Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Воздействие апитоксина на некоторые показатели системы иммунитета в норме и при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите (экспериментальное исследование)

;. 4

На правах рукописи

КОЧЕТКОВА НАТАЛЬЯ ГЕННАДЬЕВНА

ВОЗДЕЙСТВИЕ АПИТОКСИНА НА НЕКОТОРЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМЫ ИММУНИТЕТА В НОРМЕ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ АЛЛЕРГИЧЕСКОМ ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТЕ

(экспериментальное исследование)

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

член-корреспондент РАЕН, засл. деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Л. Я. Эберг

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор С. Н. Теплова доктор биологических наук, профессор В. Н. Крылов

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

НИИ экспериментальной медицины РАМН (С.-Петербург)

Защита состоится_ 1998 года в_ часов на заседании ученого

совета Челябинской государственной медицинской академии (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан ._ 1998 года.

На правах рукописи

КОЧЕТКОВА НАТАЛЬЯ ГЕННАДЬЕВНА

ВОЗДЕЙСТВИЕ АПИТОКСИНА НА НЕКОТОРЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМЫ ИММУНИТЕТА В НОРМЕ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ АЛЛЕРГИЧЕСКОМ ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТЕ

(экспериментальное исследование) 14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

член-корреспондент РАЕН, засл. деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Л. Я. Эберт

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор С. Н. Теплова доктор биологических наук, профессор В. Н. Крылов

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

НИИ экспериментальной медицины РАМН (С.-Петербург)

Защита состоится_ 1998 года в_ часов на заседании ученого

совета Челябинской государственной медицинской академии (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан _ 1998 года.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы,

Демиелинизирующие заболевания и среди них рассеянный склероз представляют собой поражения нервной системы, протекающие с обострениями и ремиссиями или неуклонно прогредиентно, с множественными очагами поражения центральной и периферической нервной системы (Гусев Е.И., Демина Т.Л., Бойко А.Н.,1997, Завалишин И.А., 1990, Baum, Junge М., Felix R., 1994).

Такие заболевания, как правило, возникают у лиц молодого трудоспособного возраста (20 -40 лет) и подавляющее большинство заболевших приводят к инвалидности в первые 3-5 лет ( Завалишин И.А., 1990 ).

Заболеваемость демиелинизирующей патологией растет, существует тенденция к распространению ее в те районы, она ранее практически не встречалась (Завалишин И.А.,1990, Гусев Е. И.,1995,4.М.Позер, 1993). В странах Западной Европы до 10,5 %от всей органической неврологической патологии составляет рассеянный склероз ( Kleinet et al.,1994).Несмотря на постоянный интерес к этой проблеме, точная этиология демиелинизирующих заболеваний пока не определена, вопрос о патогенезе остается спорным.

Увеличение в последние годы исследований, посвященных иммунопатологии демиелинизирующих заболеваний привело к пониманию ведущей роли иммунологических расстройств в их патогенезе, что и послужило основанием для применения в комплексной терапии этих расстройств медикаментозных и физических средств, так или иначе воздействующих на нарушенный иммунный гомеостаз.

Поиски таких средств постоянно продолжаются, в том числе и среди веществ биологической природы. Одним из таких веществ, привлекающих в последние 15 лет интерес исследователей, является апи-токсин (пчелиный яд).

Известно, что апитоксин, имея достаточно сложную структуру, включающую белковые вещества, органические и неорганические кис-

лоты, биологически активные вещества, оказывает действие на иммунную систему человека и животных ( Орлов Б.Н., 1972-1980, Лудянский Э.В..1994, Крылов В.Н., 1995). Качество этого воздействия зависит от вводимой дозы апитоксина.

Так, по данным Е.Б.Романовой ( 1980,1987), апитоксин в дозах 2,264,5 мг/кг вызывает иммунодепрессивный эффект, а в дозе ОД 3 мг/кг (Савчук Н.А., Савчук О.Е.,1970) - стимулирующий.

Кроме того, определенный интерес для коррекции звеньев патогенеза демиелинизирующих заболеваний представляют также следующие механизмы действия апитоксина:

- активация коры надпочечников с выбросом эндогенного кор-тизола в кровь (Зайцев Г.П., Виноградова Т.В., 1960, Орлов Б.Н., 1978, 1980, 1987);

- снижение уровня холестерина в крови (Зайцев Г.П., Виноградова Т.В., 1974, Архангельский А.А., 1977);

Работами Орлова Б.Н. (1972,1973, 1987,1988) также было установлено, что апитоксин в зависимости от вводимых доз способен оказывать влияние на миелиновую оболочку нервного волокна.

Апитерапия как метод лечения различных заболеваний существует достаточно давно. Исследованиями последних двадцати лет значительно расширены сведения о структуре яда и его влиянии на организм человека и животных..

