Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка средств и методов диагностики и специфической профилактики аденовирусных болезней кур

На правах рукописи

□03054Э4Э

БОРИСОВ Владимир Владимирович

РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ И МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ АДЕНОВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ КУР

Специальность: 16.00.03. - «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Иваново - 2007

003054949

На правах рукописи

БОРИСОВ Владимир Владимирович

РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ И МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ АДЕНОВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ КУР

Специальность: 16.00.03. - «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Иваново - 2007

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Аденовирусные болезни кур регистрируются во многих странах с ратпгыы промышленным птицеводством и наносят значительный экономический ущерб [Baxendale W. 1978; Коровин Р-Н., Рождественский И.К., 1990; Фомина Н.В., 1995; McFeitah J.B-, 1998; Баку л и н RA., 1998,2002].

Довременная классификация аденовирусов птиц предусматривает деление их на i группы, ir; которых возбудители 1 и III группы представляют опасность для птицеводческих предприятий [Benko М. с соя кг., 2000).

Вирус синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76), относящийся к II! группе, щлэывает бессимптомное снижение яичной продуктивности у кур различных кроссов J Мер erran J.В;, 1977; Baxendale W. 1978; Zanella А. с соавт., 1978; Коровин P.H., Рождественский И.К., 1990;).

Аденовирус!!! 4 серотипа I группы за последние два десятилетия повысили свою иатогенноегь и наряду с развитием у бройлеров инклузионного гепатита, стали вызывать проявление нового синдрома - синдрома ги дро пери кардита (С ГПК) со смертностью до 75% (Anjum A.D., 1988, 1989: 1990; Qureshi A.A., 1988, 1989, 1997; Khan M.Z. с соавт., 1988; Voss М., 1989; Abdul-Aziz Т. A., 1991; Cowen B.S., 1991,1995; Того Н. с соавт., 1999].

В Российской Федерации массовое проявление СП ПС наблюдали в 1992г. в Челябинской области в бройлерных стадах со смертностью до 12% [Лагуткин Ü.A. с соавт., 1992]. Однако причины, вызвавшие развитие этой болезни, пе были выяснен/,i.

Проблема аденовирусных болезней кур актуальна еще и по той причине, что эти инфекции трудно диагностировать, так как они способны протекать латентно с отдельными периодами ремиссий и рецидивов [Коровин Р.П., 1990; Фомина Н.В., 1995; МсЬеггап J.B. 1998].

Лабораторная диагностика аденовирусных болезней кур основана на выделении вируса и его идентификации вирусологическими и серологическими методами. ! 1едостатком такой схемы является длительность постановки и сложность выявления латентпо-переистирующих вирусом,

I [римепение модекулярпо-биологических методов (ПЦР, нуклеотидное еекве мировая не) способно решить эчу задачу. ПЦР обладает высокой специфичностью и чу ветви та ¡ы i о егь га, а сравнительный анализ нуклеотиднШ!х последовательностей ампдифицированных фрагментов позволяет установить генетические связи между исследуемыми изодятами и известными штаммами [Mullid К, с соавт., 1987; ¡Irlich ПЛ., 1988]. Однако, количество данных о применении i (ЦР и иуклеот идпо; о секвениропапия для индикации аденовирусов ограничено [Hess М. с соавт., 1997, 1999].

Вакцинация играет ведущее место » профилактике аденовирусных болезней кур. Установлено, что однократная иммунизация ремонтного молодняка в возрасте 90-120 сут инактивированной вакциной против С С Я-76 предупреждала развитие болезни и вертикальную передачу вируса (Baxendale W-, 1980; Zanella А, 1981; Bouquet J.F. 1982].

?

В нашей стране были разработаны инактивированные вакцины против ССЯ-76 и налажено их производство [Рождественский И.К. с соавт., 1991, 1992; Хохлачев О Ф. с соавт., 1993; Смоленский В.И., 1999, 2001; Сухинин A.A. с соавт., 1999]. Однако, эти биопрепараты были приготовлены на основе сорбентов или эмульсии прямого типа и не индуцировали у привитых кур напряженного иммунитета, регистрируемого в течение всего продуктивного периода [Троицкая И.В., 2000].

Подходом к решению этого вопроса может быть усовершенствование инактивированной вакцины против ССЯ-76 путем повышения антигенной активности за счет использования новых штаммов и адъювантов.

Систематическая вакцинация кур против ССЯ-76 потребовала осуществления регулярного мониторинга за иммунным фоном. Для этого необходимо было разработать стандартный набор для определения антител к вирусу ССЯ-76 иммуноферментным методом, который имеет существенные преимущества перед другими серологическими реакциями по специфичности, чувствительности и возможности автоматической количественной оценки результатов [Фомина Н.В. с соавт., 1988; Хилько С.Н. с соавт., 1989].

В современном птицеводстве возрастает роль специфической профилактики не только ССЯ-76, но и других вирусных болезней (НБ, ИБК). Использование для этих целей моновакцин повышает трудозатраты и вызывает развитие стрессового состояния у птиц.

Имеются сообщения об успешной разработке ассоциированных инактивированных вакцин против некоторых вирусных болезней птиц [Lombardi D. с соавт., 1981; Zanella А., 1981; Дубовой A.C. с соавт., 1995, 1998; Герман В.В. с соавт., 2002; Рождественский И.К. с соавт., 2003; Джавадов Э.Д., с соавт., 2003].

Выше указанная тенденция к возрастанию роли аденовирусов в инфекционной патологии отечественного промышленного птицеводства послужила основной предпосылкой для проведения исследовательских работ по созданию средств и методов диагностики и специфической профилактики аденовирусных болезней кур.

Цель и задачи научных исследований. Главной целью исследований являлась разработка и внедрение в ветеринарную практику эффективных средств и методов диагностики и специфической профилактики аденовирусных болезней кур. В соответсгвии с целью работы поставлены следующие задачи:

изучить эпизоотическую ситуацию по синдрому гидроперикардита кур в птицеводческих предприятиях Российской Федерации в 1995-2005гг.; уточнить этиологию синдрома гидроперикардита кур; выделить и охарактеризовать вирус, вызывающий у цыплят СГПК; разработать стратегию и тактику борьбы с СГПК и на основе экспериментальных исследований создать новые средства диагностики и специфической профилактики;

разработать метод индикации и штаммовой дифференциации аденовирусов кур на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования;

изыскать полевые изодяты аденовирусов, вызывающих ССЯ-76 и СГПК, и провести с ними селекционные работы для получения производственных штаммов;

разработать технологии изготовления и контроля инактивированных вакцин против СГПК и ССЯ-76 и наставления по их применению;

изучить иммунобиологическую целесообразность сочетания антигенов в ассоциированных инактивированных вакцинах против ССЯ-76, ИБК и НБ;

изучить иммунобиологические свойства разработанных инактивированных вакцин против аденовирусных болезней кур в лабораторных и производственных условиях;

подготовить и утвердить нормативно-техническую документацию на разработанные биопрепараты;

освоить промышленное производство диагностикумов и инактивированных вакцин против СГПК и ССЯ-76 и внедрить их в ветеринарную практику.

Научная новизна. Впервые экспериментально подтверждена вирусная природа нового заболевания молодняка кур - синдрома гидроперикардита. Показано, что основным этиологическим агентом вспышек СГПК в РФ в 19952005 гг. является вирус, генетически родственный референтному штамму серотипа НЛс1\'4, принадлежащий к роду АУ1ас1егюУ1гь$.

Разработана методика индикации и идентификации аденовирусов кур рода АУ1ас/еполпгт и АгскЛепотгт на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

Разработан и внедрен в производство и ветеринарную практику набор для определения антител к вирусу ССЯ-76 иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении.

Получен, изучен, паспортизирован и депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (г. Москва), производственный штамм «КР-95 № 114» вируса синдрома гидроперикардита кур.

Разработана и внедрена в производство технология изготовления и контроля вакцины против синдрома гидроперикардита кур инактивированной сорбированной, определены оптимальные условия промышленного получения вирусного сырья, очистки, инактивации, подобран оптимальный компонентный состав препарата и методы биологического контроля.

Научно обоснованы и экспериментально подтверждены: прививной объем, способы введения и схемы применения вакцины против синдрома гидроперикардита кур инактивированной сорбированной Изучены в лабораторных и производственных условиях иммунобиологические свойства вакцины против синдрома гидроперикардита кур, изготовленной промышленным способом.

Получен, изучен, паспортизирован и депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в

ветеринарии и животноводстве, производственный штамм «БИСС № 113» вируса синдрома снижения яйценоскости-76.

Разработаны и внедрены в промышленное производство технологии изготовления и контроля вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированной эмульгированной и вакцины ассоциированной против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированной эмульгированной.

Отработаны прививные дозы и схемы применения инактивированной эмульгированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 и ассоциированной инактивированной эмульгированной вакцины против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76 в промышленном птицеводстве.

Новизна исследований подтверждена 8 патентами на изобретения: «Штамм КР 95 № 114 вируса синдрома гидроперикардита кур для изготовления вакцинных препаратов», №2193062 от 20.11.2002г.; «Инактивированная вакцина против синдрома гидроперикардита кур», №2195959 от 10.01.2003г.; «Способ изготовления инактивированной вакцины против синдрома гидроперикардита кур», №2199342 от 27.02.2003г.; «Способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против синдрома гидроперикардита кур», №2213576 от 10.10.2003г.; «Инактивированная эмульсионная вакцина против синдрома гидроперикардита кур», №2216351 от 20.11.2003г.; «Штамм «БИСС № 113» вируса синдрома снижения яйценоскости-76 птиц для изготовления вакцинных препаратов», №2221865 от 20.01.2004г.; «Инактивированная вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76», РФ №2233671 от 10.08.2004г.; «Способ изготовления инактивированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76», №2239452 от 10.11.2004г.

Практическая значимость работы. Научные разработки вошли в следующие нормативно-технические документы, которые утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза России:

1 Вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированная эмульгированная (ТУ 9384-026-00495527-00, наставление по применению №134-2/2208 от 27.12.2000 г.);

2. Вакцина ассоциированная против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированная эмульгированная (ТУ 9384-029-00495527-00, наставление по применению №13-4-2/2204 от 25.12.2000 г.);

3 Вакцина против синдрома гидроперикардита кур инактивированная сорбированная (ТУ 9384-129-00495527-03, наставление по применению №13-304/1064 от 07.05.2004 г.),

4. Набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 иммуноферментным методом при тестировании сывороток методом последовательных разведений (ТУ 9388-015-00495527-99, наставление по применению № 13-5-02/0081 от 06.06.01г.);

5. Набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388-068-00495527-01, наставление по применению № 13-5-02/0237 от 02.11.01г.);

6. Методические указания по индикации генома вируса ССЯ-76 с использованием полимеразной цепной реакции и секвенирования амплифицированных фрагментов гена фибера (1998г.);

7. Методические указания по определению антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови иммуноферментным методом (1998г.).

Вышеперечисленные биопрепараты выпускаются серийно и имеют официальную регистрацию в Российской Федерации, а вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированная эмульгированная и вакцина ассоциированная против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированная эмульгированная зарегистрированы и широко применяются в Украине, Молдавии, Узбекистане и Беларуси.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эпизоотический процесс синдрома гидроперикардита кур в Российской Федерации;

2. Характеристика вируса синдрома гидроперикардита кур;

3. Метод индикации и штаммовой дифференциации аденовирусов кур на основе ПЦР и прямого секвенирования амплифицированных фрагментов кДНК;

4. Промышленная технология изготовления, методы контроля и способ применения вакцины против синдрома гидроперикардита кур инактивированной сорбированной;

5. Производственный штамм «БИСС» вируса ССЯ-76 для изготовления инактивированных вакцин;

6. Промышленная технология изготовления, методы контроля и способ применения вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированной эмульгированной;

7. Теоретическое обоснование целесообразности сочетаний антигенов в ассоциированных инактивированных вакцинах против ССЯ-76, ИБК и НБ;

8. Промышленная технология изготовления, методы контроля и способ применения моновакцин против ССЯ-76, ассоциированных вакцин против ССЯ-76 и ИБК, ССЯ-76, ИБК и НБ;

9. Стратегия применения разработанных биопрепаратов против аденовирусных болезней кур и их противоэпизоотическая эффективность.

Апробация работы. Основные материалы исследований по диссертационной работе доложены и одобрены на: международной конференции, посвященной 100-летию вируса ящура, «Проблемы инфекционной патологии сельско-хозяйственных животных» (Владимир, 1995), конференции «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 1996), XII интернациональном

конгрессе всемирной птицеводческой ассоциации (Будапешт, 1997), всероссийской конференции, посвященной 40-летию ВНИИЗЖ, «Современные аспекты патологии животных» (Владимир, 1998), международной конференции «Современные методы профилактики инфекционных болезней птиц» (Киев, 1998), межрегиональных координационных совещаниях «Ветеринарная практика в промышленном птицеводстве» (Ломоносов, 1999, 2000, 2001), всероссийской конференции, посвященной 30-летию ФГУП ПЗБ, «Производство и контроль медицинских и ветеринарных препаратов, опыт применения и реализация их в странах СНГ» (Вольгинский, 1999), научной Сессии РАСХН «Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России» (Москва, 1998), международной научно-практической конференции «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных» (Покров, 2000), международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию со дня рождения академика ВАСХНИЛ Гладенко И.Н., «Ветеринарная наука на пороге XXI века» (Харьков, 2000), международной конференции «Птицеводство - мировой и отечественный опыт» (Москва, 2002), международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины в условиях современного ведения животноводства» (Феодосия, 2003), IV Украинской конференции по птицеводству с международным участием (Алушта, 2003), международной научной конференции, посвященной 45-летию ФГУ ВНИИЗЖ, «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных» (Владимир, 2003), V международном форуме «Биотехнология и современность» (Санкт-Петербург, 2004), заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» (1995-2005гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 65 научных работ, в том числе 12 работ в изданиях, регламентированных ВАК РФ для докторских диссертаций. В опубликованных работах изложены основные положения и выводы по изучаемому вопросу. Материалы диссертации защищены 8 патентами РФ на изобретения. Утверждено в установленном порядке 7 комплектов нормативных документов (ТУ, наставления по применению, методические указания).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 350 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения. Список использованной литературы включает 653 источника, в том числе 522 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 33 рисунками и 84 таблицами.

В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники ФГУ «ВНИИЗЖ»: A.B. Борисов, В.В. Дрыгин, М.А. Волкова, С.К. Старов, В.И. Филатов, В.Н. Ирза, O.A. Борисова, В.А. Лобанов, C.B. Фролов, А.П. Пономарев, а также сотрудники ФГУ «ВГНКИ». В.И. Смоленский, Ю.В. Зуев, Т.В. Руденко, И.Л. Парфенова, за что приносим им сердечную благодарность.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

В работе использовали следующие материалы: Производственные и эталонные штаммы вирусов:

- производственный штамм «KP 95 № 114» вируса СГПК;

- производственные штаммы «БИСС № 113», «Б-93» и «В 8/78» вируса синдрома снижения яйценоскости -76;

- аденовирусы птиц FAdV 1-12, «Spafas» (США)

Вакцины:

- вакцина против СГПК инактивированная сорбированная;

- вакцина против ССЯ-76 инактивированная эмульгированная;

- вакцина ассоциированная против НБ, ИБК и ССЯ-76 инактивированная эмульгированная.

