемости овец на

14.5 %, ягнят на 13,4%. Наиболее высокая заболеваемость приходилась на 1989 год и составляла 42,9% у овец и 32,1% у ягнят. За 5 лет обшая заболеваемость овец составила 35+3,11%,ягнят-32,1+2,9%. Вынужденный убой за тот же период составил у овец 14,4+1,7%,у ягнят-12,9+1,1%,падеж соответственно 30,1+3,7% и 37,6+4,0 (Р<0,05).Заболевания органов дыхания за 5 лет были зарегистрированы у 42,6 +0,8% овец и 21,5+1,4 % у ягнят и вызвали падеж 34,7+2,5 % овец и 39,6+2,8% ягнят и вынужденный убой, соответственно 18,9 +2,4 % и 13,7+1,6 % (Р<0,05). От заболеваний органов дыхания погибло 33,0+1,7% овец и 33,4+3,3% ягнят и вынужденный убой соответственно составил 15,6+2,3 % и 12,8+2,5%. Болезни органов дыхания отмечены у 41,8+1,1 % овец и у 20,5+2,2 % ягнят (Р<0,05).

При анализе статистических данных по районам Ставропольского края можно • сделать вывод,что наибольший падеж и вынужденный убой животных от болезней органов дыхания регистрировался в Туркменском районе Ставропольского края: падеж-42,2+2,8% .вынужденный убой - 23,4+3,3%. В Апанасенковском районе эти показатели составили 31,7+9,6% и 14,1+1,6%, в Благодарненском районе 35,2+2,4% и 12,7+1,4% ,в Левокумском 29,6+4,3% и 18,9+4,7% соответственно (Р<0,001).

Сравнительный анализ данных о заболеваемости,падеже и вынужденном убое по кварталам 1989 года свидетельствует о наибольшей заболеваемости животных во втором и третьем квартале-40,3% и 37,1% соответственно. Одним из факторов .влияющих на этот показатель .явилось то,что респираторные заболевания проявлялись, в основном, в весенне-летний период.

Анализ статистических данных позволяет сделать вывод, что в значительной степени причинами заболеваемости,падежа и вынужденного убоя овец являются болезни респираторного характера.

3.2. Разработка эритроцитарного диагностикума для выявления антител к респираторно-синцитиальному вирусу.

• 3.2.1. Оптимизация режима подготовки эритроцитов для сенсибилизации.

При разработке способа изготовления жидкого эритроцитарного диагностикума с антигеном РС вируса за основу взят метод Ж.Яндла и Р.Сим-монса (1957). Разработка нового способа изготовления эритроцитарного диагностикума с антигеном РСВ была связана с отработкой различных параметров стабилизации ,танизации и сенсибилизации эритроцитов.

В процессе отработки параметров стабилизации была проверена также способность агглютинировать эритроциты домашних видов животных нормальной сывороткой этих же видов в реакции конглютинации.а также изу-

чена сорбционная способность эритроцитов в отношении PC вируса.

Результаты проведенных исследований показали ,что эритроциты к; и коз агглютинируются нормальной сывороткой различных видов животных наименьшей агглютинирующей способностью обладали эритроциты быка, б; рана, человека и свиньи.

Таким образом ,для дальнейшей работы нами были отобраны эритрощ ты быка,барана,человека и свиньи.

Результаты исследований свидетельствовали ,что наилучшую сорбщ онную способность в отношении PCB имели эритроциты быкаэ несколы меныие-эритроциты барана. Слабая сорбционная способность отмечена эритроцитов свиней и человека. При отработке дальнейших параметров иг готовления эритроцитарного диагностикума были использованы эритроцит крупного рогатого скота.

Результаты сравнительных исследований по использованию различнь альдегидов для стабилизации эритроцитов крупного рогатого скота и г чувствительности полученных на основе этих эритроцитов эритроцитарнь диагностикумов показали, что из испытанных веществ наилучшим оказалс акриловый альдегид (акролеин), несколько хуже - глютаровый и формаль дегид. Чувствительность диагностикумов полученных на эритроцитах обра ботанных глютаровым альдегидом и формальдегид оказалась значительн ниже,чем у диагностикума,полученного на стабилизированных акролеино эритроцитах в 5% концентрации. При более низких концентрациях эритро цитов происходил гемолиз.

