Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние температуры на пуринорецептор-опосредуемые сократительные ответы гладкой и сердечной мышц

На правах рукописи

Рынков Алексеи Владимирович

ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА ПУРИНОРЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДУЕМЫЕ СОКРАТИТЕЛЬНЫЕ ОТВЕТЫ ГЛАДКОЙ И СЕРДЕЧНОЙ МЫШЦ

14 00 25 - фармакология, клиническая фармакология 14 00 16 - патофизиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

КАЗАНЬ-2007 о /

1 4 МАИ 2007

003059981

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Зиганшин Айрат Усманович доктор медицинских наук, профессор Джорджикия Роин Кондратьевич

Официальные оппоненты:

кандидат медицинских наук, доцент Хазиахметова Вероника Николаевна доктор медицинских наук, профессор Бойчук Сергей Васильевич

Ведущая организация:

НИИ Фармакологии им В В Закусова РАМН

Защита состоится « 17 » мая 2007 г в 10 00 на заседании диссертационного совета Д 208 034 01 при ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Казань, ул Бутлерова, д 49

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Казань, ул Бутлерова, д 49 Б

Автореферат разослан «_» апреля 2007 г

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Нигматуллина Р Р

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

А ктуалыюсть исследования

Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды вовлечены в регуляцию многих физиологических функции в организме млекопитающих, опосредуя свои эффекты через чувствительные к ним Р2-рецепторы (Burnstock G , Knight G , 2004, Burnstock G, 2006a) Помимо физиологической роли Р2-рецепторов, установлено их участие в ряде патофизиологических реакций вазоспазм, тромбоз, боль, воспаление (Spedding M , Williams РЛ , 1996, Jacobson К А , Jarvis MF, 1997, Burnstock G, 2006b) Исследование Р2-рецепторов в большинстве случаев проводится в физиологических условиях, однако, известно, что изменение некоторых параметров эксперимента может привести к существенному изменению Р2-опосредуемых ответов тканей, например, при снижении pH среды значительно возрастает эффективность ответов, опосредуемых Р2Х2 рецепторами (King В et al, 1996)

В клинической медицине для лечения ряда заболеваний часто искусственно создаются условия, отличающиеся от физиологических В кардиохирургии во время операций на открытом сердце используется метод искусственного кровообращения в режиме гипотермии Целью гипотермии является повышение резистентности тканей и органов к неизбежно возникающей во время операции ишемии (Тимофеев H H , 1983) С началом искусственного кровообращения кровь подвергается ряду механических и физико-химических воздействий со стороны экстракорпорального контура аппарата искусственного кровообращения, что вызывает травму форменных элементов крови и выход большого количества биологически активных веществ в плазму, в том числе, пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, которые в большом количестве содержатся в эритроцитах (Gordon J L , 1986, Fori ester T , 1990, Ellsworth M L , 1995) Это ведет к активации каскада реакций, вызывающих системный воспалительный ответ, а гипотермический режим лишь усугубляет тяжесть реакции, приводя к клинической картине «перфузионного шока» и являясь причиной осложнений или смерти больных в интраоперационном и раннем послеоперационном периодах (Меньшугин И H , 1998)

В литературе имеются сведения об изменении чувствительности некоторых подтипов пуринорецепторов в тканях животных при изменении

температуры (Kenneth J , et al, 1985, Hansen T H et ail, 1997, Wiley J S , 1998,

L 1

Tominaga M, et all, 2001), однако, до начала наших исследований не было проведено системного анализа влияния температурного фактора на Р2-рецептор-опосредуемые ответы Кроме того, отсутствуют работы, где в качестве объекта исследования были бы использованы ткани человека

Работа выполнялась при финансовой поддержке совместного гранта РФФИ - Республика Татарстан № 03-04-96246

Целью настоящего исследования было изучение влияния гипотермии на эффективность пуринорецептор-опосредуемых ответов сердечной мышцы человека и гладких мышц морской свинки Задачи исследования:

1 Оценить изменение чувствительности Р2Х рецепторов мочевого пузыря и семявыносящего протока морской свинки при гипотермии и гипертермии

2 Оценить изменение чувствительности P2Y рецепторов продольной мышцы слепой кишки морской свинки при гипотермии и гипертермии

3 Провести анализ влияния гипотермии на изменение сократительных ответов изолированного ушка правого предсердия человека, опосредованных Р2-рецепторами у пациентов с дефектом межпредсердной перегородки и больных с ревматическим пороком митрального клапана

4 Провести анализ антагонистического эффекта пиридоксальфосфат-6-азофенил-2',4'-дисульфоновой кислоты при изменении температуры, на изолированных тканях мочевого пузыря, семявыносящего протока, продольной мышцы спелой кишки морской свинки и изолированного ушка правого предсердия человека

5 Исследовать наличие Р2-рецепторов изолированного ушка правого предсердия сердца человека методом иммуногистохимического анализа

Научная новизна

Впервые установлено, что при понижении температуры среды до 30°С сократительные ответы мочевого пузыря и семявыносящего протока морской свинки, опосредуемые Р2Х-рецепторами, становятся достоверно более сильными, чем при нормальной температуре При повышении температуры до 42°С эти сократительные ответы либо остаются такими же, как при нормальной температуре, либо несколько понижаются

Впервые показано, что при понижении температуры среды до 30°С P2Y-рецептор-опосредуемое расслабление продольной мышцы слепой кишки

морской свинки, вызванное электрической стимуляцией, достоверно усиливается по сравнению с таковой при нормальной температуре При повышении температуры среды до 42°С расслабление этой ткани достоверно не отличается от соответствующих значений при нормальной температуре Как понижение, так и повышение температуры существенно не влияет на Р2У-рецептор-опосредуемую релаксацию продольной мышцы слепой кишки морской свинки, вызванную экзогенной аденозин-5'-трифосфорной кислотой (АТФ)

В экспериментах на изолированных мышечных препаратах ушка правого предсердия человека впервые установлено, что экзогенные АТФ и уридин-5'-трифосфорная кислота (УТФ), как при нормальной, так и при пониженной температуре, снижают амплитуду сокращений изолированного ушка правого предсердия человека, вызванных электрической стимуляцией При этом угнетающий эффект АТФ достоверно более выражен в условиях гипотермии, тогда как эффект УТФ не изменяется при понижении температуры