Однако в доступной нам литературе отсутствуют данные о влиянии апитоксина на систему иммунитета при демиелинизирующем процессе.

Исследование же такого влияния позволило бы обосновать целесообразность применения апитоксина в качестве лечебного патогенетического средства при демиелинизирующих заболеваниях.

В качестве адекватной и общепризнанной модели демиелинизи-рующего процесса выбран экспериментальный аллергический энцефаломиелит ( гагпуй Б8, 81еттап Ь.,1990, Ьтп^оп С е1 а1., 1988, 1993 ).

Цель исследования:

Изучить в эксперименте на белых крысах воздействие аг итоксина на некоторые показатели системы иммунитета в норме и ирг экспериментальном аллергическом энцефаломиелите.

Задачи исследования:

1. Изучить воздействие апитоксина на некоторые показатели системы иммунитета у здоровых животных.

2. Исследовать некоторые показатели иммунитета, их взаимосвязь с неврологическими расстройствами, патоморфологическими изменениями в нервной ткани при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите у крыс.

3. Оценить влияние апитоксина на некоторые показатели системы иммунитета и течение экспериментального аллергического энцефаломиелита.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное исследование влияния апитоксина на отдельные звенья иммунитета у экспериментальных животных в норме при дробном его введении. Впервые изучено влияние апитоксина на клиническое состояние, неврологический статус и морфологические изменения в оболочке нервных волокон центральной и периферической нервной системы у животных с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом с соответствующим им изменениям в иммунной системе.

Экспериментально обоснована возможность применения апитоксина в терапии демиелинизирующей патологии.

Положения,выносимые на защиту

1. Введение апитоксина здоровым крысам линии Вистар вызывает увеличение массы и клеточности селезенки и количесвта антителообра-зующих клеток селезенки как проявление иммуностимулирующего действия яда на факторы гуморального иммунитета.

2. Апитоксин при введении крысам с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом не приводит к повышению активности пе-ритонеальных макрофагов и усилению реакции гиперчувствительнос-ги замедленного типа по сравнению со здоровыми животными.

3. Апитоксин облегчает клиническое течение экспериментального аллергического энцефаломиелита у крыс, способствует более быстрому регрессу неврологических расстройств, уменьшает выраженность пато-морфологических изменений нервной ткани, что свидетельствует о его возможном применении при демиелинизирующей патологии.

2 Зан 2223

3

Внедрение в практику

Впервые проведено исследование по возможности лечебного действия апитоксина на крыс с ЭАЭ. Результаты исследования позволяют наметить подходы к экспериментальному обоснованию применения апитоксина при лечении демиелинизирующей патологии у человека.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседании Ассоциации неврологов Челябинской области (Челябинск 1996), на ежегодных Европейских конгрессах по рассеянному склерозу (Иерусалим, 1995, Копенгаген, 1996, Стамбул, 1997, Стокгольм, 1998), а также на заседании кафедры микробиологии Челябинской медицинской академии (1997).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на страницах машинописного текста , состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего <£ ^источников, в том числе зарубежных авторов.

Работа иллюстрирована 20 таблицами, 8 микрофотографиями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Экспериментальная часть работы выполнена на 360 половозрелых крысах-самцах линии Вистар со средним весом 200 г. Животные содержались в стационарных условиях вивария при температуре 18-20°С, на смешанном рационе питания со свободным доступом к воде. Перед проведением эксперимента все крысы выдерживались в карантине 20 дней.

Все болезненные манипуляции проводились под эфирным наркозом, животных забивали методом цервикалыюй дислокации.

В качестве модели был использован экспериментальный аллергический энцефаломиелит, который воспроизводился методом однократной инокуляции основного белка миелина с полным адъювантом Фрей-нда в подушечки лап крыс (Житнухин O.J1., 1996). Основной белок миелина (ОБМ) получен из спинного мозга быка методом колоночной хроматографии на сефадексах G-25 и G-50. Молекулярный вес - 18000. Использован ОБМ-инокулят, предоставленный Институтом мозга им. Бехтерева РАН (С.-Пб.).

В ходе эксперимента наблюдались характерные нейропатологиче-ские проявления ЭАЭ: снижение двигательной активности, реакции на болевое раздражение, падение веса, атаксия, нижние и верхние парезы и параплегии, тетрапарезы и тетраплегии, парезы и параличи сфинктеров, что достоверно свидетельствует о множественных уровнях поражения нервной системы.

Оценка результатов проводилась на основании учета числа животных с неврологическими поражениями и летальными исходами, а также интегральной оценки выраженности неврологических симптомов ЭАЭ с помощью устройства для оценки равновесия, позы и локомоции Г.С.Айзикова(1980).

Оценка неврологических нарушений производилась в баллах:

0 - тетрапарез.тетраплегия, паралич сфинктеров;

1 - параплегия, паралич сфинктеров;

2 - выраженный парапарез;

3 - слабовыраженный парапарез, атаксия;

4 - снижение двигательной активности без парезов;

5 - отсутствие патологических проявлений.