Таким образом, результаты опытов по оптимизации режимов стабили зации эритроцитов позволили сделать вывод,что эритроциты крупного ро гатого скота необходимо стабилизировать акролеином в 0,2%-ной концент рации при 5% взвеси нативных отмытых эритроцитов в течение 60 мину при 37°С. При более низкой концентрации акролеина эритроциты лизирова лись, а при более высокой чувствительность диагностикума снижалась При снижении времени стабилизации эритроциты лизировались,а увеличен» времени вызывало самоагглютинацию.

Изготовление эритроцитарных диагностикумов из свежеприготовленны эритроцитов крупного рогатого скота показало, что PCB в данном случа не сорбировался на них.

Изучение чувствительности эритроцитарного диагностикума в зависи мости от сроков хранения стабилизированных эритроцитов показало,чт после стабилизации эритроциты можно использовать для изготовлени эритроцитарных диагностикумов не ранее чем через 2 месяца и в течени 25 месяцев (срок наблюдения ) сохранялась их высокая сорбционная спо собность.

Одним из важных этапов изготовления эритроцитарных диагностикумо

вляетсн их танизация . При этом эритроциты приобретают повышенную орбционную емкость и скорость оседания.

Данные по отработке оптимальных концентраций танина при тапизации табилизированных эритроцитов показывают,что оптимальной является кон-[ентрация танина 1:50000.

Полученные данные о влиянии различной температуры при танизации эритроцитов показывают,что оптимальной при танизации является темпера-■ура 1-37 °С ,хотя можно использовать и температуры +20 °С и 56 °С, но [ри этом чувствительность эритроцитарных диагностикумов значительно юнижается в 2-4 раза.

Результаты по отработке оптимального времени при танизации эрит-юцитов крупного рогатого скота свидетельствуют .что 45-90 минутная жспозиция при танизации позволяет придать эритроцитам высокую еорбци-жную емкость, и диагностикум при этом получается высокочувствительном.

Таким образом,танизацию стабилизированных акролеином эритроцитов крупного рогатого скота необходимо проводить в растворе танина .:50000 при температуре +37 °С в течение 45-90 минут.

3.2.2. Оптимизация режима сенсибилизации эритроцитов РСВ.

Оптимизация режима сенсибилизации стабилизированных акролеином ганизированных эритроцитов крупного рогатого скота позволила устано-'ить ,что оптимальным для получения высокоактивного эртроцитарного диагностикума с антигеном PC вируса с наивысшей чувствительностью является: концентрация PC вируса 105 ТДД so /мл объем 50%-ной взвеси Фитроцитов;5-6 минутная экспозиция,использование 4,5 объемов хлорида Фома в концентрации 0,1%.

3.2.3. Изучение специфичности жидкого эритроцитарного диагностикума.

После оптимизации режимов стабилизации,танизации и сенсибилизации эритроцитов была проверена их специфичность в сравнительном аспекте с различными серологическими реакциями,различными сыворотками, изучена жтивность эритроцитарного диагностикума в зависимости от сроков хра-юния .

Для постановки реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) эритроци-гарный диагностикум, содержащий антиген PC-вируса штамм "RANDALL") для 3НГА-1 готовили по методу Яндла-Симмонса в нашей модификации.

РИГА ставили микрометодом в 96-луночных планшетах с U-образным ном при помощи титратора Такачи в объеме 0,075 мл путем разведения

исследуемых сывороток крови от 1:2 до 1:256 и добавления эритроци тарного диагностикума .

Для постановки РИГА микрометодом использовали:

а)специфический эритроцитарный антиген PC-вируса ;

б)контрольный эритроцитарный антиген;

в)специфическая сыворотка к РС-вируеу;

г)отрицательная сыворотка крупного рогатого скота.

Наряду с исследуемыми сыворотками одновременно ставили контроли:

- на отсутствие спонтанной агглютинации специфического и конт рольного эритроцитарных антигенов;

- на отсутствие агглютинации специфического и контрольного ант» генов с отрицательной сывороткой;

- на активность специфического эритроцитарного антигена РСВ со специфической сывороткой;

- О,15М фосфатно-буфферный физиологический раствор (ФБФР) р 7,2-7,4 с добавлением нормальной сыворотки кролика в количестве IX с объема буфера.