В экспериментах на изолированных тканях мочевого пузыря, семявыносящего протока, продольной мышцы слепой кишки морской свинки и изолированного ушка правого предсердия человека впервые установлено, что эффективность антагонистического действия пиридоксальфосфат-6-азофенил-2',4'-дисульфоновой кислоты (РРАЭБ) по отношению к Р2Х и Р2У-рецепторам сохраняется при изменениях температуры среды в пределах 30-42°С

Методом иммуногистохимического анализа впервые установлено наличие нескольких подтипов Р2 рецепторов в ткани ушка правого предсердия человека

Научно-практическая значимость работы

Выявленное нами повышение эффективности Р2-рецептор-опосредованных ответов при пониженной температуре является особенностью, которую важно учитывать при исследовании функциональной активности этих рецепторов Установленное повышение чувствительности Р2 рецепторов в ушке правого предсердия человека к действию экзогенных агонистов позволяет предполагать большую фармакологическую активность лекарственных препаратов, являющихся пуриновыми нуклеозидами и нуклеотидами, при применении их в условиях гипотермии

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Чувствительность Р2Х рецепторов мочевого пузыря и семявыносящего протока морской свинки повышается в ответ на действие эндогенных и экзогенных агонистов при понижении температуры

2 Чувствительность Р2У рецепторов продольной мышцы слепой кишки морской свинки повышается в ответ на действие эндогенных агонистов при понижении температуры

3 В миокарде человека имеются Р2 рецепторы, чувствительность которых к действию экзогенной АТФ повышается в условиях гипотермии

Апробация работы

Результаты работы и основные положения диссертации были доложены и обсуждены на VII ежегодной сессии научного центра сердечно-сосудистой хирургии им А Н Бакулева РАМН (Москва, 2003), 2-ом съезде Российского научного общества фармакологов (Москва, 2003), научной конференции, посвященной 40-летию Центральной научно-исследовательской лаборатории КГМУ (Казань, 2002), ежегодной конференции молодых ученых КГМУ (Казань, 2002, 2003)

Публикация результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 127 источников, из которых 33 отечественных, и приложения Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 59 рисунками, 15 таблицами

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фармакологические эксперименты

Эксперименты проведены на изолированных гладкомышечных тканях 57 морских свинок-самцов, а также тканях ушка правого предсердия человека, полученных интраоперационно при осуществлении кардиохирургических вмешательств у 34 больных

Из тканей мочевого пузыря, семявыносящего протока и продольного тяжа слепой кишки морских свинок, а также ушка правого предсердия человека готовили мышечные препараты, механическую активность которых оценивали с использованием стандартных термостатируемых стаканчиков для изолированных тканей и электронных изометрических датчиков Запись результатов экспериментов производили на компьютере с помощью специальной программы (MP 100WSW, Data Acquisition System) и интерфейса, разработанного фирмой Biopack (Великобритания) Температурный режим экспериментов обеспечивался нагревающим насосом Techne ТЕ-8А (Великобритания), меняя температуру обогревающей стаканчик жидкости

На тканях мочевого пузыря и семявыносящего протока морской свинки оценивали сократительные ответы на a.ß-метилен-ЛТФ в концентрациях 0,01-30 цМ и на стимуляцию электрическим полем (СЭП, 100 В, 0 5 мс, 1-64 Гц) в присутствии атропина (1 цМ) и фентоламина (3 цМ) В экспериментах на продольной мышце слепой кишки расслабление ткани оценивали на АТФ (1-100 цМ) и на СЭП (100 В, 0 5 мс, 0,5-8 Гц) на фоне тонического действия карбахолина (1-3 цМ) Эксперименты всегда начинали исследованием механической активности тканей при температуре 37°С, затем в половине опытов температуру омывающего раствора снижали до 30°С, а в другой половине повышали до 42°С Ткань адаптировалась к выбранной температуре в течение 10-15 минут, после чего повторно регистрировали механические ответы на агонист и на СЭП Эффект пиридоксальфосфат-6-азофенил-2',4'-дисулъфоновой кислоты (PPADS, 1-30 цМ) на агонисты и СЭП оценивали до и после инкубации тканей с PPADS в течение 25 минут

Более подробно методика фармакологического исследования на тканях морской свинки была описана нами ранее (Зиганшин А У и др , 2000, 2001, Ziganshin AU et al, 2002)

Ушко правого предсердия для фармакологических исследований забиралось у больных, поступивших в течение 2003-2004 годов в Центр сердечно-сосудистой хирургии им Н П Медведева (г Казань) для проведения плановых кардиохирургических операций Оценивали наличие или отсутствие субъективных и объективных признаков хронической сердечной недостаточности, на основании чего нами было выделено две группы пациентов Первая группа - без явлений хронической сердечной недостаточности, в нее

вошли 16 пациентов с дефектом межпредсердной перегородки, средний возраст пациентов был 13,3 года Вторую группу составили пациенты с ревматическим поражением митрального клапана, у которых имелась хроническая сердечная недостаточность 1 и ПА стадии В нее вошло 18 пациентов, средний возраст -47,7 лет Ушко правого предсердия забиралось во время операций - коррекции дефекта межпредсердной перегородки (1 группа) и коррекции ревматического порока митрального клапана (2 группа) при подключении аппарата искусственного кровообращения Из ушка готовили мышечные препараты и дальнейший ход эксперимента и запись результатов производили аналогично экспериментам с тканями морской свинки Особенностью было то, что после адаптации мышечного препарата к условиям эксперимента, электростимулятором задавался постоянный ритм сокращений с частотой 1,4 Гц Изменение амплитуды сокращений в ответ на норадреналин (1-100 рМ), АТФ (0 1-1000 цМ) и УТФ (1-1000 рМ) регистрировали при температурах 37°С и 30°С Влияние антагонистов PPADS (30 рМ) и 8-сульфофенилтеофиллин (8-SPT, 30 рМ) на эффекты АТФ и УТФ оценивали до и после инкубации тканей с антагонистами в течение 25 минут