Все животные были разделены на следующие группы:

I.Здоровые интактные животные

II.Здоровые животные, получавшие апитоксин

III.Животные с энцефаломиелитом, не получавшие апитоксин

IV-Животные с энцефаломиелитом, получавшие инъекции яда

Методы иммунологических исследований

В работе исследовались:

- масса и клеточность тимуса и селезенки (Горизонтов П.Д.,Бело-усова О.И.,Федотова М.И., 1983),

2*

5

- количество антителообразующих клеток в селезенке крыс (Jeme N. К., NordinA. А, 1963),

- функциональная активность перитонеальных макрофагов (Долгушин И.И. и соавт.,1992, Маянский А.Н. и соавт.,1977, Park Вп et al., 1968, Segal AW, 1974),

- реакция гиперчувствительности замедленного типа (Landgrlade РН et al., 1974, 1980).

Использовался яд-сырец нчелы Apis mellifera расы «среднерусская», полученный методом электростимуляции. Яд сертифицирован Уральским региональным учебно-технологическим центром «Апис плюс» Челябинского агроинженерного университета.

Место сбора яда - Челябинская область.

Чистый вес партии яда - ЮОгр. Регистрационный номер партии яда - 201.

Химический состав яда представлен в таблице № 1.

Таблица № 1

Химический состав использованного яда-сырца

Предмет анализа, Единицы измерения яда-сырца Требования по нормативным актам Результат анализа

Структура Порошок из чешуек и крупинок - по ТУ Порошок в виде круПинок

Цвет От серовато-желтого до бурого по ФС, ТУ Серовато-желтый

Потери в массе при Высушивании, % Не более 12% по ФС, ТУ 2,1%

Нерастворимый в воде Осадок, % Не более 10% по ФС 4,6%

Окраска раствора в Разведении 1:300 Не должна превышать эталон N За по ТУ Не превышает раствор N За

Содержание Сахаров Не нормируется 4,8%

Гемолитическая Активность, мин. Не более 8 мин. по ФС 1,33 мин

Фосфолипазная Активность, мкг Не более 8 мкг, по ТУ Менее 4 мкг

Содержание мелиттина Не нормируется Не опр.

ТУ - ТУ 46 РСФСР 67-72 «Яд пчелиный-сырец»

ФС - Фармакопейная статья N 42-2683-89 Фармакопеи СССР.

Апитоксин вводился подкожно в виде 1 мл водного раствора из расчета 0,25 мкг/кг массы тела животного через день в течение 14 суток (7 инъекций). Доза была выбрана согласно исследованиям Орлова Б.Н. (1973), установившем, что в данной дозировке яд препятствует демие-лннизации нервного волокна. Раствор готовился ex tempore.Схема эксперимента представлена в таблице № 2.

Таблица № 2

№ группы Схема эксперимента

1 ОБМ и АТ не вводился ( контроль) ----• сутки 1 27

2 ОБМ не вводился 1 Введение АТ 4-

1 15 17 19 21 23 25 27

3 4 Введение ОБМ АТ не вводился »-----• сутки 1 27

4 4- Введение ОБМ 4 Введение АТ 1 •--—•-1-1-1-1-1-• сутки 1 15 17 19 21 23 25 27

ОБМ - основной белок миелина, АТ - апитоксин

Животные забивались через сутки, 7 суток и 14 суток после окончания введения яда.

Морфологические методы исследования

Для морфологической верификации экспериментального аллергического энцефаломиелита была использована методика Шпильмейера, позволяющая выявить дефекты миелиновых оболочек нервных волокон центральной нервной системы у животных. Участки демиелиниза-ции выявлялись при микроскопии (х 100).

Степень разрушения миелинового волокна оценивалась полуколичественным методом (в крестах);

++++ - полное отсутствие миелиновой оболочки +++ - отсутствие миелиновой оболочки >50% ++ - отсутствие миелиновой оболочки >25% + - снижение интенсивности окраски с сохранением продольной структуры оболочки.

3 3;ш.2223 „

Статистическая обработка материала

Полученные данные обрабатывались статистически с использованием прикладного пакета программ STATGRAPAPHICAS Vers. 7.0. Для каждого показателя рассчитывали среднюю арифметическую (М) и стандартную ошибку (ш). Достоверность различий между группами определяли с помощью критерия Стьюдента (t). Различия считали достоверными при р <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Клиническое состояние и морфологическая оценка структур центральной нервной системы у животных после экспериментальных воздействий.

Клиническое наблюдение за животными показало, что апитоксин не вызвал у крыс явлений интоксикации.

Наоборот, животные, получавшие яд, активно набирали вес, имели более густую и блестящую шерсть.