Диагностику мы:

- для определения антител к аденовирусу птиц 4 серотипа группы I иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении;

- для определения антител к аденовирусу птиц 4 серотипа группы I иммуноферментным методом;

- для определения антител к вирусу ССЯ-76 иммуноферментным методом при тестировании сывороток методом последовательных разведений;

- для определения антител к вирусу ССЯ-76 иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении;

- для диагностики вируса СГПК в РДП;

- для выявления антигенов аденовируса 4 серотипа и вируса ССЯ-76 в непрямом жидкофазном блокирующем варианте ИФА,

- для обнаружения антител к вирусам ССЯ-76 и НБ в РТГА;

- наборы для обнаружения антител к возбудителям вирусных болезней птиц иммуноферментным методом «Synbiotics» (Франция).

Куриные, утиные эмбрионы и инкубационные яйца:

- яйца СПФ-кур фирм «Lohmann Tierzucht» (Германия);

- эмбрионы уток кросса «Благоварский» и «Медео» (Россия);

- эмбрионы кур кросса «Хайсекс белый» (Россия).

Птицы:

- цыплята и куры различных возрастов мясных и яичных кроссов (Россия);

- СПФ-цыплята;

- безлейкозные цыплята, полученные из ОНЦ РАМН (г. Москва) Питательные среды, реактивы, растворы и сыворотки:

- мясо-пептонный агар и бульон;

- мясо-пептонный печеночный бульон;

- среда Сабуро;

- тиогликолевая среда;

- формалин технический (ГОСТ 1625-61);

- 15-24% водный раствор АЭЭИ;

- 3% коллоидный раствор ГОА;

- сапонин «Fluka», (Швеция);

- полигексаметиленгуанидингидрохлорид (ТУ 10-09-41-90);

- трихлорметан (хлороформ) (ТУ 2631 -020-11291058-96);

- фреон-113 (ГОСТ 23844-79);

- пеногаситель марки КЭ-1221 (ТУ 6-02690-7);

- полиэтиленгликоль ПЭГ 6000 (Serva);

- тиосульфат натрия;

- ледяная уксусная кислота (ГОСТ 61-75);

- натрия хлорид;

- мертиолят «Acros» (США);

- бензилпенициллина натриевая соль;

- масляный адъювант ФГУ «ВНИИЗЖ» (ТУ 10-09-108-91);

- масляные адъюванты Эмульсиген «MPL» (США);

- масляные адъюванты серии Монтанид ИЗА «SEPPIC» (Франция);

- коммерческие антивидовые конъюгаты НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалея (Россия).

Химические и биологические реагенты для ПЦР:

Для приготовления буферных растворов и растворов для ферментативных реакций использовали химические реактивы фирм «Serva», «Sigma», «Fluka», «Pharmacia», «Promega» и ферменты: ДНК-лигаза Т4 и рестриктазы (Fermentas), протеиназа К (Serva), Taq ДНК-полимераза и полинуклеотидкиназа (Promega).

Методы исследования

Определение титра инфекционной активности вирусов

Титр инфекционности вируса СГПК определяли на 1^3-суточных СПФ-цыплятах в течение 14 сут после заражения.

Инфекционную активность вируса ССЯ-76 проверяли в 9~11 -суточных эмбрионах уток по наличию агглютинирующей активности ЭЭЖ.

Титр вируса определяли по методу Кербера в модификации И.Г1. Ашмарина по формуле: lg ЛД50/„„ = lg Д„ - 5(1 Li - 0,5).

Определение стерильности

Определение стерильности проводили по ГОСТ 28085-89 путем высевов материалов в пробирки с питательными средами МПА, МПБ, МППБ, Сабуро и тиогликолевой средой. О стерильности материалов судили по отсутствию роста микроорганизмов на данных питательных средах.

Культивирование вирусов СГПК и ССЯ-76

Вирус СГПК культивировали в организме цыплят мясных и яичных кроссов, используя в качестве вируссодержащего материала печень. Матровую расплодку вируса с активностью 2,5-2,75 lg ЛДэдо 2«л инъецировали

внутримышечно цыплятам в дозе 1 мл и наблюдали в течение 7 сут. Активность материала определяли в РДП или ИФА.

Вирус ССЯ-76 репродуцировали в 9-12-суточных эмбрионах уток, инокулируя матровую расплодку с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ЭИД50/0.2МЛ в аллантоисную полость. Зараженные эмбрионы инкубировали в течение 96-144 час при температуре 37,5±0,5°С и относительной влажности 7080 %. После чего эмбрионы охлаждали и отбирали ВСЭЭЖ.

Приготовление суспензии вируса СГПК

Вирусный материал измельчали в коллоидной мельнице JV-10 (Германия) в смеси с ФБР до получения 10% суспензии в течение 10-30 мин. По окончании размола суспензию собирали в реактор, выдерживали в течение 1-1,5 час при температуре от 6 до 12 °С для экстракции вируса.

Очистка вируссодержащих суспензий от балластных белков

Очистку суспензий вирусов ССЯ-76 и СГПК проводили хлороформом (1^5%), фреоном-113 (0,5-2,0 %) и полигексаметиленгуанидингидрохлоридом (0,002^-0,01%) с последующим центрифугированием или сепарированием, а так же фильтрацией через патронные фильтры с разным диаметром пор.

Очистка и концентрирование вируса ССЯ-76

Вируссодержащий материал концентрировали ПЭГ 6000 (7%) в течение 16-18 час при температуре 2-8°С. Полученный осадок ресуспендировали в буфере до 1/50 исходного объёма, очищали хлороформом, наслаивали на ступенчатый градиент CsCI-сахароза и центрифугировали 6 час при 70000g. Опалесцирующая полоса, содержащая вирус, формировалась в зоне с плотностью 1,34—1,35 г/мл. Концентраты вируса контролировали электронной микроскопией, спектрофотометрией и электрофорезом вирусных белков в SDS-ПААГ и хранили при температуре минус 40 70°С.

Определение прозрачности и концентрации белка в вирусной суспензии

Определение прозрачности вирусной суспензии проводили на фотоколориметре КФК-2 с использованием кюветы размером 20 мм при длине волны 540 нм. Контролем служила дистиллированная вода.

Количество растворённого белка определяли на спектрофотометре Shimadzu UV-260 при длине волны 280 нм. После определения оптической плотности образцов по калибровочной кривой, которую строили по стандартным растворам яичного белка, находили соответствующее значение количества растворённых белков.

Определение гемагглютинирующей активности вирусов ССЯ-76 и НБ

Гемагглютинирующую активность вирусов ССЯ-76 и НБ определяли с использованием 1% суспензии эритроцитов кур в планшетах с U-образными лунками. Титр гемагглютининов в материале выражали в виде лог2.

Определение активности вирусов СГПК и ССЯ-76 в ИФА

Активность вирусов СГПК и ССЯ-76 определяли в непрямом сэндвич-варианте ИФА по методике, разработанной в ФГУ «ВНИИЗЖ».

Инактивация вирусов СГПК и ССЯ-76

Инактивацию вирусов проводили димером аминоэтилэтиленимина (0,050,4%) в течение 24 48 час при температуре от 28 до 37°С.

Изготовление сорбированных вакцин

Для изготовления сорбированной вакцины в инактивированную суспензию вируса СГПК вносили 3% гель ГОА в соотношении 1:1-1:4 и 10% раствор сапонина.

Изготовление эмульгированных форм инактивированных вакцин

Суспензии инактивированных вирусов СГПК, ССЯ-76, ИБК и НБ смешивали на гомогенизаторе с масляными адъювантами в соотношении, рекомендованном производителем. Промышленные серии вакцин получали с использованием тех же компонентов, проводя эмульгирование на гомогенизаторе Silverson 450 LS (Великобритания).

Определение физических свойств инактивированных эмульгированных вакцин против СГПК, ССЯ-76, ИБК и НБ

Стабильность эмульсии определяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Кинематическую вязкость эмульгированных вакцин определяли на вискозиметре ВПЖ-2 (Россия) по методике, изложенной в паспорте, и выражали в мм2/с.

Исследования частиц эмульсии методом лазерной гранулометрии

Определение размера частиц дисперсной фазы проводили на лазерном анализаторе микрочастиц «Mastersizer S» (Великобритания) согласно рекомендациям по эксплуатации прибора.

Определение полноты инактивации вирусов СГПК и ССЯ-76

Полноту инактивации аденовирусов определяли методом двух-трехкратных «слепых» пассажей на: 10-20-суточных цыплятах для вируса СГГ1К и 9-12-суточных эмбрионах уток для вируса ССЯ-76.

Определение безвредности и антигенной активности инактивированных вакцин против СГПК, ССЯ-76, ИБК и НБ

Послеубойную визуальную оценку степени поражения тканей в месте введения вакцин проводили по критериям, предложенным Н. Stone [1997].

Для определения антигенной активности инактивированных вакцин против СГПК, ССЯ-76, ИБК и НБ использовали коммерческих цыплят яичных и мясных кроссов различных возрастов. Антигенную активность оценивали по титрам антител, определяемым в РДП, ИФА и РТГА. Значения титров, полученные в ИФА, представляли в виде величин, обратных разведениям.

Постановка реакции торможения гемагглютинации

РТГА ставили в плексигласовых планшетах микро- и макрометодом по стандартной методике с использованием рабочего разведения антигена, равного 4 ГАЕ.

Титром сыворотки считали её наибольшее разведение, при котором отсутствовала агглютинация эритроцитов.

Постановка ИФА для определения антител в сыворотках крови кур

Определение антител к различным вирусам проводили с использованием наборов ФГУ «ВНИИЗЖ» и' «Synbiotics», согласно прилагаемым к наборам инструкциям по применению.

Определение иммуногенной активности и протективности инактивированной вакцины против СГПК

Иммуногенность вакцины (ИмДз0 мл) определяли объёмным методом на 10-20-суточных цыплятах яичных кроссов путем введения разведений препарата (1:3, 1:9, 1:27 и 1:81), которых через 21 сут после прививки заражали вирусом СГПК. Проверку учитывали, если из 10 контрольных цыплят заболевало не менее 6.

ИмД50 мл вычисляли по формуле Кербера-Ашмарина lg ИмД50= lg Д - lg Kx(XLi-0,5). ПД50 рассчитывали путём деления прививной дозы на значение ИмД50.

Выделение ДНК аденовирусов кур

ДНК аденовирусов кур из очищенных вирионов выделяли по модифицированному методу Van der Eb (1969). При выделении ДНК из патологического материала готовили 20% суспензию, в которую добавляли денатурирующий раствор (гуанидинтиоцианат, саркозил, меркаптоэтанол в 0,1М трис-HCl), пропускали через GF/F фильтр (Whatman) и элюировали 40-60 мкл деионизованной воды.

Постановка ПЦР с помощью системы праймеров, ограничивающих фрагмент 3'-концевой области гена фибера вируса ССЯ-76

Реакции амплификации проводили с внешней парой праймеров (Fl, F4), а для реамплификации применяли внутреннюю пару праймеров (F2, F3).

Постановка ПЦР с помощью универсальных праймеров

Первую реакцию амплификации (35 циклов) проводили с праймерами hexl и hex4, а реамплификацию (25 циклов) с праймерами hex2 и ЬехЗ.

Секвенирование амплифицированных фрагментов кДНК

Амплифицированные фрагменты кДНК очищали с использованием набора «Wizard™ PCR Preps» (Promega). Циклическое секвенирование фрагментов кДНК проводили с помощью набора «fmol DNA Sequencing System Sample» (Promega). Продукты реакций секвенирования разделяли

электрофорезом в 4-6% полиакриламидных гелях с 7М мочевины и проводили радиоавтографию с пленкой Сгопех (США).

Компьютерный анализ и сравнение первичных нуклеопшдных и аминокислотных последовательностей

Для сравнения нуклеотидных последовательностей использовали программу «ALIGN» (Scientific & Educational Software), а для выбора оптимальной структуры праймеров - «OLIGO» (версия 4.0).

Сравнительный анализ нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей амплифицированных фрагментов геномов аденовирусов птиц проводили с использованием пакета программ SeqProgs (Data handling for molecular epidemiology), версия 1.0 (N. J. Knowles, IFAH).

Статистическая обработка результатов

Использовали общепринятые способы статистической обработки экспериментально полученных выборок варьирующих переменных. Определяли среднее значение выборки (М), стандартное отклонение (тх) и доверительный интервал средних значений. Корреляцию связанных переменных оценивали соответствующими коэффициентами.

Значимость всех опубликованных величин была не ниже первого критериального порога (р<0,05).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Анализ эпизоотической ситуации по синдрому гидроперикардита кур в Российской Федерации за 1995-2005гг.

Первый случай синдрома гидроперикардита кур в Российской Федерации был зафиксирован на птицефабрике «Сосновская» Челябинской области в 1992г. [Лагуткин Н.А. с соавт., 1992].

В 1995-1996гг. заболевание бройлеров СГПК с большим отходом было отмечено в ряде птицепредприятий Красноярского края, Республик Хакасия и Марий Эл. Гибель цыплят от СГПК регистрировали в возрасте 3-5 недель с высокими показателями заболеваемости и летальности.

Позднее, количество вспышек СГПК возрастало с вовлечением новых административно-географических регионов Российской Федерации. Так, в период с 1996 по 1999гг. синдром гидроперикардита фиксировали на птицефабриках, расположенных в Пермской, Челябинской, Томской, Архангельской, Свердловской областях, Республиках Карелия и Марий Эл, а также в Красноярском крае.

В 2000-2004гг. СГПК фиксировали в птицеводческих предприятиях мясного направления, расположенных в Южном федеральном округе, (Республика Адыгея, Краснодарский край, Республика Кабардино-Балкария, Республика Северная Осетия и Ставропольский край). Заболевание бройлеров начиналось в возрасте 19-22 сут и продолжалось в течение 12-16 сут. При этом показатель смертности от синдрома гидроперикардита кур был высоким и составлял от 37,3 до 55,8%.

В период эпизоотии С ЛПК в ЮФО четко прослеживался трансовариальмый путь передачи нируса. Бройлеры болели, как правило^ в тех птицефабриках, которые приобретали инкубационные яйца из неблагополучного репродуктора.

Географическое расположение регионов Российской Федерации, неблагополучных по синдрому гидропери кардита кур в период с i 995 по 2005 гг., отображено на рис, 1.

Рис. 1. Административно-географические регионы Российской Федерации, неблагополучный но СГПК в период с 1995 по 2005гг.

Всего с 1995 по 2005гг. синдром гидроперикардита кур, вызванный аденовирусом, был зарегистрирован в 81 птицефабрике, которые расположены а 5 Федеральных округах (Северо-Западный, Приволжский, Южный, Уральский и Сибирский) Российской Федерации. Следует отмстись, что па долю птице предприятий мясного направления приходилось 88,6% всех случаен. Стратегия специфической профилактики СГПК с помощью инактнвировгжнои вакцины, разработанной и ФГУ «Г5НИИЗЖ», дала ощутимые результаты ч ] 998-2001 гг. в итущифабрнках Уральского, Сибирского, Семеро-За на дно го и 11риволжского округов, а п 2003-2005гг. позволила значительно снизить заболеваемость бройлеров в Южном Федеральном округе.

