Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние иммуностимулятора "Вегетан" на свойства мембраны В-лимфоцитов: ионные каналы, мембранный потенциал, электрическая емкость мембраны

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ р Г 5 л П ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

КАРИМОВ Далер Пулатович

ВЛИЯНИЕ ИММУНОСТИМУЛЯТОРА "ВЕГЕТАН" НА СВОЙСТВА МЕМБРАНЫ В—ЛИМФОЦИТОВ: ИОННЫЕ КАНАЛЫ, МЕМБРАННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ, ЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ ЕМКОСТЬ

МЕМБРАНЫ.

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 1994 г.

я

/ ^ - л /,;

.. > • .(' /V /

Работа выполнена в Институте иммунологии Мшгздравмсдпрома РФ

Научный руководитель-

доктор медицинских наук, профессор Р.И. Атауллаханов •

Научный консультант-

кандидат биологических наук В.А. Мальцев

Официальные оппоненты:

академик ЛЕН, доктор медицинских наук, профессор А.А. Ярилин . >ктор медицинских наук А.А. Иванов

Ведущей) организация - Российский государственный медицинский университет

Зашита состоится 26 октября 1994 г. в 14 часов' на заседании диссертацнонного совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии Минздравмедпрома РФ по адресу. 115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться о библиотеке Института иммунологии Минадраамедпрома РФ

Автореферат разослан_ 1994 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Л.С. Сеславнна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Вегетан - новый эффективный иммуностимулятор растительной природы, полученный в Институте иммунологии Минздравмедпрома РФ. Он оказывает сильное иммуностимулирующее действие при парентеральном введении различным животным. Описаны условия применения вегетана, при которых реакция антителооброзования на гетерологнчные антигены попыталась в 10100 раз. В культуре лимфоцитов вегетан индуцирует пролиферацию D лимфоцитов и их дифференцировку в Ig-секретирующие клетки. Митогенный эффект вегетана сильнее, чем липополисахарида из E-coli (ЛПС), но при этом он имеет очень широкий диапазон нетоксических митогениых концентраций.

Испытания на животных показали, что вегетан обладает сильным иммуностимулирующим действием и его лечебный эффект при целом ряде тяжелых заболеваний домашних и сельскохозяйственных животных не вызывает сомнений. Для широкого применения такого мощного препарата естественно прежде необходимо детально изучить его структуру и механизмы влияния на иммунную систему. Такие исследования "интенсивно ведутся в Институте иммунологии.под руководством профессора Р.И. Атауллаханова.

Вегетан - это полимер с заряженными карбоксильными группами. В связи с этим было сделано предположение, что он имеет сходный механизм действия с водорастворимыми линейными полннонами-иммуностимуляторамн . Эти вещества с успехом применяют для поликлональной стимуляции иммунитета (Diamantstein Т. et at.,1973, 1975; Земсков В.М.. 1973; Петров Р.В.,Хаитов P.M. и соавт. 1974-1977). Полиионы используют и в качестве иммуноадыовантов для активации специфического иммунного ответа на антиген. Известно, что полиноны активируют миграцию нммунокомпетентных клеток в периферические лимфоидные органы, а также взаимодействие Г и В лимфоцитов в ходе антителогенеза. Полиионы усиливают хелперную функцию макрофагов. Кроме того, они могут выступать в роли ко-факторов пролиферации лнмфоидных клеток. Установлено, что ответ лнмфоидных клеток на полиионы определяется их способностью модифицировать ионпроводящне свойства плазматической мембраны (Атауллаханов Р.И. и соавт. 1984). Полииоп индуцирует быстрое увеличение пассивных потоков К+, Naf, Сз++, что сопровождается активацией транспорта этих катионов мембранными АТФазами (Петров Р.В., Хаитов P.M., Атауллаханов Р.И. 1984). Методом локальной фиксации потенциала patch-clamp было Показано, что эта проводимость имеет иеканальную природу (Мальцев В.А. с соавт, 1989-1991), В настоящей работе меюдом patch-clamp были исследованы изменения ионной проводимости плазматической мембраны лимфоцитов при их активации йегетаном. Влияние вегетана

на клеточную мембрану сравнивали с эффектами других известных активаторов В клеток, и в частности, с влиянием на мембрану В лимфоцитов Л ПС и липшкптида (В-клеточный активатор, синтетический аналог липопротеина из бактериальной стенки), а также с действием ФГА на мембрану Т лимфоцитов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение изменений ионной проводимости плазматической мембраны В лимфоцитов под влиянием нового иммуностимулятора вегетана и сравнение его действия с эффектами других известных активаторов В лимфоцитов -"ПС и липопептида, а также Т клеточного активатора ФГА. В процессе проведения работы решались следующие задачи:

1. Изучение базовых характеристик нон-проводящей системы мембраны В-лимфоцнгов: оценка суммарной ' ионной проводимости и вольт-амперных характеристик мембраны, идентификация ионных каналов, определение их количества, измерение электрического потенциала мембраны и электрической емкости мембраны покоящихся В лимфоцитов.

2. Изучение быстрых (минуты) эффектов вегетана на мон-проводящие свойства мембраны В лимфоцитов.

