Влияние культур, обогащенных стволовыми клетками, на сперматогенез при экспериментальном двухстороннем крипторхизме

Охоботов, Дмитрий Александрович

Диссертации по медицине → Урология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.40) на тему:Влияние культур, обогащенных стволовыми клетками, на сперматогенез при экспериментальном двухстороннем крипторхизме

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Охоботов, Дмитрий Александрович Москва 2008 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.40

Автореферат диссертации по медицине на тему Влияние культур, обогащенных стволовыми клетками, на сперматогенез при экспериментальном двухстороннем крипторхизме

На правах рукописи

УДК 616.681 - 007.041 - 085.361 - 092.9

ОХОБОТОВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ВЛИЯНИЕ КУЛЬТУР, ОБОГАЩЕННЫХ СТВОЛОВЫМИ КЛЕТКАМИ, НА СПЕРМАТОГЕНЕЗ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ДВУХСТОРОННЕМ КРИПТОРХИЗМЕ.

14.00.40- Урология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003456381

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательский институт урологии» Росмедтехнологий Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Камалов Армаис Альбертович доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Сухих Геннадий Тихонович.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Борисов Владимир Викторович доктор медицинских наук, профессор Божедомов Владимир Александрович

Ведущее учреждение: Московский областной научно-клинический институт им.М.Ф. Владимирского

Защита состоится «16» декабря 2008 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.056.01 при ФГУ НИИ урологии Росмедтехнологий 105425, Москва, 3-я Парковая ул., дом 51.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ НИИ урологии Росмедтехнологий Москва, 3-я Парковая ул., дом 51. Автореферат разослан «_»_ 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.056.01 ФГУ НИИ Урологии Росмедтехнологий,

доктор медицинских наук Т. С. Перепанова

Актуальность темы

Во всем мире проблема инфсртильности имеет не только важное медицинское, но социальное значение. Демофафические показатели России и многих стран мира свидетельствуют об увеличении частоты инфсртильности у мужчин, достигающей в среднем о г 30 до 50 %. Доля «мужского» фактора бесплодия в общей доле бесплодных браков составляет по некоторым данным от 30 до 40 % (Божсдомов В.А., 2001, Тср-Аванесов Г.В., 2000)

По данным некоторых авторов за последние десятилетия во всем мире отмечается прогрессирующее снижение качества спермы у мужчин, обеспечивающее их фертильность. Так при анализе эякулята в фиксированной мужской популяции с 1973 по 1992 годы содержание сперматозоидов в эякуляте ежегодно снижалось на 2,1 % (Auger J., 1997). За последние полвека отмечалось снижение показателей спермограммы почти в 3 раза (Irvine S, 1996). Частота бесплодия в браке колеблется от 8-29%. По оценке специалистов, в Европе бесплодны около 10% супружеских пар, в США - 8-15%, в России от 8 до 17,5% и в настоящее время нет тенденции к сшгжснию (Кулаков В И., 2005).

На фертильность мужчин оказывают влияние различные социальные и демографические факторы, такие как загрязнение окружающей среды, стрессы, привычные интоксикации и другие (Курило Л.Ф., Гришина Е.М., 2006). Полнэтиологичносн. мужского бесплодия, сложность развития заболевания, функциональная взаимосвязь мужских гонад со всеми системами и органами, создают большие трудности в разработке адекватных методов лечения сперматогенеза (Тер-Аванесов Г.В., 2000).

В связи с увеличением числа бесплодных браков, на фоне увеличения доли мужского бесплодия, актуальной задачей на сегодняшний день, является разработка новых методов лечения инфсртильности у мужчин. В последние годы, появившиеся инновационные методики лечения, такие как нанотехнологии, генная инженерия, терапия стволовыми клетками, и успехи их применения, о которых периодически сообщается в мировой печати, заслуживают пристального внимания и могут рассматриваться в качестве перспективных методов для лечения мужского бесплодия. Имеются попытки применения культур, обогащенных различными видами стволовых клеток (сингснных, аутологичных и.т.д.) дчя восстановления фертильиости у мужчин, результаты которых часто являются предметом дискуссии и служат предметом дальнейшего изучения (Ogawa Т, et al., 2003, Shinohara Т., 2006).

Сперматогенез это процесс, осуществляющийся у мужчин на протяжении всей жизни. Обусловлен он делениями сперматогенных стволовых клеток, имеющих но некоторым

данным неограниченный потенциал деления (Russell L.D., 1990). Это предположение

основано на том, что эти клетки имеют высокий потенциал дифференцировки, самообновления, и быстрого деления.

Эффективность трансплантации, при пересадке культур, обогащенных сперматогенными стволовыми клетками у животных, в различных вариантах по разным данным, колеблется от 18 до 80% (Впп.^ег Я.Ь.,2002; №ко!ао.5 Б., 2004).

Большая разница в показателях, полученная при оценке результатов этих исследований, отсутствие стандартных методик выделения, культивирования трансплантации и оценки эффективности результатов обуславливает актуальность создания модели для изучения эффекта трансплантации обогащенными клеточными культурами или препаратами, содержащими стволовые клетки разных видов, а также для оценки возможности восстановления фертильности и безопасности такой процедуры.

На сегодняшний день публикации по этим вопросам единичны. Все вышеперечисленное определяет актуальность темы, как с научной, так и с практической точки зрения.

Цель исследования

Улучшение сперматогенеза у мужчин путем определения влияния ксенотрансплантации клеточных культур, обогащенных стволовыми клетками различных видов, при экспериментальном крипторхизме.

Задачи исследования

1. Определить степень нарушений, обратимости и восстановления процессов сперматогенеза на модели абдоминального двухстороннего крипторхизма у экспериментальных животных.

2. Изучить фертилыюсть экспериментальных животных на фоне сформированного двухстороннего абдоминального крипторхизма, оценить изменения и возможности восстановления после его устранения.

3. Оценить особенности клинического эффекта ксенотрансплантации культур, обогащенных стволовыми клетками различных видов на всех этапах эксперимента.

4. Исследовать воздействие ксенотрансплантации культур, обогащенных фетальными стволовыми и прогениторными клетками человека, на репродуктивную способность экспериментальных животных.

5. Сформулировать критерии эффективности ксенотрансплантации обогащенных клеточных культур при лечении инфертильности, обусловленной формированием абдоминального крипторхизма у экспериментальных животных.

Научная новизна

Доказано что гипогонадизм у крыс развивается вследствие непосредственного поражения тсстикулярной ткани при абдоминальном крипторхизме и характеризуется гипоплазией яичек, повышением уровней гонадотропинов в крови и снижением уровня общего тестостерона

Отмечено восстановление показателя фертильности при ксенотрансплантации культур, обогащенных человеческими фетальиыми прогениторными и стволовыми клетками разных групп в поздние сроки наблюдения.

Ксенотрансплантапия культур обогащенных стволовыми и прогениторными клетками у животных приводит к более быстрому и более полноценному восстановлению сперматогенеза и общего тестостерона в сравнении с контрольной группой.

Установлено, что нормальные показатели уровня общего тестостерона у крыс после трансплантации обогащенных клеточных культур обеспечиваются за счет гиперфункции имеющейся стабильной популяции клеток Лейдига, с признаками нормохромии ядер и средним количеством хромафинных зерен. Доказано, что при отсутствии лечения относительная нормализация уровней гонадотропинов и общего тестостерона обеспечивается, за счет количественных показателей гиперплазировшшой популяции клеток Лейдига, находящихся в выраженном функциональном напряжении.

Обосновано, что трансплантация обогащенных клеточных культур усиливает эффективность восстановления герминогенной и сперматогенной функции яичек.

Практическая значимость

Усовершенствована модель экспериментального двухстороннего абдоминального крипторхизма Изучены особенности повреждения и восстановления сперматогенеза у экспериментачьных животных на разных сроках. Установлены сроки восстановления фертилькосги и синтеза общего тестостерона у животных при экспериментальном крипторхизме. Разработана оптимальная техника тканевой трансплантации под капсулу яичка и доказана се эффективность и безопасность для животных. Проведена оценка эффективности восстановления сперматогенеза при экспериментальном крипторхизме. после

введения обогащенных клеточных культур различных видов. Исключено влияние операционного стресса на фертильносгь экспериментальных животных.

Основные положения, выносимые на защиту

Ксенотрансплантация обогащенных фетальных клеточных культур является самостоятельным методом оперативного лечения инфертильности и гипергонадотропного гипогонадизма.

Экспериментальная модель двухстороннего абдоминального крипторхизма является удобной дня изучения и внедрения новых методов лечения инфертильности и гипергонадотропного гипогонадизма.

Перенесенный операционный стресс не оказывает влияния на фертильность экспериментальных животных.

Ксенотрансплантация обогащенных фетальных клеточных культур приводит к восстановлению фертильности у экспериментальных животных, которая выявляется не ранее 72 суток от момента ксенотрансплантации.

После ксенотрансплантации клетки пересаженного материала выживают в отдаленные периоды наблюдения.

Ксенотрансплантация обогащенной культуры клеток фетального яичка оказывает наиболее выраженное воздействие на восстановление показателя фертильности, чем обогащенная мононуклеарная культура клеток костного мозга и культура, обогащенная мезенхимапьцыми стволовыми и прогениторными клетками.

В группах животных перенесших трансплантацию обогащенных клеточных культур происходит снижение индекса сперматогенеза, что говорит об активном увеличении форменных элементов сперматогенеза по отношению к общему количеству клеток Сертоли.

Ксенотрансплантация культур, обогащенных стволовыми и прогениторными, фетальными человеческими клетками различных видов не приводит к образованию в семенниках реципиента донорских сперматозоидов, а стимулирует собственный сперматогенез у экспериментальных животных. Это обеспечивает генетическую межвидовую безопасность метода

Связь с планом НИР ФГУ «НИИ урологии Росмедтехнологий» Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ (НИР) ФГУ «НИИ урологии Росмедтехнологий», а также с планами НИР Проблемной комиссии №24 00 Межведомственного Научного Совета по «Уронефрологии» РАМН и

Миниперства здравоохранения и социального развития Российской Федерации - № государственной регистрации 0120.0 807031.

Внелрснне в практику

Результаты исследования могут служить основой для лечения пациентов с бесплодием эндокринного, иммунологического и посггравмагического гепеза, а также у пациентов с абдоминальным крипторхизмом. Полученные результаты исследования направлены на рецензию в НИИ биологии гена РАН, Институт биологии развития имени Н.К.Кольцова РАН, ФФМ МГУ им. М.В.Ломоносова, НИИ прикладной механики РАН. Получены положительные отзывы на представленную работу.

Апробация работы

Основные положения работы доложены на:

1. Координационном совете ФГУ «НИИ урологии Росмедтехнологий» (г. Москва, 15 января 2008г.);

2. Симпозиуме: «Высокотехнологичная помощь в урологии: проблемы и перспективы внедрения», (г. Москва, 26 сентября 2007 г);

3. XI Съезде Российского общества урологов (6-8 ноября 2007 г.);

4. Четвертом Российском конгрессе «Мужское здоровье» (г. Москва, 12-14 ноября 2008г.);

5. Международном медицинском форуме «Индустрия здоровья» (Крокус - Сити, 14-18 апреля 2008 г);

6. Московском обществе урологов (г. Москва, 25 декабря 2007 г);

7. Втором Съезде «Репродуктивное здоровье семьи», 22 января 2008 г;

8. Российско-кубинском форуме «Стратегические вопросы репродуктивного здоровья» (г.Гавана, Куба 1-11 апреля 2008 г);

9. Научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии», г.Москва, 21 февраля 2008 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, в которых отражены основные положения диссертационной работы, из них 2 в рецензируемых изданиях ВАК РФ.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, состоит из введения,

5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 36 отечественных и 100 зарубежных источников литературы. Работа . иллюстрирована 12 таблицами и 22 рисунками.

Материал и методы исследования.

Для экспериментальной работы нами была выбрана модель абдоминальной формы двухстороннего крипторхизма, описанная в диссертационной работе Дендеберовым Е.С. (1993), в модификации Кирпатовского В.И., заключающаяся в мобилизации яичек у животных лапаротомным доступом под эфирным наркозом и фиксации их лигатурами (5/0, 6/0) в районе латеральных боковых каналов. По истечении определенного периода времени, при использовании лапаротомного доступа выполнялись орхфуникулоэктомии с перевязкой магистральных сосудов. Время подобной операции составляло 21-24 минуты.