2,2.2. Изучение этиологии синдрома гидроперикардита нур

В связи с появлением и птицеводческих Хозяйствах Российской Федерации нового заболевания цыплят с неизвестной этиологией возникла необходимость в его изучении.

/(ля экспериментального воспроизведения СГПК 28-суточным цыплятам, полученным из безлейкозного хозяйства ОНЦ РАМН, вводили внутримышечно, очищенную хлороформом и микрофильтрацией, 20% суспензию паренхиматозных органов, отобранных от больных бройлеров на

птицефабрике «Красноярская» в 1995г. Через 72-96 час после инокуляции материала была зарегистрирована гибель цыплят с проявлением характерных для синдрома гидроперикардита кур патологических изменений в органах (отек легких, гидроперикардит, гепатит, холецистит, панкреатит, нефрит). У павших птиц отбирали паренхиматозные органы для проведения дополнительных пассажей на СПФ и коммерческих цыплятах, используя оральный, окулярный, назальный и инъекционные пути инфицирования.

Заболевание СПФ-цыплят и коммерческих птиц с высоким уровнем смертности (до 90%) удавалось воспроизвести только при парентеральном введении материала (проведено 10 пассажей).

Для вирусологических исследований у павших СПФ-цыплят отбирали паренхиматозные органы, которые суспендировали в ФБР, очищали хлороформом и концентрировали ПЭГ-6000 с центрифугированием в градиенте CsCl-сахароза (кратность концентрирования до 100 по объему).

Концентрированный препарат негативно контрастировали 4% раствором фосфорновольфрамовой кислоты и исследовали в электронном микроскопе JEM 100В (Япония) при увеличении 1,8><105. Установлено, что препарат содержит безоболочечные вирусные частицы с икосаэдрической структурой капсида и диаметром 70-80 нм (рис. 2). Структура и размеры выявленных частиц были аналогичны структуре и размерам аденовирусов.

Рис. 2. Вирус СГПК при инструментальном увеличении 1,8><105.

Очищенный препарат реагировал в РДП с гипериммунной сывороткой Ну-уас (США), специфичной к I группе аденовирусов кур (РАёУ). Выделенный изолят был обозначен как «КР 95».

При сравнительном рестрикционном анализе генома изолята «КР 95» с геномами аденовирусов ССЯ-76 и РА(1У1 были установлены существенные отличия размеров геномов использованных вирусов.

Аналогичные различия между этими вирусами были получены и при определении степени гомологии геномов при гибридизации по Саузерну. Мажорный структурный полипептид вируса СГПК, предположительно гексон, имел примерно такую же молекулярную массу, как и гексон вируса РАс^!

(около 110 кДа), но другие полипептиды изолята «KP 95» отличапись по молекулярным массам от мол. масс полипептидов вирусов ССЯ-76 и FAdVI.

Таким образом, было показано, что этиологическим агентом синдрома гидроперикардита является аденовирус I группы. Дополнительно с помощью стандартных методик на основе ПЦР было установлено, что изолят «KP 95» вызывал СГПК без коинфекции вирусами инфекционной бурсапьной болезни, инфекционной анемии цыплят, инфекционного бронхита кур, ньюкаслской болезни и инфекционного энцефаломиелита птиц.

Изолят аденовируса «KP 95» не снижал свои вирулентные свойства через 10 пассажей на коммерческих цыплятах, вызывая их гибель от 70 до 100%, это позволило использовать данный изолят в качестве производственного штамма при наработке вирусного сырья.

В группах СПФ-цыплят искусственно инфицированных изолятами аденовирусов I группы (Петрозаводский, Красноярский, Кировградский, ПА-01 и Тбиллиский), выделенных на птицефабриках РФ в 1996-2005гг. от бройлеров больных синдромом гидроперикардита, регистрировался падеж птиц с признаками СГПК в течение 1-5 сут после заражения. Показатель смертности при этом был достаточно высоким и составлял 80-90%.

В 2000г. производственный штамм «KP 95» был депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве под регистрационным номером № KP 95 114 Деп.

2.2.3. Разработка молекулярных методов выявления и идентификации

аденовирусов кур'

Экономические потери, вызванные аденовирусами в птицефабриках РФ, продиктовали необходимость разработки высокоспецифичных и чувствительных методов лабораторной диагностики Одним из наиболее перспективных методов индикации аденовирусов птиц является ПЦР, которая позволяет выявлять геном вируса при различных формах течения болезни (острая, хроническая и субклиническая), а в сочетании с методом нуклеотидного секвенирования дает возможность получить информацию о генетических отличиях штаммов.

В связи с этим было целесообразно разработать и включить в схему лабораторной диагностики аденовирусных инфекций метод индикации и штаммовой дифференциации аденовирусов на основе ПЦР и секвенирования.

При разработке ПЦР для выявления генома вируса ССЯ-76 для амплификации и последующего секвенирования выбрали ген, кодирующий С-концевой глобулярный домен фибера. Домен содержит типоспецифическую антигенную у-детерминанту, идентичную вирусному гемагглютинину, что предполагало возможность проведения штаммовой дифференциации ССЯ-76 [Norrby Е. с соавт., 1976; Louis N. с соавт., 1994, Henry L.J. с соавт., 1994].

В результате были подобраны две пары олигонуклеотидных праймеров

' Данный раздел выполнен cobmrctho с сотрудником ФГУ «ВНИИЗЖ» Лобановым В А

(F1-F4, F2-F3), которые использовали для постановки ПЦР. Нуклеотидную последовательность амплифицированных фрагментов гена фибера определяли с использованием праймеров F2 и F3. Сравнение нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов генома штаммов 127, В8/78, Б-93 и БИСС показало полную гомологию между ними, а в нуклеотидной последовательности аналогичного фрагмента изолята L497, выделенного от больных кур на Украине, отмечены две замены в третьей позиции кодонов в области, кодирующей стержень фибера, не приводящие к замене аминокислот. Это согласуется с данными об отсутствии выраженных антигенных различий у возбудителей ССЯ-76 в серологических реакциях.

Наличие множества серологических вариантов FAdV значительно осложняет разработку методов лабораторной диагностики. На данный момент существует американская и европейская классификации FAdV на 12 серотипов, не соответствующих друг другу, что создает значительные трудности для разработки универсального метода ПЦР. Также трудностью на пути разработки универсального метода выявления FAdV с помощью ПЦР является отсутствие достаточной информации о первичной структуре гена, кодирующего гексон. Несмотря на широкую изученность аденовирусов в международных базах данных нуклеотидных последовательностей GenBank и EMBL на момент начала исследований, последовательности генома FAdV были представлены в единичных числах.

Поэтому, был проведен сравнительный анализ нуклеотидных и предполагаемых аминокислотных последовательностей гена гексона ряда аденовирусов млекопитающих и птиц (HAV2, BAV3, MAV1, FAdVl, FAdV 10, ССЯ-76), что позволило выявить наиболее консервативные области в структуре гена гексона у различных аденовирусов. На основании полученных данных подобраны две пары универсальных праймеров (hexl-hex4 и hex2-hex3), содержащие последовательности, соответствующие четырем наиболее консервативным аминокислотным мотивам пьедестальных областей PI и Р2 гена гексона. Данный набор праймеров использовали для индикации генома и штаммовой дифференциации аденовирусов с помощью ПЦР и секвенирования амплифицированных фрагментов.

Пригодность метода для выявления генома аденовирусов кур была проверена в реакциях с ДНК референтных штаммов FAdVl-12 (Spafas, США) и производственных штаммов ССЯ-76 (127, В 8/78, Б-93 и БИСС). В результате проведенных реакций были синтезированы фрагменты специфической длины во всех пробах.

Метод определения нуклеотидной последовательности консервативной области гена гексона на основе ПЦР и секвенирования амплифицированных фрагментов включен в комплексную схему диагностики аденовирусных инфекций, разработанную в ФГУ «ВНИИЗЖ», и используется для выявления аденовирусов кур (рис. 3).

За время проведенных исследований с помощью разработанных методов выявления аденовирусов были тестированы пробы внутренних органов из 196

птицефабрик Российской Федерации и стран СНГ. Выявлен и охарактеризован 41 изолят аденовирусов.

Рис. 3. Схема диагностических исследований при аденовирусных болезнях кур.

У выявленных изолятов аденовирусов кур были определены нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов гена гексона, которые сравнивали с помощью пакета прикладных программ «ВюЕсШ» с последовательностями референтных штаммов, опубликованных в ЕМВЬ, и между собой. На основе полученного выравнивания с помощью программы «Тгееу1е\у» была построена дендрограмма, показывающая уровень сходства нуклеотидных последовательностей и филогенетическое отношение штаммов и изолятов аденовирусов кур (Рис. 4).

На дендрограмме достаточно четко представлены две группы аденовирусов. Первую группу составляют штаммы и ряд изолятов, отнесенные к вирусу ССЯ-76. Исследованные последовательности вирусов ССЯ-76 имеют 100% гомологию на сравниваемом участке гена гексона, что возможно и определяет отсутствие антигенных отличий в этой группе.

Вторая группа менее однородна и представлена последовательностями штаммов и изолятов РАс1\Л На основе сравнения фрагмента гексона, выбранного для амплификации, представители РАс1У формируют 6 групп, что соответствует современной классификации на 6 генотипов. Таким образом, для анализа нами был выбран достаточно информативный участок генома, то есть секвенирование амплифицированного фрагмента генома выделенного изолята и последующий сравнительный анализ с базой данных нуклеотидных последовательностей позволяет проводить генотипирование.

AY683545

FA0554049 FAD431719 FAD459805 PET 12/98 ündovskaya 98 Krasnoyaisky 96 Volgskaya 98 BER10/98 Novooskolskaya 99

AAVMCPHEX

В

FAdV

Sitvenskaya 9 Kazansky99 AV683551 AY683S47

D1

EDS-76

Рис. 4. Дендрограмма, отражающая отношения между изолятами аденовирусов кур, установленная на основе структурной гомологии нуклеотидных последовательностей фрагмента гена гексона.

Филогенетические кластеры A-D соответствуют современной классификации аденовирусов на типы (species) [Benko М. с соавт., 2000].

Все выявленные нами изоляты относятся к двум генетическим кластерам С и D1. При этом группу С составляют представители серотипа FAdV4 (изоляты выделены при вспышках СГПК). Другая группа изолятов относится к кластеру, который составляют представители ряда других серотипов (FAdV 5, 6,7,9 и 12).

Довольно высокий уровень гомологии (92,2%) оказался при сравнительном изучении нуклеотидных последовательностей консервативной области гена гексона у изолятов, вызывающих у кур СГПК, и референтного штамма FAdV 10. Касательно данного факта следует отметить, что в литературе идет обсуждение вопроса об объединении штаммов FAdV4 и FAVdlO в один серотип [Егпу K.M. с соавт. 1995].

На основании проведенных исследований были разработаны и утверждены «Методические указания по индикации генома вируса ССЯ-76 с использованием ПЦР и секвенирования амплифицированных фрагментов гена фибера», которые вошли в «Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных методом полимеразной цепной реакции», рекомендованные Департаментом ветеринарии Минсельхоза России в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.

2.2.4. Разработка набора для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 методом иммуноферментного анализа2

Необходимость проведения работ по созданию набора для определения антител к вирусу ССЯ-76 была обусловлена тем, что определение иммунного статуса и проведение эпизоотологического мониторинга при вирусных болезнях птиц широко используют ИФА, обладающий высокой специфичностью, чувствительностью и стандартностью.

Отечественные исследователи разрабатывали ИФА для диагностики ССЯ-76 и показали его высокую специфичность и чувствительность, но не внедрили его в ветеринарную практику [Фомина Н.В., с соавт., 1984; Дубовой A.C. с соавт., 1988; Сергеев В.Д. с соавт., 1990].

При разработке набора для определения антител к вирусу ССЯ-76 иммуноферментным методом внимание было уделено следующим вопросам: получение высокоочищенных антигенов вируса и специфичных гипериммунных сывороток; сравнительные испытания различных вариантов постановки ИФА и определение оптимальной компоновки набора. Из всего разнообразия испытанных схем постановки ИФА предпочтение было отдано непрямому варианту, как наиболее практичному, менее трудоемкому и выполнимому при минимальном лабораторном обеспечении.

С целью проверки специфичности и чувствительности ИФА были проведены опыты, где динамику и уровень накопления антител к вирусу ССЯ-76 у кур определяли параллельно в РТГА и в ИФА. Статистический анализ результатов сравнительного выявления антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови в ИФА и РТГА показал наличие парной корреляции (R=0,86297) между использованными методами, что позволило рекомендовать ИФА для практического внедрения.

В 1997-2005гг. с помощью ИФА в ФГУ «ВНИИЗЖ» было исследовано около 30 тыс. проб сывороток крови, поступивших из 300 птицефабрик РФ и стран СНГ. Более 1500 наборов ИФА для определения антител к вирусу ССЯ-76 реализовано ветеринарным диагностическим лабораториям.

НТД на набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 методом ИФА была утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхоза России в 1999г. (ТУ 9388-015-00495527-99, наставление по применению № 13-5-02/0081).

Были проведены исследования по созданию набора для определения титров антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови кур при исследовании проб в одном разведении. Для прогнозирования титра антител по значению S/P (отношение оптической плотности (ОП) испытуемой сыворотки к значению ОП положительной контрольной сыворотки за вычетом из обоих значений ОП отрицательного контроля), измеренному для одного разведения сыворотки, использовали уравнения стандартной кривой, полученные методом линейной регрессии на основании титра, определенного методом последовательных разведений данной сыворотки.

2 Данный раздел выполнен совместно с сотрудником ФГУ «ВНИИЗЖ» Волковой М А

При отработке условий постановки реакции испытывали в качестве меченых детекторных антител антикуриный иммунопероксидазный конъюгат, а в качестве субстрата пероксидазный АБТС фирмы ЗупЬюйсв (Франция).

После оптимизации условий постановки и учета результатов ИФА были проведены сравнительные исследования полевых сывороток крови кур с применением разрабатываемого набора и набора, основанного на методе последовательных разведений сыворотки.

Статистический анализ результатов сравнительного выявления антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови кур в двух вариантах иммуноферментного анализа показал наличие парной корреляции (11=0,8959) между использованными методами, что позволило рекомендовать набор ИФА, основанный на тестировании одного разведения исследуемой сыворотки крови для практического внедрения.

Комплект НТД на набор для определения антител к вирусу ССЯ-76 иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении был утвержден в 2001г. Департаментом ветеринарии Минсельхоза России (ТУ 9388-068-00495527-01, наставление по применению № 13-5-02/0237).

Наборы для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 иммуноферментным методом при тестировании сывороток, как в одном разведении, так и при последовательных разведений, используются в комплексной схеме диагностики аденовирусных инфекций кур (рис. 3).

На основании выполненных исследований были подготовлены «Методические указания по определению антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови иммуноферментным методом», включенные в сборник «Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом», рекомендованный Департаментом ветеринарии Минсельхоза России в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.

2.2.5. Разработка технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против синдрома гидроперикардита чур

Разработка инактивированной вакцины против синдрома гидроперикардита кур была проведена в связи с появлением в птицеводческих предприятиях РФ высоковирулентных штаммов аденовирусов, вызвавших большой отход бройлеров.