3. Изучение медленных (часы, десятки часов) эффектов сегетана на нон-проводящие свойства мембраны В лимфоцитов.

4. Сравнение действия вегетана на ноннроводяшне свойства мембраны с эффектами известных активаторов В лимфоцитов (ЛПС, лилопптш) и Т лимфоцитов (ФГА).

Научная иогшяз Впервые показано, что новый иммуностимулятор вегетан, а также синтетический аналог бактериального липопротеина, липопептид, значительно увеличивают, калиевую проводимость плазматической мембраны В лимфоцитов. Показано, что рост проводимости связан не только с увеличением размера клетки, но и с многократным повышением поверхностной плотности калиевых каналов. Эти каналы подробно охарактеризованы и фармакологически идентифицированы. Впервые выявлена и оценена корреляция между площадью поверхности мембраны лимфоцитов и ее калиевой проводимостью в разные сроки активации клеток. Зарегистрированы и подробно описаны Са ^-активируемые К+-каналы в мембране активированных В клеток. Впервые на Т лимфоцитах крови человека и В лимфоцитах мыши при работе в натнвной конфигурации метода patch-clamp была показана гиперполярнзация мембраны в ответ на увеличение внутриклеточной концентрации кальция.

Наушо-практическая значимость Полученные результаты вносят существенный вклад в современные представления о сопряжении рецепции активирующего лиганда с суммарной К+-проводимосшо мембраны лимфоцита, Са++-сигналом и электрическим потенциалом мембраны. Исолсдовины основные электрофизиологические характеристики мембраны до и после активации новым иммуностимулятором всгетаном. Сопоставление размеров клеток с величиной суммарной К+-проводимости в процессе трансформации В лимфоцита в лимфобласт под влиянием вегетана показало, что вегетан значительно увеличивает К+-проводимость, но этот эффект является не сигналом, запукающим процесс активации, а ее следствием. Сравнение действия вегетана с действием ЛПС и липопептида на В лимфоциты и действием ФГА на Т лимфоциты свидетельствует о том, что многократное увеличение К+-проводимости является универсальным признаком бластгрансформации лимфоцитов. Кроме того, обнаружены и охарактеризованы кальций-активируемые калиевые каналы, описанные ранее для возбудимых клеток. Их наличие в мембране лимфоцитов, объясняет механизм сопряжения Са++-сигнала с мембранным потенциалом и ,в частности, гиперполяризацию мембраны ' лимфоцитов при активации. Отработанные автором способы изучения Са++-актнвируемых К+-каналов могут с успехом применяться в электрофизиологических исследованиях.

Апробация работы Основные результаты исследований были обсуждены на Всесоюзном симпозиуме "Ионные каналы в биологических мембранах" (п.Планерское, 1990г.) и на совместной межлабораторной научной конференции лабораторий активации иммунитета . и искусственных антигенов Института иммунологии Минздрава РФ и лаборатории физической биохимии систем крови Гематологического Научного Центра РАМН, от 10.11.1993 г.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введен)1я, обзора литературы, описания материалов и методов, трех 1лав собственных исследований, выводов и списка литературы Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста, иллюстрированы 20 рисунками и 1 таблицей. В списке использованной литературы указаны источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Получение клеток.

В-лимфоциты получали из селезенки мыши (СВА) с помощью колонки с нейлоновой ватой. Для этого 0.6 г. нейлоновой ваты укладывали в 10 мл шприц с резиновой трубкой на конце. Колонку промывали раствором Хэнкса, обогащенным фстальной телячьей сывороткой (5%) н инкубировали в вертикальном положении

1 час в увлажненной среде СОг-ннкубатора при 37°С и 5% COj. После этого зажимом перекрывали нижний конец колонки и наносили

2 ил суспензии клеюк селезенки кл/мл) и инкубировали 45 к .шут и СОг-имкубаторе, От непрнлнпших клеток колонку отмывали 100 мл теплой среды. Затем для получения прилипающих клеток, Пережав нижний конец колонки, добавляли 2 мл охлажденного раствора Версена и пинцетом разминали вату. После этого колонку промывали 10 мл раствора Версена и оставшуюся жидкость выдавливали поршнем. Суспензию прилипающих клеток собирали и центрифугировали при 200 g в течение 10 минут и затем определили жизнеспособность выделенных клеток с помощью трипанового синего красителя. Она составляла не менее 95%. Суспензия прилипающих к вате клеток содержала более 90% В лимфоцитов и менее 5% Т лимфоцитов, что было оценено на проточном цитофлуориметре АТС-3000 (Bruker-ODAM, F.R.O.-Fiance) с использованием fitc-меченных овечьих антител к lg мыши и кроличьих анти-ТЬу!.2 антител.

