Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.04) на тему:Экспериментальная и клиническая фармакология препаратов плаценты, полученных методом криофракционирования

ООЗиэагоз

На правах рукописи

ВОСТРОИЛОВА ГАЛИНА АНАТОЛЬЕВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ ПРЕПАРАТОВ ПЛАЦЕНТЫ, ПОЛУЧАЕМЫХ МЕТОДОМ КРИОФРАКЦИОНИРОВАНИЯ

16 00 04 - ветеринарная фармакология с токсикологией 03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 7

2007

Воронеж - 2007

003059789

Работа выполнена в отделе биотехнологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН и ЗАО НПП «Агрофарм»

Научные консультанты: доктор ветеринарных наук, профессор

Шабунин Сергей Викторович доктор биологических наук, профессор Рецкий Михаил Исаакович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Папин Николай Ефимович доктор биологических наук, профессор Горшков Григорий Иванович доктор фармацевтических наук, профессор Сливкин Алексей Иванович

Ведущая организация: ФГОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины

Защита состоится « 25 » мая 2007 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006 004 01 при Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте патологии, фармакологии и терапии РАСХН (394087, г Воронеж, ул Ломоносова, 1146)

Автореферат разослан <

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИВИПФиТ

Ученый секретарь диссертационного совета, к биол.н

ТИ Ермакова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Создание широкой сети промышленных животноводческих комплексов поставило перед ветеринарной наукой ряд проблем, связанных с совершенствованием технологических систем на животноводческих комплексах и специализированных фермах, обеспечивающих получение здорового приплода с высокой резистентностью и реактивностью, с одной стороны, разработкой более эффективных средств и способов общей неспецифической и специфической профилактики и терапии болезней животных, особенно молодняка, с другой (С М Сулейманов, 2000, В С Шипилов с со-авт , 1987, А Г Шахов с соавт , 1997, 2000 и др ) Вместе с тем, очевидно, что применение лекарственных средств специфического этиопатогенного действия не может устранить основную причину патологического состояния, являющегося в большинстве случаев следствием нарушения метаболизма - вы-сокоинтегрированного и целенаправленного процесса, обеспечивающего обмен веществ и энергии между клеткой и средой В свою очередь, общее нарушение обменных процессов зачастую сопровождается снижением иммунологической резистентности организма животных Если принять во внимание то, что даже в простейшей бактериальной клетке может протекать одновременно более тысячи взаимосвязанных реакций, то нетрудно представить, насколько сложен метаболизм у высших организмов, и, соответственно, сложна проблема создания лекарственных средств для его коррекции (И М Ганджа с соавт, 1985, АМ Земсков, 1994, А Г Шахов с соавт, 1999, ВС Бузлама, 2000, 2003, Д А Харкевич, 2000, \У К СоШпЬ е1 а1 , 1984)

Прогрессирующий рост заболеваний животных, обусловленный экологическими и социальными факторами, выдвигает проблему создания лекарственных средств для коррекции метаболизма, в том числе иммунитета, в одну из важнейших в медицине и ветеринарии (В Т Самохин, 1988, Ю А Гри-невич, 1989, Г Н Дранник, 1994, Л X Гаркави, 1990, С В Шабунин с соавт, 1996, А Ф Исмагилова, 1997, В Д Соколов, 1997, Г Г Шитов, 1999, В И Беляев, 2000, М И Рецкий с соавт, 2001)

В последние годы наметилась тенденция к созданию и использованию препаратов, изготовленных из природного сырья При этом многие из них обладают разносторонней биологической активностью и в то же время безвредны для организма (К К Мовсум-Заде с соавт , 1972, Н А Пучковская с соавт , 1975, Т В Дегтяренко, 1995, В X Хавинсон, 2001, с соавт , 2001, С Б ЬоеЬ е1 а1, 1992)

Препараты природного происхождения обладают специфическим и общим неспецифическим положительным действием на весь организм Среди них широкое распространение получили вакцины, сыворотки, тканевые препараты, антибиотики, витамины, комплексы микроэлементов (В Т Самохин с соавт , 1988, Е Н Романов с соавт , 2000, А Е Белов, 2001, Д В Пчельников с соавт , 2003, Т Н Вовк, 2005)

Тканевые препараты обеспечивают максимально возможную видовую специфичность исходного сырья, так как чем ближе природа белкового вещества к организму животного, тем выше возможность достижения цели

Оптимальным вариантом для получения лекарственного средства является использование органов и тканей человека и животных (Г Г Шитов, 1991, С М Грибко, 1998, А Ф Колчина, 2000, Р М Полковников, 2000)

Практическое значение применения тканевых препаратов при болезнях молодняка, бесплодии и ряде заболеваний трудно поддающихся лечению исключительно велико (Б И Кузник с соавт, 1998, В Г Морозов с соавт, 2000, В И Беляев с соавт, 2001) Тканевые препараты, введенные в организм животных, способствуют восстановлению нарушенного обмена веществ, активизируют функциональную деятельность организма и повышают устойчивость организма к неблагоприятным факторам внешней среды

Основу наиболее эффективных современных технологий переработки биологического сырья составляют такие методы, которые максимально сохраняют его нативную молекулярную структуру, витаминный, гормональный состав, тем самым, сохраняя его высокую биологическую активность Наиболее полно этим требованиям удовлетворяют криогенные технологии, при реализации которых перерабатываемое сырье находится при отрицательных температурах (А Г Подольский, А И Осецкий, 2001) При этом ингибируют-ся окислительные процессы в перерабатываемом сырье, предотвращается денатурация и диссоциация наиболее важных молекулярных комплексов

Новый технологический подход расширяет перечень лекарственных препаратов с использованием в качестве исходного сырья тканей плаценты сельскохозяйственных животных Однако практически нет сведений по экспериментальной и клинической фармакологии препаратов плаценты, получаемых с использованием криотехнологии и эффективности применения таких препаратов в ветеринарной медицине

С учетом выше изложенного, были определены направленность исследований, их методическое и материальное обеспечение, объем, разнообразие, широта и глубина экспериментальных разработок и клинической апробации новых препаратов

Цель и задачи исследований Цель настоящего исследования были разработка, экспериментальная оценка, клинико-биохимическое изучение препаратов из свиной плаценты, и, с учетом полученных данных, сформулировать теоретические и методологические принципы получения ветеринарных фармакологических препаратов на основе криогенных технологий В соответствии с поставленной целью решены следующие задачи

- разработать новые препараты из плаценты свиной на основе криогенных технологий,

- дать фармако-токсикологическую характеристику разработанных препаратов,

- изучить противовоспалительные, репаративные, иммуностимулирующие, гепатопротекторные, стресспротекторные свойства препаратов на основе свиной плаценты,

- разработать показания к применению разработанных препаратов и провести их клинические испытания,

- подготовить нормативно-техническую документацию на новые препараты

Научная новизна. Впервые на основе новейших методов криофрак-ционирования биологических тканей разработаны и экспериментально изучены препараты из свиной плаценты липотон, аминотон и криотон В результате выполнения работы научно аргументировано, экспериментально и клинически обоснована перспективность использования этих препаратов в ветеринарной медицине и животноводстве Впервые изучены биохимические механизмы их адаптогенного, стресс-корректорного, иммуномодулирующе-го, противовоспалительного, гепатопротекторного действия

Практическая значимость и реализация результатов исследований.

На основании результатов исследований разработаны технические условия и ТР, регламентирующие технологический процесс производства препаратов криотон (ТУ У 24 4 31293151 033-03), аминотон (ТУ У 24 4 31293151 031 2005) и липотон (ТУ У 24 4 31293151 032 2005) Департаментом ветеринарной медицины Министерства аграрной политики Украины утверждены временное наставление по применению — криотона (протокол № 8 от 1 09 2003) Департаментом ветеринарной медицины Министерства аграрной политики Украины зарегистрированы препараты - аминотон (№ 2034-02720-06 от 06 10 2006 ) и липотон (№ 2035-02-721-06 от 06 10 2006) Широкие производственные испытания криотона, липотона и аминотона разрешены Главным государственным ветеринарным инспектором Воронежской области (Временные наставления на криотон, липотон и аминотон от 11 01 2005) Нормативно-техническая документация на препараты липотон и аминотон представлена на регистрацию в Федеральную службу ветеринарного и фито-санитарного надзора РФ

Результаты проведенных исследований вошли в Методическое пособие «Экспресс-биотест Биологический мониторинг экологический систем», рассмотренное и одобренное секцией ветеринарной медицины Россельхозакаде-мии (протокол № 5 от 12 11 1996), Методическое пособие «Скрининг адапто-генов — стресс-корректоров», рассмотренное и одобренное секцией ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №1 от 30 03 2000), «Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике субинволюции матки у коров» и «Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике субклинического мастита у свиноматок», рассмотренные и одобренные секцией «Патология, фармакология и терапия» Отделения ветеринарной медицины (протокол №1 от 24 03 2005)

Апробация работы. Результаты экспериментальных и клинических исследований были представлены на заседаниях Ученого Совета института криогенных технологий (Харьков, 2003-2004 г г.), на заседании межведомственного научно-технического Совета Росветкормсоюза (Москва, 2004), на 2,3,4 съездах общества биотехнологов России им Ю А Овчинникова (Москва, 2004, 2005, 2006), на заседаниях Ветфармсовета Украины (Львов, 2003, 2006), на Международной научно-практической конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных» (Воронеж, 2004), на 2 ре-

гиональной конференции практикующих ветеринарных врачей (Воронеж, 2004), на Международном координационном совещании «Новые биотропные препараты и косметологические средства для лечения и ухода непродуктивных домашних животных» (Харьков, 2004), на XIII и XIV Международном Московском конгрессе по болезням мелких домашних животных (Москва, 2005, 2006 ), на 1 научно-практической конференции «Современная ветеринарная защита коров высокопродуктивных пород» (Воронеж, 2005), на Ш-ей Международной конференции «Экстракция органических соединений» ЭОС-2005 (Воронеж, 2005), на Международной конференции «Актуальные проблемы и достижения криобиологии и криомедицины Структурная и функциональная организация стволовых клеток в условиях действия низких температур» (Харьков, 2005), на 9 региональной научно-практической конференции «Проблемы экологии и экологической безопасности Центрального Черноземья РФ» (Липецк, 2005), на 1 научно-практической конференции «Современная ветеринарная защита коров высокопродуктивных пород» (Воронеж, 2006), на Международной научно-производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва А А «Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных» (Воронеж, 2006)

Публикации Основные научные результаты, включенные в диссертацию, опубликованы в 32 печатных работах, в том числе в 5 статях в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Аграрная наука», «Птицеводство», «Ветеринарная патология»), 2 методических рекомендациях и 2 методических пособиях, 5 патентах

Основные положения, выносимые на защиту.

- о возможности создания на основе криогенных технологий активно действующих веществ, для получения лекарственных форм ветеринарных препаратов,

- о взаимосвязи криотехнологий фракционирования плаценты свиной с биологической активностью получаемых продуктов,

- о биохимических механизмах фармакологического действия препаратов, полученных из различных криофракций свиной плаценты,

- о клинической эффективности применения ветеринарных фармакологических препаратов на основе криофракционирования плаценты свиной

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 319 страницах и включает введение, обзор литературы, материал, объем и методы исследований, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы, предложения, список литературы и приложения Диссертационная работа проиллюстрирована 86 таблицами и 46 рисунками Список литературы включает 562 источника, в том числе 156 на иностранных языках

2. МАТЕРИАЛ, ОБЪЕМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 1996-2006 г г в отделах фармакологии, биотехнологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН в соответствии с планом на-

учно-исследовательских работ по заданиям 04 01 01 «Изучить на молекуляр-но-биохимическом, структурно-функциональном, системно-физиологическом и экологическом уровнях и определить причины и механизмы перехода организма из нормального состояния в патологическое и на этой основе разработать средства, системы и технологии защиты здоровья и продуктивности животных» (№ roc per 01 200 11 17018) и 08 04 03 «Разработать новые высокоэффективные средства и методы повышения общей резистентности и иммунного статуса крупного рогатого скота, свиней и птиц» (№ roc per 15070 3666026906 06 8 003 04) Программ фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации Россельхозакадемии на 2001-2005 и 2006-2010 г г и в ЗАО НПП «Агрофарм»

В проведении ряда исследований принимали участие сотрудники ВНИВИ патологии, фармакологии и терапии Жаркой Б JI, Золототрубов А П , Ефремова М В , Ческидова JI В , Топольницкая А В , Сулейманов С М , Шушлебин В И , сотрудники «Зооветеринарного центра» Курило Н Ф , Гребенщиков В Е , Конев В Ф , Галкин А В и другие, которым автор выражает искреннюю признательность за оказанную помощь и плодотворное сотрудничество

Лабораторные и опытные образцы препаратов из плаценты свиной изготовлены в ЗАО «Институт криогенных технологий» и «Зооветеринарном центре» г Харькова

Экспериментальные и научно-производственные опыты проведены в соответствие с требованиями к врачебно-биологическому эксперименту по подбору аналогов, постановке контроля, соблюдению одинаковых условий кормления и содержания животных в период проведения работы и учета результатов (Фролов И Т , 1965) Перед экспериментом животные выдерживались в течение 2 недель в карантинных условиях на стандартном пищевом рационе (И П Западнюк с соавт , 1983) Для опыта животных брали в эксперимент после внутригрупповой адаптации Доступ к воде и корму был свободным, световой режим естественным

При выполнении работы проводили токсикологические, физико-химические, гематологические, биохимические, иммунологические исследования с применением современных методов

В проведении экспериментальных и научно-производственных работ использовали культуру инфузорий - Paramecium caudatum, самцов и самок мышей белых беспородных и линейных СВА с массой тела 20,0±3,0 г (п=3870), самцов и самок белых крыс беспородных и линии Wistar с массой тела 180,0±25,0 г (п=600), 4 — морские свинки (п=100, кроликов разного пола породы шиншилла с массой тела от 1,1 до 2,5 кг (п=60), откормочных быков и телят черно-пестрой породы (п=250), свиней крупной белой породы и помесей разного возраста и пола (п=1000), 8 - кур и цыплят кросса Арбор Ай-керс (п>50000), 9 - собак и кошек (п=100) Подробнее схемы опытов и дозировки препаратов представлены в соответствующих разделах диссертации

Острую и хроническую токсичность оценивали в соответствии с «Методическими указаниями по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве», утвержденными ГУВ СССР (1991), аллергенную в соответствии с «Методическими рекомендациями по оценке аллергенных свойств фармакологических средств» (1988), эмбриоток-сическую и тератогенную активность в соответствии с «Методическими рекомендациями по доклиническому изучению репродуктивной токсичности фармакологических средств» (1997), мутагенную активность препаратов оценивали в соответствии с «Методическими рекомендациями по оценке мутагенности новых лекарственных средств»( 1994) и иммунотоксические свойства в соответствии с «Методическими рекомендациями по изучению имму-номодулирующих свойств фармакологических средств» (1992)

Изучение острой токсичности препаратов проводили общепринятыми методами (МП Беленький, 1963, ИВ Саноцкий, 1970, ОН Елизарова, 1971) на белых мышах и белых крысах Препараты применяли внутрь, внутримышечно, внутрибрюшинно После введения препаратов за опытными животными вели непрерывное наблюдение на протяжении первого дня В последующем состояние животных отмечали дважды в сутки в течение 14 дней Регистрировали общий статус и поведение животных, состояние нервно-мышечных и вегетативных функций, шерстного покрова, поедание корма, потребление воды и времени наступления токсикоза и гибели

Хроническую токсичность препаратов плаценты изучали на белых крысах при длительном накожном и парентеральном введении их в дозах ориентировочно-терапевтической, в 5, 20, 100 и 1000 раз превышающих ориентировочно-терапевтическую Препараты вводили ежедневно в течение 60 суток Наблюдение за клиническим состоянием животных вели на протяжении 90 дней от начала опыта Определение массы тела у всех животных проводили до начала введения препарата и подекадно На 30-е и 60-е сутки от начала введения препаратов определяли относительную массу (коэффициенты) внутренних органов крыс - головного мозга, печени, почек, легких, сердца, селезенки, надпочечников и семенников (В М Гацура, 1974)

Раздражающее действие препаратов плаценты на кожу изучали в опытах на кроликах (при нанесении препарата в чистом виде) Площадь нанесения составляла для кроликов 80-82 см2 (5% от общей поверхности тела животных) За два дня до эксперимента тщательно выстригали шерсть на спине, избегая механических повреждений кожных покровов Экспозиция плацентарных препаратов составляла 4 часа, после чего кожу аккуратно протирали ватным тампоном, смоченным дистиллированной водой Реакцию кожи на воздействие препарата оценивали через 1 и 16 часов после однократного нанесения

Учитывали функциональные нарушения кожи, характеризующиеся появлением различной степени выраженности эритемы, отека, трещин, изъязвлений, изменением температуры Оценку раздражающего действия препарата проводили по балльной системе

Дня изучения влияния препаратов плаценты на глаз кролика в конъюнк-тивальный мешок левого глаза закапывали пипеткой по 2 капли подогретого до 37°С препарата Правый глаз у кроликов служил контролем, на него препарат не наносили

Через 0,5, 1, 2, 3, 4, 5 и 6 часов после инстилляции препарата учитывали клиническое состояние организма животных (температуру тела, частоту пульса, количество дыхательных движений), а также изменение кровенаполнения конъюнктивы, наличие лакримации и выделений, состояние роговицы и век