Производственный штамм «КР 95» вируса СГПК был проверен на инфекционную активность, стерильность, контаминацию микоплазмами и посторонними вирусами и иммуногенность.

Результаты проверки на стерильность и контаминацию микоплазмами показали отсутствие контаминации матровых расплодок штамма «КР 95» бактериальной микрофлорой, грибами и микоплазмами.

Проведением вирусологических и молекулярно-биологических исследований штамма «КР 95» установлена его принадлежность к 4 серотипу 1 группы аденовирусов и показано отсутствие контаминации вирусами НБ, ИБК, ИББ и др.

Важным этапом в исследовании биологических свойств производственного штамма «КР 95» вируса СГГТК было определение его инфекционной активности, а также иммуногенности и протективности в составе инактивированной вакцины.

Для этого провели 10 последовательных пассажей штамма «КР 95» на 10-суточных СПФ-цыплятах, определяя при этом показатели смертности и титр инфекционной активности.

Установлено, что штамм «КР 95» был высоковирулентным и вызывал гибель цыплят после заражения от 93 до 100%. Инфекционная активность производственного штамма «КР 95» вируса синдрома гидроперикардита кур в пассажных уровнях была не менее 3,58±0,20 ^ ЛД5о/о,2мл-

Оценку иммуногенной активности штамма проводили в составе инактивированной вакцины, которую готовили из 15% суспензии печени цыплят, полученной от 1, 5 и 10 пассажа. В качестве адъюванта использовали 3% гель ГОА (1,5%).

Иммуногенность биопрепарата определяли объемным способом, путем прививки 8-суточных цыплят цельной вакциной и разведениями на «плацебо» (1:3, 1:9 и 1:27) в дозе 0,3 мл подкожно в шею. Через 21 сут после вакцинации всех цыплят заражали вирусом СГПК и определяли ИмД50 по формуле Кербера-Ашмарина.

Результаты исследований свидетельствуют о сохранении иммунобиологических свойств у штамма «КР 95» при проведении 10 последовательных пассажей на СПФ-цыплятах. Вакцина, изготовленная из вируса от 1 пассажа, содержала в прививном объеме 37,5 ПД50, а препарат, полученный из вирусного материала от 10 пассажа, был даже несколько активнее и имел в прививном объеме 43,0 ПД5о-

В 2002г. на производственный штамм «КР 95» аденовируса кур был получен патент РФ № 2193062, заявка № 2001129741 от 02.11.2001г.

При выборе оптимальной модели крупномасштабного культивирования производственного штамма «КР 95» установлено, что цыплята яичных кроссов в возрасте 30-55 сут наиболее чувствительны к парентеральному способу инфицирования вирусом СГПК (смертность цыплят регистрировалась практически в 100% случаев).

Результаты определения уровня накопления штамма «КР 95» во внутренних органах зараженных цыплят, полученные с помощью реакции диффузионной преципитации со специфической гипериммунной сывороткой и ИФА представлены в табл. 1, из которой видно, что вирус синдрома гидроперикардита кур максимально накапливался в печени.

Опираясь на результаты данных исследований, можно заключить, что для получения в производственных масштабах сырья, содержащего вирус СГПК, следует использовать печень цыплят яичных кроссов инфицированных штаммом «КР 95» в возрасте 30-60 сут. Полученные данные по культивированию штамма «КР 95» в организме цыплят были положены в основу технологического регламента по изготовлению инактивированной вакцины против СГПК.

Таблица I

Накопление вируса СГПК в различных органах цыплят после экспериментального заражения

(п=5)

10%-ная суспензия Активность суспензии в

РДП, лог2 ИФА, лог2

Печень 4,22±0,20 7,43±1,52

Почки 0 4,06±1,60

Селезенка 0 3,24±0,96

Легкие 0 3,62±0,48

Поджелудочная железа 0 3,08±0,80

Всего в период с 2001 по 2005г. в производственных условиях ФГУ «ВНИИЗЖ» по отработанной методике культивирования вируса СГПК было получено более 425 кг вирусного материала с активностью в ИФА выше 6 лог2, что свидетельствует об эффективности репродукции штамма «КР 95» в организме цыплят яичных кроссов.

Необходимость разработки метода очистки органо-тканевого вирусного материала при изготовлении инактивированной вакцины была обусловлена высоким содержанием в нем балластных белков, которые могут мешать проведению процесса инактивации, способствовать развитию воспалительных реакций в месте инъекции препарата и вызывать дополнительную нагрузку на иммунную систему птиц [Сергеев В.А., 1993].

Для удаления балластных примесей из вирусного материала были испытаны комбинированные варианты очистки детергентами, флокулянтами и центрифугированием.

Результаты проверки иммунобиологических свойств суспензий вируса СГПК, очищенных разными способами, показали, что наиболее успешным было использование хлороформа, высокомолекулярного полигуанидина и фреона-113 в конечной концентрации 2,5; 0,01 и 2,5%, соответственно, с последующим низкоскоростным центрифугированием или сепарированием.

В табл. 2 приведена характеристика биологических и физических показателей очищенных суспензий вируса синдрома гидроперикардита кур, определенных с помощью ИФА и спектрофотометрии, которые подчеркивают установленную ранее зависимость влияния концентрации реактивов (детергенты, флокулянт) на степень удаления балластных примесей и биологические показатели вируса.

Итак, в лабораторных условиях было отработано несколько эффективных вариантов комбинированных способов очистки органо-тканевой суспензии, содержащей вирус синдрома гидроперикардита кур от балластных примесей, которые были внедрены в промышленную технологию изготовления инактивированной сорбированной вакцины.

Таблица 2

Сравнительная характеристика суспензий вируса СГПК, очищенных различными способами

(п=5)

Способ очистки Прозрачность, % Количество белков, мг/% Активность в ИФА, лог2

Хлороформ (2,5%) 32,2±0,6 3412±765 9,0±0,2

Фреон-113 (2,5%) 40,4±1,2 2625±586 9,1 ±0,3

ВПГ (0,01%) 28,8±0,6 4462±852 9,1 ±0,2

ВПГ (0,01%) хлороформ (2,5%) 26,4± 1,4 3844±688 9,2±0,3

Центрифугирование 10,4±0,8 5224±950 8,2±0,3

Исходная суспензия Менее 5 ]0125±1336 9,2±0,2

При отработке процесса инактивации штамма «КР 95» в органо-тканевой суспензии был определен эффективный режим инактивации вируса с помощью димера аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ), позволяющий необратимо подавить инфекционную активность вируса при максимальном сохранении его антигенных свойств. Режим инактивации вируса синдрома гидроперикардита кур имел следующие параметры: концентрация АЭЭИ - 0,3-0,4%, температура смеси при инактивации - 28-35°С и продолжительность инактивации - 24 час.

Иммунобиологические свойства инактивированных противовирусных вакцин напрямую зависят от качества и количества инактивированного антигена и адъювантов, входящих в их состав. При выборе адъювантов для инактивированной вакцины против СГПК использовали недорогие и широко применяемые в ветеринарной практике сапонин и гель ГОА.

Установлено, что оптимальная иммунологически сбалансированная концентрация геля ГОА и сапонина в составе инактивированной вакцины против СГПК составляет в пересчете на сухое вещество 1,0-1,5% и 1,0-1,5 мг/мл, соответственно.

При изучении влияния способа введения препарата на его иммунобиологические свойства установлено, что иммуногенная активность инактивированной сорбированной вакцины против СГПК была несколько выше при подкожном введении.

Предварительные исследования по изучению совместимости масляных адъювантов и инактивированной суспензии вируса СГПК показали, что они образовывали при помощи гомогенизатора однородные эмульсии типа «вода-масло» и «вода-масло-вода».

Инактивированная вакцина против СГПК, приготовленная на основе масляного адъюванта Монтанид ИЗА 70, была более иммуногенной при всех испытанных способах введения, чем препарат, содержащий адъювант Монтанид ИЗА 206.

В месте инъекции препарата у цыплят регистрировали легкие изменения тканей и незначительное остаточное количество вакцины.

При разработке средств специфической профилактики СГПК следует учитывать тот факт, что заболевание цыплят может проявляться в раннем возрасте (до 15 сут). Поэтому инактивированная вакцина против СГПК должна обладать свойствами «ранней защиты».

Динамика формирования иммунитета у цыплят после прививки инактивированной сорбированной вакциной против СГПК приведена в табл. 3.

Таблица 3

Динамика формирования иммунитета у цыплят, привитых инактивированной сорбированной вакциной против СГПК

(п=3)

Активность Срок после Доза, Количество Уровень

антигена в прививки, мл защищенных цыплят защиты,

вакцине, лога час (в числителе) %

24 0,3 ■ 1/10 10

4,0 0,6 2/10 20

48 0,3 4/10 40

0,6 5/10 50

24 0,3 1/10 10

7,0 0,6 9/10 90

48 0,3 7/10 70

0,6 10/10 100

24 0,3 9/10 90

8,0 0,6 9/10 90

48 0,3 10/10 100

0,6 10/10 100

Контрольная группа - - 0/10 0

В экспериментах с контрольным заражением цыплят, привитых инактивированной вакциной против СГПК, установлено, что срок формирования защиты у птиц подчиняется зависимости «доза-эффект».

При разработке схемы специфической профилактики СГПК в бройлерных предприятиях было показано, что инъекция инактивированной вакцины цыплятам в возрасте от 5 до 12 сут является наиболее оптимальным сроком.

Продолжительность иммунитета у птиц, привитых инактивированной вакциной против СГПК, определяли по срокам циркуляции специфических антител к возбудителю СГПК. Результаты опытов показали, что вакцина против синдрома гидроперикардита кур индуцировала у привитых бройлеров образование специфических антител к вирусу СГПК, которые регистрировали в РДП и ИФА до конца периода выращивания (45 сут).

Одним их важных качеств инактивированных противовирусных вакцин является сохраняемость иммунобиологических свойств биопрепарата при длительном хранении. Иммуногенную активность инактивированной сорбированной вакцины против СГПК контролировали объемным способом сразу после изготовления и в процессе хранения при температуре 2-8°С в течение 18-33 мес. В экспериментах установлено, что иммуногенная и протективная активность инактивированной вакцины против СГПК не снижалась в процессе длительного хранения при температуре от 2 до 8°С.

Так, показатель ПД50 в прививном объеме 0,3 мл у вакцины после изготовления составил 37,5, а через 33 месяца хранения при температуре 2-8°С - 33,7. Показатели ИиДм,™ для данного биопрепарата составили 0,0080 и 0,0089, соответственно.

Результаты комиссионной проверки эффективности инактивированной вакцины против синдрома гидроперикардита кур в ОАО «Птицефабрика «Приморская» Краснодарского края, проведенной согласно приказу № 33 Департамента ветеринарии от 15.08.2001г., показали, что биопрепарат был безвреден для бройлеров в «тест-дозе» (3 прививных объема) и имел показатель эффективности вакцинации равный 86,7%.

После проведения комиссионной проверки эффективности вакцины против СГПК инактивированной сорбированной этот биопрепарат был рекомендован для использования в промышленном птицеводстве.

Применение инактивированной сорбированной вакцины против СГПК в неблагополучных птицехозяйствах Ставропольского края и Республики Кабардино-Балкария позволило повысить сохранность бройлеров по закрытым партиям с 30-70 до 94-96%.

Установлено, что ремонтный молодняк родительских стад необходимо иммунизировать инактивированной сорбированной вакциной против СГПК двукратно, первый раз в возрасте 10-20 сут в прививном объеме 0,3 мл с последующей ревакцинацией за 1 мес до начала яйцекладки в дозе 0,6 мл.

Эксперименты по определению продолжительности циркуляции специфичных к вирусу синдрома гидроперикардита кур МАТ у цыплят, полученных от родительских стад привитых по такой схеме, показали, что циркуляция пассивных антител к возбудителю СГПК у бройлеров регистрировалась до 12 сут. Максимальные уровни антител были обнаружены у цыплят в период с 3 по 6 сут жизни.

НТД на вакцину против СГПК инактивированную сорбированную была утверждена в 2004г. Департаментом ветеринарии Минсельхоза России без ограничения срока действия (ТУ 9384-129-00495527-03, наставление по применению № 13-3-04/1064). В 2003г. Российским агентством по патентам и товарным знакам были выданы следующие патенты: № 2195959 «Инактивированная вакцина против синдрома гидроперикардита кур» от 10.01.2003г.; № 2199342 «Способ изготовления инактивированной вакцины против синдрома гидроперикардита кур» от 27.02.2003г.; № 2213576 «Способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против синдрома

гидроперикардита кур» от 10.11.2003г. и № 22163351 «Инактивированная эмульсионная вакцина против синдрома гидроперикардита кур» от 20.11.2003г.

2.2.6. Разработка технологии изготовления и контроля инактивированной

вакцины против ССЯ-76

Появление в птицефабриках Российской Федерации вируса ССЯ-76 и нанесение им серьезного экономического ущерба послужило основанием для проведения НИР по созданию инактивированной эмульгированной вакцины.

Получение высокоиммуногенных инактивированных противовирусных вакцин, главным образом, зависит от качества производственных штаммов и метода наработки биомассы [Сергеев В.А., 1993].

Поэтому с целью получения нового производственного штамма вируса синдрома снижения яйценоскости-76 были проведены селекционные работы с полевым изолятом, выделенным в 1999г. на птицефабрике «Отрадненская», Ульяновской области.

Установлено, что выделенный изолят имел морфологическое (рис. 5) и генетическое соответствие референтным штаммам вируса ССЯ-76, был свободен от контаминации бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами, а также накапливался с высоким инфекционным титром (7,22±0,08 ^ ЭИД50/0,2мл) в экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ) инокулированных утиных эмбрионов (УЭ).

Рис. 5. Электронная микрофотография вирионов штамма «БИСС» при инструментальном увеличении 1,8x105.3

Полученному штамму было дано название «БИСС» и 05.10.2000г. он был депонирован во Всероссийской государственной коллекции - штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве под регистрационным номером «БИСС № 113 ДЕП».

3 Исследование штамма «БИСС» методом электронной микроскопии проведено совместно с сотрудником ФГУ «ВНИИЗЖ» А П Пономаревым

В экспериментах по сравнительному изучению эффективности культивирования производственных штаммов «БИСС» и «В 8/78» в развивающихся УЭ было установлено, что новый штамм имел более выраженные биологические свойства, чем прототип (табл. 4).

Таблица 4

Биологические свойства производственных штаммов «БИСС» и «В 8/78» вируса ССЯ-76 репродуцированных в развивающихся эмбрионах уток

(п=8)

Штамм Пассаж Инфекционная активность, lg ЭИД^димл РГА, лог2 ИФА

«В 8/98» 1 6,42±0,20 17,8±0,2 8960±485

2 6,62±0,16 18,0±0,2 7480±642

3 6,88±0,18 18,8±0,2 9600±342

«БИСС» 1 6,83±0,12 18,0±0,2 10240±266

2 7,04±0,16 19,4±0,4 >12800

3 1,22±0,08 20,0±0,2 >12800

При отработке методики крупномасштабного культивирования штамма «БИСС» в эмбрионах уток в качестве системы репродуцирования были выбраны УЭ 9-10-суточной инкубации кросса «Благоварский» и установлены следующие ключевые параметры этого процесса: инфекционная активность инокулята - от 6,0 до 7,0 1ц ЭИД50/0,2мл; экспозиция инкубации инфицированных эмбрионов - 120 час.