Работа выполнена на 64 белых беспородных белых крысах-самцах с доказанной изначальной фертильностью, весом от 250 до 450 г, в возрасте 2,5-3 месяца, выращенных в Питомнике РАН «Крюково», в стандартных климатических условиях, на стандартных кормах. Для контроля использовалось 25 крыс-самок аналогичных характеристик.

Исследование было разделено на 3 этапа.

На первом этапе осуществлялось исследование изначальной фергильносги у экспериментальных животных, которая была определена путем случайной выборки и подсадки 30% животных к самкам и выявления факта наличия беременности у самок и родов. Наличие появления потомства у всех самок свидетельствует о том, что в исследуемой экспериментальной популяции, все животные были изначально фертильными.

На втором этапе изучались особенности течения линейного, управляемого, экспериментального, двухстороннего, абдоминального крипторхизма с исследованием состояния общего тестостерона сыворотки крови, фертильности экспериментальных животных и весовых характеристик удаленных у них яичек и придатков, с оценкой их гистологического состояния Популяция участвующих в эксперименте крыс - самцов, была разделена на 4 равные группы. Основные 3 клинические группы (из 6 животных каждая) разделялись по степени воздействия экспериментально индуцированного крипторхизма, ограниченной временными рамками 14, 21 и 28 суток. Четвертой группе животных (6 крыс) проводились фантомные операции, заключающиеся в выведении яичек в операционную рану и их обратном низведении в мошонку, без фиксации их в брюшной полости. Анестезиологическое пособие - масочный эфирный наркоз. Схема исследования на втором этапе работы представлена в таблице 1.

Таблица 1: Схема исследовании при изучении двухстороннего абдоминального крипторхщма:

Параметры Изначально Низведение яичек в мошонку (сроки) Сроки после низведения

Сутки 0 Группа 1 (14 суток) Группа 2 (21 суток) Группа 3 (28 суток) Группа контроля (0 суток) 14 21 28 72 108

Весовые характеристики яичек и придатков (мг) + + + - + - -

Исследование тестостерона (нг/мл) + + + - + - -

Гистология ткани яичек - + + - + - +

Расчет индекса сперматогенеза + + + - + - -

Оценка состояния клеток Лейдига + + + - + - -

Оценка фертильности + - - + - + +

После орхфуникулоэктомий производились контрольные взвешивания яичек и придатков. Объекты взвешивались на торсионных весах, чувствительностью до 1 мг. При взвешивании макропрспарата весом более 500 мг, объект скальпелем разделялся на фрагменты и взвешивался по частям.

Для определения общего уровня тестостерона, а также гонадотропных гормонов использовался иммупохемилюминисцектный метод исследования гормонального профиля, на иммуно-химическом анализаторе Access 2, фирмы Beckman Coulter (USA). Сбор крови осуществлялся путем косого купирования кончика хвоста у крысы и собирания выделяющейся крови в пластиковую пробирку, содержащую гель, объемом 4 мл. Затем полученная кровь центрифугировалась в пробирках при скорости 3000 оборотов, в течение 10 минут. Сыворотка отделялась гелем от клеток и переливалась в пробирки-эппендорфы, а затем замораживалась при минус 20°С. На этапе исследований репарационных возможностей яичек после устранения абдоминального двухстороннего крипторхизма исследовались показатели общего тестостерона На этапе исследования эффектов терапии обогащенными клеточиыми культурами исследовались уровни тестостерона, лютешшзирующего (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормонов (ФСГ). У экспериментальных животных, при

исследовании изначального уровня общего тестостерона было выявлено, что он колеблется в пределах 120,5-222,5 нг/мл, что явилось нормой базовых колебаний общего тестостерона в сыворотке крови экспериментальной популяции.

На всех этапах эксперимента применялась микроскопия препаратов, приготовленных по стандартной методике парафинных срезов. После взвешивания фрагменты макропрепаратов или целые объекты помещались в стеклянные флаконы, объемом до 20мл3, содержащие 10% раствор формальдегида, для последующей подготовки препаратов, по методу парафиновых блоков. Полученные микропрепараты окрашивались гематоксилином -эозином

Определение фертильности в экспериментальных популяциях осуществлялось путем выделения 2 животных из каждой группы, включая контрольную, и их подсадки к самкам, из расчета 1 самец на 3-4 самки. В дальнейшем оперативные вмешательства у этих животных не выполнялись. Сроки определения фертильности у экспериментальных животных определялись из расчета полного цикла развития сперматозоида у крыс (32-35 суток) и срока беременности у крысы 22-24 дня (Ковалевский K.JI., 1951). При оценке сексуальной активности крыс на 21 сутки отмечено, что все крысы хорошо переносили операционный стресс, но при этом были инфертильны, за исключением животных, которые перенесли фантомные (ложные) операции. Таким образом, отдаленные контрольные точки исследования фертильности были нами определены как 72 и 108 сутки после трансплантации.

Во время второго этапа эксперимента нами было выполнено 74 оперативных вмешательства, которые представлены в таблице 2.

Таблица 2: Количество экспериментальных операций на этапе изучения биологической модели двухстороннего абдоминального крипторхизма.

№ Название операции Количество операций

1 Формирование абдоминальной формы крипторхизма 18

2 Низведение яичек в мошонку 18

3 «Фантомная» операция моделирования крипторхизма 6

4 Орхфуникулоэктомия 32

ВСЕГО: 74

На 3 этапе работы для оценки клинического эффекта ксенотрансплантации обогащенных клеточных культур различных видов, принимая во внимание то, что мировой наукой накоплен наиболее значительный опыт в области изучения различных аспектов

межвидовых ксенотрансплантацнй культур, обогащенных стволовыми и прогениторными клетками у различных видов животных и человека (Артюхин А А, 2006; Jahnukaincn К. а а1., 2006), а также тот факт, что семенник является иммунологически привилегированным органом (Артюхин А.А., 2003, Кирпатовский В.И. с соавт., 2006), мы решили в работе использовать вариант ксено1ранснлантации человеческих стволовых и прогениторных клеток крысам, имеющим тяжелые нарушения сперматогенеза на фоне моделированного гипергонадотрошюго гипогонадизма сроком 21 день. Учитывая то, что наличия антигенов главного комплекса гистосовместимосги в ксеноварианте клеточных культур не предполагалось, иммунной защиты у животных не проводилось.

Животные, используемые в эксперименте, были разделены на 4 группы (по 10 животных). Первая группа (группа А) животных перенесла ксенотрансплантацию клеточной культуры, обогащенной мезенхимальными столовыми клетками, вторая группа (группа Б) -ксенотрансплантацию культуры обогащенной стволовыми и прогениторными фстального яичка, обогащенной спсрматогенными стволовыми и прогениторными клетками, третья (группа В) - ксенотрансплантацию мононуклеарной фракции клеток костного мозга, четвертая (группа Г, контрольная) - физиологический раствор хлорида натрия. Анестезиологическое пособие, оперативная техника и контроль проводились аналогично работе второго этапа. Схема исследования па 3 этапе работы представлена в таблице 3.

Таблица 3: Схема исследования на этапе оценки эффектов ксенотрансплантацнй, обогащенных клеточных культур различных видов:

Параметры Изначально Низведение яичек в мошонку (сроки) Сроки после низведения

Сутки 0 21 сутки 14 21 28 72 108

Вес яичек и придатков (мг) - + + - + - -

Исследование тестостерона, ЛГ и ФСГ (нг/мл) + + + - + - -

Гистология ткани яичек - + + - + - +

Индекс сперматогенеза + + + - + - -

Исследование клеток Лейдига + + + - + - -

Фсртильность + - - + - + +

Во время третьего этапа эксперимента нами было выполнено 136 оперативных вмешательств, данные о которых представлены в таблице 4.

Таблица 4: Количество экспериментальных операций на этапе изучения эффектов клеточной трансплантации.

№ Название операции Количество операций

1 Формирование абдоминальной формы крипторхизма 40

2 Низведение яичек в мошонку 40

3 Трансплантация клеточных культур 30

4 Орхфуникулоэктомия 56

ВСЕГО: 136 +30 клеточных трансплантаций

Стволовые и прогениторные клетки получали из плодов человека 16 недель гестации, полученных в лицензированных медицинских учреждениях, действующих в рамках законодательства РФ (приказ МЗ №302 от 28.12.1993 и приложения №3 от 05.04.1994).

Клетки вымывали из костного мозга средой DMEM содержащей 2 мМ ЭДГА в качестве антикоагулянта. Затем суспензию клеток наслаивали на раствор фиколла-урографина (плотность 1,077 г/мл) и центрифуговали 30 мин при 2000 g. Отбирали фракцию мононуклеарных клеток на границе раздела фаз, ресуспендировали в среде и повторно центрифуговали 5 мин при 1500g. Полученный осадок ресуспендировали в полной питательной среде (DMEM и F-12 (в соотношении 1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,02% гентамицина) и хранили не более суток до момента использования при температуре 4оС.

Культуру стволовых и прогениторных клеток фетального яичка получали от плодов 16 недель гестации. Культивировали в стандартных пластиковых флаконах (75 см2, Corning, USA) при 37°С в атмосфере с 5% С02 в среде DMEM/F-12 (в соотношении 1:1) с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (FCS), эпидермального ростового фактора (ЭФР) - 20нг/мл. Культивирование проводили адгезивно, смену среды проводили каждые 3-5 сутки, при достижении клетками монослоя, пассировали.

Для трансплантации экспериментальным животным использовали культуру клеток 3-его пассажа, жизнеспособность составляла 98%, ее определяли по трипановому синему или пропидию иодиду.

Для оценки выживаемости клеточных культур и изучения путей их возможной миграции была использована система меток ДНК-специфичным красителем Бромдиоксиуридином (BrDu) и полученными моноклональными кроличьими антителами к

суммарному антигену сперматозоидов челоавска Суммарный антиген сперматозоидов человека был получен из 25 порций эякулята, которые центрифугировали, а полученный центрифугат обработали ультразвуком при мощности 200 Ватт, 10-кратно, па ледяной бане (время каждого сеанса 40 секунд, с 40 секундными интерватами). Затем санификат центрифугировали при 3000 оборотах в минуту в течение 30 мин. Декоигировхш осадок, ликватировали его и замораживали до дальнейшего использования при - 20 °С. Концентрацию антигена определяли спектрофотомстричсским методом. По спектрофотометру оптическая плотность составила - 0,479 при разведении в 10 раз. Пул моноклональных кроличьих антител получали путем 4-х этапной иммунунизации кроликов, вводя антиген в подушечки лап. Полученные иммунные антисыворотки были сорбированы специфическим сорбентом из ткани семенника крыс. В результате получена моноспецифическая антпсыворотка для выявления экспрессии суммарного спермального антигена. Затем были изготовлены аффинные моноспецифические антитела против суммарного спермального антигена человека с помощью аффинной хроматографии на иммуносорбенте, из полученных сывороток. Полученные гистологические препараты обрабатывались моноклональными антителами, и контроль жизнедеятельное™ вводимых клеточных культур в тканях, на разных сроках наблюдения, осуществлялся при люминисцснтной микроскопии.

Подсчет трансплантируемого клеточного материала осуществлялся в модифицированной камере Горяева, путем подсчета количества клеток в 1 ряде, с последующим умножением на количество рядов в штриховой сетке. Приблизительно 1/10 часть трансплантируемых клеток окрашивалась ДНК-специфичным красителем Бромдиоксиуридином (ВгИи), который применялся для исследований многими авторами (ЯЫпоЬага е1 а1., 2006; С^аша й а1., 2000) при работах с клеточными культурами в тканях яичек. Таким образом, в группе Л на 1 крысу пришлось 1125000 немеченых мезенхимальпых стволовых клеток и 13200 стволовых клеток меченных ВгОи. (Всего в группе трансплантировано 11250000 немеченых мезенхимальпых стволовых клеток и 132000 стволовых клеток меченных ВгОи.) В группе Б на 1 крысу пришлось 920000 немеченых и 26400 стволовых спсрматогенных клеток, меченных ВгОи. (Всего в группе трансплантировано 9200000 не меченых и 264000 меченых ВгОи, сперматогенных стволовых клеток. В группе В на 1 животное приходилось не менее 150000-200000 стволовых и прогениторных клеток костного мозга.

Ксенотрансплантация осуществлялась при низведении яичек в мошонку, нутем подкапсульного введения культуральной взвеси в пространство между капсулой и семенными канальцами, в бессосудистой зоне.