Изучение эмбриотоксического и тератогенного действия проведено по методике АП Шицковой с соавт (1977) на самках белых крыс массой 220,0±20,0 г Фазу полового цикла устанавливали путем исследования вагинального содержимого Первым днем беременности считали день обнаружения спермиев после подсадки самцов к самкам На 19-20 день беременности оценивали состояние матки, плацент и плодов, подсчитывали количество желтых тел беременности, оценивали равномерность расположения плодов в рогах матки Раннюю и позднюю резорбцию, общую эмбриональную смертность, выживаемость подсчитывали по формулам, предложенным А М Ма-лашенко и И К Егоровым (1977) В целях выявления патологии внутренних органов эмбрионов материал фиксировали в жидкости Боуэна и 70° спирте Аномалии скелета выявляли по методу Даусона (1984) Критериями оценки эмбриотоксического и тератогенного действия препарата служили показатели гибели зародышей на пред- и постимплантационных стадиях развития (эм-бриотоксический эффект), наличие аномалий развития внутренних органов и скелета (тератогенный эффект), уровень плодовитости, масса зародышей

Исследование аллергенных свойств препаратов проведено на 30 морских свинках-аналогах массой тела 270-310 г, обоего пола белого цвета или имеющих крупные белые пятна на боках туловища, с использованием реакции специфического лизиса лейкоцитов и реакции специфической агломерации лейкоцитов

Влияние препаратов на качество мясопродуктов проведено с использованием слепого метода по 9-ти бальной шкале для органолептической оценки качества варенного мяса и бульона разработанного ВНИИМП (1985)

Оценку иммуномодулирующей активности (влияние на фагоцитоз и клеточный иммунный ответ) проводили в соответствии с «Методическими указаниями по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ (Р М Хаитов с соавт ,2000)

Механизм фармакологического действия препаратов изучали согласно «Методическим рекомендациям по изучению новых препаратов для коррекции метаболизма в организме животных», утвержденных Департаментом ветеринарии РФ (1998)

При изучении противовоспалительных свойств препаратов плаценты в качестве флогогенного агента использовали 1% раствор каррагенина (Л В Яковлева, И А Зупанец, 1987, Di Rosa М et al, 1971), 2% раствор формалина и 2% суспензию зимозана (Ф П Тринус с соавт, 1974, ФП Тринус, Н А Мохорт, 1975, К Gado, G Gigler, 1991)

Противоязвенное действие препаратов изучали на модели, вызываемой совместным введением дексаметазона и диклофенака (АС Белоусов, 1965, 1973) В конце опыта в желудке у животных число язв, определяли поражение слизистой желудка, выраженное в баллах (Häkkinen J et al, 1966), индекс язвообразования (ЯИ) Эффективными считали соединения, у которых противоязвенная активность была > 2,0

Репаративные свойства препаратов изучены на моделях лоскутных кожных ран и ожогов Нанесение ожоговой травмы, взятие биологического материала от экспериментальных животных проводили в соответствии с существующими требованиями проведения экспериментов на животных Исследования проводили на белых беспородных крысах массой от 180 до 200 г Для воспроизведения лоскутной раны на боковой поверхности тела крысы удалялся шерстный покров и участок кожи площадью 10><10 мм2

Два дозированных симметричных ожога ША степени площадью по 300 мм2 наносили под хлороформным ингаляционным наркозом на обе стороны предварительно выбритой заднебоковой части тела с помощью специального приспособления при t =100°С в течении 10 секунд Общая площадь ожогов при этом составляла около 5% поверхности тела Спустя 5, 10, 15, 20, 25, 30 дней рассчитывают индекс заживления раны (ожога)

Острый токсический гепагит воспроизводили подкожным введением 50% масляного раствора четыреххлористого углерода из расчета 0,5 мл на 100 г массы тела животного в течение 3 дней (В С Поздняков, Н Г Иванов, 1979) Подострый гепатит воспроизводили при комбинированном введении тетрахлорметана и этанола (Н П Скакун, С Ф Ковальчук, 1987) Гепатоток-сины вводили по следующей схеме 50% масляный раствор тетрахлорметана подкожно в дозе 0,4 мл/100 г массы, через 3 часа - внутрижелудочно 40% этанол в дозе 1,3 мл/100 г массы тела Процедуру повторяли на протяжении 4 суток Исследуемые вещества и препараты сравнения вводили за 1 час до введения гепатотропных ядов на протяжении всего периода интоксикации Анализ функциональных и биохимических показателей проводили через 72 часа после последнего введения гепатотоксинов

Анальгетическую активность оценивали по способности препаратов уменьшать количество «корчей» в исследуемой группе животных по сравнению с контрольной и выражали в процентах «Корчи» вызывали 0,75% раствором уксусной кислоты из расчета 0,1 мл на 10 г массы животного, который вводили внутрибрюшинно За животными наблюдали в течение 20 минут и подсчитывали количество «корчей»

Скрининговые опыты выполняли в соответствии с методическим пособием «Скрининг адаптогенов - стресс-корректоров, Воронеж, 2000» Первый этап осуществлен на инфузориях Р caudatum

Физическую нагрузку создавали методом плавания мышей в обезвоз-душенной водопроводной воде при 20°С Мышам на корень хвоста закрепляли груз в 5 % от массы тела Учитывали продолжительность плавания до полного утомления Не допуская гибели, мышей извлекали из воды, высушивали, отогревали и при необходимости использовали для повторных нагрузок

Иммобилизационный стресс белых крыс воспроизводили классическим методом Животных до начала экстремального воздействия за 14 часов подвергали депривации без лишения доступа к воде Испытуемые препараты вводили однократно за 1-24 часа или в течение трех дней (инъекционно) В последнем случае введение препарата прекращали за 24 часа до иммобилизации Иммобилизацию осуществляли лежа на спине на специальных дощечках путем щадящей фиксации животных за четыре конечности Продолжительность иммобилизации - 18 часов Дощечки размещали на лабораторных столах Температура воздуха в помещении 18°-20°С Контрольным и интактным животным инъекционно вводили стерильный физиологический раствор или масло кукурузное Интактных животных содержали рядом в клетках в свободном состоянии До экстремального воздействия и после иммобилизации животных взвешивали Затем с соблюдением существующих норм декапитировали, отделяли и взвешивали надпочечники, тимус, селезенку Вычисляли коэффициент их массы Для оценки стрессогенного ульцерогенеза желудок промывали, просматривали и подсчитывали в нем количество язв, измеряли их диаметр Также подсчитывали количество точечных и петехиальных кровоизлияний

С целью характеристики общего состояния животных при проведении модельных опытов общепринятыми методами, описанными в соответствующих руководствах (В Г Предтеченский, 1964, И П Кондрахин с соавт , 1983, И М Карпуть, 1986) в крови определяли количество эритроцитов (1012/л), гемоглобина (г/л), СОЭ (мм/ч), лейкоцитов (109/л), тромбоцитов (10%), в сыворотке крови - активность АлАТ, АсАТ, у-ГГТ (Ед/л) (В В Меньшиков, 1973), щелочной фосфатазы (Ед/л) (Н М Дорошенко, 1976) или наборами фирмы «Vital Diagnostics», содержание холестерина (мМ/л) по Ильку (Меньшиков В В с соавт, 1987), общих липидов (г/л) (Орлов Л В , 1980), альбуминов (г/л) наборами фирмы «Vital Diagnostics», p-липопротеидов (мг%) турбодиметриче-ским методом (М Ледвина, 1960), общего белка рефрактометрически и белковые фракции электрофорезом на агарозе (Ю Б Филиппович с соавт, 1975), содержание каротина и витамина А в яйце (Л И Войтов с соавт, 1989)

Характеристику системы пероксидное окисление липидов - антиоксидант-ная защита (ПОЛ-АОЗ) у животных проводили по показателям содержание в крови конъюгированных диенов (D233/мг липидов) и кетодиенов (0278/мг липидов) определяли спектрофотометрически при в гептановой фазе липидного экстракта крови, а содержание (мкМ/л) малонового диальдегида - по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (В С Бузлама с соавт, 1997), содержание в сыворотке крови флуоресцирующих оснований Шиффа в уел ед /мл сыворотки на спектроколориметре «Спекол-Ю» с флуоресцентной приставкой при длине волны возбуждения 365 нм и испускания — 435-440 нм За 1 условную единицу принимали интенсивность флуоресценции раствора хинин-сульфата с концентрацией 1 мкг/мл в 0,1 Н серной кислоте (W R Bidlack, A L Tappel, 1973, V G Malshet, A L Tappel, 1973), содержание в сыворотке крови витамина Е в мкМ/л (Р Ш Ки-силевич, СИ Скварко, 1972) Для повышения чувствительности метода вместо 2,2-дипиридила использовали батофенантролин (1 D Desai, F Е Martinez, 1986), активность глутатионпероксидазы (К Ф 1 11 1 9) в крови с использованием в

качестве субстрата гидроперекиси изопропилбензола (Г О Кругликова, И М Штутман, 1976) Активность фермента выражали в мМ восстановленного глута-тиона/л мин, активность глутатионредуктазы (К Ф 1 6 4 2 ) в крови в мМ окисленного глутатиона/л мин, (ГО Кругликова, ИМ Штутман, 1976), активность катапазы по способности перекиси водорода образовывать с молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс с максимумом поглощения при 410 нм (М А Королюк, 1988) Влияние криопрепаратов плаценты на уровень генерации активных форм кислорода изучали методом индуцированной люми-нолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) в модельной системе на основе реакции Фентона (Fe2+/H202) Измерение интенсивности хемилюминесценции проводили на хемилюминометре БХЛ-06 М Регистрировали светосумму вспышки (S), интенсивность ХЛ в точке наибольшей интенсивности реакции (Imax), скорость снижения интенсивности ХЛ (tga2), отражающая антиокислительную активность (АОА) препарата

Ангирадикальные свойства тканевых препаратов изучали на модели взаимодействия их со стабильным свободным радикалом - а-дифенил-а-пикрилгидразилом (ДФПГ) по Glavind (Владимиров Ю А, Арчаков А И , 1972) Оценку антирадикальной активности препаратов проводили в сравнении с аскарбиновой кислотой и L-цистеином

Для характеристики состояния гуморального звена неспецифической иммунологической резистентности организма определяли бактерицидную активность (%) сыворотки крови (О В Смирнова, ТА Кузьмина, 1966), лизоцимную активность (мкг/мл) сыворотки крови (ОВ Бухарин, HB Васильев, 1974), комплементарную активность (% гемолиза) сыворотки крови (ГФ Вагнер, 1966), содержание суммарных иммуноглобулинов (отн ед) в сыворотке крови с помощью цинк-сульфатного теста (М А Воловенко, 1975), функциональную активность нейтрофилов по НСТ-тесту (Д Н Маянский с соавт, 1978)

Профилактическую и терапевтическую эффективность применения препаратов плаценты определяли по снижению заболеваемости и падежа, повышению сохранности животных, их продуктивности, воспроизводительных показателей и качества животноводческой продукции Клиническое наблюдение за опытными животными и диагностические исследования проведены совместно с ветеринарными специалистами

Статистическая обработка результатов проведена с пользованием пакетов прикладных программ «Microsoft Excel», «Statistica 5,0» на PC «Pentium III» Достоверность отличий оценивали методом парных сравнений, используя t-критерий Стьюдента (Г Ф Лакин, 1990)

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Технологические параметры, физико-химические свойства и биологическая активность продуктов криофракционирования плаценты свиной

Разработана принципиальная схема криофракционирования плаценты свиной Оценку правильности выбора технологической схемы или технологического параметра производили на основе основного показателя - актив-

ность по отношению к определенным биологическим объектам Скрининг предусматривал использование в качестве тест-объекгов культуру клеток Р саисЫит и лабораторных животных В результате первичного скрининга выделили ряд оптимальных технологических параметров и соответствующие им субстанции, которые проявляли максимальную биологическую активность Проведенные исследования взаимосвязи технологического процесса с биологической активностью препаратов, получаемых криофракционировани-ем, позволили успешно качественно и количественно оценить условия проведения данного процесса Включение скрининговой модели в технологический процесс ускорило процесс поиска и получения новых биологически активных субстанций — низкомолекулярной, липофильной и гидрофильной фракций плаценты свиной, на основе которых были получены препараты -криотон, липотон и аминотон

Химический состав низкомолекулярной фракции плаценты свиной микроэлементы (мг/л) - медь - 0,17-0,22, цинк - 1,0-1,26, железо - 0,8-0,95, марганец - 0,02-0,03 Свободные аминокислоты (мМ/л) глютаминовая кислота -17,2- 17,5, глицин — 6,6-8,2, апанин — 6,8-8,0, вапин - 15,4-16,6, изолейцин -9,3-10,4, лейцин - 12,9-13,8, тирозин - 14,5-15,3, фенилаланин-23,9-26,2,гистидин - 40,7-45,0, триптофан - 18,0-19,6, лизин - 18,8-19,3 Также присутствуют сахара и полисахариды, летучие эфиры жирных кислот, полипептиды м м до 300

Препарат из низкомолекулярной фракции - криотон Это однородная прозрачная жидкость (разрешается незначительная опалесценция), от бесцветного до светло-желтого цвета со специфическим запахом

Липофильная фракция плаценты свиной представляет собой коричнево-бурую массу, размягчающуюся при комнатной температуре Химический состав липофильной фракции липиды - 93-97%, из них триглицериды - 2426%, НЭЖК - 20-22%, стерины - 10-15%, фосфолипиды - 35-42%, из них лизолецнтин - 12,1-19,8%, сфингомиелин - 13,3-15,5%, фосфатидилхолин -43,8-50,5%, фосфатидилинозитол - 5,3-8,6%, фосфатидилсерин - 11,6-13,5%, фосфатидилэтаноламин - 5,4-7,7%, фосфатидиловая кислота - 5,0-7,2%, витамины витамин Е - 1,51-1,74 мг%, витамин А - 199,8-214,2 мкг/г, витамин В2 -4,07-5,18 мкг/г, макро- и микроэлементы (мг/кг) цинк - 130-190, медь - 150300, марганец - 10-35, кальций - 0,56%, фосфор - 0,073 %, гексозы - 3-7%, свободные аминокислоты (мкМ/л) глютаминовая кислота - 4,2, глицин -2,5, аланин-2,0, валин - 4,2, изолейцин - 9,9, лейцин - 75,4, тирозин — 5,8, фенилаланин - 14,4, гистидин - 58,3, лизин - 100,3

На основе липофильной фракции плаценты свиной разработан препарат липотон Препарат представляет собой прозрачную маслянистую жидкость светло-желтого цвета со специфическим запахом

Гидрофильная фракция плаценты свиной - субстанция, получаемая в результате водной экстракции после выделения липофильной фракции

Физико-химический состав следующий аминокислоты (мкМ/л) - цистеи-новая кислота — 17,8 - 28,6, аспарагиновая кислота - 65,6 - 70,4, треонин — 205,3 -257,5, серии - 296,2-354,0, глютаминовая кислота - 412,7-501,5, пролин -

265.0-360,0, цистин - 45,5-81,0, глицин - 310,8-368,4, аланин - 521,7-576,7, валин - 224,3-307,6, метионин - 51,9-78,3, изолейцин - 142,9-187,5, лейцин -

588.1-660,7, тирозин - 101,3-109,5, фенилапанин - 267,0-353,1, гистидин -38,6-50,5, триптофан - 76,1-93,5, лизин - 295,7-324,3, аргинин - 114,9-133,9, глютамин - 488,9-571,4, таурин - 203,4-216,3, (3-аланин - 64,4-87,2, фосфо-этаноламин - 142,9-203,4, макро- и микроэлементы (мг/л) цинк - 0,27-0,28 , медь - 0,08-0,11, марганец - 0,33-0,38, железо - 5,44-6,93, кальций - 8,128,63, фосфор - 6,14-6,79, нуклеиновые кислоты - 0,036-0,04 мг/мл Также присутствуют гексуроновые кислоты, полисахариды

На основе гидрофильной фракции плаценты свиной разработан препарат аминотон, который представляет собой однородную суспензию светло-коричневого цвета со специфическим запахом При хранении допускается расслоение суспензии, которое исчезает после встряхивания

3.2. Токсикологическая характеристика препаратов криотои, липотон и

аминотон

3 2.1. Острая токсичность

Определение параметров токсичности исследуемых препаратов в остром опыте при однократном пероральном и внутрибрюшинном введении проведено на двух видах лабораторных животных белых крысах и белых мышах Одновременно на этих животных изучены симптомы острого экспериментального отравления препаратами Павших животных и особей, перенесших отравление препаратом, подвергали патологоанатомическому вскрытию

Препараты вводили однократно внутрь в дозах от 5,0 до 30,0 мл/кг в объеме 0,6 мл на мышь и 6,0 мл на крысу (дозы являются предельно допустимыми по объему для перорагтьного введения) и однократно внутрибрю-шинно в дозах от 10,0 до 50,0 мл/кг массы тела в объеме 1,0 мл на мышь и 5,0 мл на крысу (дозы являются предельно допустимыми по объему для внутри-брюшинного введения)

При двухнедельном наблюдении за животными (мыши и крысы) отмечено сохранение нормальной координации движений, болевой чувствительности и адекватной реакции на внешние раздражители Не отмечалось расстройств дефекации, мочеиспускания, других вегетативных симптомов и признаков нейротоксичности На протяжении двух недель наблюдения изменений в общем состоянии и поведении животных, как и случаев гибели не было отмечено Патоморфологическое изучение по окончании эксперимента не выявило нарушений в структурной организации внутренних органов, как при пероральном, так и внутрибрюшинном способе введения