Все лунки предварительно заполняли ФБФР в объеме 0,05 мл. В пер вые лунки каждого ряда вносили по 0,05 мл исследуемой сыворотки и де лали двукратные разведения от 1:2 до 1:256. На каждую исследуемую сь воротку использовали два ряда лунок. В первый ряд вносили по 0,025 n 1Z взвеси специфического эритроцитарного антигена, а во второй л 0,025 мл 1Z взвеси контрольного эритроцитарного антигена,встряхивали оставляли при 4°С на 16-24 часа. Одновременно ставили контроли.

В качестве положительного контроля использовали специфическую сь: воротку РСВ крупного рогатого скота с титром в РН 1:8-1:16. В качеств отрицательного контроля использовали нормальную сыворотку крупного рс гатого скота ,не содержащую антител к РСВ. За титр в РНГА принимал большее разведение сывортки с четкой агглютинацией .Диагностически считали титр 1:16 и выше. Учет реакции проводили через 1,5-2 часа пос ле полного осаждения эритроцитов в контроле.

Сравнительные исследования чувствительности разработанного Hah эритроцитарного диагностикума, содержащего в качестве антигена штак* "RANDALL" РСВ человека (его использовали в РНГА-1).проводили РН,,РИД,РАД,РНГА-2 (с использованием предоставленых доктором биологи ческих наук Н.Г.Осидзе микросерий эритроцитарного диагностикума с aii тигеном РСВ крупного рогатого скота штамм "N0MI").

Специфичность выявления антител в сыворотке крови овец при cpai

нении РИГА с другими серологическими реакциями используемыми для выявления антител к РС вирусу представлена в таблице 1.

Из таблицы видно,что антитела .выявляемые в РНГА-1 выявляются также в РНГА-2,РИД,РН,ИФА,РАЦ.

Исходя из результатов представленных в таблице 1 по сравнительному исследованию РИГА с другими серологическими реакциями (РНГА-2, РИД, РН, ИФА, РАЦ) на основании сопоставления тиров антител был определен коэффициент корреляции: РНГА-1 и РН составляют - 0,73;РНГА-1 и ИФА-0,79; РНГА-1 (с эритроцитарным диагностикум к РС вирусу в нашей модификации) и РНГА-2 ( с эритроцитарным диагностикум к РС вирусу в модификации МВА) -0,75;РНГА-1 и РАЦ-0,5.

Результаты считаются достоверными если коэффициент корреляции составляет 0,2-1.

Таблица 1

Результаты определения специфичности выявления антител к РСЬ в сыворотке крови овец

I I I

|Серологичес-|

|п/п|кая реакция |-

I I I N1

п

|Коэфф. -| коррел-ляпии

Сыворотка крови овец

N2

I N3 | N4 I

11. РНГА -1 1:25-6 1:64 1:2 1:2 -

|2. РНГА -2 1:512 1:128 1:2 1:2 0,75

|3. РН 1;6Ч 1:32 0 0 0,73

14. ИФА 1:5120 1:80 1:10 1:10 0,79

15. РИД + + - - 0.7

16. РАЦ + + - - 0.5

Примечание *:Ь11 - гипериммунная сыворотка;

N2 - сыворотка переболевшего животного: N3 - отрицательная сыворотка ; N4 - сыворотка здорового животного.

Таблица 2

t'i ; '1'аты определении специфичности эритроцитарного диагностикума с различными сыворотками.

| N | Сыворотка | Титр антител |

111/п | I в РИГА |

I___I_______I__|

1. Антисыворотка к РСЬ 1:256

2. Эмбриональная телячья 0

с'1. Эмбриональная овечья 0

4. Нормальная сыворотка крс 1:2

Ö. Нормальная сыворотка овец 1:4

f.. Сыворотка ягненка оольного ОРЗ N1 1:16

7. _ и_ N2 1:8

8. N3 1:32

N4 1:32

10. Сыворотка ягненка переболевшего

ОРЗ N1 1:64

11. N2 1:128

12. _ м N3 1:32

i;s. N4 1:64

14. Сыворотка крови овцы больной

Ib. ОРЗ N1 1:32

И-.. N2 1:64

1?. N3 1:128

IV. N4 1:64

l'j. Сыворотка крови здорового

ягненка N1 1:2

PO. N2 0

1-: 1. N3 1:2

22. N4 0

Результаты исследований исследований сыворотки овец с различным клиническим состоянием: больных, переболевших PCB инфекцией , клинически здоровых представленные в таблице 2 свидетельствуют , что в РНРА можно выявлять антитела в антисыворотках против PCB в сыворотках больных и переболевших РСЬИ животных.