Диагностика гипосперматогенеза и атрофии сперматогенных клеток яичка проводилась по методу Асграханцева А.Ф. и Соловьева А А. (2003), путем подсчета сустентоцитов на 30 строго поперечных срезах семенных канальцев гистологического препарата, с помощью микроскопа «Биолан» - Р11 (ЛОМО), при общем увеличении оптической системы X 420,0. Затем производились подсчет общего количества сперматогенных клеток и расчет индекса сперматогенеза, как соотношение сустентоциты / клетки сперматогенной ткани. Также измерялся минимальный диаметр поперечного среза семенного канальца оптическим винтовым окуляром-микрометром используемого микроскопа, и производилась оценка состояния клеток Лейдига, путем их подсчета в 30 межканальцевых локусах, и их морфометрической оценкой. Расчет индекса сперматогенеза как соотношение сустентоциты/клетки сперматогенной ткани обеспечивает комплексность оценки, объективизирует исследование. Разделение нарушений сперматогенеза на формы в зависимости от показателя индекса сперматогенеза: гипосперматогенез и атрофию сперматогенных клеток яичка увеличивает информативность исследования и повышает достоверность диагностики (Астраханцев А.Ф., 2003).

Для определения степени выраженности фертильности у крыс, нами дополнительно был введен Индекс фертильности (ИФ) для каждой из групп, который рассчитывался как произведение количества беременных самок (%) к среднему количеству крысят в группе и деленное на общее количество фертильных самцов в группе. Соответственно, чем выше индекс, тем более выражена фертильность у экспериментальных животных.

На всех этапах работы полученные данные заносились в таблицы и обрабатывалась программами Microsoft Excel (Microsoft Office XP, professional) и Statistica *99 Edition Kernel release 5.5k.

Результаты работы и их обсуждение.

На первом этапе исследования была определена изначальная фертильность животных экспериментальной популяции. При оценке фертильности случайно выбранных 30% экспериментальных животных было выявлено, что все животные были фертильны. Таким образом, мы признали изучаемую популяцию животных условно изначально фертильной в 100% случаев.

На втором этапе изучались особенности течения экспериментального, двустороннего, абдоминального крипторхизма с исследованием состояния общего тестостерона сыворотки крови, фертильности экспериментальных животных и весовых

характеристик удаленных у них яичек и придатков, а также оценкой их гистологического состояния и расчетом индекса сперматогенеза.

Изменения весовых характеристик яичек лишь косвенно свидетельствуют о происходящих дегенеративных и атрофических процессах в крипторхированных яичках. Нарастание массы яичек после низведения, может свидетельствовать как об активном восстановлении нормального метаболизма за счет функции сперматогенного эпителия и клеток Лейдига уцелевших канатьцев, что подтверждается данными ряда авторов. (Симодейко A.A. 1994; Ilio K.Y., 2000), так и о наличии местного отека в исследуемом органе, что более характерно для более тяжелых форм криигорхизма

Результаты представлены на рисунках 1 и 2.

Рисунок 1: Динамика массы яичек на этапе изучения биологической модели у животных с крингорхизмои продолжительностью 2,3 и 4 недели.

при

низведении

14 сут

28 сут

X---- ---------у I

у........

/ I

/ ! S \

ЕВ

кг . -

* \

"2 нед "Знед "4 нед " норма макс 'норма мин

сутки

Рисунок 2: Динамика массы придатков яичек на этапе изучения биологической модели у животных с крипторхизмом продолжительностью 2,3 и 4 недели.

при низведении

14 сут

"2 нед "3 нед "4 нед " норма макс "норма мин

сутки

28 сут

Динамика общего тестостерона плазмы крови в исследуемых группах на втором этапе работы представлена на рисунке 3.

Рисунок 3: Динамика общего тестостерона плазмы крови в исследуемых группах.

Отмечено, что уровень общего тестостерона снижался у животных всех экспериментальных групп, кроме контрольной, ниже определенной нами нормы. В контрольной группе колебания средних цифр общего тестостерона находились в границах популяционной нормы и за их пределы не выходили, что свидетельствует о том, что <ошрургический фактор воздействия» ложной операции не влияет на результаты,

полученные в работе. После низведения яичек в мошонку у всех крипторхированных животных произошло восстановление общего тестостерона плазмы крови до нормальных популяционных значений. Причем отмечено, что чем короче время воздействия крипторхнзма, тем быстрее и эффективнее восстанавливается уровень общего тестостерона в сыворотке крови, а повышение общего тестостерона выше нормы свидетельствует о компенсаторной гиперплазии клеток ЛеЦдига.

При анализе гистологических изменений в полученных препаратах выявлено что, чем выраженнсе и продолжительнее неблагоприятное воздействие абдоминального крипторхнзма, тем больше угнетаются процессы метаболизма в яичках и тем выше вероятность атрофии. Прогрессирующая атрофия семенного эпителия и очаговое разрастание соединительной ткани в шггерстиции указывают на то, что компенсаторные возможности инкреторного аппарата задержанного яичка весьма ограничены. Испеченный кршггорхизм приводит к полному склеротическому перерождению и "стиранию" семенных канальцев, нередко к формированию гистологической картины "одних клеток Сертолн", обуславливая инфертильность. Такую картину мы наблюдали в большинстве семенных канальцев животных с индуцированным 4-х недельным крипторхизмом, при этом отмечаюсь запустевание семенных канальцев и заполнение их зозинофильным гомогенным содержимым, что свидетельствовало о резком угнетении сперматогенеза, по всей видимости, за счет процессов аутоиммунной природы и образования антисперматьных антител. После устранения повреждающего воздействия происходило частичное восстановление сперматогенеза во всех группах, наряду с атрофией части семенных канальцев. Связано это, по всей видимости, с неравномерным воздействием на канальцы повреждающих факторов при абдоминальном крипторхизме. Восстановление сперматогенеза и фертильности в данном случае зависит от доли сохранившихся в функциональном отношении семенных канальцев. Чем более продолжителен период воздействия, тем большее количество семенных канальцев подвергается повреждению и атрофии, и их регенераторная способность снижается.

Оценка индекса сперматогенеза, проведенная в группах, выявила достоверное снижение в группе животных, которые перенесли крипторхизм в течение двух недель. В группах животных перенесших 3 и 4 недельное воздействие отмечено увеличение индекса, что свидетельствует о снижении формирования элементов сперматогенеза, по отношению к сустснтоцитам, за счет более глубокой атрофии сперматогенного эпителия семенных канальцев. В группе контроля величина индекса практически не изменилась, что свидетельствует о том, что сам характер оперативного вмешательства не влияет на качество сперматогенеза и, соответственно, фертильности.

Оценка индекса сперматогенеза на втором этапе работы представлена на рисунке 4.

Рисунок 4: Показатели индекса сперматогенеза в исследуемых группах на 2 этапе работы.

2 неД К 3 нед К Л нед К Контр

Восстановление фертильности после устранения экспериментального крипторхизма нам удалось выявить только у животных с двухнедельным воздействием. У них фертильность восстановилась частично только к 72 и 108 суткам, причем родившееся потомство было малочисленно, и составляло 1-2 на одну самку (в обычных условиях от 8 до 14 новорожденных крысят) и вскоре погибло. Группы животных, перенесшие абдоминальный крипторхизм в течение 3 и 4 недель, остались инфертильными и в более поздние сроки. Мы допускаем частичное восстановление полного цикла сперматогенеза у этих животных, но наличия показателя фертильности нам выявить у них не удалось.

На втором этапе работы нами было выявлено, что чем более продолжителен абдоминальный крипторхизм, тем большей атрофии подвергаются семенные канальцы, тем более страдают герминогенная функция клеток Лейдига и активность сперматогенеза.

Изменения популяции клеток Лейдига, на втором этапе работы, выявленные при исследовании гистологических препаратов, представлены в таблице 5.

Таблица 5: Характеристика популяции клеток Лейдига (КЛ) в исследуемых группах на этапе изучения модели абдоминального крипторхизма*.

Группы Крипторхнзм 2 недели Крипторхнзм 3 недели

Число КЛ/1сперм.ка палец Хромность ядер Хромафин. гранулы КЛ Число ЮШсперм.ка малец Хромность ядер Хромафин. гранулы КЛ

Низведение 5,3+1,1 +++ +++ 6,9+1,6 +++ +++

14 сутки 5,8+2,4 +++ ++ 7,1+2,0 +++ +++

28 сутки 4,9+0,2 ++ ++ 6,7+1,1 ++ ++

Группы Крипторхнзм 4 недели Контрольная группа

Число КЛ/1спсрм.к аиалец Хромиость ядер Хромафин. гранулы КЛ Число КЛАсперм.к аналец Хромность ядер Хромафин. гранулы КЛ

Низведение 6,5+1,9 ++ ++ 4,2+0,5 +++ +++

14 сутки 8,5+0,4 ++ + 4,5+3,3 +++ +++

28 сутки 8,5+0,9 + + 5,0+1,6 ++ +++

*- приведены средние значения при Р менее или равном 0,05.

При исследовании состояния популяции клеток Лейдига у животных с кригтгорхизмом во всех группах выявлено, что момент низведения яичек в мошонку характеризовался увеличением их количества в локусах между семенными канальцами из расчета на 1 каналец, гиперхромией ядер и увеличением числа хромафинных гранул. Через две недели после низведения яичек в мошонку в контрольной группе и группе животных с двухнедельным крипторхизмом, через 2 недели после низведения было отмечено снижение числа клеток Лейдига при расчете на 1 каналец Эти клетки имели нормохромную окраску ядер и меньшее количество хромафинных гранул. В группах животных после 3 и 4 недельного крипторхизма отмечено увеличение количества клеток Лейдига с гиперхромными ядрами и увеличенным количеством хромафинных гранул. К 28 суткам в контрольной и 2 недельной группах отмечено снижение числа клеток Лейдига, характеризующихся нормохромией ядер и умеренным количеством хромаффинных зерен. В 3 и 4 недельных группах отмечена дальнейшая эскалация количества клеток Лейдига, со снижением хромности ядер и уменьшением количества хромафинных зерен. Эти данные свидетельствуют о том, что нормализация показателей общего тестостерона, в контрольной группе и в группе животных с двухнедельным абдоминальным крипторхизмом обусловлена гиперфункцией имеющейся популяции клеток Лейдига В группах животных с 3 и 4 недельным крипторхизмом восстановление общего тестостерона обеспечивается за счет

количественного увеличения популяции клеток Лейдига, причем состояние их секреторного аппарата свидетельствует о выраженном функциональном напряжении.

На 3 этапе работы для оценки результатов трансплантации различных видов стволовых клеток, нами была выбрана исследованная ранее модель абдоминальной формы двухстороннего крипторхизма. Используемая модель является удобной для создания тяжелых нарушений функций яичек, в том числе эндокринной функции. При этом регенерационные возможности и степень повреждения тканей контролируются временем воздействия. С нашей точки зрения наиболее рационально было использование подобной модели сроком 21 день, так как после него самостоятельного восстановления фертильности у животных не происходит. Регенерационные резервы тестикулярной ткани после трехнедельного воздействия высоки, так как быстро восстанавливают гормоннродуцирующую функцию яичек уже к 14 суткам. Степень гипотрофии яичек по данным гистологического исследования также умеренна по сравнению с яичками животных перенесших абдоминальный крипторхизм в течение 4 недель.

Динамика весовых характеристик яичек и придатков представлена на рисунке 5.

Рисунок 5: Изменения весовых характеристик в исследуемых группах на этапе изучения эффектов ксенотраксплантации культур, обогащенных стволовыми и прогениторнмми клетками различных видов.

По данным проведенного исследования отмечена тенденция к нарастанию массы яичек и придатков к 14 суткам во всех группах, которая сохранялась и к 28 контрольным

суткам. На 3 этапе работы при оценке гормонального профиля общего тестостерона, ЛГ и ФСГ нами были получены данные, представленные в таблице 6.

Таблица 6: Изменения гормонального профиля в исследуемых группах.

Группа животных Гормоны изначально Низведение и трапепл-ция 14 сут. 28 сут.