Результаты фармакологических опытов статистически обработаны с использованием критерия / Стьюдента для связанных и несвязанных величин и дисперсионного анализа (ANOVA - тест) Достоверной считали разницу при Р < 0 05

В большинстве экспериментов в качестве основного критерия эффективности агониста использовали величину pD2 - отрицательный десятичный логарифм молярной концентрации агониста, вызывающей половину максимального эффекта В тех случаях, когда не удавалось достичь максимального эффекта агониста, максимальным эффектом условно считался эффект агониста в наибольшей использованной концентрации Иммуногистохимические исследования

Для оценки присутствия в ушке предсердия Р2 рецепторов использовали иммунофлюоресцентный метод исследования криостатных срезов

Сразу после забора ушко тщательно промывалось для удаления остатков крови и погружалось в фиксирующий раствор (4% раствор параформальдегида в фосфатном буфере) После фиксации ткань замораживали в жидком азоте и из замороженных тканей готовили срезы толщиной 12 микрометров, используя

криостатный микротом (Reichert Jung CM 1800, Германия) Срезы наносили на желатинизированные предметные стекла, которые хранили в морозильной камере при -20°С до проведения иммуногистохимического анализа

Срезы инкубировали в течение 14-16 часов с первичными антителами против Р2Х,-Р2Х4 и P2Yb P2Y2, P2Y4 рецепторов (Roche Bioscience Polo Alto, США), поскольку именно эти подтипы Р2 рецепторов чаще всего встречаются в сердечно-сосудистой системе В контроле срезы инкубировали с 10% раствором нормальной лошадиной сыворотки без каких-либо первичных антител После отмывки избытка первичных антител, срезы инкубировали со вторичными антителами (Oregon Green, Jackson Immunoresearch Laboratories, США), конъюгированными с флюрохромом, дающим ярко зеленое свечение под флюоресцентным микроскопом Микроскопирование срезов проводили, используя флюоресцентный микроскоп Zeiss Axioplan (Zeiss, Германия) Фотографирование проводили при помощи цифрового фотоаппарата Nikon CoolPix 990 (Япония)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Эксперименты на тканях морской свинки

а,р-Метилен-АТФ в концентрациях 0 01-30 цМ вызывала концентрационно-зависнмые сократительные ответы изолированных препаратов мочевого пузыря морской свинки при всех используемых температурных режимах При этом, сокращения, вызываемые а,р-метилен-АТФ при температуре 30°С, были значительно выше таковых при 37°С, что проявилось смещением влево кривои «концентрация-эффект» на графике (Рис 1, А) Повышение температуры до 42°С несколько снижало сократительные ответы ткани на а$-метилен-АТФ по сравнению с таковыми при 37°С Величина pD? (отрицательный десятичный логарифм молярной концентрации агониста, вызывающей половину максимального эффекта) для а,р-метилен-АТФ на этой ткани составила 6 68±0 11 % (п=8), 6 24±0 10 % (п=14) и 5 91±0 08 % (п=6) при 30°С, 37°С и 42°С соответственно (все значения достоверно отличаются друг от друга) Стимуляция электрическим полем (СЭП) вызывала частото-зависимые сократительные ответы мочевого пузыря при всех исследованных температурах Снижение температуры среды до 30°С приводило к сдвигу кривой «частота-эффект» влево (Рис 1, В) При повышении температуры до 42°С сократительные

ответы мочевого пузыря на СЭП были заметно слабее, чем при двух других температурах Величина ^(ЕР5о) (десятичный логарифм частоты стимуляции, вызывающей половину максимального эффекта) составила О 36±0 15 % (п=10), О 60±0 03 % (п=13) и 0 59±0 04 % (п=14) при 30°С, 37°С и 42°С соответственно, различия с показателями при 30°С достоверны

-log[a,p-meATP, М] log2(Hz)

Рис 1 Сократительные ответы изолированного мочевого пузыря морской свинки вызванные а р-метилен-АТФ (А) и стимуляцией электрическим полем в присутствие атропина и фентолачина (В), зарегистрированные при температурах 30°С, 37°С и 42°С п = 8-14 * - Р<0 05

На изолированных гладкомышечных препаратах семявыносящего протока морской свинки сокращения, вызываемые а,(3-метилен-АТФ при температуре 30°С, были значительно выше сокращений при 37°С, что отражалось смещением кривой влево на графике «концентрация - ответ» Повышение температуры до 42°С существенно не изменяло сократительные ответы ткани семявыносящего протока на а,р-метилен-АТФ по сравнению с таковыми при 37°С (Рис 2, А) Величина pD2 для а,р-метилен-АТФ на этой ткани составила 6 28±0 08 % (п=8), 5 57±0 14 % (п=8) и 5 58±0 11 % (п=6) при температурах 30°С, 37°С и 42°С, соответственно, первое значение достоверно отличается от двух последних СЭП вызывает сократительные ответы изолированного семявыносящего протока морской свинки, которые при снижении температуры среды до 30°С становились значительно выше сокращений при 37°С (Рис 2, В) При температуре 42°С ответы этой ткани на электростимуляцию в основном достоверно не отличались от сокращений при 37°С Однако, величины log(EF50), вычисленные при температурах 30°С, 37°С и 42°С, достоверно отличались друг от друга, составляя соответственно 0 84±0 09 % (n=10), 1 13±0 05 % (п=14) и 1 30±0 06 % (п=12)

-Iog[a,p-meATP, M] log2(Hz)

Рис 2 Сократительные ответы (полированного семявыносящего протока морской свинки вызванные а.р-метилен-АТФ (А) и стимуляцией электрическим полем в присутствие атропина и фентоламина (В), зарегистрированные при температурах 30°С, 37°С и 42°С п = 6-14, * - Р<0 05

Используемые температурные режимы не оказывали значительного влияния на сократительные ответы продольной мышцы слепой кишки морской свинки, вызываемые карбахолином, которые составили 4 87±0 67 г (п=12),