Вирусная суспензия, полученная на утиных эмбрионах, содержит большое количество балластных белков, которые мешают образованию стабильной эмульсии, а также могут приводить к развитию поствакцинальных осложнений {риршэ Ь., 2002, 2004].

Для удаления балластных белков из вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости (ВСЭЭЖ) были испытаны и сравнены следующие методы: высокоскоростное проточное центрифугирование, микрофильтрация через каскад фильтров, применение различных концентраций детергентов (хлороформ, фреон-113) и поликатионного высокомолекулярного флокулянта полигексаметиленгуанидингидрохлорида (ВПГ) в сочетании с низкоскоростным центрифугированием.

Установлено, что осветление ВСЭЭЖ на проточной центрифуге ОТР-102К-01 было наиболее эффективным при скорости подачи материала 75-100 л/час и позволяло удалить до 50% балластных примесей.

Фильтрация инактивированного вируса ССЯ-76 через каскад фильтров НС, КФБЖ и КФП-С не оказывала негативного влияния на биологические свойства суспензии (активность в РГА и ИФА, антигенная активность в составе вакцины) и позволяла удалить до 30% балластных белков.

Использование для очистки ВСЭЭЖ детергентов и флокулянтов в комбинации с низкоскоростным центрифугированием приводило к существенному снижению активности материала в РГА (на 2,0-4,0 лог:).

При отработке режима инактивации вируса ССЯ-76 стояла задача подбора эффективной концентрации инактиванта и оптимальных параметров процесса инактивации, обеспечивающих полное и необратимое подавление инфекционной активности возбудителя при максимальном сохранении его иммунобиологических свойств (антигенная активность, безвредность).

Инактивацию вирусных суспензий проводили при температуре 28 и 37°С димером аминоэтилэтиленимина, который инокулировали в материал до конечной концентрации от 0,1 до 0,4%.

Динамика инактивации инфекционных свойств вируса ССЯ-76 находилась в прямой зависимости от конечной концентрации АЭЭИ в материале, продолжительности его контакта с возбудителем и температуры реакционной смеси.

Таким образом, был отработан эффективный режим инактивации вируса ССЯ-76 с помощью димера АЭЭИ, не оказывающий существенного влияния на иммунобиологические свойства материала. Режим инактивации вируса ССЯ-76 при экспозиции в 48 час имел следующие параметры: концентрация АЭЭИ - от 0,3 до 0,4%, температура смеси - от 28 до 37°С.

При выборе адъюванта использовали широкий спектр опытных и коммерческих масляных адъювантов, образующих эмульсию различных типов (табл. 5).

Таблица 5

Характеристика масляных адъювантов для инактивированных вакцин

Наименование адъюванта Производитель Тип эмульсии Соотношение водной и масляной фаз

ФГУ «ВНИИЗЖ» Россия В/М 40/60

Монтанид ИЗА 70 БЕРРГС, Франция В/М 30/70

Монтанид ИЗА 50 8ЕРР1С, Франция В/М 50/50

Монтанид ИЗА 763 А 8ЕРР1С, Франция В/М 30/70

Монтанид ИЗА 708 БЕРРГС, Франция В/М 30/70

Монтанид ИЗА 740 8ЕРР1С, Франция В/М 30/70

Монтанид ИЗА 206 БЕРР1С, Франция В/М/В 50/50

Монтанид ИЗА 266 БЕРРГС, Франция В/М/В 50/50

Монтанид ИМС 1312 БЕРРЮ, Франция н 80/20

Эмульсиген МУР, США М/В 80/20

Эмульсиген 54 МУР, США В/М 50/50

Примечание: типы эмульсий: В/М - «вода/масло»; М/В - «масло/вода»; В/М/В - «вода/масло/вода»; Н - эмульсия с наночастицами.

У инактивированных вакцин против ССЯ-76, изготовленных на базе различных масляных адъювантов, определяли тип эмульсии, кинематическую вязкость, стабильность эмульсии после низкоскоростного центрифугирования и в процессе хранения при температурных режимах 2-8, 20 и 35°С, а также

изучали антигенную активность, общую и местную безвредность. Дополнительно методом лазерной гранулометрии на анализаторе микрочастиц «Маз1ег517.ег Б» (Великобритания) измеряли размер частиц дисперсной фазы эмульсии и рассчитывали показатель СПАН, который характеризует однородность эмульсионных частиц (эмульсия считается однородной при СПАН менее 2,0).

Наиболее оптимальные физические показатели (средний размер частиц дисперсной фазы - 0,83 мкм при диапазоне от 0,32 до 1,62 мкм; СПАН - 1,98; стабильность при температуре 2-8°С более 12 мес.; кинематическая вязкость менее 50,0 Мм^/с) и иммунобиологические свойства (безвредность в «тест-дозе»; антигенная активность выше 7,0 лог2 через 28 сут после прививки), удовлетворяющие международные требования [С)ое1 Т.Я., 1997], предъявляемые к инактивированным вакцинам против ССЯ-76, имел биопрепарат, изготовленный на основе масляного адъюванта Монтанид ИЗА 70, что позволило приступить к исследованиям по отработке оптимального компонентного состава вакцины против ССЯ-76.

Для определения оптимального компонентного состава в инактивированной вакцине против ССЯ-76 - соотношения дисперсной фазы (инактивированный вирус) и дисперсной среды (масляный адъювант Монтанид ИЗА 70) были изготовлены опытные образцы препарата с различным весовым содержанием водной и масляной фаз (20/80, 30/70 и 40/60), а так же с различной концентрацией инактивированного вируса ССЯ-76 в водной фазе (от 400 до 4000 ГАЕ).

Установлено, что наиболее стабильную эмульсию (более 12 мес. при температуре 2-8°С) и выраженные иммуногенные свойства имел биопрепарат, приготовленный из 70 частей масляного адъюванта Монтанид ИЗА 70 и 30 частей водной фазы с концентрацией инактивированного вируса синдрома снижения яйценоскости -76 в дисперсной фазе не менее 1000 ГАЕ (10 лог2 в РГА).

Эксперименты по изучению продолжительности и напряженности иммунитета у кур привитых в возрасте 90 сут инактивированной вакциной против ССЯ-76, полученной на базе масляного адъюванта Монтанид ИЗА 70, показали, что оба прививных объема препарата (0,3 и 0,5 мл), обусловили выработку напряженного иммунитета у птиц продолжительностью 12 мес. (срок наблюдения) (рис. 6).

Опытно-промышленные образцы инактивированной эмульгированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 имели стабильную эмульсию и обладали выраженной антигенной активностью в процессе хранения продолжительностью 12 мес. (гарантийный срок реализации вакцины) при температуре 2-8°С.

При изучении иммунобиологических свойств инактивированной эмульгированной вакцины против ССЯ-76 в условиях промышленных птицеводческих предприятий было показано, что вакцина не вызывала у привитых птиц поствакцинальных осложнений местного или общего характера, что свидетельствует о ее безвредности.

Возраст кур, сут

-*-0,3 мл ~й--0,5 мл Д контроль

Рис. 6. Динамика формирования специфических антител к вирусу ССЯ-76 у кур после иммунизации инактивированной вакциной в прививных объемах 0,3 и 0,5 мл.

Динамика формирования поствакцинального иммунитета у кур, привитых в условиях птицефабрик Российской Федерации в возрасте от 90 до 120 сут инактивированной эмульгированной вакциной против синдрома снижения яйценоскости-76, изготовленной промышленным способом в ФГУ «ВНИИЗЖ», свидетельствует о том, что протективный уровень специфических антител к вирусу ССЯ-76 (более 5,0 лог2) у птиц был сформирован через 15-30 сут после введения биопрепарата.

Максимальные титры специфических антигемагглютининов (от 10,0 до 11,0 лог2) были обнаружены у кур через 60-70 сут после иммунизации инактивированной вакциной. В более поздние сроки (8-10 мес) после иммунизации у птиц регистрировали незначительное снижение специфических антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 до уровня 7,5-8,5 лог2. Случаев снижения яичной продуктивности, вызванных возбудителем ССЯ-76, у кур иммунизированных биопрепаратом ФГУ «ВНИИЗЖ» не регистрировали.

Основные технологические параметры изготовления и биологического контроля качества инактивированной вакцины против ССЯ-76, определенные в ходе лабораторных исследований, были положены в основу комплекта НТД на производство вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированной эмульгированной (ТУ 9384-026-00495527-00 и наставление по применению № 13-4-2/2208), который был утвержден Департаментом ветеринарии Минсельхоза России в 2000г. В 1998-2005гг. было изготовлено и реализовано 135,8 млн. прививных доз вакцины.

Технология изготовления вакцины защищена следующими патентами РФ: инактивированная вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 -патент РФ № 2233671 от 10.08.2004г„ заявка № 2003100194; способ изготовления инактивированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 - патент РФ № 2239452 от 10.11.2004г., заявка № 2003100193 от 04.01.2003г.

2.2.7. Разработка технологии изготовления и контроля ассоциированных инактивированных вакцин с компонентом синдрома снижения яйценоскости- 76

Специфическая профилактика ряда вирусных болезней (НБ, ИБК, ССЯ-76), вызывающих у кур снижение яичной продуктивности, с помощью инактивированных биопрепаратов является одним из обязательных условий эффективного ведения современного промышленного птицеводства. Использование для этих целей моновакцин эффективно, но требует повышенных трудозатрат и сопровождается многократным стрессированием птиц, а также может привести к возникновению поствакцинальных осложнений местного характера.

Поэтому при конструировании оптимального компонентного состава ассоциированных инактивированных вакцин против синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционного бронхита кур и ньюкаслской болезни птиц наши исследования были нацелены на достижение баланса между высокой антигенной активностью препарата и безвредностью.

Результаты исследований, направленных на разработку иммунологически сбалансированной пропорции инактивированных вирусов ССЯ-76, НБ и ИБК в водной фазе (дисперсная фаза) би- и трехвалентных вакцин, приготовленных на основе масляного адъюванта Монтанид ИЗА 70, приведены в табл. 6.

Установлено, что ассоциированные эмульгированные вакцины против ССЯ-76, ИБК и НБ, содержащие в дисперсной фазе инактивированные вирусы НБ и ССЯ-76 с агглютинирующей активностью 9,0 и 12,0 лог2, соответственно, а так же инактивированный вирус ИБК с титром в ИФА 1600, были антигенно активны и не уступали по этим показателям моновалентным биопрепаратам.

Полученные данные согласуются с сообщениями многих авторов о том, что иммунный ответ птиц на вирусные компоненты, включенные в состав моно и ассоциированных вакцин, отличался незначительно [Zanella A., Marchi R., 1981; Stone Н., 1988; Bidin Z. с соавт., 1995 и др.].

Таблица 6

Антигенная активность моно- и ассоциированных инактивированных вакцин против ССЯ-76, ИБК и НБ

(п=3)

Вакцина Активность антигена в водной фазе Титры антител* Индекс сероконверсии

До прививки Через 28 сут после прививки

ССЯ-76 12,0 лог2 н/о 10,2±0,4 10,2

ИБК 1600 3246/22 14662/16 4,52

НБ 9,0 лог2 6,8±0,2 14,4±0,4 7,6

ССЯ-76 ИБК 12,0 лог. н/о 9,8±0,2 9,8

1600 3678/18 14988/21 4,08

ССЯ-76 НБ 12,0 лог2 н/о 10,4±0,3 10,4

9,0 лог? 6,2±0,1 14,2±0,2 8,0

ССЯ-76 ИБК НБ 12,0 лог2 н/о 10,1 ±0,2 10,1

1600 2984/24 16346/21 5,48

9,0 лог2 7,2±0,3 14,6±0,4 7,4

Контрольная группа

ССЯ-76 - н/о н/о -

ИБК - 3156/28 2124/34 -

НБ - 6,4±0,2 5,8±0,4 -

Примечание: средние титры антител к вирусам ССЯ-76 и НБ в РТГА выражены через лог2; н/о - не обнаружили; 3156/28 - в числителе средний геометрический титр специфических антител к вирусу ИБК, определенный в ИФА, в знаменателе - коэффициент вариации (коэффициент вариации менее 40% свидетельствует об однородном иммунитете).

Определение оптимального компонентного состава инактивированных ассоциированных вакцин против ССЯ-76, ИБК и НБ позволило приступить к

расширенному изучению физических и иммунобиологических свойств данных биопрепаратов.

Для сравнения эффективности ассоциированных би- и трехвалентных форм инактивированных вакцин против ССЯ-76, ИБК и НБ, изготовленных в ФГУ «ВНИИЗЖ», с зарубежными аналогами (Интервет, Мериал, Сева и Шафит) были проведены эксперименты, в которых установлено, что максимальный иммунный ответ к компоненту ССЯ-76 (от 9,4±0,5 до 12,4±0,2 лог2), определенный через 42 сут (срок наблюдения) после вакцинации, был обнаружен у кур, привитых препаратами ФГУ «ВНИИЗЖ». Иммунный ответ птиц на инактивированный вирус ИБК был примерно одинаковым для всех вакцин, содержащих данный компонент, и находился в пределах от 15565 до 18900. Титр специфических антител к вирусу ныокаслской болезни птиц был выше у кур после введения ассоциированных биопрепаратов ФГУ «ВНИИЗЖ», Сева и Мериал (11,8±0,5 лог2,12,0±0,1 лог2и 12,4±0,6 лог2, соответственно).

При оценке реакции тканей в месте инъекции установлено, что степень изменений была легкой после применения всех вакцин, за исключением биопрепарата фирмы Интервет, вызвавшего изменения грудных мышц средней степени.

Анализ данных, полученных при изучении динамики циркуляции специфических антител к вирусам ССЯ-76, НБ и ИБК у кур, однократно иммунизированных в возрасте 90 сут би- и трехвалентной ассоциированными вакцинами в прививном объеме 0,3 и 0,5 мл, показывает, что биопрепараты обладали выраженной антигенной активностью по всем специфическим компонентам, включенным в их состав, независимо от дозы (табл. 7).

Изучение степени местной реакции тканей у кур на ассоциированную эмульгированную вакцину против НБ, ИБК и ССЯ-76 при различных вариантах внутримышечной и подкожной инъекции позволило установить, что препарат не реактогенен. Степень поражения тканей у птиц, привитых внутримышечно в область груди, бедра и крыла и подкожно в область шеи, была лёгкой. Реакция тканей была более выражена у кур, иммунизированных в мышцы крыла, что согласуется с сообщениями [Mutalib С. с соавт., 1994 и Sander J., 1997]. Альтернативный метод введения вакцины подкожно в область паха, предложенный [Dutton R., 1998], не обеспечил в наших экспериментах полного рассасывания эмульсии, причём остатки вакцины обнаруживали в области скакательного сустава. Оптимальными способами введения вакцины, при которых не обнаруживали следов эмульсии через 42 сут после прививки, оказались: подкожная инъекция в среднюю треть шеи и инъекция в копчик, что подтверждает данные [Glisson J.R. с соавт., 1990,1998].