Таким образом, препараты по степени токсичности относятся к IV классу опасности - малоопасные вещества (ГОСТ 12 1 007-76)

3.2 2. Хроническая токсичность

Хроническую токсичность препарата криотон изучали при накожном применение в течение 21 дня, а препаратов липотон и аминотон - при внутримышечном введении в течение 60 дней по следующим схемам

- криотон равномерно наносили на поверхность выстриженного участка кожи крыс по 0,5 мл на площадь 5 см2, то есть плотность нанесения препарата составляла 0,1 мл/ см2 Первая группа крыс была контрольной, второй группе животных наносили препарат в течение 21 дня

- липотон вводили в дозах 5,0, 100,0 и 1000,0 мкг/кг (по ДВ) массы тела (терапевтическая, в 20 и 200 раз превышающие терапевтическую дозу) и аминотон - в дозах 0,1 и 2,0 мл/кг массы тела (терапевтическая и в 20 раз превышающая терапевтическую дозу) в течение 60 дней Наблюдение за животными вели на протяжении всего опыта

Ежедневное нанесение криотона на кожу в течение трех недель и внутримышечное введение липотона и аминотона в течение двух месяцев в ранее указанных дозах не вызывало видимых изменений в поведении, клиническом состоянии животных Препарат не вызывал изменений в поведенческих реакциях, реакции на внешние раздражители, а также нарушений в двигательной активности животных

За период наблюдения у животных опытных групп не было отмечено нарушений функций пищеварения и мочеотделения Подопытные животные потребляли обычное количество корма и воды Случаев гибели животных опытных и контрольных групп не отмечалось

В течение курса применения криотона подопытные животные не отличались от контрольных животных по приросту массы тела Несколько иная картина отмечена при применении препаратов липотон и аминотон За период наблюдений общий прирост контрольных животных шел постоянно и составил плюс 107,1% к исходному Разница между контрольной и опытными группами по интенсивности роста в конце опыта составила 29,1% (аминотон - 0,1 мл/кг) и 9,8-10,4% (липотон - 5,0 и 100,0 мкг/кг) Применение аминотона в дозе 2,0 мл/кг и липотона в дозе 1000,0 мкг/кг (по ДВ) проявило такое же, но менее выраженное влияние на рост белых крыс

По окончании эксперимента статистически достоверных различий по коэффициентам массы внутренних органов крыс между контрольной и опытными группами не обнаружено и находятся в пределах физиологической нормы Длительное применение криотона и липотона не оказывало отрицательного влияния на морфологические и биохимические показатели крови лабораторных животных В то же время, хроническое внутримышечное введение аминотона в дозах 0,1 и 2,0 мл/кг оказало стимулирующее влияние на гемопо-эз, выражающееся в увеличении содержания гемоглобина на 9,1% и количества эритроцитов на 10,7%, по сравнению с контрольными животными

3.2.3. Эмбрнотоксическое и тератогенное действие

В опытах по изучению эмбриотоксического и тератогенного действия аминотона и липотона на крысах, которым вводили внутримышечно изучаемые препараты в терапевтической дозе и в 20 раз (аминотон) и в 200 раз (липотон) превышающей терапевтическую дозу с первого дня беременности и в течение всего периода беременности (21-22 дня) установлено отсутствие эффекта действия

Липотон в дозах 5,0 и 1000 мкг/кг массы тела не оказывает отрицательного влияния на овуляторные процессы, а даже усиливает эмбриогенез (количество мест имплантации на самку увеличивается при введении препарата в дозе 5,0 мкг/кг на 16,1%, а в дозе 1000 мкг/кг - на 20,0%)

Введение липотона в течение всей беременности в изучаемых дозах снижает предимплантационную гибель плодов на 67,2% и 72,3%, а постим-плантационную гибель на 58,8% и 45,2% И, в целом, снижает общую эмбриональную смертность в среднем на 61% Общая эмбриональная смертность при введении аминотона снижается на 8,8% (0,1 мл/кг) и на 13,7% (2,0 мл/кг)

Липотон и аминотон оказывают влияние на рождаемость и развитие плодов при длительном применении их беременным самкам Хотя ряд данных статистически недостоверны (Р > 0,05), но тенденция прослеживается очень устойчиво При применении липотона количество живорожденных крысят возрастает на 4,5%, средняя масса их увеличивается на 4,7% При применении аминотона количество живорожденных крысят возрастает на 2,7%, средняя масса их увеличивается на 5,4% У плодов не обнаружено отклонений от нормы в строении внутренних органов, нарушений развития костной системы, а также изменения массы и краниокаудальных размеров плодов, что свидетельствует об отсутствии тератогенного действия у препаратов

3.2.4 Местнораздражающее действие

В результате проведенных исследований местнораздражающего действия препаратов установлено, что при однократной аппликации на кожные покровы кроликам при плотности нанесения от 0,020 до 0,10 мл/см2 криотон, аминотон и липотон не вызывают повреждение кожи в виде эритемы или ее отеков

Изучение раздражающих свойств криотона, липотона и аминотона при внутрикожном способе введения и на слизистые оболочки, проведенное на кроликах, показало, что через 60, 180 минут и 4 часа раздражающее действие препаратов отсутствовало

Оценка кожно-резорбтивного действия липотона и аминотона на белых мышах и белых крысах не выявило какого-либо заметного влияния препаратов на прирост массы тела мышей и крыс, их поведенческие реакции, а также количество лейкоцитов и эритроцитов в крови Не было выявлено органических повреждений хвоста мышей, нарушения целостности кожи на месте нанесения препаратов у крыс, не наблюдали нарушений функционального состояния организма подопытных животных

3.2 5. Аллергенные свойства

Исследования по изучению аллергенных свойств препаратов из криогенных фракций свиной плаценты, в зависимости от путей введения, проводили при наружном и парентеральном способах применения Опыты по изучению аллергенных свойств криотона проведены на белых беспородных крысах, аминотона и липотона на морских свинках

Результаты оценки сенсибилизирующего действия криотона, аминотона и липотона показали отсутствие выраженной реакции иммунной системы

подопытных животных на введение препаратов Препараты не вызывали контактного дерматита после многократных накожных аппликаций, а реакции специфического лизиса и специфической агломерации лейкоцитов были отрицательны Полученные данные позволяют сделать вывод об отсутствии аллергенного действия изучаемых препаратов

3.2.6. Мутагенное действие препаратов

Данные, характеризующие индукцию клеток с хромосомными аберрациями представлены в таблице 1, из которой видно, что как при однократном введении липотона в дозе 1000 мкг/кг (по ДВ), а аминотона - 2,0 мл/кг, так и при 4-х кратном не обнаружено достоверного увеличения хромосомных аберраций при разных экспозициях Качественный спектр хромосомных нарушений в контрольных и опытных группах включали гепы и одиночные фрагменты Сходные результаты получены при многократном введении препаратов в тех же дозах

Обобщая результаты цитогенетических исследований можно заключить, что липотон и аминотон в изученных дозах не проявляют мутагенную активность в тесте индукции хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей

3.2.7. Влияние липотона и аминотона на качество мясопродуктов Гигиеническую оценку на качество мясопродуктов проводили на кроликах с массой тела 2,7-3,0 кг Животным опытных групп вводили липотон в дозе 1000 мкг/кг массы тела по ДВ, аминотон - в дозе 2,0 мл/кг Препараты вводили один раз в сутки внутримышечно в течение 7 дней

Таблица 1

Мутагенная активность липотона и аминотона _

Аберрации Кол-во

с<3 Кол-во исслед клеток Фрагменты клеток Доля

С п >, сх и Одиночные Парные Обмены Гепы с множеств абер-рац аберрантных клеток

Контроль(однократно)

1 100 1,17±0,31 | 0 0 1,00±0,52 0 1,17±0,31

Контроль (четырехк ратно)

2 100 1,00±0,26 | 0 0 0 0 1,00±0,26

Липотон (однократно)

3 100 1,17±0,48 | 0 0 0,33±0,21 0 1,17±0,48

Липотон (четырехкратно)

4 100 1,67±0,33 | 0 ^ 0 0,83 ±0,48 0 1,67±0,33

Аминотон (однократно)

5 100 0,83±0,31 I 0 о 0,42±0,18 0 0,83±0,31

Аминотон (четырехкратно)

6 100 1,33±0,21 0 0 0,67±0,33 0 1,33±0,21

В результате проведенных органолептических исследований не установлено существенных различий между качеством проб бульона и мяса кроликов контрольной и опытных групп.

Пробы мяса имели хороший, свойственный продукту цвет и вид на разрезе, ароматный запах, приятный вкус, нежную консистенцию и достаточную сонность. Бульоны были прозрачные, слегка золотистого цвета с капельками жира, приятные на вкус и достаточно ароматные. Общая органолентическая оценка проб мяса и бульона - хорошая.

3 3. Экспериментальная фармакология препаратов 3.3.1. И м м у и о м одул ирую ши е свойства ли iiotgii а и амниогонл

Результаты исследований влияния липотона и аминотона на фагоцитарную активность макрофагов перитонеального экссудата мышей представлены на рисунке 1. Из представленных данных видно, что липотон и амино-тон повышает фагоцитарную активность макрофагов (% фагоцитоза по сравнению с контролем выше в 2,0-2,9 и 2,9-3,5 раза соответственно). Кроме того, препараты оказывают выраженное воздействие на переваривающую способность фагоцитов, повышая индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) с 19,08% - в контроле до 66,7-68,2% - при применении аминотона и до 53,654,5% - лигютона. При этом достаточно четко прослеживается дозозависимая активность препаратов.

Увеличение лозы аминотона до 1,0 мл/кг снижает фагоцитарную активность, а у липотона эффект усиливается с нарастанием Дозы. Также установлено, что липотон и ам иного н достоверно повышают процент HCT-положи тельных нейт-рофилов крови мышей в спонтанном НСТ-тееге в 2,4 раза, в стимулирован-иом-в среднем в 3 раза. При атом, Рис. I. Влияние липотона и аминотона на эффект стимуляции является для ИЗФперитонеаяъныхмакрофаянмышей них дозозависимым.

Для изучения влияния препаратов на некоторые показатели гуморального иммунитета липотон вводили коровам подкожно в дозе 100,0 мкг/кг, телятам - 5 мкг/кг; аминотон (коровам и телятам) - в дозе 0,1 мл/кг; ПДЭ (коровам и телятам) - 20 мл/гол. Препараты вводили пятикратно с интервалом 48 часов.

Все тканевые препараты оказывают выраженное стимулирующее действие на показатели гуморального звена нсспецифической иммунологической резистентности. У коров и 2-х месячных телят, обработанных липото-ном, отмечено повышение бактерицидной активности сыворотки крови (БАСК), соответственно, на 23,3% и 16,6%, лизоцимной активности (ЛАСК) - на 29,7% и 30,9% и содержание общего комплемента - на 28,4% и 38,9% по сравнению с контролем. Под влиянием аминотона бактерицидная активность сыворотки крови телят повышается на 20,5%, у коров - 25,6%. Аминотон

,TlП1'П до \mi]но7о 11

I ü üi:.ik[ м'I ПОД Mk I гг:j □ i,0 мкг/мл

вызывает повышениие активности лизоцима у коров на 38,1%, у телят— на 29,6%. I [репарагы до 30,2% повышают и активность комплемента у корон и до 42,1% у телят (рис. 2 и 3).

140 135 130 125 120 115 110

1

1 тtH

fnpl =i

Koimjicoretfr BACK ЛАСК

ЕЗ imh но тон Олнлотон ШТ1ДЭ

Рис. 2. Влияние ышшпюнп, липотона и

коатлетянт БАСК ЛАСК Йаетннотон Олнпотон ППДЭ

Рис. 3. Влияние аминотона, липотона

ПДЭ на иокшатеаи естественной резистент- и ПДЭ на показатели естественной ре-ноачи KOjxte (в%кктннраяю) тетентноепш у телят (% к контролю).

При этом следует отметить, что по силе влияния на изученные показатели аминотон и липотон несколько превосходят известный тканевый препарат ПДЭ.

3.3.2. Антиоксидантные свойства препаратов плаценты 3.3,2.1, Антиокислительные и янтирадмкальные препаратов плаценты in vitro

При изучении влияния тканевых препаратов на интенсивность процессов си обод норад икал ьнбш окисления in vitro установлено, что исследуемые препараты проявляют антиокислительные свойства в условиях моделирования реакции Фентонз (табл.2).

Таблица 2

Препарат S Ьпах tga2

Аминотон 25,2±1,51 * 7,7±0,64* 2,6±0,24*

Липотон 14,6±0,64* 5,4±0,49* 2,1 ±0,22*

Крмотон 31,1 ±0,39* 12,2±0,86*

ПДЭ 68,7±1,80* 28/4± 1,24 12,041,26

Контроль (Н20) б6,0±2,21 2 7,6± 1,79 11,7±1,08

Смесь ПЭО/ПГ 62,5± 1,97 23,3±1,55 9,4±0,98

* - Р < 0,05 по отношению к контрольной пробе

Наибольшее ингибируюшее влияние на максимальную интенсивность ХЛ оказывал липотон (ингибирование на 77,9% по отношению к контролю), У аминотон а и криотона это действие проявляется приблизительно в одинаковой степени - на 61,8 и 52,9% соответственно. ПДЭ в ^той системе проявляет прооксидангные свойства. Максимальное увеличение длительности латентно-

го периода ХЛ вызывал липотон (в 5,6 раза). Аминотон также существенно удлинял его в 4,5 раза. В меньшей степени действовал криотон — в 2 раза.

Как видно из данных, представленных на рисунке 4 наибольшей анпфадикапьной активностью (АРА) в отношении стабильного свободного радика; га ДФПГ обладает липотон, который превосходит АРА аскорбиновой

кислоты и цистеина в 2,1 и 5,2

íw

-150

mi

Í4>

Ж)

-

:оо 141

т w ó

I | I | ® Э Рща ссютветственн°- АРА амино-I ¿ I | | тона сравнима с АРА препарата

< ^ ü w ПДЭ и превосходят цистеин на

Рис.4. Антирадикадьная активность пли- 23,5 и 70,9% соответственно, в го центарних препаратов (мкМДФПГхч) же время уступая АРА аскорбино-

вой кислоты. Криотон АРА практически не обладает.

Таким образом, препараты из плаценты свиной, полученные методом криогенного фракционирования, обладают выраженным антиокислительным и антирадикальным действием. При этом аминотон, липотон и криотон оказывают различное действие на показатели ХЛ и обладают разной степенью антирадикальной активности, что свидетельствует о разно компонентном их составе.

3.3.2.2. Влияние препаратов плаценты на интенсивность П О Л и систему АОЗ при их применении здоровым животным

Изучение влияния тканевых препаратов на интенсивность процессов свободнорадякального окисления in vivo проведено на здоровых иитактных животных (белые крысы), когда интенсивность процессов переписного окисления находится на стационарном уровне.

Для оценки состояния процессов пероксидиого окисления липидов и состояния системы антиоксидантной защиты (АОЗ) было изучено влияние препаратов на концентрацию малонового диальдегида в крови и общую ан-тиокислительмую активность крови, методом лю м и н о л за в и Симой биохеми-люмикесценции, активность ферментативного звена системы АОЗ (катапаза, глутатионлероксидаэ а, гл у тат и о н реду ктаза).

Препараты применяли в следующих дозах: аминотон - 0,1 мл/кг, липотон - 5 М кг/кг (но ДВ), криотон - 0,1 мл/кг и ПДЭ - 0,1 мл/кг. Препараты вводили пятикратно внутримышечно с интервалом 48 часов. Исследования проводили через сутки после последнего введения препаратов.

Установлено, что применение тканевых препаратов вызывает сдвиг в балансе реакций свободнорадикального окисления липидов, что выражается в снижении уровня МДА (рис, 5). Концентрация МДА в крови крыс, получавших аминотон, в конце опыта была ниже, чем у контрольных животных на 17,0%, в группе, получавшей липотон, на 23,6%, криотон - на 4,7% и ПДЭ

— на 6,3%. Применение препаратов оказало влияние и на состояние ферментативного звена системы антиоксидантной защиты организма.

В ведение животным ли погона приводило к повышению активности ферментов антиоксидантной защиты — активность катал азы возрастала на 9,5%, активность ферментов глутатионового звена; ГР и ГПО - на 11,3% и 9,5% соответственно по сравнению с контрольной группой животных ■ *<.*троп1 вллкиотчи □ ткпатои икрщток ипдэ (табл.З), Аминотон, как и ПДЭ Рис 5. влияние тканешх препаратов на примерно в одинаковой степени со держан не МДЛ в крови крыс.; оказывают стимулирующее влия-

ние на ферментативное звено системы антиоксидантной защиты организма.