нг\мл нг\мл нг\мл нг\мл

Культура фетального яичка Тестостерон 5,11+1,08 2,74+0,7 4,38+0,7 4,67+0,9

ЛГ 6,67+1,3 7,10+1,2 4,52+0,6 4,36+0,6

ФСГ 4,96+0,6 5,26+0,6 3,13+0,46 3,03+0,6

Культура костномозговы х клеток Тестостерон 4,25+0,65 1,78+0,5 3,67+1,4 4,57+0,8

ЛГ 3,13+0,46 3,26+0,7 2,37+0,7 2,83+0,7

ФСГ 4,7 9+0,8 4,44+0,53 2,47+0,2 2,09+0,2

0,9% раствор хлорида натрия Тестостерон 4,92+0,5 2,39+0,2 3,21+0,3 3,36+0,3

ЛГ 4,46+0,6 4,84+0,8 3,22+0,2 3,42+0,4

ФСГ 5,04+0,8 5,46+0,6 4,05+0,9 4,32+0,8

*- приведены средние значения, при Р равном или менее 0,05

При исследовании состояния гормонального профиля у крыс во всех группах к 3 неделе крипторхизма было выявлено снижение уровня общего тестостерона плазмы крови относительно изначальных цифр. Концентрация гонадотропных гормонов оказалась повышенной. После устранения абдоминального крипторхизма и низведения яичек в мошонку у животных основных групп (А, Б и В) к 14 суткам восстанавливался адекватный уровень общего тестостерона, который стабильно сохранялся на нормальных цифрах к 28 суткам наблюдения. В группе контроля (группа Г) восстановление уровня общего тестостерона шло более медленно, и к 28-м суткам достигло лишь нижней границы нормальных значений в экспериментальной популяции, что представлено на рисунке 5. Во всех группах животных, перенесших ксенотрансплантацию обогащенных клеточных культур, уровень гонадотропинов снизился до начальных значений. В группе контроля также произошло снижение уровня гонадотропинов, в частности ЛГ гормональный профиль которого был наиболее показательный На фоне клеточной терапии к 14 суткам после низведения яичек, концентрация гонадотропинов снизилась, по всей видимости, за счет действующей по типу «обратной связи» гипертестостеронемии. Сниженные концентрации ФСГ и ЛГ сохранились к 28 суткам. Отмечено, что в группах крыс, перенесших трансплантацию клеточными культурами, восстановление уровня общего тестостерона происходило быстрее, чем в контрольной группе и показатели были более значимыми. Трансплантация костномозговых стволовых и прогениторных клеток (мононуклеарная фракция), а также культура обогащенная мезенхимальными стволовыми и прогениторными

клетками, оказала более выраженное воздействие на уровень тестостерона, чем культура специфичных сперматогенных стволовых клеток, что представлено на рисунке 6.

Рисунок 6: Изменения гормонального профиля у экспериментальных животных после ксенотрансплантации обогащенных клеточных культур.

Группа А — ксенотрансплантщия клеточной культуры, обогаи/енной мезгнхимальными стволовыми и прогениторными клетками

Группа Б - ксенотранстантация клеточной культуры, обогащенной сперматогенными стволовыми и прогениторными клетками

Группа В - ксенотранстантация клеточной культуры, обогащенной стволовыми и прогениторными клетками костного мозга Группа Г - контрольная группа

Динамика гормонов в группе А

I Тестостерон

сроки наблюдения

Динамика гормонов в группе Б т тестостерон

2 3

сроки наблюдения

Динамика гормонов в групп© В »Тестостерон

нг/мл

12 3 4

Сроки наблюдения

Контрольные сроки наблюдения:

1- До операции

2- При низведении и ксенотрансплантации

3- Через 14 суток после низведения и ксенотрансплантации

4- Через 28 суток после низведения и ксенотрансплантации

В нашем исследовании на момент низведения яичек в мошонку были получены гистологические изменения одинаковые для всех групп экспериментальных животных, сходные с литературными данными (Симодейко A.A. 1994; IIio K.Y., 2000), заключавшиеся в резком угнетении сперматогенеза в семенных канальцах, которые были структурно деформированы. В отдельных канальцах встречались лишь небольшие участки с клетками Сертоли. В ламинальных частях отдельных канальцев встречались резко дистрофичные сперматогонии. Многие канальцы были заполнены эозинофильным гомогенным содержимым.

При оценке гистологических изменений в контрольной группе (группа Г) к J 4 суткам отмечены признаки выраженной деструкции в 50% канапьцев, такие как вакуолизация сперматогенного эпителия с нарушением его рядности, на фоне единичных уцелевших

канальцев. К 28 суткам наряду с аналогичными признаками отмечено опустошение большинства семенных канальцев.

В группе Б животных было выявлено, что на 14 сутки в единичных канальцах было выявлено наличие 2-3 слоев сперматогенного эпителия. В большинстве канальцев были отмечены вакуолизация половых клеток и их слущивание в просвет семенных канальцев, а также наличие гигшггских многоядерных клеток. На 28 сутки, в большей части семенных канальцев было выявлено наличие правильного расположения слоев сперматогенного эпителия, что свидетельствует об активизации процессов регенерации. Тем не менее, в некоторых семенных канальцах было выявлено наличие признаков гибели сперматогенного эпителия.

Сходные результаты были получены при анализе гистологических срезов тестикулярной ткани в группе В. Причем в большинстве канальцев имело место правильное расположение слоев сперматогенного эпителия, с элементами всех стадий сперматогенеза (сперматогонии, спермагоциты, сперматиды и сперматозоиды)

В группе А на 14 сутки в яичках отмечены изменения, свидетельствующие о частичной регенерации отдельных семенных канальцев, ясно видимых на общем фоне клеточной картины. В целом морфологическая картина яичка характеризовалась выраженной отечностью тканей, с сильной инфильтрацией и кровенаполнением сосудов. В половине канальцев наблюдалась выраженная дистрофия семенных канальцев, сопровождающаяся вакуолизацией сперматогенного эпителия и нарушением его рядности. В отдельных канальцах наблюдались конгломераты клеток сперматогенного эпителия слущеных в просвет канальца. Тем не менее, в некоторых канальцах наблюдалось сохранение 2-3 слоев сперматогеннного эпителия, с выраженной рядностью слоев, что расценивается нами как признаки частичной регенерации. К 28 суткам гистологическая картина в части поврежденных канальцев имела признаки дегенерации, на фоне небольшого отека интсрстициальной ткани наблюдались признаки деструкции, такие как вакуолизация половых клеток, наличие гигантских многоядерных клеток и гиперхромных сперматид. Тем не менее, в большинстве канальцев было отмечено правильное расположение слоев сперматогенного эпителия, что свидетельствует о частичной регенерации

Результаты исследования индекса сперматогенеза в исследуемых группах на 3 этапе работы представлены на рисунке 7.

Рисунок 7: Исследование индекса сперматогенеза в исследуемых группах*.

Группа А - ксенотрансппантацш клеточной культуры, обогащенной мезенхимапьными стволовыми и прогениторными клетками

Группа Б - ксенотрансплантация клеточной культуры, обогащенной сперматогенньши стволовыми и прогениторными клетками

Группа В - ксенотрансплантация клеточной культуры, обогащенной стволовыми и прогениторными клетками костного мозга Группа Г- контрольная группа

*- приведены средние значения при Р менее или равном 0,05.

В группах животных перенесших трансплантацию обогащенных клеточных культур происходило недостоверное снижение индекса сперматогенеза, что говорит об активном увеличении форменных элементов сперматогенеза по отношению к общему количеству клеток Сертоли. Минимальные изменения индекса в группе контроля свидетельствуют о менее выраженной активности процессов регенерации сперматогенного эпителия, чем в основных группах.

Изменения популяции клеток Лейдига, выявленные при исследовании гистологический препаратов представлены в таблице 7.

Таблица 7: Характеристика популяции клеток Лейдига (КЛ) в исследуемых группах на 3 этапе работы*.

Группы Группа А Группа Б

Число КЛ/1 сперм, каналец Хромность ядер Хромафин. гранулы КЛ Число КЛ/1 сперм, каналец Хромность ядер Хромафин. гранулы КЛ

Низведение 6,8+4,4 +++ +++ 7,9+2,2 +++ +++

14 сутки 6,5+3,1 +++ ++ 6,2+1,1 +++ ++

28 сутки 5,7+1,2 ++ ++ 6,3+2,5 ++ ++

Группы Группа В Группа Г (контроль)

Число КЛ/1спсрм.к аналец Хромность ядер Хромафин. гранулы КЛ Число КЛ/1сперм.к аналец Хромность ядер Хромафин. гранулы КЛ

Низведение 6,5+1,9 +++ +++ 7,8+2,4 +++ +++

14 сутки 4,5+0,8 +++ ++ 9,5+1,3 +++ +++

28 сутки 4,5+1,9 ++ ++ 9,8+1,1 ++ +

приведены средние значения при Р менее или равном 0,05.

При исследовании состояния клеток Лсйдига у животных всех групп выявлено, что момент низведения яичек в мошонку характеризовался увеличением их количества в локусах между семенными канальцами из расчета на 1 каналец, гиперхромией ядер и увеличением числа хромафинных гранул. Через две недели после низведения яичек в мошонку в основных группах (А, Б и В) было отмечено снижение числа клеток Лейдига при расчете на 1 каналец. Эти клетки имели нормохромную окраску ядер и меньшее количество хромафинных гранул. В группе контроля (Г) отмечено увеличение количества клеток Лейдига с гиперхромными ядрами и увеличенным количеством хромафинных гранул. К 28 суткам в основных группах отмечено снижение числа клеток Лейдига, характеризующихся нормохромией ядер и умеренным количеством хромаффинных зерен. В группе контроля отмечена дальнейшая эскалация количества клеток Лейдига, со снижением хромности ядер и уменьшением количества хромафинных зерен. Полученные данные полностью коррелируют с данными 2 этапа работы.

Огмечено, что к 3 неделе крипторхизма формируются характерные для гипергонадотропного гипогонадизма гормональные изменения, характеризующиеся снижением продукции тестостерона яичками, на фоне гиперстимуляции их гонадотропинами. При этом возникла гиперплазия клеток Лейдига, характеризующаяся увеличением их количества, гиперхромией ядер и увеличением числа хромафинных гранул в 1 клетке, развивающаяся, по всей видимости, в результате стимулирующего влияния

повышенной секреции ЛГ гипофизом. После устранения крипторхизма происходит снижение выраженности гипергонадотропного гипогонадизма с нормализацией уровня гонадотропинов гормонов гипофиза. Тем не менее, уровень тестостерона достигал лишь нижней границы нормы, несмотря на сохраняющееся повышенное содержание клеток Лейдига в яичках В этих клетках, было выявлено снижение количества хромаффинных гранул в цитоплазме, при сохраняющейся гиперхромности ядер. Это может свидетельствовать об истощении функциональных возможностей тестостерон-продуцирующих клеток в связи с их длительной избыточной стимуляцией

Ксенотрансплантация культур обогащенных стволовыми и прогениторными клетками у животных приводит к более быстрому и более полноценному восстановлению общего тестостерона в сравнении с контрольной группой при нормализации уровня тропных гормонов гипофиза (Рисунок 6).

Показатели общего тестостерона в группах обеспечиваются состоянием популяций клеток Лейдига. В группах животных, которые перенесли ксенотрансплантацию обогащенных клеточных культур, нормальные показатели уровня общего тестостерона обеспечиваются за счет гиперфункции имеющейся стабильной популяции клеток Лейдига, с признаками нормохромии ядер и средним количеством хромафинных зерен. В группе контроля (Г), относительная нормализация обеспечивается, за счет количественных показателей гиперплазированной популяции клеток Лейдига, причем их состояние свидетельствует о выраженном функциональном напряжении.

Фертильность у животных экспериментальных групп оценивалась в сроки указанные в таблице 3, по принципам, которые были представлены при описании второго этапа работы. Результаты исследований фертильности представлены в таблице 8.

Таблица 8:Оценка фертильности в экспериментальных группах на 3 этапе.

Показа тсль Кол-во беременных самок (%) Кол-во фертильных самцов (%) Ср. число живых крысят (шт.) Индекс фертильности

\сутки труп так. 21 72 108 21 72 108 21 72 108 21 72 108

А* 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Б** 0 55,5 88,8 0 66,6 100 0 4,6 7,4 0 3,33 5,52

В*** 0 33,3 66,6 0 66,6 66,6 0 0,8 2,8 0 0,4 2,8

р**** 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0" 0

* Группа А - группа животных, перенесшая ксенотрансппантацию клеточной культуры, обогащенной мезепхимальньши стволовыми клетками;

** Группа Б - группа окгшотных, перенесшая ксенотрансплантацию культуры обогащенной стволовыми и прогениторными клетками фетальпого яичка;

*** Группа В - группа животных, перенесшая ксенотрансплантацию мононуклеарной фракции клеток костного мозга;

**** Группа Г - группа животных, перенесшая интратестикулярпую инъекцию 0,9% раствора хлорида натрия (контрольная).

В группах А и Г (контрольная) при оценке фертильности на 72 сутки и на 108 сутки после трансплантации появление потомства отмечено не было.