В экспериментах по изучению влияния температурного фактора (минус 20, 2-8, 37, 56 и 70°С) на стабильность эмульсии и антигенную активность у инактивированной вакцины против НБ, ИБК и ССЯ-76 установлена сохранность иммунобиологических и физических свойств препарата в процессе длительного хранения при температуре 2-8°С (12 мес.) и кратковременной экспозиции (до 24 час) при температуре минус 20°С и 37°С.

Таблица 7

Поствакцинальный иммунитет у птиц, привитых би- и трехвалентными формами вакцин против ССЯ-76, ИБК и НБ, в объеме 0,3 и 0,5 мл

Вакцина Прививной объем, мл Антиген Уровень специфических поствакцинальных антител*

Срок после иммунизации, сут

0 30 60 90 120 150 180 210 240

ССЯ-76, ИБК 0,3 ССЯ-76 н/о 9,3±0,1 9,5±0,1 8,5±0,1 8,0±0,1 7,5±0,2 7,5±0,2 7,3±0,2 7,0±0,2

ИБК 3610 17266 18265 14843 20781 20845 18742 16388 13453

0,5 ССЯ-76 н/о 8,8±0,2 10,2±0,3 9,4±0,1 9,0±0,1 8,4±0,2 8,4±0,2 8,6±0,2 7,8±0,2

ИБК 3692 16944 20563 17593 20354 21467 16588 17961 14514

ССЯ-76, ИБК, НБ 0,3 ССЯ-76 н/о 7,6±0,3 7,8±0,2 8,2±0,2 7,4±0,2 7,4±0,3 7,8±0,2 7,4±0,3 7,8±0,2

ИБК 3642 18452 19323 12287 18864 18431 15563 14362 13045

НБ 6,9±0,3 10,8±0,2 11,3±0,4 9,8±0,2 9,6±0,1 9,0±0,3 9,2±0,2 9,4±0,2 9,0±0,2

0,5 ССЯ-76 н/о 9,8±0,1 9,4±0,2 10,0±0,2 9,0±0,1 8,8±0,2 7,8±0,2 7,8±0,1 7,3±0,2

ИБК 3602 18740 18865 16244 14486 19123 15344 16432 16276

НБ 6,9±0,3 9,8±0,2 9,4±0,1 9,0±0,2 8,0±0,3 7,3±0,3 7,8±0,2 8,0±0,2 8,3=0,2

Контроль - ССЯ-76 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о

ИБК 3648 3029 н/и 2486 2678 н/и н/и 1988 1512

НБ 6,9±0,3 6,8±0,2 н/и 6,4±0,2 6,0±0,3 н/и н/и 5,8±0,1 5,2±0,2

*Примечание: средний титр антител в РТГА выражен через лог2; н/о - не обнаружили; н/и - не исследовали.

Изучение динамики образования специфических антител к вирусам ССЯ-76, ИБК и НБ у кур яичного и мясного кроссов, привитых ассоциированной вакциной в производственных условиях в возрасте НО и 130 сут, соответственно, показало, что у птиц обоих кроссов регистрировали выраженную сероконверсию ко всем специфическим биологическим компонентам препарата в первые 4 мес. после иммунизации (рис. 7).

вакц.

Срок после иммунизации, мес

—♦—НБ (м) -6-ССЯ-76 (м) ИБК (м) *~Р~НБ (я) -*-ССЯ-76 (я) -«-ИБК(»0

Рис. 7. Динамика формирования специфических антител к вирусам ССЯ-76, ИБК и НБ у кур мясного и яичного кроссов после иммунизации ассоциированной инактивированной вакциной. Примечание: (м) - мясной кросс, (я) - яичный кросс.

В более отдаленные сроки после прививки у кур обоих кроссов отмечалось снижение уровней специфических антител к вирусам ССЯ-76, ИБК и НБ, однако титры поствакцинальных антител к указанным возбудителям всегда в несколько раз превышали протективные титры.

Следует отметить, что концентрация специфических антител к вирусам ССЯ-76 и ИБК, определенная в ИФА, была в 1,7 раза выше у яичных кур, чем у мясных. В отношении антител к возбудителю ньюкаслской болезни птиц эта разница составила 2,5 раза.

Цыплята, полученные от родительских стад, иммунизированных ассоциированной вакциной, имели однородный пассивный иммунитет к вирусам: НБ от 10 до 20 сут, ИБК от 5 до 15 сут и ССЯ-76 от 5 до 20 сут, в зависимости от возраста кур.

Основные технологические параметры изготовления и биологического контроля качества ассоциированных инактивированных вакцин против НБ, ИБК и ССЯ-76, определенные в ходе лабораторных исследований, были

положены в основу НТД на производство ассоциированных инактивированных вакцин против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76, которая была утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхоза России без ограничения срока действия (ТУ 9384029-00495527-00, наставление по применению № 13-4-2/2204 от 25 12.2000г.). В период с 1998 по 2005г. было изготовлено и реализовано более 350 млн. прививных доз ассоциированных вакцин с компонентом ССЯ-76.

3. ВЫВОДЫ

1. Установлено, что этиологической причиной синдрома гидроперикардита кур является аденовирус, генетически родственный референтному штамму серотипа РАс1У4, родаЛ\~шс1епо\1ги$.

2. Разработан метод индикации и идентификации аденовирусов кур, принадлежащих к родам Ау'шйепох'тт и А1ас1епоу1гш на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования амплифицированных фрагментов кДНК.

3. Разработана и внедрена в промышленное производство технология изготовления и контроля инактивированной сорбированной вакцины против синдрома гидроперикардита кур на основе производственного штамма «КР 95», репродуцированного в организме восприимчивых птиц, очищенного детергентами и сепарированием, инактивированного димером этиленимина.

4. Разработанная инактивированная сорбированная вакцина против синдрома гидроперикардита кур безвредна, антигенно активна, высокоиммуногенна при разных способах парентерального введения и сохраняет свои иммунобиологические свойства при длительном хранении при температуре от 2 до 8°С (до 12 месяцев срок наблюдения). Напряженный иммунитет у привитых птиц сохраняется в течение 6 месяцев.

5. Цыплята, полученные от кур, привитых инактивированной вакциной против синдрома гидроперикардита кур, приобретают пассивный иммунитет против этой болезни, который сохраняется до 12-суточного возраста.

6. Получен производственный штамм «БИСС № 113» вируса ССЯ-76, обладающий выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, и позволяющий при крупномасштабном культивировании в развивающихся утиных эмбрионах нарабатывать вирусный материал с высокими биологическими свойствами (инфекционная активность не менее 7,0 ^ ЭИД5о/о,2М, агглютинирующая активность не менее 18,0 лог2).

7. Разработана и внедрена в промышленное производство технология изготовления инактивированной эмульгированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 на базе производственного штамма «БИСС», репродуцированного в развивающихся утиных эмбрионах, инактивированного 0,3-0,4% димера АЭЭИ, очищенного микрофильтрацией или проточным центрифугированием и эмульгированного в масляном адъюванте Монтанид ИЗА 70.

8. Разработана промышленная технология изготовления и контроля ассоциированной инактивированной эмульгированной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76, в которой подобраны оптимальные иммунологически сбалансированные соотношения антигенных компонентов и масляного адъюванта Монтанид ИЗА 70.

9. Ассоциированная инактивированная эмульгированная вакцина против НБ, ИБК и ССЯ-76 индуцирует у кур, привитых однократно в возрасте от 90 до ПО сут, протективные уровни гуморального иммунитета, регистрируемые в течение всего продуктивного периода.

10. Для проведения массовых серологических исследований разработан и внедрен в ветеринарную практику набор ИФА для определения антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови кур при тестировании методом последовательных разведений и при использовании одного разведения сыворотки.

11. Разработана эффективная комплексная система профилактики аденовирусных болезней кур, основанная на использовании высокоспецифичных диагностических средств и эффективных инактивированных вакцин.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Научные разработки автора вошли в следующие нормативно-технические документы, которые утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза России:

1. Вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированная эмульгированная (ТУ 9384-026-00495527-00, наставление по применению №13-4-2/2208 от 27.12.2000 г.);

2. Вакцина ассоциированная против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированная эмульгированная (ТУ 9384-029-00495527-00, наставление по применению №13-4-2/2204 от 25.12.2000 г.);

3. Вакцина против синдрома гидроперикардита кур инактивированная сорбированная (ТУ 9384-129-00495527-03, наставление по применению №13-304/1064 от 07.05.2004 г.);

4. Набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 иммуноферментным методом при тестировании сывороток методом последовательных разведений (ТУ 9388-015-00495527-99, наставление по применению № 13-5-02/0081 от 06.06.01г.),

5. Набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388-068-00495527-01, наставление по применению № 13-5-02/0237 от 02.11.01г.);

6. Методические указания по индикации генома вируса ССЯ-76 с использованием полимеразной цепной реакции и секвенирования амплифицированных фрагментов гена фибера (1998г.);

7. Методические указания по определению антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови нммуноферментным методом (1998г.).

Вышеперечисленные биопрепараты выпускаются серийно и имеют официальную регистрацию в Российской Федерации, а вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированная эмульгированная и вакцина ассоциированная против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированная эмульгированная зарегистрированы и широко применяются в Украине, Молдавии, Узбекистане и Беларуси.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Борисов В.В., Борисов A.B., Фалина Г.М. и др Выделение и характеристика возбудителя гидроперикардита кур // Акт. пробл. биотехнол. в растениеводстве, жив-ве и ветерин.: Тез. конф. - М., 1996. - С. 13.

2. Borisov V.V., Borisov A.V., Gusev A.A. Hydropericardium syndrome in chickens in Russia // XIth Int. Congr. World Vet. Poultry Ass.: Abstr. - Budapest, 1997.-P. 258.

3. Лобанов B.A., Дрыгин B.B., Борисов B.B. и др. Индикация генома вируса синдрома снижения яйценоскости (EDS-76) с использованием полимеразной цепной реакции // Матер, конф., посвящен. 40-лет. ВНИИЗЖ. -Владимир, 1998.-С 215-224.

4. Лобанов В.А. Дрыгин В.В., Борисов В.В. и др. Методические указания по индикации генома вируса синдрома снижения яйценоскости-76 с использованием полимеразной цепной реакции и секвенирования амплифицированных фрагментов гена фибера // Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных методом полимеразной цепной реакции. - Владимир, 1998. - С. 280-290.

5. Гусев A.A., Борисов В.В., Дрыгин В.В. и др. Методические указания по определению антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 в сыворотках крови птиц нммуноферментным методом // Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных нммуноферментным методом. - Владимир, 1998. - С. 48-52.

6. Волкова М.А., Дрыгин В.В., Мудрак Н.С., Борисов В.В. Разработка иммуноферментной тест-системы для количественного определения антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови кур методом одного разведения // Матер, конф., посвящен. 40-лет. ВНИИЗЖ. - Владимир, 1998. - С. 224-235.

7. Борисов В.В., Борисов A.B., Старов С.К. и др. Викорнстания живих та ¡нактивированих вакцин для профшактики eipycnnx хвороб птищ' // Вет. мед. Укршни. - 1999, № 3. - С. 10-11.

8. Борисов В.В., Сурнев ДС., Гусев A.A. Восприимчивость цыплят кросса «Смена» к возбудителю синдрома гидроперикардита кур при экспериментальном заражении // Уч. зап. Витебской гос. акад. вет. мед.-Витебск, 1999. - Т. 35, ч.1. - С. 20-22.

9. Дрыгин В.В., Борисов A.B., Борисов В.В., и др. Молекулярная эпизоотология некотрых вирусных болезней птиц на территории Российской Федерации // Докл. конф., посвящен. 40-лет. ВНИИЗЖ. - Владимир, 1999. - С. 90-117.

10. Борисов В.В., Борисов A.B., Дрыгин В.В. и др. Диагностика и профилактика аденовирусных болезней сельскохозяйственной птицы // Докл. конф, посвящен. 40-лет. ВНИИЗЖ. - Владимир, 1999. - С. 127-136.

11. Волкова М.А., Дрыгин В.В, My драк Н.С, Борисов В.В. Разработка иммуноферме-нтной тест-системы для количественного опреде-ления антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови кур методом одного разведения // Докл. конф, посвящен. 40-лет. ВНИИЗЖ. - Владимир, 1999. - С. 224-235.

12. Borisov V, Borisov A, Guseva Е. Laboratory reproduction of the hydropericardium syndrome in SPF chickens // XIth Int. Congr. Viröl. - Sydney, 1999.-P. 168.

13. Lobanov V, Drygin V, Borisov V. et a!. Characterization of avian adenovirus associated with hydropericardium syndrome in chickens // XIth Int. Congr. Virol. - Sydney, 1999. - P. 169.

14. Дрыгин В.В. Борисов В.В, Старое C.K. и др. Молекулярная эпизоотология некоторых вирусных болезней птиц на территории Российской Федерации (на примере болезней Гамборо, Ньюкасла, ССЯ-76 и инфекционного бронхита кур) // Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России. (К 100-летн. юбилею ВИЭВ). - М, 1999. - Ч. 2. - С. 220-224.

15. Борисов В.В, Борисов A.B., Старов С.К. и др. Стратегия применения новых отечественных вакцин для профилактики вирусных болезней птиц // Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России. (К 100-летн. юбилею ВИЭВ). - М„ 1999. - Ч. 2. - С. 227-229.

16. Лобанов В.А., Щербакова Л.О., Борисов В.В. и др. Аденовирус KR 95, выделенный от цыплят во время вспышки синдрома гидроперикардита, является возбудителем этого заболевания // Журнал «Вопросы вирусологии». -М., 2000, JY» 3. - С. 36-40.

17. Лобанов В.А., Борисов В.В., Борисов A.B. и др. Анализ последовательности гена гексона аденовируса KR 95, вызывающего синдром гидроперикардита у кур // Журнал «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология». - М, 2000, № 1. - С. 30-36.

18. Борисов В.В, Д.С. Сурнев, A.B. Борисов Изучение иммунобиологических свойств масляных адьювантов Монтанид ИЗА 70 и Монтанид ИЗА 206 в составе инактивированной вакцины против синдрома гидроперикардита кур // Вет. мед. - Харьков, 2000. - Вып 78, ч.1. - С. 23-28.

19. Борисов В.В., Лозовой Д.А. Использование микрофильтрации при производстве инактивированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 // Сб. статей Междунар. науч.-практ. конф. 15-16 августа 2000г., - Покров, 2000 - С. 106-108.

20. Борисов В.В., Борисов A.B., Сурнев Д.С. Разработка и производственные испытания инактивированной сорбированной вакцины против синдрома гидроперикардита кур // Матер междунар. науч.-произв. конф. - Алматы, 2000. - С. 77-79.

21. Борисов В.В., Сурнев Д.С., Ельникова Е.В. и др. Изучение антигенной активности инактивированной сорбированной вакцины против синдрома гидроперикардита кур в процессе хранения // Сб. науч. тр. - Уфа,

2000. - С. 46-48.

22. Ирза В.Н., Борисов В.В., Борисов A.B. и др. Иммунный ответ и местные тканевые реакции у кур при разных способах введения инактивированной ассоциированной вакцины против нькжаслской болезни, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76 // Сб. статей Междунар. науч.-практ. конф. 15-16 августа 2000г., - Покров, 2000. - С. 110-113.

23. Сурнев Д.С., Борисов В.В., Ельникова Е.В. Изучение патогенных свойств эпизоотического изолята КР-95 - возбудителя синдрома гидроперикардита кур / // Матер, междунар. конф. - Воронеж, 2000. - Т.2. - С. 225-227.