Таблица 3

Влияние препаратов плаценты на показатели ферментативного звена системы антиоксидантной защиты в кропи у крыс Показатели

Группы Катал аза, мкМ НгОУлхсек ГПО, мМ В Г/л х мин ГР, мкМ ОГ/лхмин Небелковые 5Н-группы, мМ/л

Контроль 33,6±0,57 38,2± 1,07 124,9±2,41 2,18±0,10

Липотон 36,8±1,18* 42,5±1,21 * 136,8±3,19* 2,31±0,16

Аминотон 34,8±2,37 40,1±1,12 1|5,3±3,41 2,26±0,19

ПДЭ 34,6± 1,42 39,4±3,09 133,9±6,18 2,22±0,14

* - Р<0,05 по отношению к контролю

Оба препарата повышают активность катал азы на 3,6%, активность ГПО — на 5%, а ГР — на 8,3-7,2%. Активность глутатионпероксидадазы в крови крыс, получавших криотон практически не изменялась,

3,3.3. Противовоспалительное и репаративное действие препаратов

плаценты

3.3.3.1. Противовоспалительное действие липотона и аминотона

Исследование влияния липотона и аминотона на воспаление, вызванное 2% формалином, 1% раствором каррагенином и 2% суспензией знмозана у белых половозрелых неинбредных мышей и крыс показало, что изучаемые препараты обладают выраженным антифлогистическим действием. Так, липотон угнетал каррагениновое воспаление на 46% (Р<0,05), аминотон - на 40,2% (Р<0,05). Воспаление, вызванное введением формалина, липотон снижал на 52% (Р<0,05), аминотон - на 43,6% (р<0,05) по сравнению с контрольными животными (рис,6). Противовоспалительное действие аминотона и липотона па модели воспаления вызванного каррагенином было аналогично действию орто-

Kapp а^еннно вое Формалиновое воспаление воспаление

■ контроль О амин ото а S липами а ГЩЭ Портофзн

Рис.6. Противовоспалительная активность липотона и аминотона

фена, а на модели формалинового воспаления эффективность препаратов плаценты даже превышала активность ортофена в 1,3-2 раза.

На модели асептического экссудат ив но го воспаления у крыс, вызванное введением зимозана установлено, что максимальный отек лап крыс, получавших линотон, аминотон и дексаме-тазон развивался на 3-й час после введения суспензии зимозана. Наиболее активными оказались лнпотон и декса-мстазон, под влиянием которых в течение первого часа увеличение объема лапы крыс было меньше, чем в контрольной группе, соответственно, на 87,4% и 50,8%. Препарат ПДЭ на данной модели проявлял провосиалитель-ные свойства, т.к. отек лапы крыс был выше, чем в контроле на ! 1,4%,

Противовоспалительное действие лнпотон а при зимозановом отеке было аналогично действию дексаметазона, а к концу первого часа после введения зимозана даже превышало действие дексаметазона в 1,9 раза. Противовоспалительное действие аминотона при зимозановом отеке было также аналогично действию дексаметазонз, но активность его была значительно ниже (в 1,5 раза), но и в этом случае интенсивность воспаления была выражена значительно слабее, чем в контроле (на 16%).

Таким образом, изучение противовоспалительных свойств липотона и аминотона на различных моделях воспаления позволило установить, что препараты оказывают лечебное действие на стадии локального воспаления и их противовоспалительная активность, особенно липотона, сравнима с эффективностью дексаметазона и ортофена.

3.3.3.2. Противоязвенное действие ли потока и аминотона

Противоязвенное действие липотона и аминотона изучали на модели, вызываемой совместным введением лексаметазона и дикпофенака. Изучаемые препараты вводили дважды - за 24 часа и за час до введения поражающих факторов в дозах: липотон - 5,0 мкг/кг, аминотон и ПДЭ - 0,1 мл/кг. 13 качестве препарата сравнения использовали ПДЭ и известный противоязвенный препарат фамотиднн.

Из данных, представленных в таблице 4 видно, что под влиянием липотона происходит уменьшение количества язвенных поражений слизистой оболочки желудка (СОЖ), по сравнению с животными контрольной группы на 79,7%, а также в сравнении с животными, которым применяли ПДЭ - на 57,8%.

Противоязвенный эффект липотона был соизмерим с эффективностью, известного противоязвенного препарата — фамотидина. Аналогичным, хотя и в меньшей степени, было действие аминотона, под влиянием которого происходило уменьшение числа язвенных поражений СОЖ, по сравнению с кон-

трольной группой на 52,8% При этом противоязвенный эффект аминотона был значительно ниже, чем у фамотидина в 2,5 раза

Таблица 4

______Противоязвенная активность аминотона и липотона__

Препарат Доза Кол-во животных Количество повреждений СОЖ Противоязвенная активность (ПЯ)

Контроль - 6 9,00±1,37 -

Липотон 5 мкг/кг 6 1,83±0,91 + 4,82

Аминотон 0,1 мл/кг 6 4,25±0,87* 2,12

ПДЭ 0,1 мл/кг 6 4,34±0,97* 2,07

Фамотидин, 40 мг/кг 6 1,67±0,76* 5,38

* - Р < 0,05-0,001 по сравнению с контролем

Таким образом, использование липотона в дозе 5 мкг/кг (по ДВ) оказывает выраженный антиульцерогенный эффект на модели повреждения СОЖ, индуцированного диклофенаком

3.3 3.3 Влияние липотона и аминотона на регенерацию кожи

Целью настоящих исследований явилось изучение скорости заживления ран у крыс под действием липотона и аминотона Липотон в зависимости от задач эксперимента применяли в двух вариантах 1) препарат вводили внутримышечно в дозе 5,0 мкг/кг массы тела - 1-я группа, препарат наносили на раневую поверхность с помощью автоматической пипетки в дозе 100 мкл, равномерно распределяя по всей пораженной поверхности - 2-я группа Аминотон и ПДЭ вводили внутримышечно в дозе 0,1 мл/кг (3-я и 4-я группы), животным контрольной группы никакие препараты не применялись (пятая группа) Препараты применяли ежедневно (до полного заживления ран)

На модели лоскутной раны у крыс наиболее эффективным оказался липотон, который вводили внутримышечно На 15-е сутки площадь ран, по сравнению с исходной, в первой группе сократилась на 91,9 % , во второй группе - на 76,8%, в третьей группе - на 82,1%, в четвертой - на 67,7%, а у контрольных животных - на 28,4%

Полное заживление раны в группе животных, которым липотон вводили внутримышечно, наступило на 15-17 день, в группе животных, леченных липотоном наружно - на 17 день, в третьей группе — на 16-18 день, в группе животных получавших ПДЭ - на 19 день У контрольных животных полное заживление раны наступило на 26-27 дни после нанесения травмы

Аналогичные результаты получены и на модели ожоговой травмы у крыс В отличие от контрольных животных, при термическом ожоге у крыс, которых лечили липотоном и аминотоном, на 4-6-й день рана хорошо эпителизирова-лась, струп был неподвижен и плотно покрывал раневую поверхность

На 10-е сутки площадь ожоговой раны у крыс, которым липотон наносился на рану, была меньше, чем у контрольных крыс почти на 18% (Р< 0,05), а при внутримышечном применении - в 1,2 раза (Р < 0,05) И в последующие периоды наблюдения отмечали ускоренное, по сравнению с контролем, за-

живление ожогов у крыс, получавших липотон При этом наибольшие различия с контролем были зарегистрированы у крыс, которым препарат применяли внутримышечно У отдельных животных из этой группы полное заживление ожогов и образование нежного рубца происходило уже на 20-е сутки после нанесения ожога

Аминотон при парентеральном применении после ожога также оказывает достаточно выраженное действие На 10-е сутки скорость заживления ран в опытной группе была выше, чем в контрольной в 1,5 раза, а площадь ожоговой раны у крыс, которым вводили аминотон, была меньше, чем у контрольных крыс на 20,4% (Р<0,05) К 15-му дню отмечалась самая высокая скорость заживления ожогов При сравнении средней площади ран в опытной группе отмечено ее уменьшение по сравнению с 10-м днем, от начала опыта, на 42,2%, в то время как в контрольной - на 30,4% (Р<0,05)

У отдельных животных из опытной группы наблюдали полное заживление ожогов и образование нежного рубца уже на 20-25-е сутки (против 2830 дней в контроле)

Развитие ожоговой болезни вследствие нанесения даже относительно небольшого по площади (5% от общей поверхности тела) и частично глубокого ожога ША степени приводило к повышению в крови содержания продуктов ПОЛ (табл 5)

Таблица 5

Влияние липотона и аминотона на интенсивность процессов ПОЛ в крови у

крыс при ожоге

Показатели ПОЛ Группы животных

Контроль Ожог Липотон, Липотон, Аминотон,

в/м + ожог нар + ожог в/м + ожог

3-й сутки после ожога

ДК, Бгзг/мг ли-пидов 0,122±0,011 0,290±0,024* 0,163±0,017* 0,187±0,019* 0,191±0,023*

КД, 0278/мГ ЛИ-пидов 0,032±0,002 0,095±0,007* 0,054±0,002* 0,067±0,001* 0,066±0,002*

МДА, мкМ/л 2,35±0,09 4,02±0,53* 2,57±0,02* 2,73±0,11* 3,08±0,16*

14-е сутки после ожога

ДК, 0232/мгли-пидйв 0,122±0,011 0,150±0,010* 0,131±0,014 0,145±0,012 0,147±0,008*

КД, 0278/МГЛИ- пидов 0,032*0,002 0,042±0,003* 0,03 5±0,002 0,037±0,002* 0,038±0,003*

МДА, мкМ/л 2,35±0,09 3,06±0,14» 2,28±0,17 2,39±0,11 2,58±0,09*

* - Р<0,05 по сравнению с итактными животными

Изменения в интенсивности течения процессов ПОЛ наиболее ярко проявляются в первую неделю постожогового периода На 3-й сутки после нанесения ожоговой травмы в крови крыс контрольной группы уровень конъюгированных диенов возрастал в 2,4 раза, МДА - на 71, 1%, кетодиенов - в 3 раза При аппликации липотона на ожоговую рану содержание в крови диеновых коныогатов повышается через 3 суток на 53,3%, МДА - на 16,2%, кетодиенов - в 2,1 раза При внутримышечном применении липотона содер-

жание ДК в липидах крови и МДА возрастает всего - на 33,6% и 9,4% соответственно, более поздних продуктов ПОЛ - кетодиенов - на 68,8%

При парэнтеральном применении аминотона через 3-е суток после нанесения ожоговой травмы степень индукции ПОЛ ниже, чем у контрольных животных в зависимости от характера изученных продуктов ДК - на 56,6%, МДА-на31,1%, КД-в 2,1 раза

К концу второй недели после ожога уровень первичных и вторичных продуктов ПОЛ, а также более поздних - кетодиенов в контрольной и опытных группах снижается практически до значений этих показателей у интакт-ных животных

Развитие ожогового поражения сопровождается активацией ферментативного звена антиоксидантной системы (табл 6)

Таблица б

Влияние типотона и аминотона на состояние антиоксидантной системы у

крыс при ожоге

Показатели ПОЛ Группы животных

Контроль Ожог Липотон, в/м + ожог Липотон, нар + ожог Аминотон, в/м+ ожог

3-й сутки после ожога

Катал аза, мкМ НгОг/лхмнн 38,7±1,61 58,8±2,31* 49,2±2,36* 50,8±4,17* 50,3±3,87*

ГПО, мМ В Г/л* мин 36,2± 1,89 47,8±2,71* 41,5±2,06 42,8±3,11 42,9±2,15*

ГР, мкМ ОГ/л*мин 159,8±8,76 293,8±11,7* 251,1±14,1* 260,9±12,7» 268,8±5,33*

14-е сутки после ожога

Каталаза, мкМ НгОг/л^мин 38,7± 1,61 45,9±3,09* 41,1±3,17 43,5±1,29* 42,9±2,19

ГПО, мМ ВГ/лхмин 36,2±1,89 40,3± 1,13 37,9±1,67 38,0±1,66 38,9±3,11

ГР, мкМ ОГ/лхмин 159,8±8,76 201,5±9,71* 176,8±7,07 183,1±5,86 184,2±7,63

* - Р<0,05-0,001 по сравнению с интактными животными

Активность селензависимой ГПО через 3 суток после нанесения ожога увеличивается на 32,0%, а глутатионредуктазы - на 83,9 по сравнению с интактными животными В этот же период времени наблюдается и максимальная активность каталазы, которая превосходила активность данного фермента у интактных животных на 51,9%

Применение животным липотона и аминотона нормализовало состояние глутатионового звена антиоксидантной системы в крови в период наибольших изменений в процессах ПОЛ и состоянии антиоксидантного статуса организма, а именно на 3-й сутки после нанесения ожога В этот период активность ГПО и ГР в крови животных, которым вводили внутримышечно липотон, повышается на 4,6 и 10,6% соответственно по сравнению с интактными животными, но в свою очередь ниже, чем у животных с ожогом на 13,2 и 14,5% Повышение активности на 3-й сутки после ожога ГПО и ГР в крови

крыс, которых лечили липотоном (наружно) составляла 5,0 и 7,5%, а аминотона (внутримышечно) 14,6 и 15,3 % соответственно по сравнению с интакт-ными крысами Аналогичная динамика установлена и в отношении влияния липотона и аминотона на активность каталазы в крови крыс при ожоге

Таким образом, препараты липотон и аминотон обладают выраженным ранозаживляющим действием, превосходя по репаративной активности ПДЭ В условиях ожогового поражения введение препаратов препятствует избыточному накоплению в организме продуктов пероксидации липидов, нормализует реакцию со стороны системы антиоксидантной защиты и способствует более быстрому заживлению ожоговых травм

3.3.4. Изучение гепатопротекторного действия криопрепаратов

3.3.4 1. Геиатопротекторное действие липотона

Токсическое повреждение печени вызывали путем подкожного введения один раз в сутки 50% масляного раствора четыреххлористого углерода (ССЦ) из расчета 0,5 мл на 100 г массы тела белых крыс в течение 3 дней (Поздняков В С, Иванов Н Г, 1979)

Препараты начинали вводить через сутки после последнего введения тетрахлорметана, ежедневно, в течение 5 дней Первая группа (п=10) - ин-тактные животные, которым внутримышечно вводили стерильное растительное масло из расчета 0,25 мл на животное У животных 2-ой группы (п=10) вызывали токсическое повреждение печени тетрахлорметаном Крысам 3-ей и 4-ой групп (п=10) внутримышечно вводили липотон в дозах 1,0 и 5,0 мкг/кг массы тела (по ДВ) Животным 5-ой группы (п=10) вводили внутрибрюшин-но эссенциале в дозе 0,3 мл/кг Все исследования проводили через сутки после последнего введения препаратов

Применение липотона значительно снижало степень увеличения активности АсАТ и АлАТ в сыворотке крови, особенно в дозе 5 мкг/кг (табл 7)

Таблица 7

Влияние липотона и эссенциале на биохимические показатели сыворотки

крови крыс при токсическом гепатите

Показатели ССЦ-индуцнрованный гепатит

Контроль ССЬ-гепатит СС14 + эссенциале ССЦ+ липотон

1,0 мкг/кг 5,0 мкг/кг

АсАТ, ЕД/л 17,6±1,9 67,9±1,27* 58,5±2,51* 15,81±2,04а 14,9±2,34ж

АлАТ, ЕД/л 36,6±2,8 222,3±14,7* 59,5±3,02*а 87,4± 11,8** 34,8±5,10*

ЩФ, ЕД/л 74,4±15,2 146,6±3,65* 132,9±33,2* 71,49±8,96а 85,3±13,2Ж

у-П П, ЕД/л 18,08±4,8 35,5±4,44* 25,11±2,57* 21,74±4,80 18,50±4,30а

Общий белок, г/л 71,4±5,4 65,7±3,40 67,0±4,80 68,7±4,90 74,30±3,43

Альбумин, г/л 41,9±2,58 27,6±0,37* 33,2±1,95а 38,4±3,90А 40,22±1,20*

Креатинин, кМ/л 163,1±6,2 187,2±5,178* 176,3±8,93 172,б±9,11 170,9±5,11

Мочевина, мМ/л 5,20±0 21 7,80±1,61* 6,24±0,58* 7,80±1,61 5,93±042а

Общ липнды, г/л 2,77±0,09 3,95±0,11* 3,18±0,07*а 2,93±0,10* 2,90±0,08*

Холестерин,мМ/л 2,10±0,14 3,18±0,07* 1,40±0,25*а 2,11 ±0,29 А 0,90±0,1 1*а

Билирубин,мкМ/л 1,70±0,23 Ю,2±1,45* 7,30±1,47* 3,30±0,90А 2,22±0,23а

* - Р<0,05 по сравнению с контролем, А- Р<0,05 по сравненшо с СС14

Применение эссенциале препятствовало цитолитическому действию гепатотоксина в несколько меньшей степени

Наряду с этим при применении липотона в меньшей степени (на 14,7%), чем при применении эссенциале (на 78,6%) повышалась активность и маркерного фермента холестаза - щелочной фосфатазы Липотон в дозе 5,0 мкг/кг (по ДВ) при СС14-интоксикации так же препятствовал росту уровня креатинина (на 8,7%), мочевины (на 24%) и холестерина (на 71,7% )

Применение липотона животным, у которых в вызывали развитие токсического ССЦ-индуцированного гепатита, снижало уровень МДА на 14,8% (в дозе 1,0 мкг/кг) и на 29,1 % (в дозе 5,0 мкг/кг) по сравнению с животными, которых лечили эссенциале (табл 8) Уровень первичных продуктов ПОЛ в опытных группах снижался на 12-29 %

Таблица 8

Влияние липотона на показатели ПОЛ в крови крыс _при токсическом повреждении печени_

Группа животных Диеновые конъюгаты, 02зг/мг липидов Кетодиены, 0278/мГ липидов МДА, мкМ/л

Контроль 0,126+0,008 0,034±0,009 1,30+0,02

СС14 0,276±0,016* 0,06710,006* 2,87+0,11*

Эссенциале + ССЦ 0,191±0,046 0,049+0,011 1,96±0,04*А

Липотон, 1,0 + ССЦ 0,18910,021 *А 0,05310,018 1,67+0,15* А

Липотон, 5,0 + СС14 0,169+0,0 12*А 0,035±0,007А 1,39+0,09А

* - Р < 0,05 по сравнению с контролем, - Р < 0,05 по сравнению с СС14

При применении липотона активность глутатионзависимых ферментов увеличивалась в среднем на 19,0-31,5% и 9,4-16,0% Наиболее выраженное действие липотон оказывал в дозе 5,0 мкг/кг