Таблица 3

Постановка перекрестной РИГА с различными антисыворотками к вирусным возбудителям

1 1 1 N | |п/'п | 1 1 Антисыворотка к возбудителю: I 1 I Титр I ] I 1 1

1 1. Парагриппа-3 0 1

1 2. Респираторно-синцитиальной 1

инфекции (крс) 1:256 |

1 з. Респираторно-синцитиальной 1

инфекции (овечья) 1:256 1

1 4. Болезни Ньюкасла 1:8 !

1 5. Нормальная сыворотка 1:2 i

Как видно из таблицы 3,результаты проверки специфичности полученного эритроцитарного диагностикума с помощью перекрестной РИГА со стандартными антисыворотками к возбудителям других вирусных инфекций показали, что полученный эритроцитарный диагностикум с антигеном PCB человека (штамм "RANDALL") специфичен. Проверка специфичности эритроцитарного диагностикума в нашей модификации в зависимости от сроков хранения показала возможность хранения эритроцитарного диагностикума в течение 12 месяцев без снижения его активности при +2 +4 °С.

Таким образом .результаты изучения специфичности диагностикума с антигеном PCB человека штамм "RANDALL" позволяют сделать вывод,что данный диагностический препарат имеет высокую активность и специфичность.

В результате исследований для руководства по работе с диагности-кумом содержащим антиген штамм "NOMI" PCB крупного рогатого скота совместно с сотрудниками лаборатории МВА был разработаны "Методические указания по выявлению антител к респираторно-синштиальному вирусу крупного рогатого скота, овец и коз в реакции непрямой гемагглютина-ции" ,и "Временное наставление по применению набора эритроцитарного диагностикума для выявления антител к PC-вирусу крупного рогатого скота, овец и коз в РИГА".

3.3. Изучение уровня серопозитивности овец к PCB в овиехозяйс-твах различных регионов.

Для изучения широты распространения РСВИ. проводили исследования

образцов сыворотки крови из овцехозяйств Молдавии,Киргизии и Ставро польского края. Пробы сыворотки крови овец также дополнительно иссле довали наличие антител к вирусу ПГ-3 и АДВ.

В Молдавии в овцехозяйствах Вулканештского.Григориопольского Думбравенского, Котовского, Новоаненского, Окницкого, Тараклийского Унгенского районов исследовали 1420 сывороток крови ОЕец и ягнят каракульской, цигайской, остфризской пород и их помесей. Данные исследовани! в РИГА сыворотки позволили выявить наличие антител в титре 4-8 log2 i PCB у 47% ярок и овцематок и 53,8% ягнят,к вирусу ПГ-З у 52,1% ярок i овцематок и 44,2% ягнят, к АДВ у 41,3 % ярок и овцематок и 66,6% ягнят. Исследование сыворотки крови от 450 овец киргизской породы Чуйс-кого и Кантского районов Киргизии выявило наличие антител к PCB j 22,3% ярок и овцематок 1-6 лет , 27,1% ягнят до 6 месячного возраста, к вирусу ПГ-3 у 46,9% ярок и овцематок, 40,3% ягнят,к АДВ у 54,6% ярор и овцематок ,38,7% ягнят. При исследовании 1156 мериносов в хозяйства? Ставропольского края антитела к PCB выявлены у 18,6% ярок и овцематор 1-6 лет и у 28,6% ягнят до 6 месячного возраста, к вирусу ПГ-3 jí 71,6% ярок и овцематок,52,5% ягнят , к АДВ у ярок и овцематок у 67,27, 48,7% ягнят. Исследование сыворотки крови овец и ягнят на наличие антител к PCB по районам Ставропольского края выявило наибольший процент ееропозитивных овцематок ( 35 %) и ягнят (45 %) в Туркменском районе и наименьший процент ееропозитивных овцематок ( 24 %) и ягнят ( 34 %) в Благодарненском районе. Титр антител при этом составил 3-6 logg .