24. Борисов В.В., Сурнев Д.С., Ельникова Е.В. и др. Изучение сроков наступления иммунитета у цыплят, привитых инактивированной вакциной против синдрома гидроперикардита кур // Матер. Междунар. науч.-практ. конф. - Минск, 2000. - С. 70-71.

25. Борисов В.В. Инактивированные ассоциированные вакцины для промышленного птицеводства // 36. наук, працъ. «Вет. науки». - Вып. 7(31). Матер. 5-го зЧзду паразитоценолоп'в Украши. - Харькш, 2001. - С. 294-296.

26. Борисов В.В., Борисова O.A., Ирза В.Н., Борисов A.B. Антигенная активность промышленных серий инактивированной вакцины против ССЯ-76 в процессе хранения // Науков. висн. Нац. аграр. ун-та. - Киев, 2001. - Вып. 36. -С. 271-274.

27. Борисов В.В., Борисов A.B., Старов С.К. и др. Изучение антигенной активности инактивированной ассоциированной вакцины против ныокаслской болезни, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76 в процессе хранения // Сборник научных трудов ВГНКИ. - М., 2001. - Т.63. - С. 134-137.

28. Борисов В.В., Лозовой Д.А., Борисова O.A. и др. Инактивированная вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 // Аграрная Россия. -

2001, №3.- С. 52-55.

29. Борисов В.В., Сурнев ДС, Курлова Н.П. и др. Разработка схемы применения инактивированной вакцины против синдрома гидроперикардита

кур для цыплят-бройлеров // Уч. зап. Витебск, гос. акад. вет. мед. - Витебск, 2001,- Т.37,ч.2.-С. 11-12.

30. Ирза В.Н., Борисов В.В., Борисов А.В. и др. Применение инактивированной вакцины // Журнал «Птицеводство». - М., 2001, №1. -С. 30-32.

31. Борисов В.В., Курлова Н.П., Сурнев Д.С. и др. Сравнительное испытание эмульсионной и сорбированной форм инактивированной вакцины против синдрома гидроперикардита кур на продолжительность и напряженность иммунитета // Науков. висн. Нац. аграр. ун-та. - Киев, 2001. -Вып. 36. - С. 274-278.

32. Borisov V.V., Surnev D.S., Borisov A.V. et ai. Development and test of inactivated autogenous vaccine against hydropericardium syndrome in Russia // XIIth Int. Congr. World Vet. Poultry Ass. - Cairo, Egypt, 2001. - P. 367.

33. Borisov V.V., Irza V.N., Borisova O.A. et al. Immune response of pullets to combined inactivated vaccine for Newcastle disease, infectious bronchitis and egg drop syndrome-76 containing emulsion adjuvant Montanide ISA 70 // XIIth Int. Congr. World Vet. Poultry Ass. - Cairo, Egypt, 2001. - P. 277.

34. Борисов B.B., Лобанов В.А., Батченко Г.В. и др. Изучение роли аденовирусов птиц в патогенезе синдрома гидроперикардита кур // Междунар. конф.-выставка: Птицеводство - мировой и отечественный опыт. - М., 2002. - С. 21-22.

35. Ирза В.Н., Борисов В.В., Борисов А.В. и др. Иммунитет у кур, привитых инактивированной ассоциированной вакциной // Журнал «Ветеринария». - М., 2002, № 4. - С. 21-23.

36. Лобанов В.А., Борисов В.В., Волкова М.А. и др. Применение молекулярно-биологических методов для диагностики синдрома гидроперикардита кур // Сб. тез. 4-й Всерос. науч.-практ. конф. - М., 2002. - С. 348-350.

37 Борисов В.В., Лозовой Д.А., Борисова О.А. и др. Физические и иммунобиологические свойства инактивированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 с обратной эмульсией // Вет. мед.: М1жвидом. тем. наук. зб. 80 рок IEKBM. - Харюв, 2002. - С 97-102.

38. Borisov V.V., Surnev D.S., Borisov A.V et al. Comparative study of protective efficacy of different vaccines against hydropericardium syndrome in broiler chickens // 11th Europ. Poultry Conf.: Abstr. - Bremen, 2002. - P. 187.

39 Борисов B.B., Гусев A.A., Дрыгин В.В. и др. Штамм КР 95 №114 вируса синдрома гидроперикардита кур для изготовления вакцинных препаратов: пат. 2193062 Рос. Федерации: 7 А61 К 39/235 // (С 12 N 7/00, С 12 R 1:93) / заявитель и патентообладатель Федеральное государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных - N 2001129741/13; заявл. 02.11.01.; опубл 20.11.02., Бюл. N 32.

40. Борисов В.В., Сурнев Д.С. Синдром гидроперикардита кур: эпизоотологические данные // Матер. 2-й Междунар. науч.-практ. конф. -Ставрополь, 2003. - С. 279-284.

41. Борисов В.В. Специфическая профилактика синдрома гидроперикардита кур // Конф. по птицеводству: Матер, конф. - Зеленоград, 2003.-С. 206-207.

42. Борисов В.В., Сурнев Д.С. Синдром гидроперикар-дита кур: эпизоотологические данные // Матер. II Междунар. науч.-практ. конф. -Ставрополь, 2003, - С. 279-284.

43. Борисов В.В., Сурнев Д.С., Волкова М.А. Экспресс-защита цыплят от аденовирусного гидроперикардита // Матер. IV Укр. конф. по птах1вн з М1жнар. участию. - Харкш, 2003. - Вып. 53. - С. 532-536.

44. Борисов В.В., Сурнев Д.С., Борисов A.B. и др. Вирусный синдром гидроперикардита кур // Журнал «Птица и птицепродукты». - М., 2003, №1. - С. 29-32.

45. Борисов В.В., Ирза В.Н., Борисов A.B. и др. Влияние температурных условий хранения на антигенные свойства инактивированной ассоциированной вакцины против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76 // Сборник научных трудов ВГНКИ. - М., 2003. -Т.64. - С. 138-144.

46. Борисов В.В., Сурнев Д.С., Кожемяка Н.В. и др. Испытания экспериментальной вакцины против аденовирусного гидроперикардита кур в условиях неблагополучного хозяйства // Сборник научных трудов ВГНКИ. - М., 2003. - Т.64. - С. 144-150.

47. Лозовой Д.А., Борисов В.В., Егоров А.А и др. Определение размера частиц дисперсной фазы инактивированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 // Матер. IV Укр. конф. по птах1вн. з М1жнар. участию. - Харив, 2003. - Вып. 53. - С. 586-591.

48. Борисов В.В., Сурнев Д.С., Лозовой Д.А. и др. Экспериментальная инактивированная вакцина против синдрома гидроперикардита кур II Сборник научных трудов ВГНКИ. - М., 2003. -Т.64. - С. 130-138.

49. Борисов В.В., Гусев A.A., Сурнев Д.С. и др. Инактивированная вакцина против синдрома гидроперикардита кур: пат. 2195959 Рос. Федерации: 7 А61 К 39/235,39/12, С 12 N 7/00 / заявитель и патентообладатель Федеральное государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных - N 2001129740/13; заявл. 02.11.01.; опубл. 10.01.03., Бюл. N 1.

50. Борисов В.В., Гусев А.А, Сурнев Д.С. Способ изготовления инактивированной вакцины против синдрома гидроперикардита кур: пат. 2199342 Рос. Федерации: 7 А61 К 39/235 / заявитель и патентообладатель Федеральное государственное учреждение Всероссийский научно-

исследовательский институт защиты животных - N 2001129742/13; заявл.

02.11.01.; опубл. 21 тт., Бюл. N 6

51. Борисов В.В., Гусев A.A., Сурнев Д.С. Способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против синдрома гидроперикардита кур: пат. 2213576 Рос. Федерации: 7 А61 К 39/235, С 12 N 7/00 / заявитель и патентообладатель Федеральное государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных - N 2002101285/13; заявл. 22.01.02.; опубл. 10.10.03., Бюл. N 28.

52. Борисов В.В., Гусев A.A., Сурнев Д.С. и др. Инактивированная эмульсионная вакцина против синдрома гидроперикардита кур: пат. 2216351 Рос. Федерации: 7 А61 К 39/235, С 12 N 7/00 / заявитель и патентообладатель Федеральное государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных - N 2002101286/13; заявл.

22.01.02.; опубл. 20.11.03., Бюл. N 32.

53. Сурнев Д.С., Борисов В.В, Ельникова Е.В. и др. Антигенная активность инактивированной эмульсионной вакцины против синдрома гидроперикардита кур при разных способах введения // Матер. V Укр. конф. по птах1вництву з М1жнар. участию. - Харк1в, 2004. - Вып. 55. - С. 585-589.

54. Борисов В.В., Борисова O.A., Борисов A.B. и др. Штамм «БИСС №113» вируса синдрома снижения яйценоскости-76 птиц для изготовления вакцинных препаратов: пат. 2221865 Рос. Федерации: 7 С 12 N 7/00 А61 К 39/235 // (С 12 N 7/00, С 12 R 1:92) / заявитель и патентообладатель Федеральное государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных - N 2002115572/13; заявл.

10.06.02.; опубл. 20.01.04., Бюл. N 2.

55. Борисов В.В. Разработка средств специфической диагностики и профилактики аденовирусного гепатита кур // Тез. докл. V Междунар. форума: Биотехнология и современность. - СПб., 2004. - С.40-41.

56. Борисов В.В. Очистка вирусных суспензий от балластных веществ при изготовлении инактивированных вакцин // Тез. докл. V Междунар. форума: Биотехнология и современность. - СПб.,2004. - С.41-42.

57. Борисов В.В., Борисова O.A., Борисов A.B. и др. Инактивированная вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76: пат. 2233671 Рос. Федерации: 7 А61 К 39/235, С 12 N 7/00 / заявитель и патентообладатель Федеральное государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных - N 2003100194/13; заявл.

04.01.03.; опубл. 10.08.04., Бюл. N 22.

58. Борисов В.В., Борисова O.A., Борисов A.B. и др. Способ изготовления инактивированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76: пат. 2239452 Рос. Федерации: 7 А61 К 39/235, С 12 N 7/00 / заявитель и патентообладатель Федеральное государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных - N 2003100193/13; заявл. 04.01.03.; опубл. 10.11.04., Бюл. N 31.

59. Сурнев Д.С, Борисов В.В, Ельникова Е.В. и др. Иммунный ответ у кур, привитых культуралыюй и тканевой эмульсионными вакцинами против синдрома гидроперикардита кур // 1-й Междунар. вет. конгр. по птицеводству. -М, 2005. -С. 97-101.

60. Борисов В.В, Сурнев Д.С, Борисов A.B. и др. Производственный штамм КР-95 вируса синдрома гидроперикардита кур // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 381-399.

61. Borisov V, Surnev D, Volkova M. Study on efficacy of killed vaccines against hydropericardium syndrome (HPS) prepared with different adjuvants // 14th World Vet. Poultry Congr. - Istanbul, Turkey, 2005. - P. 535.

62. Лозовой Д.А., Борисов B.B., Долгов Д.Л. и др. Контроль физических свойств инактивированных эмульсионных вакцин против вирусных болезней птиц // Сборник научных трудов ВГНКИ. - М., 2005. -Т.66. - С. 99-106.

63. Лозовой Д.А., Борисов В.В., Долгов Д.Л. и др. Экснресс-тест определения стабильности масляных вакцин с эмульсией обратного типа // Сборник научных трудов ВГНКИ. - М., 2005. - Т.66. - С. 119-128.

64. Борисов В.В., Ельникова Е.В. Изучение патогенных свойств полевых изолятов аденовирусов кур, выделенных на территории Российской Федерации // Журнал «Ветеринарная патология». - 2006, № 4. -С. 117-123.

65. Борисова O.A., Борисов В.В, Борисов A.B. и др. Штамм «БИСС» вируса синдрома снижения яйценоскости-76 птиц // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2006. - Т. IV. - С. 316-322.

Подписано в печать 12.01.2007 Формат бумаги 60x84 1/16.

Печ. л. 2,88 Усл. печл. 2.67 Тираж 100 экз. Заказ №422

Отпечатано на ризографе

Полиграфический отдел ФГОУ ВПО «Ивановская ГСХА имени академика Д К. Беляева». 153012 г. Иваново, ул. Советская 45

WJ

Актуальность темы. Аденовирусные болезни кур регистрируются во многих странах с развитым промышленным птицеводством и наносят значительный экономический ущерб [Baxendale W. 1978; Коровин Р.Н., Рождественский U.K., 1990; Фомина Н.В., 1995; McFerran J.В., 1998; Бакулин В А, 1998, 2002].

Современная классификация аденовирусов птиц предусматривает деление их на 3 группы, из которых возбудители I и III группы представляют опасность для птицеводческих предприятий [Benko М. с соавт., 2000].

Вирус синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76), относящийся к III у, группе, вызывает бессимптомное снижение яичной продуктивности у кур различных кроссов [McFerran J.В., 1977; Baxendale W. 1978; Zanella А. с соавт., 1978; Коровин Р.Н., Рождественский И.К., 1990;].

Аденовирусы 4 серотипа I группы за последние два десятилетия повысили свою патогенность и наряду с развитием у бройлеров инклузионного гепатита, стали вызывать проявление нового синдрома -синдрома гидроперикардита (СГПК) со смертностью до 75% [Anjum A.D., 1988, 1989, 1990; Qureshi А.А., 1988, 1989, 1997; Khan M.Z. с соавт., 1988; i/j Voss M., 1989; Abdul-Aziz ТА, 1991; Cowen B.S., 1991, 1995; Того H. с соавт., 1999].

В Российской Федерации массовое проявление СГПК наблюдали в 1992г. в Челябинской области в бройлерных стадах со смертностью до 12% [Лагуткин НА с соавт., 1992]. Однако причины, вызвавшие развитие этой болезни, не были выяснены.

Проблема аденовирусных болезней ' кур актуальна еще и по той причине, что эти инфекции трудно диагностировать, так как они способны протекать латентно с отдельными периодами ремиссий и рецидивов [Коровин Р.Н., 1990; Фомина Н.В., 1995; McFerran J.B. 1998]. ц, Лабораторная диагностика аденовирусных болезней кур основана на выделении вируса и его идентификации вирусологическими и серологическими методами. Недостатком такой схемы является длительность постановки и сложность выявления латентно-персистирующих вирусов.

Применение молекулярно-биологических методов (ПЦР, нуклеотидное секвенирование) способно решить эту задачу. ПЦР обладает высокой специфичностью и чувствительностью, а сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов позволяет установить генетические связи между исследуемыми изолятами и известными штаммами [Mullís К. с соавт., 1987; Erlich H.A., 1988]. Однако, количество данных о применении ПЦР и нуклеотидного секвенирования для индикации аденовирусов ограничено [Hess М. с соавт., 1997,1999].

Вакцинация играет ведущее место в профилактике аденовирусных болезней кур. Установлено, что однократная иммунизация ремонтного молодняка в возрасте 90-120 сут инактивированной вакциной против ССЯ-76 предупреждала развитие болезни и вертикальную передачу вируса [BaxendaleW., 1980; ZanellaA. 1981; Bouquet J.F. 1982].