Т-клеткн выделяли из гепаринизированной венозной крови здоровых доноров. Мононуклеарные клетки получали центрифугированием на градиенте FicoU- Paqut. Затем дли обогащения суслен ми Т-клетками использовали метод пеннинга (Michael G.Mage 1977 ) , основанный на специфическом связывании Jg^-клеток фиксированными на твердой поверхности антителами к lg человека. Раствор овечьих антител к IgG,A,M человека (400мкг/мл в TRIS-HCI буфере, рН 9,4; NaN3 0,1%) наносили по 2 мл в 40 мм чашки Петри и инкубировали 1час при 37°С. Затем раствор антител собирали (он может применяться многократно), чашку Петри 3-кратно отмывали раствором Хэнкса. Для уменьшения »«специфического прилипания клеток чашки инкубировали с телячьей фетальной сывороткой 1час при 37°С. После 5-кратного отмывания поверхности раствором Хэнкса наносили суспензию мононуклеарных клеток (2 млн/мл) по 2мл на чашку и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Через полчаса инкубации легкими движениями суспензию взбалтывали, после чего продолжали инкубацию. Собранная затем суспензия неприлипших клеток содержала не менее 90% Т-лимфоцитом, что было определено методом цитофлуориметрии с использованием flic-меченных антител ОКТ-3. Для получения бластов В-лимфоциты культивировали с 10 мкг/мл вегетина, 5 мкг/мл липопепгндэ Fulm3-

Cys-Ser-Lys4 или 20 мкг/мл J1 ПС, а Т-лимфошпы культивирован! с 2,5 мкг/мп ФГЛ в 96-луночных плашках (Flow Laboratories) при 37° n СО2 инкубаторе (Flow Laboratories). Культуральная среда приготовленная на основе RPMI-1640 содержала: 10% фетальной телячьей сыворотки, 10 мМ hepes, 5*10"5 М 2-меркаптоэтанола, 50мкг/мл гентаиииина и 2мМ L-глютамина. Уровень пролиферации в суспензии лимфоцитов в разные сроки активации оценивали по включению 3Н-тимидинд, Для этого к клеткам за 4 часа до окончания инкубации добавляли ^Н-тнмнлин из' расчета I mkCi на лунку. Клетки материал наносили на фильтр с помощью харвестера 550 (Flow Laboratories). Измерения производили триплетами на жидкостном сцинциляционном счетчике.

Электрофизиологические эксперименты Регистрацию трансмембранных ионных токов осуществляли методом локальной фиксации потенциала patch-clamp (Hamill et al.1981). T лимфоциты помещали в маленькую стеклянную камеру (около 500 мл). Спустя несколько минут камеру промывали раствором Хенкса (мМ): NaCl 140; KCI 4.6; MgC12 I; HEPES-NaOH (pH 7.2) 10; CaC12 1. Микроэлектроды вытягивали из капилляров фирмы WP1 (США) в лее стадии, затем кончики их оплавляли. Полученные мнкропипетки заполняли водным раствором содержащим (мМ): КС1 ¡40; NaCl 10; MgC12 I; HEPES-KOH (pH 7.2) 10; EGTA 11; CaCI2 1 (концентрация свободного Ca++ составляла около 10 нМ, что было рассчитано исходя из значения Кд для EGTA и Са++ при рН 7.2 равного Электрическое сопротивление микроэлектродоп

составляло 5-10 МОм. После того как пипетка приводилась в контакт с клеточной поверхностью к внутренности пипеткй прикладывалось небольшое отрицательное давление 5 - 40 см водного столба (подсасывание). Jto обычно приводило к установлению стабильного электрического контакта с сопротивлением 20-200 ГОм между пипеткой и клеточной поверхностью (конфигурация cell-attached). Для перехода в конфигурацию "регистрация от целой клетки" (whole-cell) прикладывали отрицательное давление величиной более 100 см водного столба к внутренности пипетки для того чтобы разрушить кусочек мембраны под пипеткой. Трансмембранные ионные токи можно было регистрировать в течение длительного времени, как правило, 0,5-1 часа. Опыты проводили при комнатной температуре 22-24°С. Для фиксации потенциала и измерений тока использовали усилитель L/M-EPC-7 "List Electronic". Эксперименты проводили в режиме on-line совместно с компьютером IBM-XT (США). Оцифровку сигнала и протоколы для изменений мембранного потенциала осуществляли АЦП ( ЦАП DACA-645-1502 "IBM" (США) с использованием оригинальных компьютерных программ, разработанных к.б.н. В.А. Мальцевым. Часть данных (временные и • амплитудные гискнраммы) обрабатывали сразу по время эксперимента.

Оригинальные кривые записывали ни твердый диск компьютера в виде файлов данных для хранения и последующей обработки. Значение максимальной К+-проводимости (Gk) оценивали гю пиковой величине суммарного К+-тока (Ьпач), зарегисгрированного и конфигурации whole-cell. Дли - акти&ации тока к мембране прикладывали деполяризующий скачок потенциала от поддерживаемого значения -70мВ до +40мВ.

Gk ы limx/tV-Ек), где Ек • равновесна;} разность потенциалов для К4 (Ек"*-90 мВ при 25°С).

К+-ток записывали через 4-5 мин. после перехода в конфигурацию whok-cell Кроме того, оценивали отношение К+-гюводимости к электрической емкости клеточной мембраны (Gk/C), величину пропорциональную поверхностной плотности каналов. Для измерения емкости С к мембране прикладывали скачек потенциала (Vs) в ЮмВ (от -70мВ до -бОмВ) и затем, чтобы получить значение заряда Q, необходимого для перезарядки мембраны, с помощью компьютера интегрировали емкостной ток (при уровне фильтрации 17,5 кГц).