3.3.1. Изучение циркуляции PCB в контролируемом эпизоотологичес-ком опыте (КЭО).

В совхозе Кучерлинский Туркменского района Ставропольского края был проведен контролируемый эпизоотологический опыт (КЭО).

С этой целью на ферме 2 в отарах N1 и N2 были сформированы 2 группы по 20 голов ягнят в возрасте 2-3 месяцев. От этих животных были взяты парные пробы сыворотки крови и исследованы в РИГА с двумя вариантами эритроцитарного диагностикума (в РНГА-1 наш вариант, в РНГА-2 диагностикум МВА) и методом иммуноферментного анализа (ИФА). Сыворотку крови брали первый раз до отъема ягнят и стрижки основного поголовья,а второй раз после стрижки овцепоголовья и переформирования отар. С этой целью учитывался порядок прохождения отар через стригальный пункт (единственный в хозяйстве-что, по-видимому явилось одним из звеньев эпизоотической цепи -фактором передачи инфекции).Таким образом, ягнята, которые содержались ранее раздельно, после хозяйственных мероприятий, оказались в одной вновь сформированной отаре N3. После объедине-

ния животных через 1-2 недели наблюдали увеличение числа животных с признаками острого респираторного заболевания.

Таблица 4

Серологические исследования овец в КЭО

1 1 1 1 1 1 До отъема i

1 1 1 N п/п|Группа Кол-во РНГА-1 i 1 РИГА-2 i 1 ИФА i 1 РАД 1

1 1 проб + 1 % i 1 + 1 1 % i 1 + 1 1 % i 1 + i 1 % 1 i i

i i |1|1 20 2 1 |10 1 13 1 115 I 14 1 |20 1 И 1 1 1 5 1

1 2 1 2 20 3 115 14 |20 14 |20 12 lio 1

1 ВСЕГО 40 5 112,5 i |7 i 117,5 i 18 i |20 i 13 i 1 7,5 1 i i

1 i 1 1 i i После отъема

1 1 1 N п/п|Группа Кол-во РНГА-1 i 1РНГА-2 i 1 ИФА i I РАЦ 1

1 1 i i проб + 1 % i 1 + 1 1 % i 1 + i 1 % i 1 + i 1 % 1 i i

1 1 |1|1 . 20 10 1 |50 1 112 1 |60 1 115 1 175 1 16 1 1 |30 1

1 2 1 2 20 7 |35 1 9 145 111 |55 14 |20 1

1 ВСЕГО i 40 17 142,5 \ 121 ! 152,5 i |26 i |65 ' i 110 i 125 1 i i

Как видно из таблицу 4 до объединения отар.серопозитивных живот-[ых было 12,5% по данным РИГА или 20% (по данным ИФА), а после объеди-[ения- 42.5 % в РИГА или 65 % в ИФА . Четырехкратный прирост титров ятител.а также появление их у серонегативных животных, доказывает ;иркуляцию респираторно-синцитального вируса в хозяйстве.

3.4. Изучение патогенных свойств штамма "N0MI" респираторно-син-цитиального вируса крупного рогатого скота для овец.

Изучение патогенного воздействия штамма "Nomi" PCB крупного рога-эго скота на овец разного возраста изучали в Вышневолоцком отделе ВИВ на опытной базе на острове Лисий в опыте . Заражение овцематок и 7нят проводили путем интраназального и интратрахеального введения ви-гесодержащей культуральной жидкости с титром вируса при заражении )4,5 ТЦД 50/Мл.Заражение проводили двукратно 2 дня подряд, опыте по заражению находились б суягных овцематок,12 ягнят 1,5-2 ме-цев ,12 овцематок находились в контакте с зараженными ягнятами. В

контроле находилось : 7 овцематок в возрасте 2-3 года и 8 ягнят 1,5 -2 месяцев. Кровь у животных брали до опыта и на 7,14,21 дни .Серологические исследования показали отсутствие антител к PCB до опыта. Животные подвергались ежедневному клиническому осмотру и термометрии. От ягнят после заражения через 72 часа брали пробы носовых секретов для вирусологического исследования.