В группе животных перенесших трансплантацию обогащенной клеточной культуры фетального яичка (группа Б) при помещении 1 самца к 3-4 самкам, на 72 и на 108 сутки, все экспериментальные самцы этой группы были фертильными. Тем не менее, следует отметить, что не все самки, использовавшиеся для контроля, смогли дать потомство. В этой группе самок, помещенных к самцам на 72 сутки, и остававшихся с ними в одних клетках в течение 7 дней, через 24-25 суток отмечено появление потомства в 55,5% случаев, причем количество живорожденных крысят варьировалось от 5 до 8, в среднем 4,6 на 1 самку, а фертильными были 66,6 % самцов.

При контрольном исследовании фертильности (группа Б) на 108 сутки отмечено появление потомства у 88,8 % самок, причем среднее число крысят в 1 помете составило 7,4 детеныша на 1 крысу. Все самцы, использовавшиеся в этой части экспериме1гга были фертильными.

В группе животных перенесших трансплантацию культуры обогащенной клетками мононуклеарной фракции костного мозга (группа В) при помещении 1 самца к 3-4 самкам, на 72 и на 108 сутки, также отмечено появление потомства у всех животных этой группы. В этой группе у самок, помещенных к самцам на 72 сутки, и остававшихся с ними в одних клетках в течение 7 дней, через 24-27 суток отмечено появление потомства в 33,3 % случаев, причем количество живорожденных крысят варьировалось от 1 до 4, в среднем 0,8 на 1 самку. В данной группе количество фертильных самцов составило 66,6%

При контрольном исследовании фертильности на 108 сутки отмечено появление потомства у 66,6 % самок, причем среднее число крысят в 1 помете составило 2,8 детеныша на 1 крысу. Число фертильных самцов осталось неизменным 66,6%.

Результаты расчетов индекса фертильности для всех групп представлены в таблице 8. Для группы Б на 14 сутки этот показатель был равен - 3,33, к 28 суткам - 5,52, а в группе В на 14 сутки этот показатель был равен 0,4, а к 28 суткам этот показатель достиг уровня 2,8.

Этот фактор объясняется, по всей видимости, более высокой тропиостью трансплантируемого материала к органу мишени и более узкой его специализацией. Кроме того, имеется предположение, что клетки трансплантированной культуры по основному действию были в основном унипотентными. В группах Л и Г при отсутствии потомства этот показатель был равен 0. Несмотря на восстановление адекватного уровня общего тестостерона, отсутствие потомства у животных в группе А, может быть объяснено следующими причинами: во-первых, с точки зрения клеточной пластичности, мезенхимальные стволовые клетки дают начало остеоцитам, адипоцитам и хондроцитам, то есть специфичным клеткам соединительной ткани. При такой специализированной пластичности сложно представить направленную дифференцировку этих клеток по синтезу гормонально-активных клеток Лейдига или регуляторных клеток Сертоли. Во-вторых, трансплантированные сперматогенные стволовые клетки крысы in vitro и in vivo приживаются и образовывают клетки, по структуре неотличимые от клеток Лейдига, которые продуцируют тестостерон. Мезенхимальные клетки человека также образовывают гормонально активные клетки, но по утверждению некоторых авторов (Yazavva Т, et. al., 2006) эти клетки продуцируют глюкокортикоиды, а не тестостерон.

Контрольная группа (группа Г) не смогла достичь показателя фертильности вследствие глубокой гипотрофии яичек, на фоне истощения компенсаторных резервов, которые, тем не менее, смогли восстановить гормональную функцию яичек у экспериментальных крыс за счет гиперплазии клеток Лейдига В этой группе восстановления фертильности не произошло и в отдаленные сроки наблюдения. Гистологические исследован™, произведенные на 28 сутки после низведения яичек выявили практически полное запустевание канальцевой сети яичек, за счет дистрофии канальцев и атрофическую трансформацию яичек в этой группе. На фоне такого кризиса появление потомства, даже в отдаленные сроки, прогностически маловероятно.

При люминисцешной микроскопии, после окраски специфическими моноклональными антителами было отмечено, что в отдаленные сроки на 72 и 108 сутки в гистологических препаратах выявляются клетки меченные бромдиоксиуридином, в то время как клеток меченных антителами выявлено не было. Это свидетельствует о том, что клетки трансплантированной культуры способны выживать в организме реципиента длительное время. При этом они стимулируют собственный сперматогенез реципиента, а не сперматозоиды донора Это свидетельствует о межвидовой безопасности данного метода лечения.

При проведении экспериментальной работы нами были выявлены осложнения, представленные в таблицах 9 и 10. »

Таблица 9: Иптраоперационные и послеоперационные осложнения на этапе

изучения биологической модели (2 этап).

Интрарперационные сложнения

Осложнение Количество животных % от общего количества операций (п=74)

Разволокнение мышц 12 16,21%

Кровотечение (в том числе из-за слетевшей лигатуры) 3 4,05%

Передозировка наркоза 3 4,05%

Послеоперационные осложнения

Послеоперационные спайки 7 9,45%

Подкожная гематома мошонки 1 1,35%

Нагноившиеся множественные гематомы 1 1,35%

Миграция яичка в мошонку 3 4,05%

Всего: 30 40,5%

Таблица 10: Интраоперационные и послеоперационные осложнения этапа изучения эффектов ксенотрапсплантацин (3 этап).

Интраоперационные осложнения

Осложнение Количество животных % от общего количества опершдой (п=136)

Разволокнение мышц 10 7,35%

Кровотечение (в том числе из-за слетевшей лигатуры) 2 1,47%

Передозировка наркоза 2 1,47%

Интратесгикулярная гематома 1 0,73%

Послеоперационные осложнения

Послеоперационные спайки 11 8,08%

Всего: 26 19,1%

Таким образом, на этапе изучения биологической модели двухстороннего крипторхизма было выявлено 40,5% осложнений, из которых тяжелыми явились передозировка эфирного наркоза и различного вида кровотечения, составившие по совокупности 8,1%. Остальные осложнения, не представляют угрозы для жизни животного, и не влияют на чистоту эксперимента. Отсутствие инфекционных осложнений, за исключением 2 случаев нагноившихся подкожных гематом, у экспериментальных животных свидетельствует о хорошей переносимости операций и высокой реактивности местного и общего иммунитета у крыс. На 3 этапе работы было выявлено 12,01% осложнений, из которых тяжелыми явились передозировка эфирного наркоза и различного вида кровотечения, составившие по совокупности 1,84 %. Это свидетельствует о совершенствовании операционной техники и учете опыта ошибок, совершенных на предыдущем этапе.

На основании результатов проведенной экспериментальной работы, доказывающей факт сохранения и дифференцировки введенных клеточных культур в отдаленные сроки, а также положительных клинических результатов в эксперименте можно предложить возможность использования данного метода для применения в клинической практике после дальнейшего изучения.

Выводы

1. Экспериментально вызванное угнетение сперматогенеза при формировании двухстороннего абдоминального крипторхизма развивается вследствие непосредственного поражения тестикулярной ткани, что приводит к развитию первичного гипогонадизма и характеризуется гипоплазией яичек, повышением уровней гонадотропинов в крови и снижением уровня общего тестостерона. После устранения абдоминального крипторхизма у экспериментальных животных происходит частичное восстановление сперматогенного эпителия с уменьшением гиперплазии клеток Лейдига

2. Стрессовое воздействие оперативного вмешательства не оказывает влияния на фертилыюсть экспериментальных животных, так как животные хорошо переносят фантомные (ложные) операции, оставаясь фертильными к 21 суткам. Двусторонний абдоминальный крипторхизм в течение 14 суток приводит к выраженной инфертильности у крыс. После его устранения происходит частичное восстановление фертильности в отдаленные сроки максимального наблюдения, не ранее 72 суток, при этом, чем больше экспозиция, тем меньше вероятность восстановления этой функции

3. Интратестикулярное введение обогащенных клеточных культур стимулирует усиление гормональной функции клеток Лейдига. При отсутствии клеточной ксенотрансплантации нормальные показатели общего тестостерона достигаются за счет выраженной гиперплазии клеток Лейдига с признаками выраженного функционапыюго напряжения.

4. Трансплантация обогащенных клеточных культур, является безопасным методом, который усиливает эффективность восстановления герминогенной и сперматогенной функции яичек. Использование данного метода приводит к усилению собственных регенераторных возможностей, более быстрому, чем в контроле, восстановлению сперматогенеза и показателя фертильности с достаточно высокими индексами.

5. Наиболее выраженное восстановление фертильности у крыс оказывает трансплантация обогащенной культуры клеток фетального яичка. Влияние

ксенотрансплантации культур обогащенных стволовыми и прогениторными клетками других видов на сперматогенез выражено меньше.

6. Ксенотрансплантация культур, обогащенных стволовыми и прогениторными клетками различных видов, приводит к эффективному восстановлению утраченных при крипторхизме функций яичка, но зависит от степени повреждения тканей, которая определяется временем воздействия. Прогноз ксенотрансплантации обогащенных клеточных культур у крыс с абдоминальным крипторхизмом, сроком более 21 суток - неблагоприятен.

7. В отдаленные сроки (на 72 и 108 сутки после ксенотрансплантации обогащенных клеточных культур) у животных в тканях семенников были выявлены клетки трансплантированной культуры, окрашенные бромдиоксиуридином, а клетки меченные специфическими моноклональными антителами выявлены не были, что свидетельствует о том, что трансплантированные чсловечсскис клетки длительно выживают в семенниках у крыс, стимулируя собственный сперматогенез животных. Сперматозоидов, обладающих человеческими антигенами, при идентификации моноклональными кроличьими антителами к суммарному антигену сперматозоидов человека у крыс выявлено не было.

8. После ксенотрансплантации обогащенных клеточных культур в семенных канальцах происходит снижение индекса сперматогенеза, что говорит об активном увеличении форменных элементов сперматогенеза по отношению к общему количеству клеток Сертоли.

Практические рекомендации

1. Экспериментальная модель двухстороннего абдоминального крипторхизма является удобной и достаточной для изучения и внедрения новых методов лечения инфертилыюсти и гипергонадотропного гипогонадизма

2. Клинический эффект восстановления функции яичек при ксенотрансплантации обогащенных клеточных культур у экспериментальных животных зависит от длительности воздействия на яички при формировании абдоминального кригггорхизма. В связи с этим использование данного метода при сроке экспериментального крипторхизма более 21 суток неэффективно.

3. Эффекта восстановления фертильности у крыс после ксенотрансплантации обогащенными клеточными культурами следует ожидать не ранее, чем через 72 дня после операции.

4. Наиболее опасными осложнениями при формировании двухстороннего абдоминального крипторхизма являются кровотечения и передозировка эфирного наркоза, поэтому необходимо уделять пристальное внимание контролю гемостаза и глубины эфирного наркоза

5. Ксенотрансплантация осуществляется путем перфорации белочной оболочки тонкой иглой и введением клеточной культуры в субкапсулярное пространство. При этом игла должна направляться параллельно капсуле с одновременной гидропрепаровкой. Это максимально снижает риск повреждения семенных канальцев.

6. При формировании абдоминального крипторхизма яички животных должны располагаться в глубине латеральных каналов как можно дальше от белой линии, что исключает их повреждение при повторном доступе.

7. При формировании фиксирующей яичко спайки необходимо захватывать паратестикулярную клетчатку. При этом соединительнотканная спайка формируется более грубой и исключает миграцию яичка в мошонку.