OQ/Vc

Результаты представлены в ыше (Среднес+SE, п»число экспериментов)

Результата и обсувдеи::г

I.ВЛИЯНИЕ UEI ETAJ1A 11А ИОНПРОВОДЯЩИЕ СВОЙСТВА МЕМБРАНЫ П-

лнмФоцитоа

Для изучения эффектои нового иммуностимулятора вегетана via проводимость мембраны лимфоцитов прежде всего необходима было провести подробное исследование базовых свойств мембраны интактных лимфоцитов. Подавляющая часть селективной ионной проводимости мембраны как Т- так и В-лимфоцитов приходится на калиевую (К+) проводимость, которая, в свою очередь, обеспечивается потенциал-зависимыми К+-каналами задержанного выпрямления (Calialan , 1985).

l.i.ВЛИЯНИЕ СЕГЕТАИА I3A ЭКСПРЕССИЮ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ

-КАНАЛОВ

1.1.1.ОЦЕНКА УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ К+-КАНАЛОВ У ИНТАКТНЫХ В ЛИМФОЦИТОВ Отличительным свойством потенциал-зависимых К+-каналов является их чувствительность к электрическому потенциалу мембраны, благодаря чему резким деполяризующим скачком потенциала можно вызвать синхронное открытие (иди активацию) почти всех каналов этого типа, имеющихся в плазматической мембране клетки. По амплитуде суммарного К+-тока, активированного таким образом, можно оценить

количество каналов. Для оценки уровня экспрессии К'•'-каналов в конфигурации whole-cell метода локальной фиксации потенциала были сделаны записи суммарного К+ тока для 89 В-лимфоцитов селезенки мыши (СВА). Потенциал мембраны поддерживали на уровне -70 мВ. Ток активировали скачкообразной деполяризацией мембранного потенциала до +40 мВ. Большинство клеток (56%) имело лишь 1-4 К+-каналов (рис. 1а) (Таблица , иеактивированные В клетки). Остальные клетки имели значительно большую К+-проводнмость и работу одиночных каналов можно было наблюдать только после инактивации суммарного тока (рис Л б).

Рис.1 Регистрация суммарных К+-токов В лимфоцитов о конфигурации whole-cell "регистрация от целой клетки". Записи типичных К+-токов активированных скачкообразной деполяризацией мембраны от -70м В до +40мВ. ( в пипетке - К+-Рингер, внешний раствор - Na+-Piutrep) а. клетка имеет всего лишь несколько К+-каналов и почти сразу после их синхронной активации видна работа одиночных каналов. G. клетка имеет не менее 10 каналов и только после инактивации суммарного тока можно наблюдать работу одиночных каналов.

м

. 2пЛ

* [_200 iio

40 мВ

-70?,ЙЗ

(

6.

4пА

j_2Шко

— "

40tiB -70mB__f

■70 мВ Л

Средшш К+-проводимость, рассчитанная по формуле:

Gk = lmax/(V-EK), где Ек - равновесная разносгь потенциалов для К+ (Ек=-90 мВ при 25*С), Iinax - амплитуда суммарного К+-тока, V - потенциал мембраны,

составила 181+26 пС (»*»89, среднее+SE). Проводимость одиночного К-1--канала составляла 15-17 пСм. Следовательно, в среднем, на каждую клетку приходится около 10 каналов. Похожие данные по В-лимфоцнтам мыши были получены Suiro J.B. с соавторами.

Кроме того, для каждой клетки измеряли электрическую емкость мембраны (С), которая пропорциональна площади оверхности мембраны. Отношение Gk/C, селичина

пропорциональная поверхностной плотности каналов, составляло 95+12 иСм/пФ. Проводимость одиночного К+-канала составляла 15-17 пСм (см ниже). Следовательно, в среднем, на каждую клетку Приходится около 10 каналов.

1.1.2.ИССЛЕДОВАНИЕ РАШШХ ЭФФЕКТОВ СЕГЕТМ1Д IIA ПОТШЦ!:ЛЯ-ЗАВИСММЫЕ Л'-КАКАЛЫ D МЕМБРАНЕ Б-Л1ШФОЦ1Ж)2

Для того, чтобы выявить быстрые (минуты) эффекты вегетана на экспрессию (или активность) потенциал-зависшие К+-каналос его добавляли во внешни» раствор либо кгшекшрогагшем, либо путем проточной 'смены растворов. Предварлтелыа*, по включению радиоактивного тимидина была определена садтц»ал&ная митогеииая доза актииатора, которая составила 10 к:аг/мл. Концентрацию вегегана меняли от оптимальной шпогешюй дозы до превышающей се на порядок. Суммарный К"*'-ток записывали т добавления вегетан.. к клетке и каждую минуту в течение десяти мицу* после его добавления (рис. 2), При этом каких-либо явных измеlistet амплитуды суммарного тока выявить на удалось. Таким образка, суммарная калиевая проводимость, а значит » уровень экспрессии К+-коналов и их поверхностная плотность (т.к. электрическая емкость, пла размер клеток, оставался не нзмеиным) не менялись по меньшей мерс в течение 10 минут после добавления вегетана.