У ягнят после заражения PCB штамм "N0MI" титр антител в значении 1:32 (РИГА) и 1:40 (ИФА) наблюдали на 7 день и 1:64 (РИГА) 1:80 (ИФА)

на 14 день. У животных наблюдали кратковременное повышение температуры тела с пиками на 3 и 7 дни с максимальным значением на 3 -й день 40,3°С, ринит,кашель,угнетенное состояние. На 14 день были убиты 2 ягненка с максимальными диагностическими титрами антител . Гистологические исследования тканей легких,трахеи,лимфатических узлов не выявили патанатомических изменений в исследуемом материале.

От одного ягненка в результате опыта из носового секрета через 72 часа после заражения был изолирован антиген идентифицированный в дальнейшем в реакции нейтрализации как респираторно-синцитиальный вирус.

В сыворотке крови остальных четырех животных группы при исследовании на 21 день обнаружили снижение титра антител до 1:16 (РНГА) и 1:20 (ИФА).

Уровень иммуноглобулинов IgG в сыворотке крови ягнят по сравнению с контролем снижался к 7 дню до 17,7+2,5 ,а затем после пика на 14 день (18,9+2,5 мг/мл) опять снижался к 21 дню до 18,4+3,56 мг/мл. Количество IgM возрастало до максимального значения 1,32+0,75 мг/мл на 14 день .затем проходило снижение уровня до 1,07+0,38 мг/мл на 21 день.

У суягных овцематок после заражения PCB штаммом "N0MI" антитела появлялись в титре 1:32 (РНГА) и 1:40 (ИФА) на 7-й день и достигали максимального значения 1:64 (РНГА) и 1:80 ИФА. У животных при этом наблюдали непродолжительный кашель,но температура не отличалась от нормы. Уровень Ig G у суягных овцематок по сравнению с контролем на 7-й день незначительно снизился, а затем отмечали его повышение к 14 дню с достижением максимального значения 23,2+0,41.Уровень IgM возрастая, также достигал пика на 21 день и составил 1,1+0,48 мг/мл.

У несуягных овцематок, зараженных PCB штаммом "N0MI" : титры антител 1:16 (РНГА) и 1:20 ИФА появлялись на 14 день и достигали максимального значения 1:32 (РНГА) и 1:40 (ИФА) на 21 день.

Клиническая картина при наблюдении за этой группой была сходной с группой, в которой содержались суягные овцематки. Уровень иммуноглобулинов IgG у несуягных овцематок по сравнению с контролем снижался к 14 дню до 22,5+0,88 мг/мл,а затем отмечали его подъем к 21 дню до 22,9+1,3 мг/мл. Уровень IgM возрастая к 7 дню до 2,9 +0,88 мг/мл,далее

снижался к 14 дню до 1,47 мг/мл и опять повышался к 21 дню до 1,63+0,55 мг/мл.

У овцематок,контактировавшими с ягнятами, зараженными PCB штаммом "N0M1" антитела в титре 1:16 (РИГА) 1:20 (ИФА) появились на 14 день, к 21 дню титр антител достиг 1:32 (РИГА) и 1:40 (ИФА). Уровень иммуноглобулинов IgG по сравнению с контролем повышался до 14 дня до значения 23,7+2,44 мг/мл, а затем снижался к 21 дню. Уровень IgM повышался к 14 дню до максимального значения 1,77+0,95 ,а затем снижался до 1,6+0,84мг /мл.

У ягнят, зараженных изолятом PCB титр антител 1:16 (РИГА) и 1:20 (ИФА) выявляли на 14 день .Далее титр антител повышался к 21 дню до 1:32 (РИГА) и 1:40 (ИФА).

Уровень Ig G по сравнению с контролем снижался до минимального значения 8,3 +1,12 мг/мл к 14 дню ,а затем повышался к 21 дню до 9,5+ 1,94 мг/мл. Уровень IgM повышался до 0,82+0,06 мг/мл ,а затем снижался до минимального значения 0,65+0,18 мг/мл на 14 день.

Клиническая картина,в отличие от группы ягнят, зараженных PCB N0MI, отличалась более низким пиком температуры 40,1°С и отсутствием повторного пика на 7 день.