При проведении гистологических исследований срезов головного и спинного мозга крыс, получавших апитоксин, признаков демиелини-зации нервных волокон выявлено не было.

При воспроизведении экспериментального аллергического энцефаломиелита, было отмечено наличие латентного периода длительностью 13-15 дней. У 90 экспериментальных животных неврологические нарушения на 15 сутки опыта выявлены в 100 % случаев.

Летальные исходы к окончанию эксперимента составили 3,3 % (3 животных).

По степени проявления патологии нервной системы на 15-е сутки от момента введения основного белка миелина животные распределялись следующим образом:

0 баллов - 3 животных, 1 балл -12 животных, 2 балла - 27 животных, 3 балла - 36 животных, 4 балла - 12 животных, 5 баллов - 0 животных.

К моменту окончания эксперимента животные с нулевой оценкой все погибли (на 20-22-е сутки от момента введения основного белка миелина). Количество животных с однобалльной оценкой уменьшилось до 10 от первоначальных 12, с двухбалльной - увеличилось до 29 с 27, с четырех- и пятибальной - осталось без изменений.

Гистологические исследования мозговой ткани производились на момент окончания эксперимента. 8

Животные с одно- и двухбалльной оценкой неврологического статуса имели примерно одинаковые изменения в ткани головного и спинного мозга. Морфологическая картина у этих крыс характеризовалась следующими изменениями в структурах головного и спинного мозга.

Выявлены крупные очаги глиоза от 0,25 до 0,3 мм в диаметре в белом веществе головного мозга у 71,4 % исследованных животных, у остальных обнаружены мелкие фокусы глиоза в сером веществе.

Очаги глиоза представлены множеством клеток, расположенных в «эозинофильной» бесструктурной массе.

Клеточные элементы очагов глиоза представлены преимущественно клетками микроглии, среди которых в части очагов обнаруживались одиночные крупные клетки с обильной базофильной цитоплазмой. При окраске гематоксилином и эозином фибриллярное строение глин в этом участке отсутствовало.

При окраске по Шпильмейеру этим очагам соответствовали очаги демиелинизации (++++), явственно выделявшиеся на фоне ритмичных структур упорядочение, параллельно расположенных, интенсивно окрашенных неизменных миелиновых волокон. Очаги демиелинизации имели светлую окраску, были бесструктурны, представлены крупно и мелкозернистыми.

Изменения спинного мозга у животных этой группы при окраске по Шпильмейеру также выглядели светлыми на темном фоне интенсивно окрашенных неизменных волокон.

В этих очагах отсутствовали присущие нормальной глин упорядочение расположенные одинаково интенсивно окрашенные волокна .

В группе животных с неврологической оценкой 3-4 балла в 31,3 % случаев наблюдалось разрежение фибриллярной структуры глин в головном мозге с сохранением параллельного расположения структур с тем отличием, что между волокнами с менее интенсивной (+++,++) чем в норме окраской располагались неокрашенные волокна. В 50 % случаев морфологические изменения в головном мозге, также как было описано для предыдущей группы крыс, представлены очагами глиоза от 0,1 до 0,2 мм.

Наблюдения за животными с ЭАЭ, получившими апитоксин, проводились по тем же критериям, что и за животными с ЭАЭ, не получившими апитоксин.

Клинические проявления энцефаломиелита у крыс также развивались

на 13-15 сутки. С этого момента начинали вводить животным апитоксин, то есть с 14-го дня от момента введения основного белка миелина.

Характер неврологических нарушений у крыс этой группы соответствовал ранее описанным.

Распределение числа подопытных крыс по баллам в первый день введения апитоксина:

О баллов - 1; 1 балл - 14; 2 балла - 24; 3 балла - 39; 4 балла - 12; 5 баллов - 0 животных.

К моменту окончания эксперимента, то есть на 15-й день введения апитоксина, у крыс, получавших апитоксин, число животных с разной степенью неврологических нарушений было представлено следующим образом:

О баллов -0;1 балл-8; 2 балла -21; 3 балла - 44; 4 балла - 12; 5 баллов - 4 животных.

Одно животное погибло на 24-й день от начала эксперимента.

Морфологическое исследование нервной ткани подопытных животных обнаружило изменения, масштаб которых не всегда совпадал с неврологическими нарушениями у этих животных.

У крыс, имевших неврологические нарушения 0-1-2 балла, изменения белого вещества головного мозга носили очаговый характер и локализовались в субэпендимарной зоне. Очаги глиоза до 0,25 мм представлены в 31,4 % случаев.

При окраске по Шпильмейеру миелиновые волокна не выявлялись (++++). Оценка в баллах у этих животных составляла 0-1-2.

У 17,7 % животных, клинически неврологический статус которых оценивался в 2-3 балла, изменения проявлялись единичными мелкими до 0,8 мм участками глиоза, также с отсутствием миелиновых волокон.