М.З.МЕДЛЕННЫЕ (ЧАСЫ-ДЕСЯТКИ ЧАСОВ) ЗФФЬКТЫ СЕГ5ГГА11А НА ЭКСПРЕССИЮ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ К*-КАПАЛО Ü

На протяжении трех суток культивирования В лимфоцитов с вегетанои (10 мкг/мл) оценивали суммарную К+-проводимость (Gk) и поверхностную плотность К+-каналов (Gk/C) для клеток разных размеров. К концу первых суток у болышшетиз клеток проводимость мембраны для К+ не отличалась от исходного уровня, количество К+-каналов и их плотность на единицу поверхности была такой же как и до воздействия вегетаиом. Но к этому времени • появлялись и более крупные клетки, которые в ответ на деполяризующий скачек потенциала от-70мВ до+40 мВ давали

Рис.2 Записи суммарного К+-тока В лимфоцитов в конфигурации \vhole-cell до добавления вегетана (I) и через 5 минут после его добавления (2) (50мкг/мл). Видно, что амплитуда К+-тока практически не изменилась.

whole-cell

10 пА

5 мин

+40мВ

-70мВ

значительно больший (более чем в 10 раз) по амплитуде ток по сравнению с интактными клетками (рис.3). Для того, чтобы определить, за счет чего происходит столь резкое увеличение К+-проводимости, был проведен тест на ее чувствительность к специфическому блокатору К+-каналовр тетраэтиламмонию (TEA). На рис.4 показаны записи суммарного К+-тока у В-лимфобластов до и после добавления ШмМ блокатира. Видно, что TEA наполовину подавляет К+-ток, что является характерным признаком потенциал-зависимых К+-каналов п-тнпа (Lewis R.S., Cabalan M.D. 1988). Кроме того, проводимость одиночного К.+-канала (см.ниже) после бласттрансформации не изменилась. Рост экспрессии К+-каналов можно было бы легко объяснить увеличением площади поверхности клеток при бласттрансформации.

Рис.3 Записи суммарных -токов интактного В .лимфоцита (I) и В лимфобласта (2), полученного на 3 сутки инкубации с 10 мкг/мл вегстана. К+-каналы активировали скачкообразной деполяризацией мембраны от -70мВ до +40мВ. Видно, что амплитуда суммарного К+-тока В лимфобласта более чем о Ю раз выше, чем у интактного лимфоцита.

200пА

40мВ

»70мВ

J

Ркс.4 Записи суммарного (С+-тока В лимфобласта, полученного на 3 сутки инкубации с 10 мкг/мл вегетаиа до (1) и после (2) добавления блокатора К+-каналов тстраэтиламмония. Блокатор наполовину подавляет амплитуду К+-тока, что является характерным признаком потенциал-зависимых К+-каналов п-типа.

200пА

-70м В f

40мВ

т_

Однако, оценка поверхностной плотности каналов по отношению Gk к электрической емкости мембраны (С) показала, что увеличивается не только Gk, но и поверхностная плотность каналов, т.е. число каналов на единицу площади мембраны. В качестве иллюстрации на рис.5 приведено распределение С к в зависимости от электрической емкости как для активированных клеток разных размеров, так и для («глистных клеток. Видно, что клетки малых размеров (<ЗпСм), независимо от контакта с митогеном, имеют низкую калиевую проводимость. Если принять за пограничную для бластов и покоящихся клеток величину емкости равную ЗпФ, то видно (см.таблицу), что бласггрансформация сопровождается значительным ростом как калиевой проводимости (в 17 раз) Gk=3177±573 пСм, (п="7), тек и поверхностной платности каналов (а 6 раз) Gk/C=578£84 пСм/пФ (п=7). Таким образом, бласггрансформация В лимфоцитов под действием вегстана сопровождается значительным увеличением К+-проводимости мембраны как за счет увелтения поверхности мембраны с присущими ей потенциал зависимыми К+-каналами n-типа, так и за счет повышения поверхностной плотности этих каналов. Кроме того, можно заключить, что изменения проводимости -ызываемые вегетаном являются не сигналом запускающим активацию В лимфоцитов, а ее следствием.

и

Рис.5 Распределение значений суммарной К"*"-проводимости (О к) интактных В лимфоцитов - О, и В клеток, полученных после культивирования с 10 мкг/мл вегетана в течение 1-3.суток - О, в зависимости от электрической емкости мембраны (С). Ок рассчитывали (см. текст) по амплитуде суммарного К+-тока, активированного скачкообразной деполяризацией мембраны от -70 мВ до +40 мВ. Видно, что активированные оегетаном властны с клетки, имеющие большую поверхность, а значит и электрическую емкость (С) обладают значительно более высокой К^-проводимостью, чем интактные клетки. Вместе с тем, в культуре активированных лимфоцитов присутствуют клетки малых размеров, имеющие токую же К+-проводимость как и интактные лимфоциты.

6 т С(нСм)

4 •■

2 •

о о

о

о

о

IS

Рнс.б Записи одиночных К+-каналов.