3 3 4 2. Гепатопротекторное действие аминотона

Поражение печени вызывали комплексным воздействием этанола и тетрахлорметана в течение 4 дней путем подкожного введения животным 50% масляного раствора четыреххлористого углерода в дозе 0,4 мл/100 г массы тела и через 3 часа, после этанола - внутрижелудочного введения 40% этанола в дозе 1,3 мл/100 г массы

Первая группа (п=10) - интактные животные, которым внутримышечно вводили стерильный физиологический раствор из расчета 0,25 мл на животное У животных 2-ой группы (п=10) вызывали токсическое повреждение печени тетрахлорметаном и этанолом Для выяснения лечебно-профилактического действия изучаемый препарат и препарат сравнения вводили внутримышечно за 1 час до введения гепатотоксинов в дозах аминотон - 0,01 мл/кг (п=10) и 0,1 мл/кг (п=10), сирепар — 0,04 мл/кг (п=10) на протяжении всего периода введения этанола и СС14, и в течение 3 дней после окончания их введения

Установлено, что применение животным аминотона и сирепара оказало нормализующеее влияние на большинство биохимических показателей крови (табл 9) При применении обоих препаратов в 1,3-3,6 раза уменьшало активность в крови трансаминаз, ЩФ в 1,4-2,3 раза, билирубина - в 1,2-1,7 раза по сравнению с животными, которым вводили только этанол и СС14

Таблица 9

Влияние аминотона и сирепара на биохимические показатели сыворотки

крови к рыс при экспериментальном токсическом гепатите

Показатели Контроль С С 1.1 + этанол ССЦ + этанол

Сирепар, 0,04 мл/кг Аминотон, 0,01 чл/кг Аминотон, 0,1 мл/кг

1 2 3 4 5

Коэф массы печени 38,0*0,71 48,4*1,42** 45,2±1,74 43,8*1,37* 41,1*2,03*

Лейкоциты,107л 7,60±0,80 17,9*2,88** 17,2*2,82 9,43*0,79* 7,87*1,30

Гемоглобин, г/л 135,7*5,8 101,7± 17,3 139,2±9,3 159,0*14,2* 154,7*14,8*

АсАТ, Ед/л 24,6±3,8 76,2*4,27* 28,9*2,28** 43,9*3,79* 21,4*0,63**

АлАТ, Ед/л 37,1±1,1 94,3*11,0** 71,3*3,12 87,4*11,8 34,8*5 10**

ЩФ, ЕД/л 63,7*7,14 162,3*10,2** 117,5*21,8 81,9*9,65** 69,4*11,7**

у-ГТП, ЕД/л 18,1*4,80 35,5*4,44* 25,1*2,57 21,7*4,80 18,5*4,30

Общий белок, г/л 76,7*2,21 61,2*2,95** 69,5*2,23 73,5*1,13** 75,2*1,16**

Альбумин, г/л 41,9±2,58 23,6*0,84** 33,1*2,16** 37,3*1,20** 42,1*0,38**

Мочевина, мМ/л 6,97*0,49 9,13*0,72* 6,40±0,19** 6,77*0,21** 6,93*0,39**

Холестерин, мМ/л 2,03±0,19 6,70*0,45** 2,70*0,23** 2,27*0,17** 2,18*0,10**

Креатинин, мкМ/л 144,2±9,9 199,9*9,8** 148,3*3,3** 166,0*2,87** 171,5*3,93*

Билирубин, мкМ/л 3,71±0,32 10,9±1,31** 8,92*1,40 7,53*0,60* 6,43*0,62*

Липиды, г/л 3,80*0,17 18,1±0,71** 7,44*0,30** 6,14*0,21** 4,22*0,16**

*- Р12< 0,01 -0,001, * *- Р2 3 4 5 < 0,01 -0,001

Исследуемые препараты в разной степени препятствовали развитию характерных для гепатита метаболических нарушений Так применение аминотона в дозе 0,1 мл/кг ограничило рост активности АсАТ на 26% и препятствовало повышению активности АлАТ на 51,2% Применение сирепара предупреждало развитие явлений цитолиза в меньшей степени, о чем свидетельствовало увеличение в большей степени, чем при применении аминотона активности ферментов-маркеров цитолитического синдрома Аминотон эффективно, чем сирепар препятствовал развитию явлений холестаза, судя по активности ЩФ Введение животным аминотона татакже снижало степень гиперферментемии у-ГТП, активность которой является одним из маркеров интоксикации этанолом (аминотон - в 1,9 раза, сирепар - в 1,4 раза, по сравнению с группой животных, которым вводили СС14+ этанол

Применение при токсическом повреждении печени аминотона в дозе 0,1 мл/кг наиболее эффективно препятствовало интенсификации процесса ПОЛ (рис 7) Установлено, что уровень малонового диальдегида в крови у животных, которым вводили только этанол и четыреххлористый углерод увеличился в 1,6 раза

Развитие токсического гепатита сопровождается повышением уровня холестерина в крови в 3,3 раза, а аминотон препятствовал развитию ги-перхолестеринемии.

Таким образом, применение ли погона и амииотона ока-

Рис. 7. Содержание МДА (мкМ/д) в крови крыс при зывает выраженное гепатопро экеперимен шальном токсическом гепатите текторное действие при разви -

тии токсического гепатита и не уступают эссен ци ал е и сирспару, а по некоторым показателям даже превосходят их по эффективности,

3.3.5 Стресс-протекторное действие липотона и аминотона

В сравнительном плане на клеточном (культура Paramecium caudatum) и организменном уровне (белые мыши и крысы) и путем воздействия на них различными экстримальными факторами выявлена ада пто ген мая активность изучаемых препаратов.

В опыте на культуре парамеций установлено, что криотон защищает тест-культуру от повреждающего действия хлорида натрия на 8,6-26,0%. Особенно высокую активность проявляют аминотон и липотон, коэффициент защиты которых от повреждающего действия хлорида натрия колеблется от 1.127 до 2,017 в зависимости от концентрации препаратов в среде. Аминотон наиболее активен в разведении 1:10000, что соответствует дозе 0,1 г/кг, а липотон - в разведении I: ¡000000, что соответствует дозе 10 мкг/кг,

Липотон и аминотон оказывают выраженное стимулирующее воздействие на интенсивность размножения парамеций, находящихся в экс потенциальной фазе роста. Повышение интенсивности размножения клеток при их применении колеблется от 118,9 до 263,0%. Аминотон наиболее активен в разведениях 1:1000- 1:10000,что соответствует дозам l,0-0,i мл/кг, а липотон - в разведении 1:1000000, что соответствует дозе 10мкг/кг.

В трех сериях опытов на модели эмоционально-физической нагрузки, установлено, что липотон при внутримышечном введении в дозах 1,0-10,0 мкг/кг эффективно повышает физическую выносливость животных на 61,763,7%. Наличие этого эффекта наблюдается в течение 2 суток (срок наблюдения). У аминотона же максимум активности установлен в течение первых суток после его применения в дозе 0,1 мл/кг. Длительность плавания мышей по сравнению с контролем возрастает на 26,5 и 35,5 % соответственно (табл. 10). К концу 2-х суток эффективность аминотона несколько снижается.

Стресс-протекторное действие препаратов также изучено на модели острого стресса, вызванного иммобилизацией животных в течение 18 часов. Установлено, что липотон и аминотон во всех изученных дозах, хотя и в разной степени, обеспечивают предупреждение стрессогенного снижения массы тела животных на 18,0-45,9%.

Таблица 10

Влияние линотона и амннотона на выносливость белых мышей

Препарат

Продолжительность плавания животных (сек) при введении линотона и амтготона

0,1/0,001 1,0/0,01 10,0/0,1 100,0/1,0

Контроль 156,¿±9,4 156,6*9,4 156,<,±9,4 156,6±9,4

Липотон, мкг/кг 199,4±11,7* 253,3±19,4* 256,3±20,1* 170,1*10,5

Аминозон, мл/кг 182,2±11,8 198,1±14,7* 212,2±10,4* 185,6±14,7

* - Р<0,05-0,00! гю сравнению с контролем

Степень гипертрофии надпочечников на фоке действия липотона при иммобилизационном стрессе составляет 123,5-135,3 %, амннотона - 117,6152,9% (против 194,1% в контроле).

Ульперогенные свойства линотона проявляются на фоне действия всех испытанных доз. При однократном введении липотона в дозе 5,0-10,0 мкг/кг до стресс-воздействия поражения слизистой желудка обнаруживаются у 33,3% животных, а трехкратное введение практически полностью предотвращает ямвообразование. При применении амннотона также проявляется снижение количества животных с язвенными поражениями слизистой оболочки желудка, по при этом активность его ниже по сравнению с лилотоном на 15-23%. Развитие иммобилизационного стресса сопровождалось инволюцией органов тим и ко-лимфати ческой системы (рис. 8),

Относительная масса селезенки при 18-часовой иммобилизации крыс уменьшалась на 16,5%, а тимуса - 30,1%. Профилактическое применение липотона и аминотоиа в изученных до-танус сслс,снка эа* предупреждало инволюцию

■ иымобшвеацвя □ лило™ 5,0 а лиштсн 50,а ™мУса и селезенки, хотя И в раз-п амкнотон о.1 и амннотон 1,0 ной степени. Масса этих органов

Рис. 8. Влияние линотона и аминотоиа на приближалась к значениям ин-цшененцемассы селезенки и тимуса при им- гакз ных животных в дозах 5,0 мобилизационном стрессе мкг/кг - ЛИЛОТОН И 0,1 мл/кг -

амкнотон. Разница в Выраженности стресса между опытом и контролем в эксперименте была существенной и составила 4-9 баллов (липотон), 7-8 баллов (аминотон), что свидетельсвует о выраженной стресс-протекторной активности препаратов.

3.3.6. Влияние криптона на кожу кролика при наружном применении

Для изучения влияния криотопа иа кожу животных было подобрано 2 группы кроликов по 5 животных в каждой. Посередине спины каждого животного с двух сторон на расстоянии 2 см от позвоночника выстригли, выбрили, смазали кремом после бритья участки кожи 5-6 см3. V контрольных животных на правой стороне по 1 разу в день в течение 7 дней наносили пипеткой с последующим осторожным распределением стеклянной палочкой по всей по-

верхности выстриженного участка по 3 мл стерильного физиологического раствора. Животным опытной группы наносили такой же объем криотона. Наблюдения за животными вели в течение 1 месяца с начала опыта.

Обработка кожи кроликов крнотоном не вызывала изменений в ее состоянии. 11а коже не было заметно воспаления, шелушения и других отклонении. Крнотон при 7-ми дневном один раз в сутки нанесении на кожу проявил выраженное стимулирующее влияние на рост шерсти у кроликов. Препарат стимулировал рост пуховых и остевых шерстинок. Они на 7-9 % были выше по сравнению с не выстриженной шерстыо и до 12 % превосходили по длине шерсть с выстриженного участка и ничем не обрабатываемого.

Для изучения влияния криотона на кожу животных были взяты образцы кожи и изучена их структурная организация.

Структурная организация кожи кроликов состояла из рогового, блестящею и собственного слоев. Собственный слой кожи состоял из одно-двух рядных клеток эпителиального пласта. Подкожная клетчатка была рыхлая, широкая н состояла из нежной неоформленной соединительной ткани, содержащей единичные жировые клетки. Таким образом, кожа кроликов в норме имела все соответствующие слои структурной организации, и ее толщина варьировала в пределах 30-35 мкм.

Кожа кроликов после наружного применения криотона 1 раз в день в течение 7 дней выглядела в виде изогнутой тонкой полосы, состоящей из рогового слоя и собственной дермы (рис. 9). Последняя состояла из двух-трех рядного клеток эпителия. Эпителиальные клетки имели светлые и сочные ядра округлой формы с пери ну клеарным просветлением, по объему превосходили объем клеток дермы у контрольных животных и имели гиперхромные ядра с компактной кариоплазмой. Толщина кожи опытных животных незначительно уменьшилась и составила 30,12^0,22 мкм против 33,23±3,61 мкм в контроле.

Рис.9. Структура кожи у кроликов Рис.10. Волосяная луковица в нод-

в виде тонкой гофрированной ПОЛОСЫ кожной кчетчатке у кролика после при-

после применения криотона. менения криотона.

Окраска гем.-эозин. Ув. ок.7, об.40. Окраска гем.-Эозин. Ув. ок. 7, об.40.

Уменьшение толщины кожи происходило за счет отслоения рогового слоя кожи. В подкожной клетчатке кожи у кроликов после применения криотона обнаруживались волосяные луковицы, состоящие из светлых, набухших и сочных эпителиоцитов (рис.10). Они были по структуре клеток идентичны

эпителиям собственной кожи Волосяные луковицы в коже у контрольных животных имели более компактное строение, состоящее из двух-трехрядного эпителиоцита с гиперхромными ядрами Кроме того, на поверхности кожи у контрольных кроликов обнаруживался более толстый слой роговицы

Таким образом, применение криотона на кожу кроликам не только отторгало частично роговой слой кожи, но и придавало эластичность и сочность собственно коже животных

3 4. Научно-производственное испытание криотона, линотона и аминотона

Применение криотона норкам положительно сказывается на качественных показателях волосяного покрова опытных животных, улучшает качественные характеристики волоса, профилактирует повреждения, недоразвитость и секучесть, улучшает рост волос, что в конечном итоге повышает сортовые характеристики шкурок (табл 11)

Таблица 11

Оценка состояния волоса у норок при применении криотона___

Группы Самцы Самки

Криотон Контроль Криотон Контроль

Кол-во животных в опыте, гол 20 20 20 20

Удержание волоса Хорошее, гол % 18 90,0 15 75,0 14 70,0 12 60,0

Удовлетворительное, гол % 2 10,0 5 15,0 6 30,0 8 40,0

Блеск волоса + + + +

Высота волосяного покрова, мм 27,0±6,1 24,0±8,7 22,0±6,9 21,0±5,4

Количество волос, тыс на 1 ем2 волосяного

покрова 3,3 ±0,9 3,1±1,0 3,2±0,7 3,2±0,9

Кол-во поврежденных, недоразвитых волос, и волос с поломанной остью, шт 260±12 349±27 297±19 417±34

% 7,8 11,2 9,2 13,0

На основании проведенных научно-производственных испытаний липото-на установлено, что у коров опытной группы более активно проходит процесс родовой деятельности время выведения плода у них сокращается на 45,6%, время отделения последа - на 34,4%, по сравнению с контролем (табл 12)

В контрольной группе у 21,3% животных, а в опытной группе лишь у 5,6% коров отмечалось задержание последа У опытных животных быстрее проходят процессы инволюции половых органов, на 35,1% короче период бесплодия

Изучение профилактической эффективности липотона при эндометритах у коров показало эффективность и целесообразность проведения лечебно-профилактических обработок в хозяйствах для профилактики гинекологических заболеваний коров после отела

Заболевание эндометритом снизилось с 73% в контроле до 6,7% - в опыте Количество коров пришедших в охоту до 60 дней после отела в опытной группе было выше в среднем на 43% по сравнению с контрольной

Таблица 12

Показатели течения родового процесса у коров при применении липотона

Показатели Контроль Липотон

Количество животных, голов 80 90

Время выведения плода, час 2,50±0,29 1,36±0,25

Время отделения последа, час 6,11±0,50 4,01 ±0,50

Задержание последа, гол % 17 21,3 5 5,6

Послеродовая субинволюция и эндометрит, гол 37 16

% 46,3 17,8

Период бесплодия, дней 74,7±3,7 48,5±3,5

Количество коров с положительным результатом на стельность после первого осеменения (по результатам гинекологических исследований через 2,5 месяца после осеменения) повысилось с 35% до 78%

В результате проведенных исследований установлено, что липотон является эффективным препаратом для лечения гепатодистрофии телят

Проведенное лечение показало, что у телят, которым применяли липотон в сыворотке крови нормализовалось содержание общего белка По сравнению с исходным состоянием достоверно повышалось в 2,1 раза содержание а-глобулинов, на 30,2% - альбуминов Отмечена тенденция к снижению уровня Р- и у-глобулинов На улучшение функционального состояния печени и снижение диспротеинемии указывает повышение апьбумин-глобулинового коэффициента на 64, 6% Применение липотона приводит к снижению проявлений цитолитического синдрома животных Активность АлАТ и АсАТ снижается соответственно в 2,6 и 2,1 раза Нормализуется уровень мочевины, содержание гемоглобина, величина СОЭ

Примениние липотона в дозе 5 мкг/кг массы тела (по ДВ) внутримышечно 1 раз в день в течение 10 дней при хроническом поражении печени (липидозе) у кошек показало, что у 80% леченых животных отмечали повышение уровня гемоглобина на 81,3%, у животных контрольной группы (эс-сенциале в дозе 0,5 мл/кг массы тела (25 мг/кг массы тела в сутки в течение 10 дней) - на 65,0%, снижение СОЭ в 1,6 раза по сравнению с контролем (табл 13) В опытной и контрольной группах отмечено повышение количества лейкоцитов в 1,8 и 1,7 раза

Отражением гепатопротекторного действия при назначении липотона являлось более выраженное, чем в контрольной группе, снижение активности аминотрансфераз (АлАТ в 3,9 раза, АсАТ в 4,8 раза против 2,1 и 2,7 раза в контроле) Наряду с этим при применении липотона в большей степени (на 70,6%), чем при применении эссенциале (на 62,5%) снижалась активность и маркерного фермента холестаза - щелочной фосфатазы