У 40% животных (оценка в баллах их неврологического статуса составила 3-4) патология проявлялась диффузным разрежением фибриллярной структуры с сотовидным строением.

При окраске по Шпильмейеру эти участки сохраняли параллельное расположение структур с наличием неокрашенных волокон.

Изменения в спинном мозге носили такой же характер, как и в головном .У 10,9 % животных при исследовании ни в головном, ни в спинном мозге изменений со стороны миелиновой оболочки обнаружено не было . К этой группе относились животные с оценкой 4-5 бах лов.

Таким образом, введение апитоксина крысам с экспериментальным

аллергическим энцефаломиелитом облегчает течение заболевания и приводит к уменьшению выраженности неврологических проявлений энцефаломиелита у этой группы животных по сравнению с группой не-леченных животных. Так, отмечается снижение количества животных с тяжелыми формами поражения нервной системы (0-2 балла ) и одновременное увеличение количества крыс с неврологическими проявлениями в 3-4 балла в группе леченных животных по сравнению с нелечен-ными. В группе животных, получавших апитоксин, к окончанию эксперимента 4 крысы не проявляли никаких неврологических признаков заболевания, тогда как в опытной группе клиническая неврологическая картина энцефаломиелита сохранялась на всем протяжении наблюдения практически без изменений. В свою очередь, и патоморфо-логические изменения миелиновой оболочки нервных волокон центральной нервной системы крыс, получавших апитоксин, выявили тенденцию к уменьшению по сравнению с таковыми у нелеченных животных ( уменьшение размеров очагов глиоза 0,25-0,3 мм в диаметре с 71.4% у нелеченных до 31,4 % у леченных, увеличение только диффузного разрежения миелиновой оболочки с 31,3% в опытной группе до 40% у крыс, получавших апитоксин). Также у 10,9%о леченных животных никаких патоморфологических изменений со стороны миелиновой оболочки нервных волокон ни в спинном, ни в головном мозге выявлено не было.

Влияние аиитоксииа на показатели иммунитета у здоровых животных

Под действием апитоксина достоверно( р< 0,05) увеличивается масса селезенки на всем протяжении динамического наблюдения. Клеточ-ность селезенки также растет (р<0,05 на 7-е и 14-е сутки).Данные представлены в таб.№ 3.

Несколько иные данные получены относительно массы и клеточ-ности тимуса. Достоверных различий по этим показателям между контрольной и опытной группами животных не получено. Однако наблюдается тенденция к увеличению как массы, так и клеточности тимуса при увеличении экспозиции по времени. Так, в процентном соотношении на седьмые сутки масса тимуса составила 104,3%, на четырнадцатые сутки - 104.76 ±.2,1%, а клеточность тимуса соответственно 110,89 _± 1,7 % и 112,97 ±2,11%».

Таблица № 3

Показатели состояния иммумокомпетентных органов, АОК и ГЗТ у животных, получавших апитоксип, и интактных животных (динамический контроль)

I - интактные животные

II - крысы, получавшие яд.

Исследуемый показатель Стат. показатель I сутки VII сутки XIV сутки

Масса селезенки, г I М±ш 591.5+3.32 600,7+13.43 607,7+10,02

п 30 30 30

И М+т 833,5±4,32 1127,78+17.86 1002.91±13.67

п 30 30 30

Р <0.05 <0,05 <0.05

Масса тимуса, мг 1 М+т 237,4+19,31 240,7+18,02 241,31±17,02

п 30 30 30

II М±т 238.1 ±6.54 248,556+21,485 2 «,443±10,76

п 30 30 30

Р > 0,05 >0.05 > 0.05

Масса селезенки Масса крысы I М+т 2.547±0.133 3,39±0.4Г>9 2.607±0.237

п 30 30 30

II М+т 3,4+0,135 4.95±0,579 4,90+0,323

п 30 30 30

Р >0,05 >0,05 <0,05

Масса Масса крысы 1 М±т 1,015+0,073 0.95+0.072 0.971±0.072

п 30 30

II М±т 0,947+0,04 1,004+0.084 1.001+0.039

п 30 30 30

Р >0,05 >0.05 >0,05

Клетки тимуса х 106 I М±т 402.0±32,599 416,25±19,82 410.2+20,71

п 30 30 30

II М±т 385,5+35.235 427,5±54,59 435.5+39.58

п 30 30 30

Р >0,05 >0,05 >0,05

Клетки селезенки х 106 I М±т 460.5+17,436 477,7±9,40 465,72+13,01

п 30 30 30

II М±ш 663,75+13,76 830,83±13,72 901,75+9,72

п 30 30 30

Р >0.05 <0,05 <0.05

АОК х 10й I М±т 11.36+0,62 11,109±1,49 11,98+1.93

п 30 30 30

II М±т 22,28+1,126 14,51+2.36 13.09+2.13

п 30 30 30

Р <0.05 >0.05 >0,05

Очевидно, что апитоксин в применяемой дозе оказывает более выраженное влияние на гуморальный иммунитет, что согласуется с исследованиями Василенко (1985), Гущина с соавт ( 1990).