5 11±0 56 г (п=20), 5 21±0 73 г (п=12) при температурах 30°С, 37°С и 42°С, соответственно (Р>0 05) При температуре 37°С, АТФ вызывала концентрационно-зависимое расслабление продольной мышцы слепой кишки, вызванной карбахолином, которое приближалось к максимальному расслаблению при наибольшей используемой концентрации агониста - 10"'М Уменьшение до 30°С или увеличение до 42°С температуры среды не влияло на ответы, вызываемые АТФ и, таким образом, кривые «концентрация - ответ» для этого агониста как при 30°С, так и при 42°С, совпадали с кривой «концентрация -ответ» при температуре 37°С (Рис 3, А) Величина pD2 для АТФ составила

6 15±0 39 (п=12), 6 14±0 38 (п=24) и 6 38±0 24 (п= 12) при температурах 30°С, 37°С и 42°С, соответственно, все эти значения достоверно не отличаются друг от друга В экспериментах с СЭП при температуре 37°С, электрические импульсы частотами 0.5, 1, 2, 4, 8 Гц вызывали зависимое от частоты расслабление ткани продольной мышцы слепой кишки морской свинки Снижение температуры среды до 30°С достоверно увеличивало расслабления ткани при всех используемых частотах, тогда как повышение температуры до 42°С уменьшало расслабление тканей на электростимуляцию (Рис 3, В) Величина log(EP50) составила -1 06±0 21 % (п=12), -0 48±0 17 % (п=12) и -0 11 ±0 09 % (п=12) при температурах 30°С, 37°С и 42°С, соответственно, все эти значения достоверно отличаются друг от друга

SO-

100-1

500-

- log [AT?. Mj

logz(Hz)

Рис. 3. Расслабление к зрбахол-го визирован но го продольного тяжа слепой кишки морской свинки, вызванное АТФ (А) и стимуляцией электрическим полем (В) при температурах, зарегистрированные при температурах 30Х', 37°С и 42"С, [1о оси ординат - % от максимального расслабления, п - 12-24, * - Р<0 05

Антагонист Р2 рецепторов РРАОЗ вызывал концентрацпощо-зависимое угнетение сократительных ответов изолированных гладкомышечпых препаратов мочевого пузыря и еем я вы носящего протока морской свинки, вызванных как мстилен-АТФ, так и СЭП (Рис. 4 и 5). Антагонизм РРАПв по отношению к этим сократительным ответам одинаково хорошо проявлялся при температурах 30°С, 37°С и 42°С.

-Метилен-АТФ, 10 - М

СЭП, 8 Ги

■ Ccrcci Ш PPADS1 рМ ЕЗРРАОЗЗдМ ESSPPADS 10 |iM

шрракзм

50-1

40-

30-*

20-

10-1

30

37

42

Рис 4 Сократительные ответы изолированного мочевого пузыря морской спннки на a.ß-метн.чсн-АТФ в концентрации I0'5 М и стимуляцию электрическим полем (СЭП) частотой 8 Гц, зарегистрированные при температурах JÖ°C. 37°С и 42°С в присутствие различных концентраций PPADS (1о оси ординат - "/• от сокращения на 240 mM KCl. по оси абсцисс - температура среды.

а,ß-Метилен-АТФ, 10-i М

СЭП, 8 Гц

Рис. 5. Сократительные ответы семи в вносящего притока морской свинки на а.р-метнлсн-АТФ в концентрации 10 М и стимуляцию электрическим полем (С'ЗП) частотой К Гц, зарегистрированные при температурах 30°С, 37"С и 42°С в присутствие различных концентраций PPADS. Г1о оси орлннат -% от сокращения на 240 mM KCl, по оси абсцисс - температура среды.

13 продольной мышие слепой кишки морской свинки PPADS, даже, в наибольшей из использованных концентрации (30 цМ) достоверно не изменяла эффективность расслабляющего действия АТФ или СЭП при всех трех использованных температурных режимах (Рис. 6).

АТФ, 10SM СЭП, 2 Гц

Рис. 6, Расслабление карбахол-тонпзиронанного продольного тяжа слепой кишки морской свинки на АТФ к концентрации 10-5 М и электрическую стимуляцию частотой 2 Гц при температурах 30°С, 37"С и 42°С в присутствие РРАИК в концентрации 30 рМ. По пси ординат - % от максимального расслабления, по оси абсцисс - температура среды

2. Фармакологические эксперименты на ушке правого предсердия человека

Норадреналин а концентрациях 1-100 рМ вызывал увеличение амплитуды сокращений изолированного ушка правого предсердия, полученных как от больных с дефектом межпредсердной перегородки (ДМПГ1), так и

ревматическим пороком митрального клапана (РПМК) При этом в обеих группах тонизирующее действие норадреналина проявлялось в достоверно большей степени при нормальной температуре (37°С), чем при температуре 30°С (Рис 7) Сравнение двух групп показало, что при нормальной температуре (37°С) эффективность норадреналина в концентрации 10 цМ значительно выше в фуппе с РПМК, чем в группе с ДМПП, тогда как при температуре 30°С та же концентрация норадреналина вызывает несколько более значительные сокращения в группе с ДМПП по сравнению с РПМК

ДМПП РПМК

10007505002500-

10001

-*-37°с тан -н-зсРс

500250-О-

—а

-т—

•6

-5

-т—

■4

1од[НА,М!

1од[НЛМ1

Рис 7 Изменения сократитетыюп активности изолированного ушка правого предсердия, вызванные норадреналином (НА), при температурах 37°С и 30°С в группах больных с дефектом межпредсердноГ! перегородки (ДМПП) и ревматическим пороком митрального клапана (РПМК) По оси ординат - % увеличения амплитуды сокращений от исходного уровня п = 4-13 * - Р<0 05

АТФ в концентрациях 10"7-10"3М в обеих группах больных вызывала концентрационно-зависимое угнетение амплитуды сокращений изолированного ушка правого предсердия, как при температуре 37°С, так и при температуре 30°С При этом, эффективность угнетающего действия АТФ при обеих температурах была более выражена в группе больных с ДМПП, чем РПМК (Рис 8) Кроме того, в обеих группах при температуре 30°С угнетение амплитуды сокращений было достоверно более выражено, чем при 37°С