¡».потенциал-зависимые К+-каналыг интактного В лимфоцита проводимостью 17 пСм (конфигурация whole-cell) (в пипетке -Рингер, внешний раствор - №+-Рингер)

б.потеициал-зависимые К+-каналы В-лимфобласта на 3 сутки культивирования с 10 мкг/мл вегетана (конфигурация cell-attached). Кроме потенциал-зависимых К+-каналов у В-лимфоблвста появился другой тип каналов (см. текст).

2пА

Упипетхии-10 мВ

05с

llLiMJlM

Упипетки**50мВ

ЗпА 50мс

1.2.ПРОВОДИМОСТЬ ОДИНОЧНОГО Я^-КЛИАЛЛ ПОСЛЕ АКТИВАЦИИ ¿•ЛИМФОЦИТОВ ВЕГЕТАНОМ.

Работу одиночных -каналов регистрировали как в конфигурации whole-cell (регистрация от целой клетки) после инактивации суммарного К+-зока, так и в конфигурациях cell-attached (регистрация тока через фрагмент мембраны нативной клетки) и inside-out (регистрация тока через оторванный фрагмент мембраны). На рнс.ба приведена запись одиночных К+-каналов, полученная на интактаом В лимфоците. Вольт-амперная характеристика одиночных каналов свидетельствует' о том, что это потскциал-зависимые К+-

каналы задержанного выпрямления, описанные ранее другими исследователями (Lewis R.S.,Cahalan M.D.1990). Проводимость одиночного К+-канала, оцененная по наклону вольт-амперной характеристики составляет 15-17 пСм, что также сходится с литературными данными. Добавление к В лимфоциту вегетана (10100 мкг/мл) не влияло на проводимость одиночного потенциал-зависимого К^-канала по меньшей мере в течение 10 минут. После бластгрансформации под действием вегетана проводимость одиночного потенциал-зависимого К.*-канала также не изменилась. Однако, кроме потенциал-зависимых К+-каналов на В-лимфобластах был обнаружен другой тип каналов рис.66. Дополнительные исследования показали, кто это кальций-активируемые К+-каналы, описанные ранее для возбудимых клеток.

Рис.7 Записи суммарного К+~тока, активированного скачкообразной деполяризацией мембраны от -70мВ до +40 мВ в конфигурации whole-cell до и после добавления к В лимфоциту ЛП€ в концентрации 100 мкг/мл. Видно, что амплитуда суммарного К+-тока не менялась по меньшей мере в течение 5 минут после добавления активатора (о пипетке - К+-Рингср, внешний раствор - Na+-Pnnrep).

ЛПС

• 5пА

I_0.5

40мВ

J

5 мин

40мВ

L I

1

-70мВ

-70мВ

2. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ДЕЙСТВИЯ ВЕГЕТАНА.ЛПС.ЛИПОПЕПТИДА 12 ОГА »и ИОНПРОВОДЯЩИЕ СВОЙСТВА МЕМБРАНЫ ЛИМФОЦИТОВ

Чтобы понять значение тех изменений К+-Е5>оглдИмосП1 В лимфоцитов, которые вызывает вепгтан аналогичные , зх'спгриыапы бьшн проведены и с другими известными активаторами В явмфиоткиц ЛПС м лнпопептидам, а также с Т-клсточным

активатором фитогемагглютинииом (ФГА). Митогены добавляли к клеткам либо инжектированием, либо путем проточной смены растворов. Концентрации препаратов меняли от ; оптимал! ¡о митогенных доз до превышающих их на порядок. Для этого предварительно по включению радиоактивного тнмидина для каждого активатора была определена оптимальная митогенная концентрация, которая составила для ЛПС - 20мкг/мл, дли липопептида - 5 мкг/мл и для ФГА - 2,5 мкг/мл. На рнс.7 показаны записи суммарного К+-тока до н после добавления к В лимфоциту ЛПС в концентрации 100 мкг/мл. Видно, что амплитуда суммарного К+-тока не менялась по меньшей мере в течение 5 минут. Липопептид и ФГА также не вызывали каких-либо быстрых изменений суммарной 1С "^проводимости В и Т лимфоцитов, соответственно.

Рис.3 Записи суммарного К^-тока (конфигурация whole-cell) интактного В лимфоцита (I) и двух В лимфобластов, полученных на 2 сутки культивирования с - липопегпидом (2) и ЛПС (3). К+-ток активировали скачкообразной деполяризацией мембранного потенциала от -70 иВ до +40 мВ. Ьидно, что оба активатора вызывают такое же увеличение суммарной К+-проводимости как и вегетан (в пипетке - К+-Рингер, внешний раствор - Na^-Рингер).

40мВ

J

L

-70мВ

Следует, однако, отметить, что при перфузии камеры липопептид содержащим раствором (0,5-50 мкг/мл) в большинстве случаев резко увеличивалась проводимость утечки. Дополнительные эксперименты с разными конфигурациями метода patcli-clamp к разными способами добавления липопептида в . рабочую ' камеру показали, что он нарушает контакт между мембраной и пипеткой, но не влияет на проводимость самой мембраны. Причем, такой эффект липопептида проявляло, только при проточной смене растворов, а при добавлении липопептид:! инжектированием никаких изменений проводимости не наблюдали. Вместе с тем, трудно объяснить этот эффект просто механическим повреждением плотного контакта между пипеткой и мембраной потоком частиц липопептида, поскольку контрольное промывание камеры быстрым потоком (150 мкл/с) 0,1% суспензии 0,45 мкм частиц латекса не влияло на контакт- Таким образом, природа этого эффекта липопептида осталась неясной. У Т-лимфоцитов человека, на которые лилопептка не оказывает активирующего действия, он вызывал такой же эффект. Следовательно, иебраноактивное действие лнпопепдида, по-видимому, не имеет отношения к его митогенным свойствам.