8. Полученные в работе данные могут служить базовой моделью для изучения стимулирующего влияния ксенотрансплантации обогащенных клеточных культур на сперматогенез человека.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Трансплантация стволовых клеток при лечении мужского бесплодия. // Вторая Всероссийская конференция «Мужское здоровье», тезис, С.56. (Камалов A.A., Сухих Г.Т., Ефремов Е.А., Охоботов Д.А.);

2. Стволовые клетки и их использование в современной клинической практике. (Обзор литературы). // Врачебное сословие, 2007, №4, с. 39-46. (Камалов А.А, Ефремов Е.А., Охоботов Д А.);

3. Иммунологические факторы бесплодия и антигены сперматозоидов. // Медицинские науки, 2007, №4, с. 31-42. (Охоботов Д.А., Зарайский Е.И., Павлова Г.В., Камалов A.A.);

4. Трансплантация сперматогенных стволовых клеток в эксперименте и клинической практике (алпогенная, ксеногенная, сингенная). И Аспирант и соискатель, 2007 - №5 (42)- с. 108-119. (Охоботов Д.А., Камалов A.A., Зарайский Е.И., Павлова Г.В.);

5. Стволовые клетки и их использование в клинической практике. (Обзор литературы). Медицинские науки, 2007, №6, с.24-41. (Охоботов Д.А., Павлова Г.В., Зарайский Е.И., Камалов A.A.);

6. Оценка фертилыюсти у животных при изучении эффектов ксеногенной трансплантации культур обогащенных стволовыми клетками на модели двухстороннего трехнедельного абдоминального кригггорхизма.// Научная конференция «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии», сборник научных трудов, г. Москва, 21 февраля 2008 г. С.151-153. (Сухих Г.Т., Полтавцева P.A., Зарайский Е.И., Камалов А.А, Кирпатовский В.И., Плотников Е.Ю, Павлова Г.В., Охоботов ДА.);

7. Оценка изменения гормонального профиля у крыс при изучении эффектов ксеногенной трансплантации культурами, обогащенными стволовыми клетками, на модели двухстороннего трехнедельного абдоминального крипторхизма. Научная конференция «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии», сборник научных трудов, г. Москва, 21 февраля 2008 г., С. 148-150. (Сухих Г.Т., Полтавцева P.A., Зарайский Е.И, Камалов А.А, Кирпатовский В.И., Плотников ЕЛО., Павлова Г.В., Охоботов Д.А.);

8. Использование модели двухстороннего абдоминального крипторхизма для изучения нарушений фертильности у животных». Научная конференция «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии», сборник научных трудов, г. Москва, 21 февраля 2008 г., С.52-54. (Зарайский Е.И., Камалов А.А, Кирпатовский В.И., Кудрявцев Ю.В., Павлова Г.В., Охоботов Д.А.);

9. Лечение индуцированного пшергонадотропного гипогонадизма у животных обогащенными клеточными культурами различных видов в эксперименте. // Тезис. Первый пленум научного общества урологов Узбекистана - сборник трудов -Тошкент, 2008г. - С.214-216. (Камалов А.А, Сухих Г.Т., Полтавцева P.A., Зарайский Е.И., Кирпатовский В.И., Ефремов Е.А., Охоботов Д.А.);

10. Лечение инфертилыюсти у животных трансплантацией обогащенных клеточных культур различных видов в эксперименте. // // Тезис. Первый пленум научного общества урологов Узбекистана - сборник трудов - Тошкент, 2008г. — С.228-229. (Камалов А.А, Сухих Г.Т., Зарайский Е.И, Кирпатовский В.И., Плотников Е.Ю., Ефремов ЕЛ., Охоботов Д.А.)

11. Роль высоких технологий в повышении репродуктивного потенциала мужского населения. // Тезис. Первый пленум научного общества урологов Узбекистана -сборник трудов - Тошкент, 2008г. - С.174. (Аполихин О.И., Камалов A.A., Щеплев П А., Ефремов Е.А., Гарин H.H., Охоботов Д.А.);

12. Стволовые клетки и их использование в клинической практике. (Обзор литературы). // Медицинские науки, 2007, №6, с 24-41. (Охоботов ДА., Павлова Г.В., Зарайский Е.И., Камалов А А.);

13. Влияние ксенотрансплантации клеточных культур, обогащенных стволовыми и прогениторными клетками на гормональный профиль крыс с абдоминальным кригггорхизмом. // Клеточные технологии в биологии и медицине, 2008, №4, с. 5-9 (Сухих Г.Т., Камалов A.A., Полтавцева P.A., Зарайский Е.И., Плотников Е. Ю., Кирпатовский В.И., Ефремов Е.А., ОрловаЕ.В., ПавловаГ.В., Охоботов Д А.);

14. Особенности регенерации тестикулярной ткани и восстановление фертилыюсти у крыс на фоне ксенотрансплантации обогащенных фетальных клеточных культур при двухстороннем абдоминальном крипторхизме. // Урология, 2008, №6, с. 7-11 (Камалов A.A., Сухих Г.Т., Кирпатовский В И., Зарайский Е.И., Полтавцева P.A., Плотников Е.Ю., Кудрявцев Ю.В, Ефремов Е.А., Охоботов Д.А.);

15. Перспективы развития высокотехнологической медицинской помощи пациентам гидрологического профиля. // IV Российский конгресс «Мужское здоровье», 12-14 ноября 2008 г, тезис, с.6-7 (Камалов А.А, Ефремов Е.А., Охоботов Д.А., Мельник Я.И.)

16. Исследование восстановления фертильности у животных после экспериментальной трансплантации обогащенных клеточных культур различных видов. // IV Российский конгресс «Мужское здоровье», 12-14 ноября 2008 г, тезис, с.16-17 (Камалов A.A., Сухих Г.Т., Зарайский Е.И., Кирпатовский В.И., Плотников Е.Ю., Ефремов Е.А., Охоботов Д А.)

17. Оценка индекса спермагогсненза после трансплантации обогащенных клеточных культур в эксперименте. // IV Российский конгресс «Мужское здоровье», 12-14 ноября 2008 г, тезис, с. 17-18 (Камалов A.A., Сухих Г.Т., Кирпатовский В.И., Ефремов Е.А, Охоботов Д А.)

Подписано в печать 15.11.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ №1198 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Оглавление диссертации Охоботов, Дмитрий Александрович :: 2008 :: Москва

1. Введение.стр.

2. Цель и задачи работы.стр.

3. Глава 1. Обзор литературы.стр.

4. Глава 2. Материалы и методы.стр.

5. Глава 3. Определение степени нарушений, обратимости и восстановления сперматогенеза при экспериментальном двухстороннем абдоминальном крипторхизме.стр.

6. Глава 4. Влияние ксенотрансплантации культур, обогащенных фетальными стволовыми и прогениторными клетками различных видов, на функциональное состояние крипторхированных яичек.стр.

8. Глава 5. Осложнения экспериментальной работы.стр.

Введение диссертации по теме "Урология", Охоботов, Дмитрий Александрович, автореферат

Актуальность темы

Во всем мире проблема инфертильности имеет не только важное медицинское, но социальное значение. Демографические показатели России и многих стран мира свидетельствуют об увеличении частоты инфертильности у мужчин, достигающей в среднем от 30 до 50 %. Доля «мужского» фактора бесплодия в общей доле бесплодных браков составляет по некоторым данным от 30 до 40 % (Божедомов В.А., 2001, Тер-Аванесов Г.В., 2000).

На фертильность мужчин оказывают влияние различные социальные и демографические факторы, такие как загрязнение окружающей среды, стрессы, привычные интоксикации и другие (Курило Л.Ф., Гришина Е.М., 2006). Полиэтиологичность мужского бесплодия, сложность развития заболевания, функциональная взаимосвязь мужских гонад со всеми системами и органами, создают большие трудности в разработке адекватных методов лечения сперматогенеза (Тер-Аванесов Г.В., 2000).

В связи с увеличением числа бесплодных браков, на фоне увеличения доли мужского бесплодия, актуальной задачей на сегодняшний день, является разработка новых методов лечения инфертильности у мужчин. В последние годы, появившиеся инновационные методики лечения, такие как нанотехнологии, генная инженерия, терапия стволовыми клетками, и успехи их применения, о которых периодически сообщается в мировой печати, заслуживают пристального внимания и могут рассматриваться в качестве перспективных методов для лечения мужского бесплодия. Имеются попытки применения культур, обогащенных различными видами стволовых клеток (сингенных, аутологичных и.т.д.) для восстановления фертильности у мужчин, результаты которых часто являются предметом дискуссии и служат предметом дальнейшего изучения (Ogawa Т, et al., 2003, Shinohara Т., 2006).

Сперматогенез это процесс, осуществляющийся у мужчин на протяжении всей жизни. Обусловлен он делениями спермальных стволовых клеток, имеющих по некоторым данным неограниченный потенциал деления (Russell L.D., 1990). Это предположение основано на том, что эти клетки имеют высокий потенциал дифференцировки, самообновления, и быстрого деления.

Цель работы: Улучшение сперматогенеза у мужчин путем определения влияния ксенотрансплантации клеточных культур, обогащенных стволовыми клетками различных видов, при экспериментальном крипторхизме.

Задачи исследования:

2. Изучить фертильность экспериментальных животных на фоне сформированного двухстороннего абдоминального крипторхизма, оценить изменения и возможности восстановления после его устранения.

Научная новизна

Дана комплексная оценка экспериментальному, линейному, управляемому, абдоминальному, двухстороннему крипторхизму, который может быть использован в качестве биологической модели для оценки эффекта новых методов лечения инфертильности в эксперименте, в том числе при ксенотрансплантации культур, обогащенных человеческими фетальными прогениторными и стволовыми клетками различных видов. Продемонстрирована безопасность ксенотрансплантации клеточных культур в эксперименте у животных. Отмечено восстановление показателя фертильности при ксенотрансплантации культур, обогащенных человеческими фетальными прогениторными и стволовыми клетками разных групп в поздние сроки наблюдения.

Доказано что гипогонадизм у крыс развивается вследствие непосредственного поражения тестикулярной ткани при абдоминальном крипторхизме и характеризуется гипоплазией яичек, повышением уровней гонадотропинов в крови и снижением уровня общего тестостерона.'

Ксенотрансплантация культур обогащенных стволовыми и прогениторными клетками у животных приводит к более быстрому и более полноценному восстановлению сперматогенеза и общего тестостерона в сравнении с контрольной группой.

Установлено, что нормальные показатели уровня общего тестостерона у крыс после трансплантации обогащенных клеточных культур обеспечиваются за счет гиперфункции имеющейся стабильной популяции клеток Лейдига, с признаками нормохромии ядер и средним количеством хромафинных зерен. Доказано, что при отсутствии лечения относительная нормализация уровней гонадотропинов и общего тестостерона обеспечивается, за счет количественных показателей гиперплазированной популяции клеток Лейдига, находящихся в крайнем функциональном напряжении.

Практическая значимость работы

Усовершенствована модель экспериментального двухстороннего абдоминального крипторхизма. Изучены особенности повреждения и восстановления сперматогенеза у экспериментальных животных на разных сроках. Установлены сроки восстановления фертильности и синтеза общего тестостерона у животных при экспериментальном крипторхизме. Разработана оптимальная техника тканевой трансплантации под капсулу яичка и доказана ее эффективность и безопасность для животных. Проведена оценка эффективности восстановления сперматогенеза при экспериментальном крипторхизме. после введения обогащенных клеточных культур различных видов. Исключено влияние операционного стресса на фертильность экспериментальных животных.

Связь с планом НИР ФГУ «НИИ урологии Росмедтехнологий»

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ (НИР) ФГУ «НИИ урологии Росмедтехнологий», а также с планами НИР Проблемной комиссии №24.00 Межведомственного Научного Совета по «Уронефрологии» РАМН и Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации - № государственной регистрации 0120.0 807031.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 36 отечественных и 100 зарубежных источников литературы. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 22 рисунками.

Заключение диссертационного исследования на тему "Влияние культур, обогащенных стволовыми клетками, на сперматогенез при экспериментальном двухстороннем крипторхизме"

106 Выводы.

2. Стрессовое воздействие оперативного вмешательства не оказывает влияния на фертильность экспериментальных животных, так как животные хорошо переносят фантомные (ложные) операции, оставаясь фертильными к 21 суткам. Двухсторонний абдоминальный крипторхизм в течение 14 суток приводит к выраженной инфертильности у крыс. После его устранения происходит частичное восстановление фертильности в отдаленные сроки максимального наблюдения, не ранее 72 суток, при этом, чем больше экспозиция, тем меньше вероятность восстановления этой функции.

Наиболее выраженное восстановление фертильности у крыс оказывает трансплантация обогащенной культуры клеток фетального яичка. Влияние ксенотрансплантации культур обогащенных стволовыми и прогениторными клетками других видов на сперматогенез выражено меньше. Ксенотрансплантация культур, обогащенных стволовыми и прогениторными клетками различных видов, приводит к эффективному восстановлению утраченных при крипторхизме функций яичка, но зависит от степени повреждения тканей, которая определяется временем воздействия. Прогноз ксенотрансплантации обогащенных клеточных культур у крыс с абдоминальным крипторхизмом, сроком более 21 суток - неблагоприятен.

В отдаленные сроки у животных в тканях семенников были выявлены клетки трансплантированной культуры, окрашенные бромдиоксиуридином, а клетки меченные специфическими моноклональными антителами выявлены не были, что свидетельствует о том, что трансплантированные человеческие клетки длительно выживают в семенниках у крыс, стимулируя собственный сперматогенез животных. Сперматозоидов, обладающих человеческими антигенами, при идентификации моноклональными кроличьими антителами к суммарному антигену сперматозоидов человека у крыс выявлено не было. После ксенотрансплантации обогащенных клеточных культур в семенных канальцах происходит снижение индекса сперматогенеза, что говорит об активном увеличении форменных элементов сперматогенеза по отношению к общему количеству-клеток Сертоли.