УТФ при температурах 37°С и 30°С оказывала некоторое угнетающее действие на величину сокращений изолированного ушка правого предсердия в обеих группах больных (Рис 9) Достоверных различий в угнетающем действии УТФ на сократительные ответы ушка правого предсердия не было выявлено ни

при сравнении его эффекта при разных температурах, ни при сравнении двух групп больных

ДМПП РПМК

О-

25-Н> 75100

-г-

-7

-1-1-г-

-6-5-4

1од[АТР,1Ч

-в-зсРс

—г-

-3

—г-

-6

-Г—

-5

—г-

-4

-т*

-3

1од[АТР,1У1

Рис 8 Изменения сократительной активности изолированного ушка правого предсердия вызванные АТФ, при температурах 37°С и 30°С в группах бочьных с дефектом межпредсердной перегородки (ДМПП) и ревматическим пороком митрального клапана (РПМК) По оси ординат - % снижения амтитуды сокращений от исходного уровня п = 5-16 * - Р<0 05

ДМПП

РПМК

10

2У

—I—

-6

0п

10-

2(Я

-5 -4 1одГУТСЕ;Гуз

-т-

-6

-5 А

1од[УТФ,1У1

Рис 9 Изменения сократительной активности изозированного ушка правого предсердия вызванные УТФ, при температурах 37°С и 30°С в группах больных с дефектом межпредсердной перегородки (ДМПП) и ревматическим пороком митрального клапана (РПМК) По оси ординат - % снижения ампчитуды сокращений от исходного уровня п = 4-9

Антагонист Р2-рецепторов РРАББ в концентрации 30 (дМ вызывал ослабление угнетающего эффекта АТФ на сокращения изолированного ушка правого предсердия в группе больных с ДМПП при обеих исследованных

температурах (Рис 10) При этом при температуре 30°С антагонистическая эффективность РРАОБ была существенно более выражена, чем при температуре 37°С

37°С

30°С

о-10

20 3040-

—I—

-6

-й- РРЮ&+АТФ -В-АТФ

-5 -4

!од[АТФ, IV!

°1 20-

любого-

-г-

-6

-5 А

1од[АТФ, IV!

Рис 10 Изменения сократительной активности изолированного ушка правого предсердия, вызванные АТФ, при температурах 37°С и 30°С в группе больных с дефектом межпредсердной перегородки на фоне РРАОЬ в концентрации 30 цМ По оси ординат - % снижения амплитуды сокращении от исходного уровня п = 4, * - Р<0 05

В группе больных с РПМК РРАЭБ не проявил сколь-нибудь значимого антагонизма по отношению к угнетающему действию АТФ на сокращения изолированного ушка правого предсердия ни при одной из исследованных температур (Рис 11)

о ю 20-ЭО 40

т-

-6

37°С

-г-

-5

-г-

-4

1од[АТФ, IV!

-В-АТФ -й- РРАС&-АТФ

т-

-3

25-

50-

7£Н

-г-

-6

30°С

—г-

-5

1од[АТФ, IV!

Рис 11 Изменения сократительной активности изолированного ушка правого предсердия, вызванные АТФ, при температурах 37°С и 30°С в группе больных с ревматическим пороком митрального клапана на фоне РРАЭБ в концентрации 30 цМ По оси ординат - % снижения амплитуды сокращений от исходного уровня, п = 4

Антагонист аденозиновых рецепторов 8-!ЗРТ в концентрации 10 цМ вызывал ослабление угнетающего эффекта АТФ на сокращения изолированного ушка правого предсердия в группе больных с ДМПП при обеих исследованных температурах (Рис 12) При этом антагонистическое действие 8-БРТ не проявлялось при использовании АТФ в наивысшей концентрации - 100 цМ

37°С ЗОРС

—1-1-1 I —I--1-1-г~

-6-54-3 -6-54-3

kxfATti IVJ кзд[АТФ, IV)

Рис 12 Изменения сократительной активности изозированного ушка правого предсердия вызванные АТФ при температурах 37°С и 30°С в группе больных с дефектом межпредсердной перегородки на фоне 8-SPT в концентрации 10 цМ По оси ординат - % снижения амгпигуды сочращений от исходного уровня п = 3, * - Р<0 05

В ipyrme больных с РПМК 8-SPT не проявил антагонизма по отношению к угнетающему действию АТФ на сокращения июлированного ушка правого предсердия ни при одной из исследованных температур

3. Иммуногистохамическое исследование ушка правого предсердия человека

Для проведения иммуногистохимических исследований был использован материал, полученный от больных с дефектом межпредсердной перегородки Из Р2Х рецепторов в ткани ушка правого предсердия человека была обнаружена невысокая плотность Р2Х, и Р2Х2 рецепторов, которые были относительно равномерно расположены по миокарду Существенной иммунореактивности по отношению к Р2Х3 и Р2Х4 рецепторам в исследованной ткани нам обнаружить не удалось P2Y рецепторы в исследуемом материале были представлены в определенной степени всеми исследованными нами подтипами -P2Yt, P2Y2 и P2Y4 В наибольшей степени в ушке правого предсердия была

выявлена иммунореактивность по отношению к Р2У4 подтипам рецепторов, которые преимущественно находились в мышечном слое

Таким образом, в результате проведенных исследований мы установили, что Р2Х рецептор-опосредуемые сократительные ответы мочевого пузыря и семявыносящего протока морской свинки значительно более выражены при гипотермии, чем при нормальной температуре Подобный результат был получен для Р2У-опосредуемой релаксации продольной мышцы слепой кишки морской свинки, вызванной электрической стимуляцией, хотя расслабление этой ткани на АТФ не были зависимы от температуры

Повышение эффективности Р2Х- и Р2У-рецептор-опосредуемых ответов, вызываемых электростимуляцией, при понижении температуры можно было бы объяснить снижением активности ферментов инактивирующих медиаторы, в частности экто-АТФазы и экто-нуклеотидазы, поскольку, было показано, что экто-АТФазная активность температуро-зависима и имеет оптимум активности в пределах 37°С для теплокровных животных (Зиганшин А У , Зиганшина Л Е , 1999) Однако это не может объяснить наши результаты с а,р-метилен-АТФ, который энзиматически стабилен и не является субстратом экто-АТФазной реакции Кроме того, мы не нашли какой-либо температурной зависимости в экспериментах с продольной мышцей слепой кишки морской свинки, когда мы использовали АТФ, которая довольно легко разрушается экто-АТФазами Поэтому, мы считаем, что повышенная чувствительность Р2 рецепторов при низкой температуре является особенностью самого рецептора и не зависит от экто-АТФазной активности