В нашей стране были разработаны инактивированные вакцины против ССЯ-76 и налажено их производство [Рождественский И.К. с соавт., 1991, 1992; Хохлачев О.Ф. с соавт., 1993; Смоленский В.И., 1999, 2001; Сухинин A.A. с соавт., 1999]. Однако, эти биопрепараты были приготовлены на основе сорбентов или эмульсии прямого типа, и не индуцировали у привитых кур напряженного иммунитета, регистрируемого в течение всего продуктивного периода [Троицкая И.В., 2000].

Подходом к решению этого вопроса может быть усовершенствование инактивированной вакцины против ССЯ-76 путем повышения антигенной активности за счет использования новых штаммов и адъювантов.

Систематическая вакцинация кур против ССЯ-76 потребовала осуществления регулярного мониторинга за иммунным фоном. Для этого необходимо было разработать стандартный набор для определения антител к вирусу ССЯ-76 иммуноферментным методом, который имеет существенные преимущества перед другими серологическими реакциями по специфичности, чувствительности и возможности автоматической количественной оценке результатов [Фомина Н.В. с соавт., 1988; Хилько С.Н. ссоавт., 1989].

В современном птицеводстве возрастает роль специфической профилактики не только ССЯ-76, но и других вирусных болезней (НБ, ИБК). Использование для этих целей моновакцин повышает трудозатраты и приводит к стрессированию птиц.

Имеются сообщения об успешной разработке ассоциированных инактивированных вакцин против некоторых вирусных болезней птиц [Lombardi D. с соавт., 1981; Zanella А., 1981; Дубовой A.C. с соавт., 1995, 1998; Герман В.В. с соавт., 2002; Рождественский И.К. с соавт., 2003; Джавадов Э.Д., с соавт., 2003].

Выше указанная тенденция к возрастанию роли аденовирусов в инфекционной патологии отечественного промышленного птицеводства послужила основной предпосылкой для проведения исследовательских работ по созданию средств и методов диагностики и специфической профилактики аденовирусных болезней кур.

Цель и задачи научных исследований. Главной целью исследований являлась разработка и внедрение в ветеринарную практику эффективных средств и методов диагностики и специфической профилактики аденовирусных болезней кур. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

- изучить эпизоотическую ситуацию по синдрому гидроперикардита кур в птицеводческих предприятиях Российской Федерации в 1995-2005гг.; * '

- уточнить этиологию синдрома гидроперикардита кур;

- выделить и охарактеризовать вирус, вызывающий у цыплят СГПК;

- разработать стратегию и тактику борьбы с СГПК и на основе экспериментальных исследований создать новые средства диагностики и специфической профилактики;

- разработать метод индикации и штаммовой дифференциации аденовирусов кур на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования;

- изыскать полевые изоляты аденовирусов, вызывающих ССЯ-76 и СГПК, и провести с ними селекционные работы для получения производственных штаммов;

- разработать технологии изготовления и контроля инактивированных вакцин против СГПК и ССЯ-76 и наставления по их применению;

- изучить иммунобиологическую целесообразность сочетания антигенов в ассоциированных инактивированных вакцинах против ССЯ-76, ИБК и НБ;

- изучить иммунобиологические свойства разработанных инактивированных вакцин против аденовирусных болезней кур в лабораторных и производственных условиях;

- подготовить и утвердить нормативно-техническую документацию на разработанные биопрепараты;

- освоить промышленное производство диагностикумов и инактивированных вакцин против СГПК и ССЯ-76 и внедрить их в ветеринарную практику.

Научная новизна. Впервые экспериментально подтверждена вирусная природа нового заболевания молодняка кур - синдрома гидроперикардита. Показано, что основным этиологическим агентом вспышек СГПК в РФ в 1995-2005гг., является вирус, генетически родственный референтному штамму серотипа РАс1\/4, принадлежащий к роду А шайе^ом/до.

Разработана методика индикации и идентификации аденовирусов кур рода Амавепошиэ и Жас/вломл/в на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

Разработан и внедрен в ветеринарную практику набор для определения антител к вирусу ССЯ-76 иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении.

Получен, изучен, паспортизирован и депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (г. Москва), производственный штамм «КР-95 № 114» вируса синдрома гидроперикардита кур.

Разработана и внедрена в производство технология изготовления и контроля вакцины против синдрома гидроперикардита кур инактивированной сорбированной, определены оптимальные условия промышленного получения вирусного сырья, очистки, инактивации, подобран оптимальный компонентный состав препарата и методы биологического контроля.

Научно обоснованы и экспериментально подтверждены: прививной объем, способы введения и схемы применения вакцины против синдрома гидроперикардита кур инактивированной сорбированной. Изучены в лабораторных и производственных условиях иммунобиологические свойства вакцины против синдрома гидроперикардита кур, изготовленной промышленным способом.

Получен, изучен, паспортизирован и депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, производственный штамм «БИСС № 113» вируса синдрома снижения яйценоскости-76.

Разработаны и внедрены в промышленное производство технологии изготовления и контроля вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированной эмульгированной и вакцины ассоциированной против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированной эмульгированной.

Отработаны прививные дозы и схемы применения инактивированной эмульгированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 и ассоциированной инактивированной эмульгированной вакцины против ньюкаслской болезни, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76 в промышленном птицеводстве.

Новизна исследований подтверждена 8 патентами на изобретения: «Штамм КР 95 № 114 вируса синдрома гидроперикардита кур для изготовления вакцинных препаратов», №2193062 от 20.11.2002г.; «Инактивированная вакцина против синдрома гидроперикардита кур»,

2195959 от 10.01.2003г.; «Способ изготовления инактивированной вакцины против синдрома гидроперикардита кур», №2199342 от 27.02.2003г.; «Способ изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против синдрома гидроперикардита кур», №2213576 от 10.10.2003г.; «Инактивированная эмульсионная вакцина против синдрома гидроперикардита кур», №2216351 от 20.11.2003г.; «Штамм «БИСС № 113» вируса синдрома снижения яйценоскости-76 птиц для изготовления вакцинных препаратов», №2221865 от 20.01.2004г.; «Инактивированная вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76», РФ №2233671 от 10.08.2004г.; «Способ изготовления инактивированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76», №2239452 от 10.11.2004г.

Практическая значимость работы. Научные разработки вошли в следующие нормативно-технические документы, которые утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза России:

1. Вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированная эмульгированная (ТУ 9384-026-00495527-00, наставление по применению №13-4-2/2208 от 27.12.2000 г.);

2. Вакцина ассоциированная против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированная эмульгированная (ТУ 9384-029-00495527-00, наставление по применению №13-4-2/2204 от 25.12.2000 г.);

3. Вакцина против синдрома гидроперикардита кур инактивированная сорбированная (ТУ 9384-129-00495527-03, наставление по применению №13-3-04/1064 от 07.05.2004 г.);

4. Набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 иммуноферментным методом при тестировании сывороток методом последовательных разведений (ТУ 9388-015-00495527-99, наставление по применению № 13-5-02/0081 от 06.06.01г.);

5. Набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388-068-00495527-01, наставление по применению № 13-5-02/0237 от 02.11.01г.);

6. Методические указания по индикации генома вируса синдрома снижения яйценоскости-76 с использованием полимеразной цепной реакции и секвенирования амплифицированных фрагментов гена фибера (1998г.);

7. Методические указания по определению антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 в сыворотках крови иммуноферментным методом (1998г.).

Вышеперечисленные биопрепараты выпускаются серийно и имеют официальную регистрацию в Российской Федерации, а вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированная эмульгированная и вакцина ассоциированная против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированная эмульгированная зарегистрированы и широко применяются в Украине, Молдавии, Узбекистане и Беларуси.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эпизоотический процесс синдрома гидроперикардита кур в Российской Федерации;

2. Характеристика вируса синдрома гидроперикардита кур;

3. Метод индикации и штаммовой дифференциации аденовирусов кур на основе ПЦР и прямого секвенирования амплифицированных фрагментов кДНК;

4. Промышленная технология изготовления, методы контроля и способ применения вакцины против синдрома гидроперикардита кур инактивированной сорбированной;

5. Производственный штамм «БИСС» вируса ССЯ-76 для изготовления инактивированных вакцин;

6. Промышленная технология изготовления, методы контроля и способ применения вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированной эмульгированной;

7. Теоретическое обоснование целесообразности сочетаний антигенов в ассоциированных инактивированных вакцинах против ССЯ-76, ИБК и НБ;

8. Промышленная технология изготовления, методы контроля и способ применения моновакцин против ССЯ-76, ассоциированных вакцин против ССЯ-76 и ИБК, ССЯ-76, ИБК и НБ;

9. Стратегия применения разработанных биопрепаратов против аденовирусных болезней кур и их противоэпизоотическая эффективность.

Апробация. Основные материалы исследований по диссертационной работе доложены и обсуждены на: заседаниях международной конференции, посвященной 100-летию вируса ящура, «Проблемы инфекционной патологии сельско-хозяйственных животных» (Владимир, 1995), конференции «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 1996), XII интернациональном конгрессе всемирной птицеводческой ассоциации (Будапешт, 1997), всероссийской конференции, посвященной 40-летию ВНИИЗЖ, «Современные аспекты патологии животных» (Владимир, 1998), международной конференции «Современные методы профилактики инфекционных болезней птиц» (Киев, 1998), межрегиональных координационных совещаниях «Ветеринарная практика в промышленном птицеводстве» (Ломоносов, 1999, 2000, 2001), всероссийской конференции, посвященной 30-летию ФГУП ПЗБ, «Производство и контроль медицинских и ветеринарных препаратов, опыт применения и реализация их в странах СНГ» (Вольгинский, 1999), научной сессии РАСХН «Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России» (Москва, 1998), международной научно-практической конференции «Прогрессивные технологии и ветеринарная медицина птицеводства XXI века» (Киев, 2000), международной научно-практической конференции «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных» (Покров, 2000), международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию со дня рождения академика ВАСХНИЛ Гладенко И.Н., «Ветеринарная наука на пороге XXI века» (Харьков, 2000), международной конференции «Птицеводство -мировой и отечественный опыт» (Москва, 2002), международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины в условиях современного ведения животноводства» (Феодосия, 2003), IV Украинской конференции по птицеводству с международным участием (Алушта, 2003), международной научной конференции, посвященной 45-летию ФГУ ВНИИЗЖ, «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных» (Владимир, 2003), V международном форуме «Биотехнология и современность» (Санкт-Петербург, 2004), заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» (1995-2005гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 65 научных работ, в том числе 12 работ в изданиях, регламентированных ВАК РФ для докторских диссертаций. Материалы диссертации защищены 8 патентами РФ на изобретения. Утверждены Департаментов ветеринарии Минсельхоза России 7 комплектов нормативных документов (ТУ, наставления по применению, методические указания).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 350 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения. Список использованной литературы включает 653 источника, в том числе 522 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 33 рисунками и 84 таблицами.

6. выводы

1. Установлено, что этиологической причиной синдрома гидроперикардита кур является аденовирус, генетически родственный референтному штамму серотипа РАс1\/4, рода Aviadenovirus.

2. Разработан метод индикации и идентификации аденовирусов кур, принадлежащих к родам Aviadenovirus и Atadenovirus на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования амплифицированных фрагментов кДНК.

3. Разработана и внедрена в промышленное производство технология изготовления и контроля инактивированной сорбированной вакцины против синдрома гидроперикардита кур на основе производственного штамма «КР 95», репродуцированного в организме восприимчивых птиц, очищенного детергентами и сепарированием, инактивированного димером этиленимина.

4. Разработанная инактивированная сорбированная вакцина против синдрома гидроперикардита кур безвредна, антигенно активна, высокоиммуногенна при разных способах парентерального введения и сохраняет свои иммунобиологические свойства при длительном хранении при температуре от 2 до 8°С (до 12 месяцев срок наблюдения). Напряженный иммунитет у привитых цыплят сохраняется в течение 6 месяцев.

5. Цыплята, полученные от кур, привитых инактивированной вакциной против синдрома гидроперикардита кур, приобретают пассивный иммунитет против этой болезни, который сохраняется до 12-суточного возраста.

6. Получен производственный штамм «БИСС № 113» вируса ССЯ-76, обладающий выраженными антигенными и иммуногенными свойствами, и позволяющий при крупномасштабном культивировании в развивающихся утиных эмбрионах нарабатывать вирусный материал с высокими биологическими свойствами (инфекционная активность не менее 7,0 1д ЭИД50/0 2м) активность в РГА не менее 18,0 лог2).

7. Разработана и внедрена в промышленное производство технология изготовления инактивированной эмульгированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 на базе производственного штамма «БИСС», репродуцированного в развивающихся утиных эмбрионах, инактивированного 0,3-0,4% димера АЭЭИ, очищенного микрофильтрацией или проточным центрифугированием и эмульгированного в масляном адъюванте Монтанид ИЗА 70.

8. Разработана промышленная технология изготовления и контроля ассоциированной инактивированной эмульгированной вакцины против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76, в которой подобраны оптимальные иммунологически сбалансированные соотношения антигенных компонентов и адъюванта.

9. Ассоциированная инактивированная эмульгированная вакцина против НБ, ИБК и ССЯ-76 индуцируют у кур, привитых однократно в возрасте от 90 до 110 сут, протективные уровни гуморального иммунитета, регистрируемые в течение всего продуктивного периода.

10. Для проведения массовых серологических исследований разработан и внедрен в ветеринарную практику набор ИФА для определения антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови кур при тестировании методом последовательных разведений и при использовании одного разведения сыворотки.

11. Разработана эффективная комплексная система профилактики аденовирусных болезней кур, основанная на использовании высокоспецифичных диагностических средств и эффективных инактивированных вакцин.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Г

Научные разработки автора вошли в следующие нормативно-технические документы, которые утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза России:

1. Вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированная эмульгированная (ТУ 9384-026-00495527-00, наставление по применению №13-4-2/2208 от 27.12.2000 г.);

2. Вакцина ассоциированная против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированная эмульгированная (ТУ 9384-029-00495527-00, наставление по применению №13-4-2/2204 от 25.12.2000 г.);

3. Вакцина против синдрома гидроперикардита кур инактивированная сорбированная (ТУ 9384-129-00495527-03, наставление по применению №13-3-04/1064 от 07.05.2004 г.);

4. Набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 иммуноферментным методом при тестировании сывороток методом последовательных разведений (ТУ 9388-015-00495527-99, наставление по применению № 13-5-02/0081 от 06.06.01г.);

5. Набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388-068-00495527-01, наставление по применению № 13-5-02/0237 от 02.11.01г.);

6. Методические указания по индикации генома вируса синдрома снижения яйценоскости-76 с использованием полимеразной цепной реакции и секвенирования амплифицированных фрагментов гена фибера (1998г.);

7. Методические указания по определению антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 в сыворотках крови иммуноферментным методом (1998г.).

Вышеперечисленные биопрепараты для специфической диагностики и профилакткии аденовирусных болезней кур выпускаются серийно и имеют официальную регистрацию в Российской Федерации, а вакцина против синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированная эмульгированная и вакцина ассоциированная против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур и синдрома снижения яйценоскости-76 инактивированная эмульгированная зарегистрированы и широко применяются в птицеводческих предприятиях Украины, Молдавии, Узбекистана и Беларуси.