Липотон также способствовал повышению концентрации альбумина (на 34,4%), уменьшению концентрации холестерола в 2,9 раза против снижения в 2,2 раза в контроле

Таблица 13

Морфологические и биохимические показатели крови кошек с хроническим

поражением печени при применении липотона

Показатели Норма До лечения После лечения

Липотон, 5 мкг/кг Эссенциале, 0,5 мл/кг

Лейкоциты, 109/л 5,0-19,5 2,60±0,05 4,55±0,25* 4,40±0,27*

Гемоглобин, г/л 80,0-150,0 40,0±0,89 72,5±3,80* 66,0±2,68*

СОЭ, мм/час 2,0-4,0 24,5±1,17 8,5±1,18 13,7±2,65

Общий белок, г/л 57,5-79,6 67,7±3,28 69,4± 1,61 69,5±2,58

Альбумины, г/л 25,8-39,7 18,9±0,63 25,4±0,87* 22,9±0,81 *

АлАТ, Ед/л 8,3-52,5 213,5±11,9 55,0±5,81* 102,5±7,83*

АсАТ, Ед/л 9,2-39,5 142,5±3,35 29,5±2,46* 52,0± 1,79*

ЩФ, Ед/л 12,0-65,1 191,5±6,04 56,3±1,90* 71,8±6,37*

Холестерин, мМ/л 1,8-4,2 11,8±0,11 4,10±0,18* 5,40±0,49*

* - Р < 0,005 по сравнению с физиологической нормой

Таким образом, при клинических испытаниях липотон зарекомендовал себя как эффективный гепатопротектор, не уступающий по своим лечебным свойствам эссенциале Кроме того, липотон как препарат фосфолипидов в рекомендуемый терапевтических дозах может использоваться при различных патологических состояниях, сопровождающихся гиперхолестеролемией Применение липотона в дозе 7,5 мкг/кг по ДВ поросятам в период отъема сказалось на изменении скорости роста поросят после отъема Так, в контрольной группе снижение среднесуточных привесов после отъема составило 20,9%, а в группе поросят, получавших липотон - 7,7% (табл 14)

Таблица 14

Эффективность применения липотона для профилактики отъемного стресса

у поросят

Показатели Контроль Липотон

Количество поросят в группе, гол 329 330

Средняя масса одного поросенка перед отъемом, кг 12,7 12,3

Среднесуточный привес, г

перед отъемом 297 299

после отъема 235 276

Заболело гол 53 37

% 16,1 11,2

Пало гол 35 21

% 10,6 6,4

Сохранность, % 89,4 93,6

Заболеваемость поросят желудочно-кишечными болезнями после отъема существенно снизилась на 4,9%, а падеж поросят в опытной группе был в 1,7 раза меньше

В научно-производственном опыте на 58970 цыплятах-бройлерах кросса Арбор Айкерс в ОАО «Курганский бройлер» установлено, что введение аминотона в состав рациона оказало благоприятное влияние на сохранность и продуктивность птицы В 16-дневном возрасте в опытной группе прирост массы зела цыплят превысил прирост в контрольной группе на 82 г (18%), а в возрасте 30 дней - на 170 г (13%) При этом за период опыта (за 42 дня) падеж в контрольной группе составил 3,18%, а в опытной -2,41%

Препарат оказывает положительное влияние на уровень и длительность прогективного гуморального иммунитета у кур в ответ на живую вакцину против ныокаслской болезни У птиц опытной группы на 20-день после вакцинации выявили протективные титры антител от 1 16 до 1 256 (рис 11)

б , - -о - Вакцинация В контрольной группе к ука-

—*—Вакцинация + аминотон занному сроку иммунологически

не защищеных и потенциально опасными - как возможный источник заболевания было 7,7% птиц, которые имели титр антител 1 4

За период проведения опыта в контрольной группе общий отход составил 3119 голов или 10,6%, а в опытной группе 2145 голов или 7,3% от общего поголовья

Применение аминотона снижало (относительно контроля) как падеж (на 29,8%), так и выбраковку птицы (на 31,9%)

При убое бройлеров опытной группы выход мяса составил 72,2%, в контроле 68,5% К первой категории в опытной группе было отнесено 76%, в контрольной — 71%, количество нестандартных тушек - соответственно 2,9 и 4,9%

В опыте, проведенном на птицеферме колхоза «Большевик» Калачеев-ского района Воронежской области на родительском стаде кросса «Конку-рент-2» установлено, аминотон способствует сохранению фонда биоантиок-сидантов как в организме птицы, так и в яйце, что улучшает его качественные показатели и повышает пищевую ценность У опытных кур в печени (табл 15) установлена более высокая концентрация витамина А (на 25,6%), витамина Е (в 1,7 раза) и уровня витамина В2 (на 14,2%) В яйце птиц, получавших аминотон, по сравнению с контролем, на 20,6% выше уровень каро-тиноидов, содержание витамина А выше на 17,8% и на 18,4% - витамина В2 При этом на 14,2% ниже кислотное число желтка

Научно-производственное испытание аминотона в дозе 20,0 мл /на гол трехкратно по следующей схеме за месяц до отела, за 15 дней до отела и сразу после отела, телятам, родившихся от этих коров на 5 и 7 сутки после рождения однократно внутримышечно в дозе 0,1 мл/кг массы тела для про-

Рис И Распределение цыплят-бройлеров в группах по титру антител

филактики желудочно-кишечных болезней и повышения резистентности новорожденных телят показали его высокую эффективность

Таблица 15

Влияние аминотона на содержание витаминов в печени и яйце кур

Показатели Контроль Аминотон

Печень

Витамин А, мкг/г 487,4±9,73 612,0+11,2*

Витамин В2, мкг/г 14,8±0,37 16,9+0,13

Витамин Е, мкг/г 87,2±2,15 150,6±7,95

Яйцо

Витамин А, мкг/г 6,42±0,14 7,56+0,09*

Сумма каротиноидов, мкг/г 10,25+0,22 12,36±0,31*

Витамин В2, мкг/г 4,25±0,05 5,03:! 0,11*

Кислотное число желтка, мг КОН 6,89+0,14 5,91+0,16

*-Р<0,05 по отношению к контролю

Установлено, что колибактериоз у телят контрольной группы регистрировался в 18,0% случаев (табл 16) Клинические признаки болезни появлялись в среднем на 3-й сутки жизни, заболевание продолжалось 6 суток

Таблица 16

Эффективность аминотона для профилактики колибактериоза

Показатели Группы телят

Контроль Аминотон

Количество телят, голов (%) 50(100) 50(100)

Из них заболело колибактериозом, голов (%) 9(18,0) 3 (6,0)

Начало возникновения заболевания, сутки 2,8+0,61 3,9+0,71

Продолжительность болезни, дней 6,0+0,21 2,8±0,28*

Масса тела на 1-е сутки, кг 37,5±1,5 38,3+1,6

Масса тела на 10-е сутки, кг 36,1+2,4 39,4±1,7

Среднесуточный прирост массы тела с 1 по 10 сут, г -140,0+9,1 110,0+15,6

Масса тела на 40-е сутки, кг 50,9±8,6 57,9+7,6

Среднесуточный прирост массы тела с 10 по 40 сут , г 523,0±15,7 617,0±20,1 *

* - Р < 0,05 по сравнению с показателями контрольной группы

У телят опытной группы колибактериоз регистрировался у 6,0% животных Заболевание начиналось на 4-е сутки после рождения и продолжалось в среднем 2,8 суток В целом, болезнь телят опытной группы протекала в более легкой форме и лечение требовало меньше затрат медикаментозных средств

У телят контрольной группы в течение 10-ти суток после рождения происходило снижение массы тела в среднем на 140 г по сравнению с массой тела при рождении У телят опытной группы снижение массы тела не наблюдалось, и ее среднесуточный прирост за первые 10 дней жизни составил в среднем 110 г С 10-х по 40-е сутки жизни у телят опытной группы среднесуточный при-

рост массы тела был на 18,0% выше, чем у телят контрольной группы

Таким образом, телята, рожденные от коров, которым применяли амино-тон с одновременным двукратным введением препарата новорожденным на 5-е и 7-е сутки жизни, меньше заболевали колибактериозом в течение 40 дней по-стнатального периода развития, переболевали им в более легкой форме, лучше росли и развивались

ВЫВОДЫ

1 Криотехнологическими методами фракционировано 20 новых биологически активных препаратов, с различным физико-химическим составом Путем скрининговых работ и оптимизации условий извлечения нативных действующих веществ из плаценты свиной получено три активно действующие субстанции - низкомолекулярная, липофильная и гидрофильная фракции, пригодных для создания новых лекарственных препаратов

2 Криосублимационная водная фракция плаценты свиной - криотон представляет собой биологически активный комплекс, основными компонентами которого являются аминокислоты, микроэлементы

3 Криотон относится к малотоксичным веществам — 4 класс опасности (ГОСТ 12 01007-76) Препарат не обладает раздражающими, аллергенными, иммунотоксическими, мутагенными свойствами, не проявляет эмбриотокси-ческого и тератогенного действия

4 Применение криотона норкам положительно сказывается на качественных показателях волосяного покрова животных, улучшает качественные характеристики волоса, профилактирует повреждения, недоразвитость и се-кучесть, улучшает рост волос, что в конечном итоге повышает сортовые характеристики шкурок

5 Липофильная фракция плаценты свиной представляет собой биологически активный комплекс основным компонентом, которого являются ли-пиды (93-97%), в состав которых входят этерифицированные и неэтерифици-рованные жирные кислоты (20-22%), триглицериды (24-26%), стерины (1015%), фосфолипиды (33-35%), гексозы (3-7%) При разделении фосфолипи-дов тонкослойной хроматографией определены следующие классы лизоле-цитин, сфингомиелин, фосфатидилинозитол, кардиолипин, фосфатидиловая кислота, фосфатидилхолин А также витамины А, Е, В2, микроэлементы

6 Липотон - масляный раствор липофильной фракции плаценты свиной относится к малотоксичным веществам — 4 класс опасности (ГОСТ 12 01007-76) Препарат не обладает раздражающими, аллергенными, иммунотоксическими, мутагенными свойствами Липотон не проявляет эмбрио-токсического и тератогенного действия, при применении липотона количество живорожденных крысят Возрастает на 4,5%, а средняя масса их увеличивается на 4,7% Препарат в исследованных дозах безвреден для сельскохозяйственных, мелких домашних животных и птицы

7 Липотон оказывает выраженное иммуностимулирующее действие Препарат повышает индекс завершенности фагоцитоза на 34,9-37,1%, процент НСТ-положительных нейтрофилов крови мышей в спонтанном НСТ-

тесте в 2,4 раза, в стимулированном - в среднем в 3 раза Липотон у коров и 2-х месячных телят повышает бактерицидную активность сыворотки крови, соответственно, на 23,3% и 16,6%, лизоцимной активности - на 29,7% и 30,9% и содержание комплемента - на 28,4% и 38,9%

8 Применение липотона крысам в дозе 5 мкг/кг (по ДВ) способствует поддержанию интенсивности процессов перекисного окисления липидов на более низком физиологическом уровне, что выражается в снижении на 16,4% содержания в крови у них малонового диальдегида и на 9,4% диеновых конъюгатов В тоже время препарат способствует увеличению функциональной мощности системы антиоксидантной защиты организма, что выражается в повышении на 9,5% активности каталазы, на 11,3% активности глутатион-редуктазы и на 9,5% - глутатионпероксидазы

9 Липотон обладает выраженным противовоспалительным действием -в дозе 5,0 мкг/кг достоверно угнетает каррагениновое воспаление на 46,4%, формалиновое - на 52,2%, зимозановое - на 87,4% Липотон обладает выраженным ранозаживляющим действием Так при кожных ранах (100 % заживление к 15-17-му дню против 27 дней в контроле), при ожоговых ранах (100% заживления ран к 20-му дню против 65,9% в контроле)

10 Под влиянием липотона происходит уменьшение количества язвенных поражений слизистой оболочки желудка, как медикаментозного происхождения (на 79,7%), так и стрессогенного характера (до 100%)

11 Липотон обладает гепатопротекторным действием при токсическом повреждении печени Применение препарата в дозе 5,0 мкг/кг (по ДВ) снижало на 78,1% увеличение активности АсАТ и на 84,3% активности АлАТ в сыворотке крови При применении липотона в меньшей степени (на 41,8%) повышалась активность маркерного фермента холестаза - щелочной фосфа-тазы Липотон при СС14-индуцированном гепатите также же препятствует росту уровня в сыворотке крови мочевины (на 24%) и холестерина (на 71,7%), способствует снижению на 14,8% уровня МДА в крови

Применение липотона животным (телята, кошки) при нарушенной функции печени в дозе 5,0 мкг/кг (по ДВ) массы тела парентерально оказывает выраженное гепатопротекторное действие, проявляющееся в нормализации белок-синтезирующей функции печени, снижении показателей цитолиза - АлАТ - в 2,6-3,9 раза, а АсАТ - в 2,1 - 4,8 раза

12 Применение липотона разным видам животным в условиях различных стресс-воздействий способствует уменьшению степени гипертрофии надпочечников и инволюции органов иммунной системы, снижению потери массы тела, сохранению функционального потенциала стресс-лимитирующей системы антиоксидантной защиты и предотвращению накопления в организме токсических продуктов пероксидного окисления липидов, что свидетельствует о наличии у липотона выраженной стресс-протективной активности Применение липотона поросятам до и после отъема позволяет снизить в адаптационный период в 4 раза заболеваемость, на 4,2% повысить сохранность

13 Гидрофильная фракция плаценты свиной - аминотон - представляет собой биологически активный комплекс, основными компонентами которого

являются аминокислоты, олигопептиды, глюкуроновые и нуклеиновые кислоты, микроэлементы

13 Аминотон относится к малотоксичным веществам - 4 класс опасности (ГОСТ 12 01007-76) Препарат не обладает раздражающими, аллергенными, иммунотоксическими, мутагенными свойствами, не проявляет эмбриоток-сического и тератогенного действия Препарат в исследованных дозах безвреден для сельскохозяйственных, мелких домашних животных и птицы

14 Аминотон оказывает выраженное иммуностимулирующее действие, повышая индекс завершенности фагоцитоза на 67,1-71,7%, процент НСТ-положительных нейтрофилов крови мышей в спонтанном НСТ-тесте в 2,4 раза, в стимулированном - в среднем в 3 раза Применение аминотона способствует повышению бактерицидной активности сыворотки крови телят на 20,5%, у коров - на 25,6%, активности лизоцима у коров на 38,1%, у телят -на 29,6%, а также активизирует выработку антител

15 Применение аминотона в дозе 0,1 мл/кг интактным животным способствует поддержанию интенсивности процессов пероксидного окисления липндов на более низком физиологическом уровне Препарат способствует повышению функциональной мощности системы антиоксидантной защиты организма, что выражается в повышении активности каталазы, глутатионре-дуктазы и глутатионпероксидазы

16 Аминотон обладает противовоспалительным действием - в дозе 0,1 мл/кг, угнетая воспалительную реакцию, вызванную каррагенином на 40,2%, формалином - на 43,6%, зимозаном — на 16,0% Препарат обладает раноза-живляющим действием, способствуя 100 % -му заживлению кожных ранах к 16-18-му дню при заживлении в контроле через 27 дней При ожогах 100%-е заживление ожоговых ран наступает к 27-30-му дню, при 88,7%-м заживлении в этот период в контроле

17 Под влиянием аминотона происходит уменьшение количества язвенных поражений слизистой оболочки желудка, как медикаментозного происхождения (на 52,8%), так и стрессогенного (на 67,1%)

18 Аминотон обладает гепатопротекторным действием при токсическом повреждении печени, вызванном тетрахлорметаном и этанолом Применение препарата в дозе 0,1 мл/кг снижало на 71,9% степень увеличения активности АсАТ и на 63,1% активности АлАТ в сыворотке крови Наряду с этим при применении аминотона в меньшей степени (на 57,2%) повышалась активность и маркерного фермента холестаза - щелочной фосфатазы, в 1,9 раза снижало степень гиперферментемии у-ГТТ

19 Применение аминотона цыплятам-бройлерам в дозе 1,0 мл/кг массы тела с питьевой водой оказывает положительное влияния на уровень и длительность гуморального иммунитета, увеличивает сохранность на 3,3% и среднесуточные привесы на 4,0% Аминотон способствует сохранению фонда биоантиоксидантов как в организме птицы, так и в яйце, что улучшает его качественные показатели и повышает пищевую ценность

20 Телята, рожденные от коров, которым аминотон применяли за месяц и за 15 дней до отела и сразу после отела, с последующим двукратным введе-

нием препарата новорожденным на 5-е и 7-е сутки жизни, в 3 раза меньше заболевают колибактериозом в ранний постнатальный период развития, в более легкой форме переболевают, лучше растут и развиваются

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 Для профилактики и лечения послеродовых заболеваний у коров и свиноматок липотон применять в дозе 0,2-0,25 мл/кг, в соответствие с листком вкладышем к регистрационному удостоверению № 2035-02-721-06 от 06 10 06, выданного Государственным Департаментом ветеринарной медицины Министерства аграрной политики Украины Для лечения гепатопатий, повышения иммунной и общей резистентности организма животных, профилактики заболеваний у молодняка животных липотон применять в дозе 0,01 мл/кг в соответствии с инструкцией по применению, рекомендованной ФГУ «ВГНКИ»к утверждению Росельхознадзором РФ