Интересным феноменом явилось то, что в продольной мышце слепой кишки ответы на электрическую стимуляцию были температуро-зависимыми, в то время как, расслабления, вызванные экзогенной АТФ, статистически не отличались при различных температурных режимах Хорошо известно, что АТФ высвобождается при электрической стимуляции продольной мышцы слепой кишки и действует на Р2У рецепторы (ВигпБШск в , 2001), но в этой ткани, по всей видимости, только пресинаптические механизмы передачи чувствительны к изменению температуры, в то время как, постсинаптические - нет

Важным обстоятельством явилось то, что антагонист Р2-рецепторов РРА05 не терял свой активности ни при низкой, ни при высокой температуре среды, проявляя свой эффект как в отношении экзогенных агонистов, так и при

стимуляции выброса эндогенных медиаторов раздражением ткани электрическим полем Кроме того, в этих экспериментах подтвердилась определенная селективность PPADS к Р2Х-рецепторам (Ziganshin A U et al, 1993, 1994), поскольку этот антагонист был инертен по отношению P2Y-рецептор-опосредованному расслаблению продольного тяжа слепой кишки морской свинки

Экзогенная АТФ вызывала отрицательный инотропный эффект в экспериментах на изолированных ушках правого предсердия обеих исследуемых групп больных Влияние АТФ было более выражено при пониженной температуре, чем при нормальной, что совпадает с результатами, полученными нами на тканях морской свинки При этом степень угнетающего действия АТФ была значительно выше в группе больных с ДМПП, чем в группе с РПМК Интересно, что эти группы отличались также по чувствительности к антагонистам аденозиновых и Р2-рецепторов - 8-SPT и PPADS частично снижали отрицательный инотропный эффект АТФ в группе больных с ДМПП, но достоверно не изменяли эффект этого агониста в группе больных с РПМК

Анализируя эффект АТФ и его взаимоотношения с антагонистами аденозиновых и Р2-рецепторов, можно предположить, что эффекты АТФ на ушке правого предсердия реализуются посредством как P2Y рецепторов, так и аденозиновых Aj рецепторов Известно, что аденозин, стимулируя аденозиновых Аь но не А2 рецепторы, вызывает отрицательный инотропный эффект (Collins and Hourani, 1993) Такое же действие описано и для экзогенной АТФ, эффект которой связывают с влиянием на определенные подтипы Р2У-рецепторов (Pelleg A et al, 1997, Vassort G , 2001) Наличие P2Y рецепторов в ушке правого предсердия было нами установлено при иммуногистохимическом исследовании

ВЫВОДЫ

1 Изменение темпера(уры влияет на выраженность механических ответов гладких мышц морской свинки и ушка правого предсердия человека, опосредованных Р2-рецепторами

2 При понижении температуры среды до 30°С сократительные ответы мочевого пузыря и семявыносяшего протока морской свинки, опосредуемые Р2Х-рецепторами, становятся достоверно более сильными, чем при нормальной температуре При повышении температуры до 42°С эти

сократительные ответы либо остаются такими же, как при нормальной температуре, либо несколько повышаются

3 При понижении температуры до 30°С Р2У-рецептор-опосредуемая релаксация продольной мышцы слепой кишки морской свинки, вызванная электрической стимуляцией, достоверно усиливается по сравнению с таковой при нормальной температуре При повышении температуры до 42°С расслабление этой ткани достоверно не отличается от соответствующих значений при нормальной температуре среды Как понижение, так и повышение температуры существенно не влияет на Р2 У-рецептор-опосредуемую релаксацию продольной мышцы слепой кишки морской свинки, вызванную АТФ

4 АТФ и УТФ, как при нормальной, так и при пониженной температуре, снижают амплитуду сокращений изолированного ушка правого предсердия человека, вызванных электрической стимуляцией Депрессивный эффект АТФ достоверно более выражен в условиях гипотермии, тогда как эффект УТФ не изменяется при изменении температуры

5 Угнетающее действие АТФ на сократимость изолированного ушка правого предсердия человека опосредуется частично Р2-рецепторами, а частично -Р1 (аденозиновыми) рецепторами

6 На изолированных тканях мочевого пузыря, семявыносящего протока, продольной мышцы слепой кишки морской свинки и изолированного правого ушка сердца человека эффективность антагонистического действия пиридоксальфосфат-6-азофенил-2',4'-дисульфоновой кислоты по отношению к Р2Х и Р2У-рецепторам остается постоянной при изменениях температуры среды в пределах 30-42°С

7 Иммуногистохимически установлено наличие нескольких подтипов Р2Х- и Р2У-рецепторов в ушке правого предсердия человека, в наибольшей степени в этой ткани выявляются Р2У4 рецепторы

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 При назначении лекарственных препаратов больным в состоянии искусственной гипотермии следует учитывать возможность изменения чувствительности рецепторов миокарда и гладкомышечных органов к этим препаратам

2 При снижении температуры среды чувствительность Р2-рецепторов к своим агонистам возрастает, что следует учитывать экспериментаторам, изучающим функциональную активность этих рецепторов

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ РАБОТ

1 Зиганшин А У Влияние температуры на сокращения мочевого пузыря морской свинки, опосредуемые Р2Х-рецепторами / А У Зиганшин, А В Рычков, Л Е Зиганшина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2000 -Т 130, № 10 -С 407-410

2 Температурная зависимость сокращений семявыносящего протока морской свинки, опосредуемых Р2Х рецепторами / А У Зиганшин, А В Рычков, J1 Е Зиганшина, А П Зайцев, Ж Ю Фалу, Д Ф Хазиахметов // Экспериментальная и клиническая фармакология -2001 -Т 64, №4 - С 27-30