Количество антителообразующих клеток (АОК) достоверно увеличивается в первые сутки после окончания введения апитоксина (р<0,05).

При увеличении экспозиции по времени отмечается снижение количества АОК. Это, безусловно, связано с прекращением поступления в организм животных апитоксина, являющегося антигеном, и снижением выработки антител на яд. В литературе мы не встречали исследований, посвященных изучению состояния АОК под воздействием апитоксина , однако исследованиями Шкендерова с соавт. (1976, 1985) показано увеличение содержания ^ в и ^Е в сыворотке людей, получавших пчелоужаления либо препараты, содержащие пчелиный яд.

Следует отметить, что количество АОК на протяжении периода наблюдения снижалось при продолжающемся нарастании общего количества клеток селезенки. Очевидно, сохраняющееся увеличение массы и клеточности селезенки связано не с продукцией антителообразу-ющих клеток.

Достоверных различий показателей у контрольной группы животных и животных, получавших апитоксин, не выявлено. Но в то же время наблюдается отчетливая тенденция к увеличению содержания активированных макрофагов, активности и интенсивности фагоцитоза и общего содержания макрофагов в мазке. Такие изменения сохраняются на всех сроках наблюдения за животными.

Эти данные подтверждаются работами Лебедева и Понякиной (1990), которые показали увеличение макрофагальной активности под воздействием яда . Недостоверность различий показателей у интакт-ных животных и животных, получавших апитоксин, очевидно, связана с используемыми минимальными дозами ядами и при увеличении дозы вводимого апитоксина можно ожидать более выраженных различий.

И, наконец, последним показателем состояния иммунитета у крыс, получавших апитоксин, была гиперчувствительность замедленного типа.

Известно, что апитоксин является сильным аллергенным средством (Орлов с соавт., 1980-1985, Габерманн,1972, Шкендеров, Иванов,1985, Крылов, 1995). Исходя из этих данных, можно предположить, что введение апитоксина приведет к усилению гиперчувствительности замедленного типа ( ГЗТ) . Однако, мы не получили подтверждение этим данным. ГЗТ у контрольных животных и крыс, получавших апитоксин, достоверно не различалась. Это подтверждает данные ряда авторов (Урбанек с соавт., 1980, Лудянский, 1994) о том, что яд может использоваться в качестве десенсибилизирующего средства.

Состояние некоторых показателей иммунитета при ЭАЭ у крыс

При оценке влияния данного патологического процесса на массу селезенки определяются достоверные( р 0,05) различия показателя у здоровых животных и животных с ЭАЭ в сторону увеличения при развитии заболевания. Это увеличение носило стабильный характер на всех сроках заболевания. Данные представлены в таб. № 4.

Таблица № 4

Исследование состояния иммунокомпетеитных органов, АОК у здоровых животных и животных с ЭАЭ (динамический контроль)

I - здоровые животные

II - животные с ЭАЭ

Исследуемый показатель Стат. показатель I сутки VII сутки XIV сутки

Масса селезенки, г I М±ш 591,5+3.32 600,7+3.13 607,7+10,02

и 30 30 30

11 М±ш 778.7±6,29 800.3+7,21 791.75+4.33

п 30 30 30

Р <0,05 <0,05 <0,05

Масса тимуса, мг I М+т 237,4+19,31 240,7± 18.02 241,31+17.02

п 30 30 30

И М±т 238,4±26,92 236,9+21.71 239.91 + 17.61

п 30 30 30

Р >0.05 >0,05 >0.05

Масса селезенки Масса крысы 1 М±т 2,547±0,133 3.39±0.469 2.607+0.237

п 30 30 30

И М+т 3.98+0.18 3,67+0,19 3,87+0, i 1

п 30 30 30

Р >0.05 >0.05 >0.05

Масса тимуса Масса крысы 1 М±т 1.015+0,073 0,95+0,072 0,971 ±0,072

п 30 30 30

11 М±т 1,19±0,11 1,17+0,27 0.997±0,27

п 30 30 30

Р >0.05 >0,05 >0,05

Клетки тимуса х 106 I М+т 402.0±32,599 416,25+19,82 410,2+20,71

п 30 30 30

и М±т 467.521+71,32 480.48+61,28 483,41 + 19,29

п 30 30 30

Р >0,05 >0,05 >0.05

Клетки селезенки х 106 I М±т 460,5±17.436 477,7±9.40 465,72+13.01

п 30 30 30

и М±т 710,00+72,1 954,0±64.15 944.07±72,41

п 30 30 30

Р >0,05 <0,05 <0,05

АОК х 10й I М±т 11,36+0,62 11,109+1,49 11.98+1.93

п 30 30 30

II М±т 24,13+0,17 22,71+0,934 22,04+1,17

п 30 30 30

Р <0,05 <0,05 <0,05

Со стороны клеточности селезенки выявлена такая же тенденция, как и для массы этого органа, хотя при сравнении контрольной и опытной группы достоверные различия (р<0,05) выявлены на седьмые и четырнадцатые сутки.