108

Практические рекомендации

1. Экспериментальная модель двухстороннего абдоминального крипторхизма является удобной и достаточной для изучения и внедрения новых методов лечения инфертильности и гипергонадотропного гипогонадизма.

2. Клинический эффект восстановления функции яичек при ксенотрансплантации обогащенных клеточных культур у экспериментальных животных зависит от длительности воздействия на яички при формировании абдоминального крипторхизма. В связи с этим использование данного метода при сроке экспериментального крипторхизма более 21 суток неэффективно.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2008 года, Охоботов, Дмитрий Александрович

1. Артюхин А. Репродуктивная ангиоандрология. Москва, 2006

2. Артюхин A.A. Зарайский Е.И.; Способ лечения больных с нарушением мужской половой функции методом трансплантации. №2200010 10.03.03

3. Артюхин A.A. Зарайский Е.И.; Романов А.И. Способ лечения больных с нарушением мужской половой функции методом трансплантации. Патент РФ на изобретение №2200012, 10.03.2003

4. Берсенев A.B., Крашенинников М.Е., Онищенко H.A., Клеточная терапия дислипидемий и атеросклероза, (аналитический обзор). Вестник трансплантологии и искусственных органов 2001; 2: 46-53.

5. Берсенев A.B. Клеточная трансплантология: история, современное состояние и клеточные перспективы. Обзор литературы. Клеточная трансплантология и тканевая инжененрия. №1,2005, стр. 49-56.

6. Божедомов В.А., Лоран О.Б., Николаева М.А., Сухих Г.Т. Влияние антиспермальных антител на мужскую репродуктивную функцию. // Андрология и генитальная хирургия. 2000. - №2.- С.25-33.

7. Божедомов В.А., Лоран О.Б., Сухих Г.Т. Этиология и патогенез мужского аутоиммунного бесплодия. Часть 2. // Андрология и генитальная хирургия. 2001. -№1. - С.78-87.

8. Боярский К.Ю. Старение репродуктивной системы и результативность вспомогательных репродуктивных технологий (обзор литературы)// Проблемы репродукции. 1996.-№4. -с.37-42.

9. Временная инструкция о порядке исследований в области клеточных технологий и их использования в учреждениях здравоохранения. Экспертный Совет Минздрава России (18.04.2002)

10. Дендеберов Е.С. Культуральная аллотрансплантация неонатальных эндокриноцитов семенников. Дисс. На соиск. Уч.ст.к.м.н., Москва, 1993

11. Дендеберов Е.С., Кирпатовский И.Д., Михалева Л.М.; Новые подходы к лечению крипторхизма, сочетающегося с вторичным гипогонадизмом. Проблемы репродукции №2 2001 год

12. Джарбусынов Б.У., Мужское бесплодие (диагностика и лечение), Диссертация на соискание уч.ст дмн, 1983

13. Зарайский Е.И.; Артюхин A.A.; Романов А.И. Способ получения первичной культуры клеток семенника, обогащенной клетками Лейдига Патент РФ на изобретение №2220200, 27.10.2003

14. Калашникова Е.А., Антигены сперматозоидов и антиспермальные антитела, ассоциированные с бесплодием. Обзор литературы. (Sperm antigens and antisperm antibodies associated with infertility), Москва Проблемы репродукции , Том 10, 4, 2004

15. Кирпатовский И.Д., Макажанов О.Х., Баскаков В.В. Андрологические аспекты хирургического лечения крипторхизма. Урология и нефрология 1986; 1: 116-119.

16. Ковалевский К.Л., Лабораторное животноводство. Практическое руководство по разведению, содержанию и применению лабораторных животных. Издательство АМН СССР, Москва, 1951.

17. Кулаков В.И., Бесплодный брак, издание под.ред., 2005

18. Курило Л.Ф. Некоторые этические вопросы технологии эмбриональных стволовых клеток, проблемы репродукции, №3, 2000.

19. Курило Л.Ф., Гришина Е.М. Роль структурных хромосомных аномалий в развитии патозооспермии у мужчин с бесплодием. №4, 2006, с. 36-41

20. Лищук В.А., Мосткова Е.В., «Стволовые клетки: исследования и практика». Валеология, №2, 2003.

21. Мираков К.К., с соавт. Лечение крипторхизма у детей. Прил. к журн. Андрология и генитиальная хирургия. Тезисы научных трудов Международного конгресса по андрологии, Москва, 2006

22. Моисеев А.Я., Самарин ДМ, Кустов СМ и др. Опыт применения трансплантационной фетальной терапии в гинекологической практике при лечении рубцово-спаечных процессов. Бюлл. Эксп.Биол.Мед. 1998, 126 Прилож 1:129.

23. Райцина С.С. Травма семенника и аутоиммунитет.- М.: Медицина, 1970.- 183 с.

24. Репин B.C., Сухих Г.Т., Медицинская клеточная биология, 1998 г.

25. Рунович АА, Курильская ТЕ, Никифоров СБ и др.: Эффективность фетальной терапии в комплексном лечении ишемической болезни сердца. Материалы 2 Межрегиональной научно-практической конференции (г.Омск, 27-28 июня 2000 г.): 76-80.

26. Сергеев B.C., Иммунологические свойства стромальных (мезенхимальных) стволовых клеток. Клеточные технологии, 04,2005.

27. Симодейко A.A. Рациональные подходы хирургического лечения и реабилитации больных крипторхизмом. Автореф. д-ра мед. наук. М 1994.

28. Стрункин ДН, Самарин ДМ, Сидоров СВ. Трансплантация кроветворных фетальных клеток в лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Материалы 2 Межрегиональной научно-практической конференции (г.Омск, 27-28 июня 2000 г.): 194-195.

29. Сухих Г.Т., Трансплантация фетальных клеток в медицине: настоящее и будущее. Трансплантация фетальных тканей и клеток. Сборник научных трудов. Приложение 1 к журналу «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», Москва, 1998.

30. Тер-Аванесов Г.В. Андрологические аспекты бесплодного брака. Практ. Руководство. М. 2000.

31. Филатов В.Ф., Загорцева Л.Л., Яковцева А.Ф., Желудева В.И., Журнал болезней уха, горла и носа, №5, 1978, с.72.

32. Хеффнер Л., Половая система в норме и патологии: Учеб. Пособ./ Перс. С англ. А.Г.Гунина.- М.ГЭОТАР-МЕД 2003, с.28.

33. Шумаков В.И., Блюмкин В.И., Скалецкий Н.Н. Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы. М.: 1995.

34. Юнда И.Ф., Имшинецкая Л.П.; К вопросу об эндокринных нарушениях при искусственном крипторхизме у крыс.- В сб.: Физиология, биохимия и патология эндокринной системы. Матер. Респ. Конф. К. 1969, 231-232. '

35. Ярыгин В.Н., Клеточные технологии медицине. Докл. на Президиуме РАМН, 29.05.2002.

36. Aggarwal S. and Pittenger М. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood 2005; 105: 1815-1822

37. Almici C., Carbo-Stella C., Mangoni L. et al. Biologic and phenotypic analisis of early hematopoietic progenitor cells in umbilical cord blood// Blood.- 1997.- Vol.90, N.10.-P.339b (4274).

38. Arcese W., Aversa F., Bandini G. et al. Clinical use of allogeneic hematopoietic stem cells from sources other than bone marrow// Haematologica.- 1998.- Vol. 83.- N. 2.- P. 159-182.

39. Atkinson K., Clinical Bone Marrow and Blood Stem Cell Transplantation. "Cambridge University Press" 2003; 3rd ed., 2000.

40. Auger J ; Evolution of male fertility in the last twenty years; Contracept Fertil Sex. 1997 Jul-Aug;25(7-8):524-9.

41. Baccarani U, Adani G.L, Sanna A. et al. Portal vein thrombosis after intraportal hepatocytes transplantation in a liver transplant recipient, Transpl Int 2005; 186): 750.

42. Baksh D., L. Song, R. S. Tuan, Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy, J. Cell. Mol. Med. Vol 8, No 3,2004 pp. 301-316

43. Bartholomew A, et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol 2002; 30: 42-48

44. Bertolini F., Battaglia M. et al. Placental blood collection: Effects on Newborns// Blood.-1995.- Vol.85.-P.3361-3362

45. Bianchi G., Banfi A., Mastrogiacomo M., Notaro R., Luzzatto L., Cancedda R., Quarto R., Ex vivo enrich ment of mesenchymal cell progenitors by fibroblast growth factor 2, Exp. Cell Res., 287: 98-105, 2003

46. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P.G., Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications, Stem Cells, 19: 180-192, 2001

47. Brinster R & Zimmermann J., Spermatogenesis following male germ cell transplantation. Proc Natl Acd Sci USA 91:11298-11302, 1994.

48. Brinster R.L.; Germline stem cell transplantation and transgenesis; Science. 2002 Jun 21; 296(5576):2174-6

49. Brittberg M., Tallheden T. Sjogren-Jansson a. et al. Autologous chondrocytes used for articular cartilage repair: an update. Clin Orthop Retat Res 2001; 331: 337.

50. Carlsen E, Petersen JH, Andersson AM, Skakkebaek NE; Effects of ejaculatory frequency and season on variations in semen quality; Fertil Steril. 2004 Aug;82(2):358-66

51. Castro-Malaspina H., Gay R.E., Resnick G., Kapoor N., Meyers P., Chiarieri D., McKenzie S., Broxmeyer H.E., Moore M.A., Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny, Blood, 56: 289-301, 1980

52. Clouthier D, Avarbock M, Maika S, Hammer RE, Brinster RL.; Rat spermatogenesis in mouse testis. Nature 381: 418-421, 1996.

53. Cremades N, Bernabeu R, Barros A, Sousa M.; In vitro maturation of round spermatids using co-culture on Vero cells. Hum Reprod 14: 1287-1293, 1999.

54. De Kretser DM, Kerr JB. The cytology of the testis. In: Knobil E, Neill JD (eds.), The Physiology of Reproduction. New York: Raven Press; 1994: 1177-1290

55. Dejbakhsh-Jones S, et al. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells. J Immunol 1995; 155: 3338-3344

56. Di Nicola M, et al. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli. Blood 2002; 99: 38383843

57. Djouad F, et al. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals. Blood 2003; 102: 3837-3844

58. Dobrinski I, Ogawa T, Avarbock MR, Brinster RL.Computer assisted image analysis to assess colonization of recipient seminiferous tubules by spermatogonial stem cells from transgenic donor mice. Mol Reprod. Dev 1999; 53:142-148.

59. Doi M., Nagano A., Nakamura Y., Molecular cloning and characterization of a novel gene, EMILIN-5, and its possible involvement in skeletal development, Biochem.Biophys. Res. Commun., 313: 888-893, 2004

60. Ferguson J., Scothorne R.J. Extended survival of pancreatic islet allografts in the testis of guinea-pigs. J Anat. 1977 Sep; 124 (Pt l):l-8

61. Fisch H, Ikeguchi EF, Goluboff ET; Worldwide variations in sperm counts. Urology.- 1996 Dec;48(6):909-11.

62. Friedenstein A.J., Osteogenetic activity of transplanted transitional epithe lium, Acta Anat. (Basel), 45: 31-59, 1961.

63. Friedenstein AJ, Petrakova KV, Kurolesova AI, Frolova GP . Heterotopic of bone marrow.Analysis of precursor cells for octeogenic and hematopoeietic tissue; Transplantation 1968, v.6: P.230-47.

64. Gangji V., Hauzeur J.P. Treatment of osteonecrosis of the femoral head with implantation of autologous bone-marrow celts. Surgical technique. J Bone Joint Surg Am 2005; 87 Suppl 1.

65. Gratwohl A., Hermans J., Baldmero H.// Bone Marrow Tranplantant.- 1996- Vol. 17.-P.137-148.

66. Guerin J.F.; Testicular tissue cryoconservation for prepubertal boy: indications and feasibility; Gynecol Obstet Fertil. 2005 Oct;33(10):804-8

67. Harada S., Rodan G.A., Control of osteoblast function and regulation of bone mass, Nature, 423: 349-355,2003

68. Head J.R., Neaves WB, Billingham RE. Immune privilege in the testis. I. Basic parameters of allograft survival. Transplantation. 1983 Oct;36(4):423-31.

69. Hill J.R., Dobrinski I.; Male germ cell transplantation in livestock; Reprod Fertil Dev. 2006; 18(1-2): 13-8

70. Huckins C. The spermatogonial stem cell population in adult rats. I.Their morphology, proliferation and maturation. Anat Rec 1971; 169: 533-558.