3 Ziganshin A U Tempei ature dependency of Р2 receptor-mediated íesponses / A U Ziganshin, A V Rychkov, L E Zrganshina, G Burnstock // European Journal of Pharmacology -2002 -V456 -P 107-114

4 Зиганшин А У Влияние температуры на сокращения изолированных гладкомышечных тканей морской свинки / А У Зиганшин, А В Рычков // Тезисы итоговой конференции Республиканского конкурса научных работ им Н И Лобачевского - Казань КГУ, 2002 - Т 2 - С 83-84

5 Зиганшин А У Температурная зависимость ответов, опосредуемых P2Y рецепторами / А У Зиганшин, А В Рычков, Л Е Зиганшина // Сборник трудов конференции "Медико-биологические проблемы термофизиологии" - Минск, 2002 - С 77-79

6 Изучение Р2-рецептор-опосредуемы\ ответов в различных тканях человека и животных /ЮТ Зефирова, 3 Р Вафина, А П Зайцев, А В Рычков, ЖЮ Фалу, ДФ Хазиахметов, А У Зиганшин // Современные методы исследования в медицине и фармации Материалы научно-практической конференции, посвященной 40-летию ЦНИЛ КГМУ - Казань, 2002 - С 19-20

7 Харитонов Г И К вопросу о клинической значимости изменений содержания внеклеточной АТФ при искусственном кровообращении / Г И Харитонов, А В Рычков // Сердечно-сосудистые заболевания / Бюллетень НЦССХ им АН Бакулева РАМН - Москва, 2003 -Т 4, №6 -С 163

8 Рычков А В Усиление отрицательного инотропного эффекта пуринов при гипотермии // Сердечно-сосудистые заболевания Бюллетень НЦССХ им А Н Бакулева РАМН - Москва, 20СЗ - Т 4, №6 - С 248

9 Анализ роли Р2-рецептор-опосредуемы\ ответов в различных тканях человека и животных / А У Зиганшин, 3 Р Вафина, А П Зайцев, Ю Т Зефирова, Б А Зиганшин, А В Рычков, Ж Ю Фалу, Д Ф Хазиахметов // Фундаментальные проблемы фармакологии Сборник тезисов 2-го Съезда Российского научного общества фармакологов - Москва, 2003 -С 199

Подписано в печать 13 04 2007г Бумага офсетная 60x84/16 Ризограф! 1Я Объем 1 0 уел -печ л Тираж 100 Заказ № 37

420012 г Казань Бутлерова, 49 типография КГМУ

Актуальность исследования.

Внеклеточные эффекты пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов опосредуются через специальные, чувствительные к ним Р2 рецепторы, наличие которых доказано во многих тканях и органах животных и человека (Burnstock and Kennedy, 1985; Burnstock G., Knight G., 2004; Burnstock G., 2006a). Помимо физиологической роли P2 рецепторов, установлено их участие в ряде патофизиологических реакций: вазоспазм, тромбоз, боль, воспаление (Inoue К., 1996; Spedding М., Williams М., 1996; Jacobson К.A., Jarvis M.F., 1997; Burnstock G., 2006b). Большинство экспериментов по изучению Р2 рецепторов проводятся в физиологических условиях, однако, известно, что изменение некоторых параметров эксперимента может привести к изменению Р2-опосредуемых ответов тканей, например, при изменении рН (King В. et al., 1996).

В клинической медицине для лечения ряда заболеваний часто искусственно создаются условия, отличающиеся от физиологических. В кардиохирургии во время операций на открытом сердце используется метод искусственного кровообращения в режиме гипотермии. Таких операций в мире ежедневно выполняется более двух тысяч. Целью гипотермии является повышение резистентности тканей и органов к ишемии (Тимофеев Н.Н., 1983). С началом искусственного кровообращения кровь подвергается ряду механических и физико-химических воздействий со стороны экстракорпорального контура аппарата искусственного кровообращения, что вызывает травму форменных элементов крови и выход большого количества биологически активных веществ в плазму, в том числе, пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, которые в большом количестве содержатся в эритроцитах (Gordon J.L., 1986; Forrester Т., 1990; Ellsworth M.L., 1995). Это ведёт к активации каскада реакций, вызывающих системный воспалительный ответ, а гипотермический режим лишь усугубляет тяжесть реакции, приводя к клинической картине «перфузионного шока» и являясь причиной осложнений или смерти больных в интраоперационном и раннем послеоперационном периодах (Менынугин И.Н., 1998).

Согласно теории Дж. Бернстока, пуринорецепторы являются наиболее древними в эволюции, и их роль более выражена у простейших и у холоднокровных животных, чем у теплокровных. Однако, возможно, что при создании условий пониженной температуры у теплокровных животных и человека их влияние на физиологические и патофизиологические процессы будет более выражено (Burnstock G., 1972).

Имеются литературные данные об изменении чувствительности некоторых подтипов пуринорецепторов в тканях животных при изменении температуры (Kenneth J., et al., 1985; Hansen Т.Н. et all., 1997; Wiley J.S., 1998; Tominaga M., et all., 2001), однако, нет подобных работ, где в качестве материала были бы использованы ткани человека. Учитывая широкое распространение Р2 рецепторов в тканях млекопитающих и человека, появление лекарственных препаратов, действующих на Р2 рецепторы, использование гипотермии в медицине, актуальным является изучение чувствительности Р2 рецепторов тканей как животных, так и человека в условиях гипотермии.

Целью настоящего исследования было изучение влияния гипотермии на эффективность пуринорецептор-опосредуемых ответов сердечной мышцы человека и гладких мышц морской свинки. Задачи исследования:

1. Оценить изменение Р2Х-рецептор-опосредуемых сокращений мочевого пузыря и семявыносящего протока морской свинки при гипотермии и гипертермии.

2. Оценить изменение Р2У-рецептор-опосредуемых ответов продольной мышцы слепой кишки морской свинки при гипотермии и гипертермии.

3. Провести анализ влияния гипотермии на изменение сократительных ответов изолированного ушка правого предсердия человека, опосредованных Р2 рецепторами у пациентов с дефектом межпредсердной перегородки и больных с ревматическим пороком митрального клапана.