2 Для профилактики и сочетанного лечения послеродовых заболеваний у коров и свиноматок, лечения гепатопатий, повышения иммунной и общей резистентности организма животных, профилактики заболеваний у молодняка животных аминотон применять в дозе 0,1 мл/кг в соответствии с листком вкладышем к регистрационному удостоверению № 2034-02-720-06 от 06 10 06, выданного Государственным Департаментом ветеринарной медицины министерства аграрной политики Украины, а также с инструкцией, утвержденной главным Государственным инспектором по Воронежской области от 11 01 2005 года

3 При разработке мероприятий по профилактике и лечению акушер-ско-гинекологических заболеваний животных руководствоваться «Методическими рекомендациями по диагностике, терапии и профилактике субинволюции матки у коров» и «Методическими рекомендациями по диагностике, терапии и профилактике субклинического мастита у свиноматок», одобренными секцией «Патология, фармакология и терапия» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол №1 от 24 марта 2005 г)

4 Для определения биологической активности и контроля эффективности производства биопрепаратов и их практического применения руководствоваться Методическими пособиями «Экспресс-биотест Биологический мониторинг экологических систем» - Воронеж, 1997, «Скрининг адаптогенов - стресс-корректоров» - Воронеж, 2000

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Методическое пособие экспресс-биотест Биологический мониторинг экологических систем - Воронеж, 1997 - НС (в соавторстве)

2 Патент № 2125261 Россия, С1, 6 й01 N 33/00, 33/18, С 12 О 1/04 Способ биологического мониторинга экологических систем и объектов /В С Бузлама, Ю П Ващенко, Г А Востроилова, Ю Т Титов, -97108740/13, Заявл 10 06 1997, Опубл 20 01 1999, Бюл №2 //ИСМ - 1999

3 Востроилова Г А Скрининг растительных биоантиоксидантов, полученных методом криогенной сублимации /ГА Востроилова // Свободные

радикалы, антиоксиданты и здоровье животных Матер международ научно-практ конф , Воронеж, 2004 - С 316-318

4 Востроилова Г А Индуцированная люминолзависимая хемилюми-иесценция как метод стандартизации тканевых препаратов /ГА Востроилова // Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных Матер международ научно-практ конф , Воронеж, 2004 -С 318-321

5 Востроилова Г А Стресспротективные и антиоксидантные свойства липотона при иммобилизационном стрессе /ГА Востроилова // Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных Матер международ научно-практ конф , Воронеж, 2004 -С 321-325

6 Востроилова Г А Влияние липотона на интенсивность процессов свободнорадикального окисления при ожоге /ГА Востроилова // Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных Матер международ научно-практ конф , Воронеж, 2004 - С 325-328

7 Востроилова Г А Сравнительное влияние липотона и аминотона на показатели ПОЛ в опыте in vivo /ГА Востроилова // Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных Матер международ научно-практ конф , Воронеж, 2004 - С 328-330

8 Востроилова Г А Интенсивность процессов перекисного окисления липидов при применении тканевых препаратов на фоне экспериментального гепатоза /ГА Востроилова // Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных Матер международ научно-практ конф , Воронеж, 2004 - С 330-334

9 Востроилова Г А Антиоксидантные свойства тканевых препаратов из плаценты, полученных методом криогенной сублимации /ГА Востроилова, И Е Шабанов // Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных Матер международ научно-практ конф , Воронеж, 2004 - С 334-337

10 Применение липотона при хронических поражениях печени у кошек /ГА Востроилова, А П Золототрубов, Б Л Жаркой, Д В Федосов // Матер 2-ой региональной конф практикующих врачей - Воронеж, 2004 - С 8

11 Патент № 2228759 Россия, С1, 7 А61 К 35/50 Способ получения низкомолекулярной фракции из тканей плаценты свиной /С В Шабунин, Г А Востроилова, Н П Мещеряков, Н Ф Курило и др , ЗАО НПП «Агрофарм» (RU) — 2003124739, Заявл 07 08 2003, Опубл 20 05 2004, Бюл №14//ИСМ -2004

12 Патент № 2237486 Россия, С1, 7 А61 К 35/50 Способ получения биологически активных липофильной и гидрофильной фракций плаценты свиной /С В Шабунин, Г А Востроилова, Н П Мещеряков, Н Ф Курило и др, ЗАО НПП «Агрофарм» (RU) - 2003124738, Заявл 07.08 2003, Опубл 10 10 2004, Бюл №28 //ИСМ -2004

13 Актуальные проблемы криофармакологии / С В Шабунин, ГА Востроилова, А И Осецкий, И Е Шабанов // Ветеринария и кормление -2004 - декабрь - С 10-11

14 Шабунин С В Токсикологическая характеристика аминотона / С В Шабунин, Г А Востроилова, И Е Шабанов // Аграрная наука - 2005 - №2 -С 23-25

15 Шабунин С В Токсикологическая характеристика липотона / С В Шабунин, Г А Востроилова // Аграрная наука - 2005 - №3 - С 29-30

16 Шабунин С В Применение амннотона при откорме цыплят-бройлеров / С В Шабунин, Г А Востроилова // Птицеводство - 2005 - №3 -С 26

17 Шабунин С В Эффективность применения липотона при гепатозе молодняка свиней / С В Шабунин, Г А Востроилова, Н Ф Курило // Аграрная наука - 2005 - №5 - С 32

18 Патент № 2253466 Россия, С1, 7 А61 К 35/50, А 61 Р 15/00 Способ профилактики и лечения эндометрита у коров и свиноматок /С В Шабунин, Г А Востроилова, Н П Мещеряков, М В Косенко и др , ЗАО НПП «Агро-фарм» (RU) - 2003137653, Заявл 25 12 2003, Опубл 10 06 2005, Бюл №16 IIWZM -2005

19 Шабунин С В Эффективность препаратов дифур и липотон для профилактики и терапии акушерско-гинекологических заболеваний у коров /С В Шабунин, Н Ф Курило, А В Галкин, Г.А Востроилова //Современная ветеринарная защита коров высокопродуктивных пород Матер 1-ой науч -практ конф - Воронеж, 2005 - С 40

20 Применение липотона для повышения резистентности и профилактики заболеваний у коров и новорожденных телят /С В Шабунин, Г А Востроилова, Н Ф Курило, А В Галкин //Современная ветеринарная защита коров высокопродуктивных пород Матер 1-ой науч-практ конф - Воронеж, 2005 -С 38-39

21 Патент № 2256458 Россия, С1, 7 А61 К 35/50, А 61 Р 15/00, 43/00 Препарат для профилактики и лечения гинекологических заболеваний у коров и свиноматок /С В Шабунин, Г А Востроилова, Н П Мещеряков, М В Косенко и др, ЗАО НПП «Агрофарм» (RU) - 2003137652/15, Заявл 25 12 2003, Опубл 20 07 2005, Бюл №20 //ИСМ - 2005

22 Шабунин С В Интеграция высокоэффективных криогенных технологий с биологическим скринингом — современный путь создания биологически активних веществ природного происхождения / С В Шабунин, Г А Востроилова, А И Осецкий и др //Матер III съезда общества биотехнологов России им ЮА Овчинникова, Москва, 2005 - С 129

23 Шабунин С В Скрининг биологически активных веществ в зависимости от технологических параметров криогенного фракционирования плаценты / С В Шабунин, Г А Востроилова, И Е Шабанов // Проблемы криобиологии -2005 -Т 15 - №3 -С 306-309

24 Шабунин С В Новые фармакологические препараты - проблемы криофармакологии при экстракции биологически активных веществ / С В Шабунин, Г А Востроилова, И.Е Шабанов // «Экстракция органических соединений» ЭОС-2005 Каталог докладов III Междунар конф - Воронеж, 2005 - С 236

25 Криотехнологии в ветеринарной медицине мелких домашних животных / С-В Шабунин, А И Осецкий, Г А Востроилова и др // Всероссий-

ский ветеринарный конгресс Матер XIII междунар Московского конгресса по болезням мелких домашних животных - Москва, Россия, 2005 -С 197-198

26 Новое в терапии лейкоза кошек / А П Золототрубов, Д В Федосов, Г А Востроилова, Б Л Жаркой // Всероссийский ветеринарный конгресс Магер XIII междунар Московского конгресса по болезням мелких домашних животных - Москва, Россия, 2005 - С 7-8

27 Шабанов И Е Эффективность применения новой кормовой добавки при гепатозах у голубей / И Е Шабанов, Г А Востроилова, В И Казаков // Голубеводство -2005 - Вып №17 - С 30

28 Золототрубов А П Терапия при неврологическом синдроме, индуцированном ретровирусами кошек / А П Золототрубов, Д В Федосов, Г А Востроилова // Всероссийский ветеринарный конгресс Матер XIV междунар Московского конгресса по болезням мелких домашних животных - Москва, Россия, 2006 - С 7-8

29 Принципы диетотерапии кошек с вирусным лейкозом /А.П. Золототрубов, Б Л Жаркой, Д В Федосов, Г А Востроилова //Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных Матер Междунар науч -производственной конф , посвящ 100-летию со дня рождения проф Авророва А А - Воронеж, 2006 - С 1049-1050

30 Применение внутриматочных свечей с циминалем и липотоном у собак /ГА Востроилова, А П Золототрубов, Б Л Жаркой, Д В Федосов //Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных Матер Междунар науч -производственной конф , посвящ 100-летию со дня рождения проф Авророва А А - Воронеж, 2006 - С 1034-1036

31 Гепатопротективные эффекты аминотона /ГА Востроилова, С В Шабунин, Б Л Жаркой, П А Паршин // Ветеринарная патология - 2006 -№2(17) - С 106-110

Подписано в печать 18 04 2006 г Формат 60x84 '/¡g

Гарнитура "Times New Roman" Печать офсетная Бумага офсетная № 1 Объем 2 0 п л Тираж 100 экз Заказ № 467

Отпечатано в полном соответствии с качеством предоставленного оригинал-макета в типографии ВГАУ 394087, г Воронеж, ул Мичурина, 1

Актуальность темы. Создание широкой сети промышленных животноводческих комплексов поставило перед ветеринарной наукой ряд проблем, связанных с совершенствованием технологических систем на животноводческих комплексах и специализированных фермах, обеспечивающих получение здорового приплода с высокой резистентностью и реактивностью, с одной стороны, разработкой более эффективных средств и способов общей неспецифической и специфической профилактики и терапии болезней животных, особенно молодняка, с другой (С.М. Сулейманов, 2000; B.C. Шипилов с со-авт., 1987; А.Г. Шахов с соавт., 1997, 2000 и др.). Вместе с тем, очевидно, что применение лекарственных средств специфического этиопатогенного действия не может устранить основную причину патологического состояния, являющегося в большинстве случаев следствием нарушения метаболизма - вы-сокоинтегрированного и целенаправленного процесса, обеспечивающего обмен веществ и энергии между клеткой и средой. В свою очередь, общее нарушение обменных процессов зачастую сопровождается снижением иммунологической резистентности организма животных. Если принять во внимание то, что даже в простейшей бактериальной клетке может протекать одновременно более тысячи взаимосвязанных реакций, то нетрудно представить, насколько сложен метаболизм у высших организмов, и, соответственно, сложна проблема создания лекарственных средств для его коррекции (И.М. Ганджа с соавт., 1985; A.M. Земсков, 1994; А.Г. Шахов с соавт., 1999; B.C. Бузлама, 2000, 2003; Д.А. Харкевич, 2000; W.K. Contrib et.al., 1984).

Прогрессирующий рост заболеваний животных, обусловленный экологическими и социальными факторами, выдвигает проблему создания лекарственных средств для коррекции метаболизма, в том числе иммунитета, в одну из важнейших в медицине и ветеринарии (В.Т. Самохин, 1988; Ю.А. Гри-невич, 1989; Г.Н. Дранник, 1994; JI.X. Гаркави, 1990; С.В. Шабунин с соавт., 1996; А.Ф. Исмагилова, 1997; В.Д. Соколов, 1997; Г.Г. Шитов, 1999; В.И. Беляев, 2000; М.И. Рецкий с соавт., 2001).

В последние годы наметилась тенденция к созданию и использованию препаратов, изготовленных из природного сырья. При этом многие из них обладают разносторонней биологической активностью и в то же время безвредны для организма (К.К. Мовсум-Заде с соавт., 1972; Н.А. Пучковская с соавт., 1975; Т.В. Дегтяренко, 1995; В.Х. Хавинсон, 2001, с соавт., 2001; C.S. Loeb et.al., 1992).

Препараты природного происхождения обладают специфическим и общим неспецифическим положительным действием на весь организм. Среди них широкое распространение получили вакцины, сыворотки, тканевые препараты, антибиотики, витамины, комплексы микроэлементов (В.Т. Само-хин с соавт., 1988; Е.Н. Романов с соавт., 2000; А.Е. Белов, 2001; Д.В. Пчельников с соавт., 2003; Т.Н. Вовк, 2005).

Тканевые препараты обеспечивают максимально возможную видовую специфичность исходного сырья, так как чем ближе природа белкового вещества к организму животного, тем выше возможность достижения цели. Оптимальным вариантом для получения лекарственного средства является использование органов и тканей человека и животных (Г.Г. Шитов, 1991; С.М. Грибко, 1998; А.Ф. Колчина, 2000; P.M. Полковников, 2000).

Практическое значение применения тканевых препаратов при болезнях молодняка, бесплодии и ряде заболеваний трудно поддающихся лечению исключительно велико (Б.И. Кузник с соавт., 1998; В.Г. Морозов с соавт., 2000; В.И. Беляев с соавт., 2001). Тканевые препараты, введенные в организм животных, способствуют восстановлению нарушенного обмена веществ, активизируют функциональную деятельность организма и повышают устойчивость организма к неблагоприятным факторам внешней среды.

Основу наиболее эффективных современных технологий переработки биологического сырья составляют такие методы, которые максимально сохраняют его нативную молекулярную структуру, витаминный, гормональный состав, тем самым, сохраняя его высокую биологическую активность. Наиболее полно этим требованиям удовлетворяют криогенные технологии, при реализации которых перерабатываемое сырье находится при отрицательных температурах (А.Г. Подольский, А.И. Осецкий, 2001). При этом ингибируют-ся окислительные процессы в перерабатываемом сырье, денатурация и диссоциация наиболее важных молекулярных комплексов.

Новый технологический подход расширяет перечень лекарственных препаратов с использованием в качестве исходного сырья тканей плаценты сельскохозяйственных животных.

С учетом выше изложенного, были определены направленность исследований, их методическое и материальное обеспечение, объем, разнообразие, широта и глубина экспериментальных разработок и клинической апробации новых препаратов.

Цель н задачи исследований. Целью настоящего исследования была разработка, экспериментальная оценка, клинико-биохимическое изучение препаратов из свиной плаценты, и, с учетом полученных данных, сформулировать теоретические и методологические принципы получения ветеринарных фармакологических препаратов на основе криогенных технологий.

В соответствии с поставленной целью решены следующие задачи:

- разработать новые препараты из плаценты свиной на основе криогенных технологий;

- дать фармако-токсикологическую характеристику разработанных препаратов;

- изучить противовоспалительные, репаративные, иммуностимулирующие, гепатопротекторные, стресспротекторные свойства препаратов на основе свиной плаценты;

- разработать показания к применению разработанных препаратов и провести их клинические испытания;

- подготовить нормативно-техническую документацию на новые препараты.

Научная новизна. Впервые на основе новейших методов криофрак-ционирования биологических тканей разработаны и экспериментально изучены препараты из свиной плаценты: липотон, аминотон и криотон. В результате выполнения работы научно аргументировано, экспериментально и клинически обоснована перспективность использования этих препаратов в ветеринарной медицине и животноводстве. Впервые изучены биохимические механизмы их адаптогенного, стресс-корректорного, иммуномодулирующе-го, противовоспалительного, гепатопротекторного действия.

Практическая значимость и реализация результатов исследовании.

На основании результатов исследований разработаны технические условия и TP, регламентирующие технологический процесс производства препаратов: криотон (ТУ У 24.4.31293151.033-03); аминотон (ТУ У 24.4.31293151.031:2005) и липотон (ТУ У 24.4.31293151.032:2005).

Департаментом ветеринарной медицины Министерства аграрной политики Украины утверждены временное наставление по применению - криотона (протокол № 8 от 1.09.2003). Департаментом ветеринарной медицины Министерства аграрной политики Украины зарегистрированы препараты - аминотон (№ 2034-02-720-06 от 06.10.2006.) и липотон (№ 2035-02-721-06 от 06.10.2006). Широкие производственные испытания криотона, липотона и аминотона разрешены Главным государственным ветеринарным инспектором Воронежской области (Временные наставления на криотон, липотон и аминотон от 11.01.2005).

Нормативно-техническая документация на препараты липотон и аминотон представлена на регистрацию в Федеральную службу ветеринарного и фи-тосанитарного надзора РФ.

Результаты проведенных исследований вошли в: Методическое пособие «Экспресс-биотест. Биологический мониторинг экологический систем», рассмотренное и одобренное секцией ветеринарной медицины Россельхозакаде-мии (протокол № 5 от 12.11.1996); Методическое пособие «Скрининг адапто-генов - стресс-корректоров», рассмотренное и одобренное секцией ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №1 от 30.03.2000); «Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике субинволюции матки у коров» и «Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике субклинического мастита у свиноматок», рассмотренные и одобренные секцией «Патология, фармакология и терапия» Отделения ветеринарной медицины (протокол №1 от 24.03.2005).