В доступной нам литературе мы не встречали данных исследования состояния массы и клеточности селезенки при ЭАЭ. Полученные данные вполне закономерны при развитии иммунопатологического состояния.

При анализе изменений со стороны массы тимуса при ЭАЭ достоверных различий между контрольной и опытной группой не выявлено.

Со стороны же клеточности тимуса проявляется отчетливая тенденция увеличения этого показателя у животных с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом по сравнению со здоровыми животными.

При экспозиции по времени различий в клеточности тимуса у крыс с ЭАЭ не наблюдалось.

Количество АОК достоверно выше (р<0,05) у животных с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом. При анализе изменений АОК у крыс с ЭАЭ во временной экспозиции различий не выявлено.

У животных с ЭАЭ достоверных изменений со стороны перитоне-альных макрофагов не выявлено,что, очевидно, связано с тем, что популяция перитонеальных макрофагов не реагирует на развитие ЭАЭ , и, очевидно, изменения следует ожидать со стороны других популяций макрофагов.

При изучении гиперчувствительности замедленного типа выявлено достоверное ее увеличение (р<0,05) у животных с ЭАЭ на всех сроках наблюдения, что соответствует данным о том, что ГЗТ является одним из основных звеньев патогенеза при развитии ЭАЭ .

Данные представлены в таб.№ 5.

Таблица № 5

Исследование состояния ГЗТ у здоровых животных и животных с ЭАЭ ( динамический контроль)

I - здоровые животные

II - животные с ЭАЭ

Исследуемый показатель Стат. показатель I сутки VII сутки XIV сутки

ГЗТ Д 1 М±т 0.484±0.07 0.472+0,098 0,50±0.062

п 30 30 30

и М±т 0,921+0,04 0,887+0,071 0,791+0,094

п 30 30 30

Р <0,05 <0,05 <0,05

Влияние апитоксина на показатели иммунитета у крыс при развитии ЭАЭ

Введение апитоксина не ведет к достоверным различиям в массе и клеточности селезенки здоровых и больных животных. Во временном промежутке показатели клеточности селезенки у больных животных под влиянием апитоксина также не изменяются.

Не выявлено достоверных различий в отношении массы тимуса между контрольной группой животных и группой животных с ЭАЭ , также, как и не выявлено различий этого показателя под воздействием апитоксина во временном промежутке.

Учитывая полученные данные о том, что апитоксин в дозе 0,25 мкг/ кг массы стимулирует выработку антителообразующих клеток у здоровых животных, мы могли предположить такой же результат и у животных с ЭАЭ. Однако количество АОК у крыс с ЭАЭ, не получавших яд, практически не отличалось от количества АОК у животных, которым вводился апитоксин (таб.№ 6). Это позволяет предположить несколько иной, чем в норме, механизм воздействия апитоксина у животных с ЭАЭ.

Таблица № 6

Показатели состояния иммунокомпетентных органов, АОК у животных с ЭАЭ, не получавших апитоксин, и леченных (динамический контроль)

I - животные с ЭАЭ, не получавшие апитоксин

II - леченные животные.

Исследуемый показатель Стат. показатель 1 сутки VI! сутки XIV сутки

Масса селезенки,г I М±т 778,7±56.29 800,3±47,21 791,75±40.33

п 30 30 30

И М+т 829,5±37,86 840,5±20.82 821.4±31,79

11 30 30 30

Р >0,05 >0,05 >0,05

Масса тимуса, мг I М±т 238,4+26,92 236.9±21.7| 239.9Ш7.6!