4. Провести анализ антагонистического эффекта пиридоксальфосфат-6азофенил-2',4'-дисульфоновой кислоты при изменении температуры, на изолированных тканях мочевого пузыря, семявыносящего протока, продольной мышцы слепой кишки морской свинки и изолированного ушка правого предсердия человека.

5. Исследовать наличие Р2 рецепторов изолированного ушка правого предсердия сердца человека методом иммуногистохимического анализа. Научная новизна

Впервые установлено, что при понижении температуры среды до 30°С сократительные ответы мочевого пузыря и семявыносящего протока морской свинки, опосредуемые Р2Х-рецепторами, становятся достоверно более сильными, чем при нормальной температуре. При повышении температуры до 42°С эти сократительные ответы либо остаются такими же, как при нормальной температуре, либо несколько повышаются.

Впервые показано, что при понижении температуры среды до 30°С P2Y-рецептор-опосредуемое расслабление продольной мышцы слепой кишки морской свинки, вызванное электрической стимуляцией, достоверно усиливается по сравнению с таковой при нормальной температуре. При повышении температуры среды до 42°С расслабление этой ткани достоверно не отличается от соответствующих значений при нормальной температуре. Как понижение, так и повышение температуры существенно не влияет на P2Y-опосредуемую релаксацию продольной мышцы слепой кишки морской свинки, вызванную экзогенной аденозин-5'-трифосфорной кислотой (АТФ).

В экспериментах на изолированных мышечных препаратах ушка правого предсердия человека впервые установлено, что экзогенные АТФ и уридин-5'-трифосфорная кислота (УТФ), как при нормальной, так и при пониженной температуре, снижают амплитуду сокращений изолированного ушка правого предсердия человека, вызванных электрической стимуляцией. При этом угнетающий эффект АТФ достоверно более выражен в условиях гипотермии, тогда как эффект УТФ остается постоянным при изменении температуры

В экспериментах на изолированных тканях мочевого пузыря, семявыносящего протока, продольной мышцы слепой кишки морской свинки и изолированного ушка правого предсердия человека впервые установлено, что эффективность антагонистического действия пиридоксальфосфат-6-азофенил

2' ,4 '-дисульфоновой кислоты (PPADS) по отношению к Р2Х и Р2У-рецепторам сохраняется при изменениях температуры среды в пределах 30-42°С.

Методом иммуногистохимического анализа впервые установлено наличие нескольких подтипов Р2 рецепторов в ткани ушка правого предсердия человека. Научно-практическая значимость работы

Выявленное нами повышение эффективности Р2-рецептор-опосредованных ответов при пониженной температуре является особенностью, которую важно учитывать при исследовании функциональной активности этих рецепторов. Установленное повышение чувствительности Р2 рецепторов в ушке правого предсердия человека к действию экзогенных агонистов позволяет предполагать большую фармакологическую активность лекарственных препаратов, являющихся пуриновыми нуклеозидами и нуклеотидами, при применении их в условиях гипотермии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Р2Х-рецептор-опосредуемые сокращения мочевого пузыря и семявыносящего протока морской свинки повышаются в ответ на действие эндогенных и экзогенных агонистов при понижении температуры.

2. Р2У-рецептор-опосредуемые ответы продольной мышцы слепой кишки морской свинки повышаются в ответ на действие эндогенных агонистов при понижении температуры.

3. В ушке правого предсердия человека имеются Р2 рецепторы, чувствительность которых к действию экзогенной АТФ повышается в условиях гипотермии.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

6. ВЫВОДЫ.

1. Изменение температуры влияет на выраженность механических ответов гладких мышц морской свинки и ушка правого предсердия человека, опосредованных Р2-рецепторами.

2. При понижении температуры до 30°С сократительные ответы мочевого пузыря и семявыносящего протока морской свинки, опосредуемые Р2Х-рецепторами, становятся достоверно более сильными, чем при нормальной температуре. При повышении температуры до 42°С эти сократительные ответы либо остаются такими же, как при нормальной температуре окружающей среды, либо несколько повышаются.

3. При понижении температуры до 30°С Р2У-рецептор-опосредуемая релаксация продольной мышцы слепой кишки морской свинки, вызванная электрической стимуляцией, достоверно усиливается по сравнению с таковой при нормальной температуре. При повышении температуры до 42°С расслабление этой ткани достоверно не отличается от соответствующих значений при нормальной температуре окружающей среды. Как понижение, так и повышение температуры существенно не влияет на Р2У-рецептор-опосредуемую релаксацию продольной мышцы слепой кишки морской свинки, вызванную АТФ.

4. АТФ и УТФ, как при нормальной, так и при пониженной температуре, снижают амплитуду сокращений изолированного ушка правого предсердия человека, вызванных электрической стимуляцией. Депрессивный эффект АТФ достоверно более выражен в условиях гипотермии, тогда как эффект УТФ не изменяется при изменении температуры.

5. АТФ оказывает отрицательный инотропный эффект на сокращения изолированного ушка сердца человека, который реализуется в группе больных без признаков хронической сердечной недостаточности как через

Р2, так и через Р1 рецепторы, а в группе с явлениями хронической сердечной недостаточности - только посредством Р2 рецепторов.

6. На изолированных тканях мочевого пузыря, семявыносящего протока, продольной мышцы слепой кишки морской свинки и изолированного правого ушка сердца человека эффективность антагонистического действия пиридоксальфосфат-6-азофенил-2' ,4' -дисульфоновой кислоты по отношению к Р2Х и Р2У-рецепторам остается постоянной при изменениях температуры окружающей среды в пределах 30-42°С.

7. Иммуногистохимически установлено наличие нескольких подтипов Р2Х-и Р2У-рецепторов в ушке правого предсердия человека; в наибольшей степени в этой ткани выявляются Р2У4 рецепторы.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При назначении лекарственных препаратов больным в состоянии искусственной гипотермии следует учитывать возможность изменения чувствительности рецепторов миокарда и гладкомышечных органов к этим препаратам.

2. При снижении температуры среды Р2-рецептор-опосредуемые ответы тканей к своим агонистам возрастают, что следует учитывать экспериментаторам, изучающим функциональную активность этих рецепторов.