Рис.9 Записи суммарного К+-тока интактиого Т лимфоцита человека (1)и Т лимфобласта, полученного на 2 сутки культивирования с 2,5 мкг/мл ФГА (конфигурация whole-cell). Видно, что ФГА также вызывает увеличение суммарной К4-проводимости .

-70м В —

Для изучения медленных эффектов активаторов на проводимость мембраны В-лимфоциты культивировали с ЛПС (20мкг/мл) и липолептидом (5 мкг/мл), а Т-лимфоциты с ФГА (2,5 мкг/мл). На протяжении трех суток культивирования оценивали суммарную kt'-проводимость и. поверхностную плотность К+-камалов Gk/C) для клеток разных размеров. К концу первых суток также, как и в случае с вегетаном появлялись более крупные клетки, которые плели большую К4"-проводимость по сравнению с контрольными клетками. На рис.8 показаны записи суммарного К+-тока интактного В лимфоцита и двух В-лимфобластив, полученных на 2 сутки культивирования с ЛПС и липопептидом. Kt-ток активировали скачкообразной деполяризацией мембранного потенциала от -70 мВ до +40 мВ. Видно, что оба активатора вызывают такое же увеличение суммарной К+-проводимости как и вегстан. Рисунок 9 демонстрирует аналогичное действие ФГА на суммарную К+-проводимость Т лимфоцита человека. Добавление к лимфобластам 10 мМ TEA (рис.10) наполовину блокировало суммарный К+-ток, что явля"ется признаком потенциал-зависимых К+-каналов n-типа. Проводимость одиночного' канала оценивали кок в конфигурации whole-cell, после инактивации суммарного , тока, так и в конфигурации inside-out и она составляла окало 16 пСидлд В-лимфоблпстов и 12-17 пСм для Т-лимфобластов, то есть била такой же, как и у интактных лимфоцитов. В то же время, клетки малых, то есть исходных размеров, имели низкую суммарную (С'-проводн* сть, такую же как интактные лимфоциты.

Ркс.Ю Специфический блокатор К+-каналов тетраэтиламмоний наполовину подавляет суммарный К+-ток. Это характерный признак потенциал-зависимых К'"-каналов н-типа.

В качестве иллюстрация на рис.11 приведено распределение Ок в зависимости от электрической емкости как для всех активированных В клеток разных размеров, так и для интактных клеток. Видно, что

клетки малых размеров (<ЗпСм), независимо от контакта с митогеном, имеют низкую калиевую проводимость. Если принять за пограничную для бластоь и покоящихся клеток величину емкости равную ЗпФ, то видно (см.таблйцу), что бласпрансформация сопровождается значительным ростом как калиевой проводимости Ок=2752+192 пСм, так и поверхностной плотности каналов Ск/С=460±30 пСм/пФ (п=97).

Однако из рис. 11 не видно строгой корреляции между размером клеток и проводимостью. Величина проводимости для бластов близких по разм<*->ам варьирует в широком диапазоне и может отличаться почти на порядок. Это относится к клеткам с емкостью от 4 до 8 пФ. Но, тем не менее, очевидно, что властные клетки (>ЗпФ) имеют значительно большую Ок, чем клетки малых размеров (<ЗпФ).

Рис. 11 Распределение значений суммарной К+-проводимости (Ок) нн. .ктных В лимфоцитов и В клеток, полученных после культивирования с вегетаном, ЛПС и лгаюпептцдом в течение 1-4 суток в зависимости от электрической емкости мембраны (С). Ок рассчитывали ^см. текст) по амплитуде суммарного К+-тока, активированного скачкообразной деполяризацией мембраны ст -70 мВ до +40 мВ.

С(нСм)

Таблица

Значения суммарной К*-..роводихюсти В лимфоцитов до и после _активации, измеренные в конфигурации whole-cell.__

В лимфоциты Gk (Gk/C)

|пСм] |пСм/пФ|

иеактпвировшшые В клетки (С<ЗпФ) 181 ±26 95 ± 12

Ск < 80 пСм 41 ± 3 25 + 2

вк > 80 пСм 353 ± 45 179± 19

все В лимфобласты (С>ЗпФ) 2752± 192 460± 30

вегетан-бласты 3177 ± 573. 578 ± 84

ЛПС-бласты 1723 ± 359 293 ± 54

липопептид-бласты 2902 ± 224 480 ± 34

Рпс.12 Распределение значений суммарной К+-проводнмости (йк) В клеток, полученных после культивирования с липопептидом в течение 18-24 часов в зависимости от электрической емкости мембраны (С), вк рассчитывали (см. текст) по амплитуде суммарного К+-тока, активированного скачкообразной деполяризацией мембраны от -70 м В до +40 мВ. Видна достаточно четкая зависимость между Ок и С с наклоном около 1пСм/пФ.