Апробация работы. Результаты экспериментальных и клинических исследований были представлены: на заседаниях Ученого Совета института криогенных технологий (Харьков, 2003-2004 г.г.); на заседании межведомственного научно-технического Совета Росветкормсоюза (Москва, 2004); на 2,3,4 съездах общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2004, 2005, 2006); на заседаниях Ветфармсовета Украины (Львов, 2003, 2006); на Международной научно-практической конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных» (Воронеж, 2004); на 2 региональной конференции практикующих ветеринарных врачей (Воронеж, 2004); на Международном координационном совещании «Новые биотропные препараты и косметологические средства для лечения и ухода непродуктивных домашних животных» (Харьков, 2004); на XIII и XIV Международном Московском конгрессе по болезням мелких домашних животных (Москва, 2005, 2006 ); на 1 научно-практической конференции «Современная ветеринарная защита коров высокопродуктивных пород» (Воронеж, 2005); на Ш-ей Международной конференции «Экстракция органических соединений» ЭОС-2005 (Воронеж, 2005); на Международной конференции «Актуальные проблемы и достижения криобиологии и криомедицины. Структурная и функциональная организация стволовых клеток в условиях действия низких температур» (Харьков, 2005); на 9-й региональной научно-практической конференции «Проблемы экологии и экологической безопасности Центрального Черноземья РФ» (Липецк, 2005); на 1 научно-практической конференции «Современная ветеринарная защита коров высокопродуктивных пород» (Воронеж, 2006); на Международной научно-производственной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Авророва А.А. «Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных» (Воронеж, 2006).

Публикации. Основные научные результаты, включенные в диссертацию, опубликованы в 32 печатных работах, в том числе в 5 статях в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Аграрная наука», «Птицеводство», «Ветеринарная патология»), 2 методических рекомендациях и 2 методических пособиях, 5 патентах.

Основные положения, выносимые на защиту.

- о возможности создания на основе криогенных технологий активно действующих веществ, для получения лекарственных форм ветеринарных препаратов;

- о взаимосвязи криотехнологий фракционирования плаценты свиной с биологической активностью получаемых продуктов;

- о биохимических механизмах фармакологического действия препаратов, полученных из различных криофракций свиной плаценты;

- о клинической эффективности применения ветеринарных фармакологических препаратов на основе криофракционирования плаценты свиной.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 319 страницах и включает введение, обзор литературы, материал, объем и методы исследований, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы, предложения, список литературы и приложения. Диссертационная работа проиллюстрирована 86 таблицами и 46 рисунками. Список литературы включает 562 источника, в том числе 156 на иностранных языках.

5. ВЫВОДЫ

1. Криотехнологическими методами фракционировано 20 новых биологически активных препаратов, с различным физико-химическим составом. Путем скрининговых работ и оптимизации условий извлечения нативных действующих веществ из плаценты свиной получено три активно действующие субстанции - низкомолекулярная, липофильная и гидрофильная фракции, пригодных для создания новых лекарственных препаратов.

2. Криосублимационная водная фракция плаценты свиной - криотон представляет собой биологически активный комплекс основными компонентами которого являются аминокислоты, микроэлементы.

3. Криотон относится к малотоксичным веществам - 4 класс опасности (ГОСТ 12.01007-76). Препарат не обладает раздражающими, аллергенными, иммунотоксическими, мутагенными свойствами, не проявляет эмбриотоксического и тератогенного действия.

4. Применение криотона норкам положительно сказывается на качественных показателях волосяного покрова животных, улучшает качественные характеристики волоса, профилактирует повреждения, недоразвитость и се-кучесть, улучшает рост волос, что в конечном итоге повышает сортовые характеристики шкурок.

5. Липофильная фракция плаценты свиной представляет собой биологически активный комплекс основным компонентом, которого являются ли-пиды (93-97%), в состав которых входят этерифицированные и неэтерифици-рованные жирные кислоты (20-22%), триглицериды (24-26%), стерины (1015%>), фосфолипиды (33-35%)), гексозы (3-7%). При разделении фосфолипи-дов тонкослойной хроматографией определены следующие классы: лизоле-цитин, сфингомиелин, фосфатидилинозитол, кардиолипин, фосфатидиловая кислота, фосфатидилхолин. А также витамины А, Е, В2, микроэлементы.

6. Липотон - масляный раствор липофильной фракции плаценты свиной относится к малотоксичным веществам - 4 класс опасности (ГОСТ

12.01007-76). Препарат не обладает раздражающими, аллергенными, имму-нотоксическими, мутагенными свойствами. Липотон не проявляет эмбрио-токсического и тератогенного действия, при применении липотона количество живорожденных крысят возрастает на 4,5%, а средняя масса их увеличивается на 4,7%. Препарат в исследованных дозах безвреден для сельскохозяйственных, мелких домашних животных и птицы.

7. Липотон оказывает выраженное иммуностимулирующее действие. Препарат повышает индекс завершенности фагоцитоза на 34,9-37,1%», процент НСТ-положительных нейтрофилов крови мышей в спонтанном НСТ-тесте в 2,4 раза, в стимулированном - в среднем в 3 раза. Липотон у коров и 2-х месячных телят повышает бактерицидную активность сыворотки крови, соответственно, на 23,3% и 16,6%, лизоцимной активности - на 29,7% и 30,9% и содержание комплемента - на 28,4% и 38,9%».

8. Применение липотона крысам в дозе 5 мкг/кг (по ДВ) способствует поддержанию интенсивности процессов перекисного окисления липидов на более низком физиологическом уровне, что выражается в снижении на 16,4% содержания в крови у них малонового диальдегида и на 9,4% диеновых конъюгатов. В тоже время препарат способствует увеличению функциональной мощности системы антиоксидантной защиты организма, что выражается в повышении на 9,5% активности каталазы, на 11,3% активности глутатионредуктазы и на 9,5% - глутатионпероксидазы.

9. Липотон обладает выраженным противовоспалительным действием -в дозе 5,0 мкг/кг достоверно угнетает каррагениновое воспаление на 46,4%, формалиновое - на 52,2%, зимозановое - на 87,4%, Липотон обладает выраженным ранозаживляющим действием. Так при кожных ранах (100 % заживление к 15-17-му дню против 27 дней в контроле), при ожоговых ранах (100% заживления ран к 20-му дню против 65,9% в контроле).

10. Под влиянием липотона происходит уменьшение количества язвенных поражений слизистой оболочки желудка, как медикаментозного происхождения (на 79,7%), так и стрессогенного характера (до 100%).

11. Липотон обладает гепатопротекторным действием при токсическом повреждении печени. Применение препарата в дозе 5,0 мкг/кг (по ДВ) снижало на 78,1% увеличение активности АсАТ и на 84,3% активности АлАТ в сыворотке крови. При применении липотона в меньшей степени (на 41,8%) повышалась активность маркерного фермента холестаза - щелочной фосфа-тазы. Липотон при ССЦ-индуцированном гепатите также же препятствовует-росту уровня в сыворотке крови мочевины (на 24%) и холестерина (на 71,7%>), способствует снижению на 14,8% уровеня МДА в крови.

Применение липотона животным (телята, кошки) при нарушенной функции печени в дозе 5,0 мкг/кг (по ДВ) массы тела парентерально оказывает выраженное гепатопротекторное действие, проявляющееся в нормализации белок-синтезирующей функции печени, снижении показателей цитолиза - АлАТ - в 2,6-3,9 раза, а АсАТ - в 2,1- 4,8 раза.

12. Применение липотона разным видам животным в условиях различных стресс-воздействий способствует уменьшению степени гипертрофии надпочечников и инволюции органов иммунной системы, снижению потери массы тела, сохранению функционального потенциала стресс-лимитирующей системы антиоксидантной защиты и предотвращению накопления в организме токсических продуктов пероксидного окисления липидов, что свидетельствует о наличии у липотона выраженной стресс-протективной активности. Применение липотона поросятам до и после отъема позволяет снизить в адаптационный период в 4 раза заболеваемость, на 4,2% повысить сохранность.

13. Гидрофильная фракция плаценты свиной - аминотон - представляет собой биологически активный комплекс основными компонентами которого являются аминокислоты, олигопептиды, глюкуроновые и нуклеиновые кислоты, микроэлементы.

13. Аминотон относится к малотоксичным веществам - 4 класс опасности (ГОСТ 12.01007-76). Препарат не обладает раздражающими, аллергенными, иммунотоксическими, мутагенными свойствами, не проявляет эмбриотоксического и тератогенного действия. Препарат в исследованных дозах безвреден для сельскохозяйственных, мелких домашних животных и птицы.

14. Аминотон оказывает выраженное иммуностимулирующее действие, повышая индекс завершенности фагоцитоза на 67,1-71,7%, процент НСТ-положительных нейтрофилов крови мышей в спонтанном НСТ-тесте в 2,4 раза, в стимулированном - в среднем в 3 раза. Применение аминотона способствует повышению бактерицидной активности сыворотки крови телят на 20,5%, у коров - на 25,6%, активности лизоцима у коров на 38,1%, у телят -на 29,6%, а также активизирует выработку антител.

15. Применение аминотона в дозе 0,1 мл/кг интактным животным способствует поддержанию интенсивности процессов пероксидного окисления липидов на более низком физиологическом уровне. Препарат способствует повышению функциональной мощности системы антиоксидантной защиты организма, что выражается в повышении активности каталазы, глутатионре-дуктазы и глутатионпероксидазы.

16. Аминотон обладает противовоспалительным действием - в дозе 0,1 мл/кг, угнетая воспалительную реакцию, вызванную каррагенином на 40,2%, формалином - на 43,6%, зимозаном - на 16,0%. Препарат обладает раноза-живляющим действием, способствуя 100 % -му заживлению кожных ранах к 16-18-му дню при заживлении в контроле через 27 дней. При ожогах 100%-е заживление ожоговых ран наступает к 27-30-му дню, при 88,7%-м заживлении в этот период в контроле.

17. Под влиянием аминотона происходит уменьшение количества язвенных поражений слизистой оболочки желудка, как медикаментозного происхождения (на 52,8%), так и стрессогенного (на 67,1%).

18. Аминотон обладает гепатопротекторным действием при токсическом повреждении печени, вызванном тетрахлорметаном и этанолом. Применение препарата в дозе 0,1 мл/кг снижало на 71,9% степень увеличения активности АсАТ и на 63,1% активности АлАТ в сыворотке крови. Наряду с этим при применении аминотона в меньшей степени (на 57,2%) повышалась активность и маркерного фермента холестаза - щелочной фосфатазы, в 1,9 раза снижало степень гиперферментемии у-ГТТ.

19. Применение аминотона цыплятам-бройлерам в дозе 1,0 мл/кг массы тела с питьевой водой оказывает положительное влияние на уровень и длительность гуморального иммунитета, увеличивает сохранность на 3,3% и среднесуточные привесы на 4,0%. Аминотон способствует сохранению фонда биоантиоксидантов как в организме птицы, так и в яйце, что улучшает его качественные показатели и повышает пищевую ценность.

20. Телята, рожденные от коров, которым аминотон применяли за месяц и за 15 дней до отела и сразу после отела, с последующим двукратным введением препарата новорожденным на 5-е и 7-е сутки жизни, в 3 раза меньше заболевают колибактериозом в ранний постнатальный период развития, в более легкой форме переболевают, лучше растут и развиваются.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для профилактики и лечения послеродовых заболеваний у коров и свиноматок липотон применять в дозе 0,2-0,25 мл/кг, в соответствие с листком вкладышем к регистрационному удостоверению № 2035-02-721-06 от 06.10.06, выданного Государственным Департаментом ветеринарной медицины Министерства аграрной политики Украины. Для лечения гепатопатий, повышения иммунной и общей резистентности организма животных, профилактики заболеваний у молодняка животных липотон применять в дозе 0,01 мл/кг в соответствии с инструкцией по применению, рекомендованной ФГУ «ВГНКИ» к утверждению Росельхознадзором РФ.

2. Для профилактики и сочетанного лечения послеродовых заболеваний у коров и свиноматок, лечения гепатопатий, повышения иммунной и общей резистентности организма животных, профилактики заболеваний у молодняка животных аминотон применять в дозе 0,1 мл/кг в соответствии с листком вкладышем к регистрационному удостоверению № 2034-02-720-06 от 06.10.06, выданного Государственным Департаментом ветеринарной медицины мини-стерства аграрной политики Украины, а также с инструкцией, утверждённой главным Государственным инспектором по Воронежской области от 11,01.2005 года.

3. При разработке мероприятий по профилактике и лечению акушерско-гинекологических заболеваний животных руководствоваться «Методическими рекомендациями по диагностике, терапии и профилактике субинволюции матки у коров» и «Методическими рекомендациями по диагностике, терапии и профилактике субклинического мастита у свиноматок», одобренными секцией «Патология, фармакология и терапия» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол №1 от 24 марта 2005 г).

4. Для определения биологической активности и контроля эффективности производства биопрепаратов и их практического применения руководствоваться Методическими пособиями «Экспресс-биотест. Биологический мониторинг экологических систем»,- Воронеж, 1997; «Скрининг адаптогенов - стресс-корректоров»,- Воронеж, 2000.

3.2.9. Заключение

Результаты фармако-токсикологического изучения препаратов крио-тон, плацент-гель, липотон и аминотон, проведенные на 4-х видах лабораторных животных (мыши, крысы, морские свинки и кролики) в соответствии с требованиями, предъявляемыми к изучению новых лекарственных средств, могут быть обобщены в следующих основных положениях.

1. Изученные препараты не токсичны для животных при однократном пероралыюм и парентеральном введении (внутрибрюшинном) в максимальных испытанных дозах. По показателям острой токсичности эти препараты относятся к веществам мало опасным - 4 класс опасности по ГОСТ 12.0100776. Выраженной видовой и половой чувствительности к ним не выявлено. Во всех испытанных дозах препараты не оказывают существенного влияния на поведение и общее состояние животных, интенсивности роста и вегетативные функции.

2. Во всех вариантах хронического введения препараты не вызывают изменений поведения и общего состояния животных, отклонений в скорости роста, нарушений гемопоэза, функций печени, почек. Они не влияют на биохимические показатели крови, характеризующие функциональное состояние внутренних органов, не вызывают изменений метаболических процессов в печени и нарушений ее обезвреживающей функции. При патоморфологиче-ском исследовании внутренних органов животных после многократного применения криопрепаратов не установлено патологических изменений структуры паренхиматозных тканей, желудочно-кишечного тракта. Препараты не оказывают местнораздражающего действия на слизистые оболочки, кожу и ткани в месте введения.

3. В исследованных дозах препараты, полученные на основе криогенных технологий, не обладают аллергизирующими свойствами, не проявляют иммунотоксического действия. Препараты не оказывают токсического действия на беременных животных, негативного влияния на течение беременности, не вызывают аномалий в развитии скелета и внутренних органов эмбрионов и неблагоприятного воздействия на развитие потомства.

4. Липотон и аминотон не обладают способностью индуцировать хромосомные аберрации в клетках костного мозга мышей. Изученные препараты статистически достоверно увеличивают фертильность и плодовитость самок крыс, что свидетельствует о благоприятном воздействии аминотона, и, особенно, липотона на функциональное состояние эндокринной системы.

3.3. Экспериментальная фармакология

3.3.1. Иммуномодулирующие свойства липотона и аминотона

Одним из важных аспектов оценки иммунотропной активности является исследование влияния препаратов на клеточное звено иммунитета.

На рисунке 13 представлены результаты исследований влияния липотона и аминотона на фагоцитарную активность макрофагов перитонеального экссудата мышей. липотон, мкг/мл доза "°'01 аминотон, мл/мл □ 0,1 01

Рис. 13. Влияние липотона и аминотона на индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ) перитонеальных макрофагов мышей

Из представленных данных видно, что липотон и аминотон повышает фагоцитарную активность макрофагов (% фагоцитоза по сравнению с контролем выше в 2,0-2,9 и 2,9-3,5 раза соответственно). Кроме того, препараты оказывают выраженное воздействие на переваривающюю способность фагоцитов, повышая индекс завершенности фагоцитоза с 19,08% - в контроле до 66,7-68,2%) - при применении аминотона и до 53,6-54,5%) - липотона. При этом достаточно четко прослеживается дозозависимая активность препаратов. Увеличение дозы аминотона до 1,0 мл/кг снижает фагоцитарную активность, а у липотона эффект усиливается с нарастанием дозы.

Другими показателями функциональной активности фагоцитирующих клеток является активность лизосомальных ферментов, показатели энергетического и окислительного метаболизма. Количественно влияние препаратов на эти показатели можно оценить по способности клеток к спонтанному восстановлению нитросинего тетразолия (НСТ-тест), что позволяет судить о состоянии системы окислительного метаболизма фагоцитов.

Установлено, что липотон и аминотон статистически достоверно повышают процент НСТ-положительных нейтрофилов крови мышей как в спонтанном, так и в стимулированном НСТ-тесте. При этом, эффект стимуляции является для них дозозависимым (табл. 47).

При оценке иммунотропных свойств фармакологических препаратов большое значение имеет определение его влияния на функциональную активность Т-лимфоцитов. Среди этих систем особое место занимает реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), выявляющая способность иммуноактивных средств влиять на индукцию сенсибилизированными лимфоцитами медиаторов разнонаправленного действия.

На рисунке 14 представлено соотношение средних величин интенсивности ГЗТ в опыте и контроле (О/К). В первой группе животных препараты вводили за 1 час до сенсибилизации (1), во второй - за 1 час до сенсибилизации и за 1 час до введения разрешающей дозы препарата (2) и в третьей группе - за 1 час до введения разрешающей дозы препарата (3).

140