71. Ilio K.Y., Grayhack J.T., Lee C. Experimental cryptorchidism inhibited growth of the rat ventral prostate. J Androl 2000 May-Jun; 21(3): 438-43.

72. Irvine S, Cawood E, Richardson D, MacDonald E, Aitken J. ; Evidence of deteriorating semen quality in the United Kingdom: birth cohort study in 577 men in Scotland over 11 years; BMJ. 1996 Feb 24;312(7029):467-71.

73. Isojima S. Recent studies of sperm immobilizing antibodies in the sera of sterile women with unknown cause. In: Mohri H, Ed. Proc 6th Annual Meeting of Japan Soc Immunol Reprod, Hayashi-Kobe, Co. Ltd., Tokyo, Japan, pp9-17, 1992.

74. Jahnukainen K, Ehmcke J, Schlatt S.; Testicular xenografts: a novel approach to study cytotoxic damage in juvenile primate testis 2006 Apr l;66(7):3813-8.

75. Jiang F.X.; Male germ cell transplantation: promise and problems; Reprod Fertil Dev. 2001;13(7-8):609-14

76. Jiang X, et al. Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells. Blood (prepublished online Feb 3, 2005); DOI 10.1182/blood-2004-02-0586

77. Jorgensen C, et al. Engineering mesenchymal stem cells for immunotherapy. Gene Therapy 2003; 10: 928-931.

78. Kawakami E., Hori T., Tsutsui T. Function of contralateral testis after artificial unilateral cryptorchidism in dogs. J Vet Med Sci 1999 Oct; 61(10): 1107-11.

79. Kliesh S., Behre H.M., Nieshlag E. Recombinant human follicle-stimulating hormone and human chorionic gonadotropin for induction of spermatogenesis in a hypogonadotrophik male. Fertil.Steril. 1996, 66, 164.

80. Kobayashi N., Okitsu T., Lakey J.R., Tanaka N. The current situation in human pancreatic islet transplantation: problems and prospects. JArcif Organs. 2004; 7: 1.

81. Kogler G., Sarnowski A., Wernet P. Volume reduction of cord blood by Hetastarch for long-term cell banking// Bone Marrow Transplant.- 1998.- Vol. 22.- Suppl. 1.- P. S.14-15.

82. Koller M.R., Manchel I., Palsson B.O., Importance of parenchymal:stromal cell ratio for the ex vivo reconstitution of human hematopoiesis, Stem Cells, 15: 305-313,1997

83. Kondziolka D., Wechsler L. Goldstein S. et al. Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke. Neurology 2000; 55: 565

84. Kudo FA, et al. Autologous transplantation of peripheral blood endothelial progenitor cells (CD34+) for therapeutic angiogenesis in patients with critical limb ischemia. Int Angiol 2003; 22; 344-348

85. Kuznetsov S.A., Krebsbach P.H., Satomura K., Kerr J., Riminucci M., Benayahu D., Robey P.G., Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo, J. Bone Miner. Res., 12: 1335-1347, 1997

86. Lazarus H.M., Koc O.N., Devine S.M. et al. Cotransplantetion of HLA-identical sibling culture-expanded mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells in hematologic malignancy patients. Biot Blood Marrow Transplant 2005: 11 (5): 389.

87. Le Blanc K, et al. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol 2003; 31: 890-896

88. Lee M.S. LJII M., Makkar R.R. Stem cell transplantation in myocardial infarction. Rev Cardiovasc Med 2004; S: 82.

89. Lindvalt O., Bjorklund A. Cell Therapy in Parkinson's Disease. Neuron* 2004; 1:3B2.

90. Lue Y, Erkkila K, Liu PY, Ma K, Wang C, Hikim AS, Swerdloff RS. Fate of bone marrow stem cells transplanted into the testis: potential implication for men with testicular failure. Am J Pathol. 2007 Mar;170(3):899-908.

91. Marshak D.R., Gardner R.L. and Gottlieb D., Stem Cell Biology. Gold Spring Harbor: Laboratory Press, 2002. - 544 p.

92. Mei-Hui Tai, Chia-Cheng Chang, L. Karl Olson, and James E. Trosko. Oct.4 expression in adult human stem cells: evidence in support of the stem cell theory of carcinogenesis. Carcinogenesis doi:10.1093.

93. Miura M, Miura Y, Padilla-Nash HM, et al. Accumulated chromosomal instability in murine bone marrow mesenchymal stemcells leads to malignant transformation. Stem Cells 2005 Nov 10; E.pub.

94. Nagano M., Patrizio P.,Brinster R.L.; Long-term survival of human spermatogonial stem cells in mouse testes.; Fertil Steril. 2002 Dec; 78(6): 1225-33

95. Niehans P, Die Zellulartherapie. Verlag von Urban & Schwarzenberg. Munhen- Berlin, 1954.

96. Nikolaos S., Apostolos K., Xenophon G., Ikuo M.; How far are ICSI procedures using human spermatozoa generated into animal testicles ? Micro- and macro-concequences of germ cell transplantation techniques. Male infertility today , 4,2004.

97. Odorico J.S., Kaufman D.S., and Thomson J.A. Multilineage differentiation from human embryonic stem cell lines // Stem Cells. 2001. - Vol. 19. - P. 193-204.

98. Ohl D.A., Naz R.K. Infertility due to antisperm antibodies. Urology 1995; 46: 591-602.

99. Ohta H, Yomogida K, Dohmae K, Nishimune Y.;Regulation of proliferation and differentiation In spermatogonial stem cells: the role of c-kit and Its ligand SCF. Development 127: 2125-2131, 2000.

100. Orlic D., Hill J.M., Arai A.E. Stem cells for myocardial regeneration // Circ. Res. -2002.-Vol. 91.-P. 1092-1102.

101. Orth JM. Cell biology of testicular development in the fetus and neonate. In: Desjardins C, Ewing LL (eds.), Cell and Molecular Biology of the Testis. New York: Oxford University Press; 1993: 3-42

102. Oatley J.M.,de Avila D.M., Reeves J.J., McLean D.J.; Spermatogenesis and germ cell transgene expression in xenografted bovine testicular tissue; Biol Reprod. 2004 Aug;71 (2) :494-501.

103. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R., Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells, Science, 284: 143-147, 1999.

104. Potten C.S., Ellis JR, Adult small intestinal stem cells: identification, location, characteristics, and clinical applications; Ernst Schering Res Found Workshop. 2006; (60): 81 -98

105. Rassoulzadegan M, Paquis-Flucklinger V, Bertino B, Sage J, Jasin M, Miyagawa K, Van Heyningen V, Besmer P, Cuzin F.;Transmeiotic differentiation of male germ cells ; in culture. Cell 75: 997-1006, 1993.

106. Rayfer J. Surgical and hormonal-therapy for cryptochidism an overviev, HORMONE RESEARCH, 1988,30(4-5): 139-143

107. Rubio D, Garcia-Castro J, Martin MC, et al. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res 2005; 65: 3035-9

108. Russell LD, Ettlin RA, SinhaHikim AMammalian spermatogenesis. In: Histological and Histopathological Evaluation of the testis. P, Clegg ED (eds.). Clearwater, FL: Cache River Press; 1990: 1-40.

109. Scadden D.T., The stem-cell niche as an entity of action. Nature. Vol. 441, 29 june 2006.

110. Schlatt S, von Schonfeldt V, Nieschlag E. Germ cell transplantation in the male: animal studies with a human perspectiveHum Fertil (Camb). 1999;2 (2): 143-148.

111. Schofield R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell. Blood Cells 1978 4:7-25

112. Schwartz R.H., A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy. Science 1990; 248: 1349-1356

113. Shamblott M.J.,J. Gaerhart et al.Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells; Proc.Natl.Acad.Sci.US; 1998,v.95, P.13726-31.

114. Shinohara T., Orwig K.E., Avarbock M.R., Brinster R.L.; Restoration of Spermatogenesis in Infertile Mice by Sertoli Cell Transplantation; BIOLOGY OF REPRODUCTION 68, 1064-1071 (2003)

115. Singh S.K., Hawkins C., Clarke I.D., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature 2004; 432: 396-401

116. Song L., Chau L., Sakamoto Y., Nakashima J., Koide M., Tua n R.S., Electric field-induced molecular vibration for noninvasive, high-efficiency DNA transfection, Mol. Ther., 9: 607-616,2004

117. Strauer B.E. and Kornowski R. Stem cell therapy in perspective // Circulation. 2003. -Vol. 107.-P. 929-934.

118. Suzuki N, Withers HR.Exponential decrease during ageing and random lifetime of mouse spermatogonial stem cells. Science 1978; 202: 1214-1215.

119. Tateishi-Yuyama E, Matsubara H, Murohara T, et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomized controlled trial. Lancet 2002; 360: 427-435

120. Teiji O. Treatment for limb ulcer with severe ischemia: therapeutic angiogenesis by autologous transplantation of bone-marrow. Wound Repair Regen. 2004; 12; 1: A5

121. Thomson J. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocyst; Science; 1998, v.282, P.l 145-47.

122. Verfaille C. medical Promise of Adult Stem Cell Research (Present and Projected) // The Presidents Councill of Bioethics 3d meeting. 2002.

123. Yulliet P.R. Greeley M., Hslloran S.M. et all. lntra-coronary arterial injection of mesenchymal stromal cells and microinf a ration in dogs. Lancet 2004; 363: 783.

124. Watson 0. Keller G.S., Lacombe V. et al, Autologous fibroblasts for treatment of facial rhytids and dermal depressions. Arch Facial Plast. Surg 1090: 1: 165.

125. Young-Sup Yoon, Park J.S., Tkebuchava T, et al. Unexpected severe calcification after transplantation of bone marrow cells in acute myocardial infarction Ore 0004; 109: 3154.

126. Zhang C, Wang L.L, Song C., Jin H.M. Allotransplantation of spermatogonial stem cells in KM mice.; Zhonghua Nan Ke Xue. 2003 Sep; 9(6):417-20

127. Zhang Z., Shao S., Meistrich M.L.; Irradiated mouse testes efficiently support spermatogenesis derived from donor germ cells of mice and rats; J Androl. 2006 May-Jun; 27(3):365-75.

128. Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

129. Трансплантация стволовых клеток при лечении мужского бесплодия. // Вторая Всероссийская конференция «Мужское здоровье», тезис, С.56. (Камалов A.A., Сухих Г.Т., Ефремов Е.А., Охоботов Д.А.);

130. Стволовые клетки и их использование в современной клинической практике. (Обзор литературы). // Врачебное сословие, 2007, №4, с. 39-46. (Камалов A.A., Ефремов Е.А., Охоботов Д.А.);

131. Иммунологические факторы бесплодия и антигены сперматозоидов. // Медицинские науки, 2007, №4, с. 31-42. (Охоботов Д.А., Зарайский Е.И., Павлова Г.В., Камалов A.A.);

132. Трансплантация сперматогенных стволовых клеток в эксперименте и клинической практике (аллогенная, ксеногенная, сингенная). // Аспирант и соискатель, 2007 -№5 (42)- с.108-119. (Охоботов Д.А., Камалов A.A., Зарайский Е.И., Павлова Г.В.);

133. Стволовые клетки и их использование в клинической практике. (Обзор литературы). Медицинские науки, 2007, №6, с.24-41. (Охоботов Д.А., Павлова Г.В., Зарайский Е.И., Камалов A.A.);

134. P.A., Зарайский Е.И., Камалов А.А, Кирпатовский В.И., Плотников Е.Ю., Павлова Г.В., Охоботов Д.А.);

135. Стволовые клетки и их использование в клинической практике. (Обзор литературы). // Медицинские науки, 2007, №6, с. 24-41. (Охоботов Д.А., Павлова Г.В., Зарайский Е.И., Камалов A.A.);

136. Перспективы развития высокотехнологической медицинской помощи пациентам андрологического профиля. // IV Российский конгресс «Мужское здоровье», 12-14 ноября 2008 г, тезис, с.6-7 (Камалов A.A., Ефремов Е.А., Охоботов Д.А., Мельник Я.И.)

Автореферат диссертации по медицине на тему Влияние культур, обогащенных стволовыми клетками, на сперматогенез при экспериментальном двухстороннем крипторхизме

Оглавление диссертации Охоботов, Дмитрий Александрович :: 2008 :: Москва

Введение диссертации по теме "Урология", Охоботов, Дмитрий Александрович, автореферат

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2008 года, Охоботов, Дмитрий Александрович

Похожие научные работы

Каталог диссертаций