У овцематок, контактировавшими с ягнятами, зараженными реизолятом PCB титры антител в максимальном значении 1:16 (РИГА) и 1:20 (ИФА) обнаруживали к 14 дню . Клинической картины заболевания не наблюдали. В сыворотке крови этой группы животных уровень Ig G по сравнению с контролем недостоверно повышался к 7 дню и составил 24,1+0,51 мг/мл. Затем наблюдали спад к 14 дню и повторный подъем до 22 ,1+0,44 мг/мл. Уровень IgM повышался к 7 дню до 2,5+0,35 мг/мл затем снижался к 14 цню до 1,1 +0,21 мг/мл и опять поднимался до 1,6+0,28 мг/мл к 21 дню.

В целом,наблюдавшийся серологический ответ у овец, зараженных PCBf ^ожно считать слабым,что по-видимому связано с низкой заражающей дозой вируса.

4. ВЫВОДЫ

i.Оптимизирован режим приготовления антигена для РНГА и показана диагностическая ценность этой реакции при РСВИ овец.

2.Сравнительная оценка РНГА с другими серологическими реакциями (РИД,РН,ИФА,РАЦ) на основании сопоставления тиров антител показала специфичность,чувствительность РНГА с эритроцитарными диагностикумами изготовленными с использованием штаммов PCB "RANDALL" и "NOMI" и ее преимущество при ретроспективной диагностике РСВИ овец (простота постановки, возможность использования в производственных условиях и длительность хранения компонентов диагностикума).

3.Коэффициент корреляции при сопоставлении титров антител,полученных в РНГА-1 (с эритроцитарным диагностикум к PC вирусу в нашей модификации) и РН составляют - 0,73;РНГА-1 И ИФА-0,79; РНГА-1 И РНГА-2 (с диагностикумом в модификации МВА)-0,75.

4. В реакции непрямой гемагглютинации установлена широкая циркуляция PCB среди овец . Процент ееропозитивных реакций среди овцепого-ловья обследованных хозяйств варьировал в пределах 18,6 - 53,8%.

5.Наряду с антителами к PCB у овец с симптомокомплексом острого респираторного заболевания при серологических исследованиях выявлены антитела против вирусов ПГ-3,АДВ.

6. В экспериментальных условиях выявлена патогенность штам-Ma"Nomi" PCB крупного рогатого скота для овец,при этом у зараженных животных отмечали ринит,кашель,угнетенное состояние с повышением температуры тела .

7. Показана возможность контактного заражения ягнят PCB крупного рогатого скота .которая была подтверждена выявлением в парных сыворотках крови четырехкратного и более прироста титров антител на фоне респираторного заболевания у ягнят.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработаны "Методические указания по выявлению антител к рес-пираторно-синцитиалыюму вирусу крупного рогатого скота, овец и коз в реакции непрямой гемагглютинации" (утвеждены ГУВ 20.09.91 г).

2. Разработано "Временное наставление по применению набора эрит-роцнтарного диагностикума для выявления антител к PC-вирусу крупного рогатого скота, овец и коз в РИГА" (утвеждены ГУВ 20.09.91 п .

3.Рационализаторское предложение N 34 от 6.04.87 "Способ изготовления эритроцитарного диагностикума с антигеном респираторно-синцити-ального вируса".

4.Рационализаторское предложение N 35 от 6.04.87 " Эритроцитарный диагностикум с антигеном респираторно-синцитиального вируса ".

6. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1.Помщжо Т.И..Красочко II. А. .Васин А.Д.Применение РИГА для серологического исследования при респираторных заболеваниях овец .Журнал "Сельское хозяйство Молдавии" 1986г.,N9 ,стр.33.

Й.Номирко Т.И..Красочко II.А.,Васин А.Д. Серологическая диагностика заболеваний овец,вызванных респираторными вирусами крупного рогатого скота//Труды ин-та/МолдНИИЖиВ. "Технология и ветобеспечение животноводства." 1Ö88 г.,стр.95-97.

3.Васин А.Д. Выявление антител к PCB среди овцопоголовья методом РИГА. Бюллетень ВИЭВ .вып.69.,1939 г.,стр .71-73.

Подписано к печати 03.02.94 г. Форы. буы. 60x90 1/16 Объём уч. изд. 1,0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 2947

ВНИШЕГМАШ ии.А.И.Целикова