п 30 30 30

И М±т 244,31 + 15,71 251,4+14,19 250,11 + 12,49

п 30 30 30

Р >0,05 >0,05 >0.05

Масса Селезенки Масса крысы I М+т 3,98+0.18 3,67±0,19 3,87±0.11

п 30 30 30

И М±т 3,97+0.23 4,01±0,11 4,04+0,11

п 30 30 30

Р >0.05 >0,05 >0,05

Исследуемып псказатель Стат. показатель 1 сутки VII сутки XIV сутки

Масса Тимуса Масса крысы 1 М+т 1,19+0,11 1,17+0.27 0.997+0,4

п 30 30 30

И М+т 1,17+0,86 0.21 ±0,14 1,07±0.44

п 30 30 30

Р >0.05 >0,05 >0,05

Клетки тимуса х !' I М±т 467.521+71,32 480,48+61.28 483.4Ы9.29

п 30 30 30

И М+т 431.59+78.28 465,5±65,9 470.4±80,11

п 30 30 30

Р >0,05 >0.05 >0,05

Клетки Селезенки х 10* 1 М+т 710.00+72,1 954,0+64,15 944.07+72,41

п 30 30 30

и М±т 757,87+61,27 80.32±69,24 878.24±64.33

п 30 30 30

Р >0.05 >0,05 >0.05

АО К х 10» 1 М+т 24.13+0,17 22,71+0,934 22.04+1,17

п 30 30 30

И М+т 25.28+0.47 21,96+0,62 23.6+0.875

п 30 30 30

Р >0.05 >0,05 >0.05

При изучении активности перитонеальных макрофагов крыс с ЭАЭ обнаружено отсутствие достоверных различий этого показателя между животными, получавшими апитоксин, и животными, которым яд не вводился.

ГЗТ у крыс с ЭАЭ под действием апитоксина не только не увеличивалась, но имела четкую тенденцию к снижению( таб. № 7).

Таблица № 7

Показатели состояния ГЗТ у животных с ЭАЭ, не получавших апитоксин, и леченных (динамический контроль)

I - животные с ЭАЭ, не получавшие апитоксин

II - леченные животные.

Исследуемый показатель Стат. показатель I сутки VII сутки XIV сутки

гзт д 1 М+т 0,921 ±0.04 0.887±0,071 0.791 ±0.094

N 30 30 30

11 М±т 0,902+0,011 0,804+0.062 0,801+0,051

N 30 30 30

Р >0.05 >0,05 >0.05

Полученные данные представляются нам достаточно важными, поскольку применение апитоксина при демиелинизирующей патологии вызывало опасение увеличения гиперчувствительности замедленного

типа и активацию процессов демиелинизации. Однако наше исследование подтверждает необоснованность предубеждения против применения апитоксина при демиелинизирующей патологии.

ВЫВОДЫ

1. Апитоксин в дозе 0,25 мкг/кг массы, введенный здоровым крысам линии Вистар, вызывает увеличение массы и клеточности селезенки и количества антителообразующих клеток у исследуемых животных в ней по сравнению с крысами, не получавшими яд.

2. Апитоксин, введенный здоровым животным, не оказывает достоверного влияния на массу и клеточность тимуса и функциональную активность перитонеальных макрофагов по сравнению со здоровыми крысами, не получавшими яд .

3. Развитие экспериментального аллергического энцефаломиелита у крыс приводит к увеличению массы селезенки, количества антитело-образующих клеток селезенки, клеточности тимуса, реа кции гиперчувствительности замедленного типа у больных животных по сравнению со здоровыми.

4. Апитоксин при введении животным с экспериментальным аллергическим энцефаломиелитом не приводит к достоверным различиям в массе и клеточности тимуса и селезенки, количества антителообразующих клеток, функциональной активности перитонеальных макрофагов и реакции гиперчувствительности замедленного типа по сравнению с животными с ЭАЭ, не получавшими яд.

5. Апитоксин облегчает клиническое течение экспериментального аллергического энцефаломиелита у крыс и способствует более быстрому регрессу неврологических расстройств.

6. Апитоксин уменьшает демиелинизацию нервных волокон в центральной и периферической нервной системе.

7. Полученные данные позволяют экспериментально обосновать целесообразность применения апитоксина в терапии демиелинизирую-щих заболеваний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. The possibility of bee venom usage in comj lex with other methods in multiple sclerosis treatment // Journal of neuroimmunology/ Abstracts of the 1 llh Congress of ECTRIMS Jerusalem,1995/et Ebert L„ Krivopalov I.- p.64.

2. Possibilities of applying apytoxin to correction of EAE. // European journal of neurology. Abstracts of the 12"1 Congress of ECTRIMS. Copenhagen, 1996 / et Ebert L., Krivopalov I.-p. 28.

3. Об эффектах апитоксина на системы крови и иммунитета и возможность его использования при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите.//Материалы юбилейной научно-практической конференции, посвященной 60-летию МГКБ№4. Челябинск, 1996/Соавт. Кри-вопалов И.В.

4. On the effect of apytoxin on the blood and immune system in rats with EAE.//Journal of the neurological sciences. Abstracts of the XVI World Congress of neurology. Buenos Aires,1997/et Krivopalov I., P.50.

5. Apytherapy in the rehabilitation of patients with MS.// Journal of the neurological sciences. Abstracts of the XVI World Congress of neurology. Buenos Aires, 1997. P.264.

6. Apytoxin effects on neytrophils production in the rats with EAE. // Abstracts of the 13th Congress of ECTRIMS, Istanbul, 1997/ et Krivopalov I. P-327.

7. The experience ofjointy application of apytoxin and betaferon in the treatment of MS. // Abstracts of the 14th Congress of ECTRIMS, Stockholm, 1998. P-379.