7

G(hCm)

4 •

Р

SbO-^o-

о

о

а

о &

О

о

о00 -а-3-

о

о

о

О о

о 0

О о

С(иф;

—I

D

4

8

Кроме того, те немногочисленные "фоновые" бластные клетки.име ииеся в культуре- как В, так и Т лимфоцитов, также имели очень высокую калиевую проводимость.

Таким образом, повышение уровня К+-проводимости, то есть. уровня экспрессии К+-каналов, можно рассматривать как универсальный маркер лимфобластов, независимо от того, чем была вызвана активация.

Для лик. .юбластов в ранние сроки активации, 18-24 часа, видна достаточно ч> <ая корреляция между Gk и С с наклоном около 1нСм/пФ (рис.12). То есть, увеличение размера клетки сопровождается увеличением количества К+-каналов. Причем, по-> видимому, увеличение Gk происходит в G1 фазу клеточного цикла, поскольку именно в этот период происходит увеличение размера клетки ( Мог.roe JG, Cambier JC, 1983). Большое количество К+-каналов, синтезированное на этой стадии, может быть важным для прохождения клетки через жизненный цикл до момента деления, так как блокаторы К+-каналов подавляют переход клетки из G1 фазы в S1 фазу (Brent L.K. с соавт., 1990; Amigorena S. с соавт., 1990). Высокая К+-проводимость может быть важна для поддержания мембранного потенциала клетки, для регуляции объема (Cabalan M.D., Lewis R.S., 1988; Grinstein S., Foskett J.К., 1990 ), а также для изменения концентрации калия в клетке, которое, по-видимому, необходимо при пролиферации (Rozengurt Е., 1984; Takagi К. с соавт., 1986). Возможно, более строгая корреляция между Gk и С (рис.15) в ранние сроки активации обусловлена тем, что клетки с одинаковыми размерами с большей вероятностью находились в одной и той же фазе жизненного цикла, то есть, мы, условно говоря, следили за первой волной вышедших в митотический цикл клеток. А большой разброс Gk в более поздние сроки активации (рис.11), когда часть клеток прошла деление, по-видимому, связан с тем, что клетки одинаковых размеров с бочьшой вероятностью могли находится на разных стадиях жизненного цикла. То есть, можно предположить, что на определенных стадиях жизненного цикла может происходить снижение Gk.

З.ПОЯВЛЕНИЕ Сй++-ЧУВСТВНТЕЛЬНЫХ /Г+-КАНАЛОВ В МЕМБРАНЕ ЛИМФОЦИТОВ ПОСЛЕ ИХ АКТИВАЦИИ ВЕГЕТАНОМ

Как уже отмечалось в главе 1.2. после активации вегетаном у В-лимфобластов были обнаружены ионные каналы, отличающиеся по свойствам от потенциал-зависимых К+-каналов. На основании предварительных экспериментов можно было предположить, что это кальций-акгивируемые К+-каналы (К+(Са++)-каналы), описанные ранее для возбудимых клеток. Данное обстоятельство заставило нас более детально исследовать эти каналы, тем более, что наличие этого типа каналов у В лимфоцитов мыши лишь предполагалось.

В работах показано, что ь первые минуты активации лимфоцитов наряду с повышением внутриклеточной концентрации Са++ происходит гиперполярнзация мег^раны (Wilson НА, Chu -d TM. 19S5; Grinstein S, Dixon SJ.1989; Tsien RY с соавт.,1982). Механизм этого явления можно было бы легко объяснить наличием К+(Са++)-каналов, которые хорошо описаны для возбудимых клеток (Schwarz W, Passow H., 1983).

Рнс.13 Изучение чувствительности каналов к Са++. Записи одиночных К+(Со++)-кгналов в конфигурации cell-attached. Инжекция A23I87 активирует К+(Са++)-каналы, a EGTA подавляет их работу. Промываю1С кгкеры раствором Рингера с 1мМ Са++ восстанавливает активность К+(Са++)-каналов (в пипетке - К+-Рингер внешний раствор - ¡чj+-Piinrcp),

ЗпА

VISÎÎI-OMB j_

Риигер .j-, ; - к-. » I.., ■■■■. •.

И дейстснтельно. такие каналы1 напрямую ггретегрированы на чел веческих В лимфоцитах, на кроличьих г.ъяпхтъх (МаЬаШ-ЗтМ МР, 5сШ1сКег 1С., 1989", МаЬат-ЗтИЬ МР. РЛгзол Г.М.$991) на человеческой! Т-«иктз«кггэй1 лилии Ляка! (^'пзэтег Б. с еоагз.£У?2>

песледовазгд полпчий К+(Са+1")-каналоп в мембране О п 7 юаздЗвоггоВ' в покое № после активации вегетаном или ФГА, ссстзетвтвекто. Для этого были использованы се11-аиас1^ и ймйе-от

конфигурации метода patch-clamp. Концентрацию внутриклеточного Са меняли добавлением омывающий раствор Са++-ионофоров (А23187 и иономицин) и ЕОТА. Клетки находились либо в нормальном, либо в калиевом растворе Рингерэ с 2м М СаС12, пипетки заполняли либо обычным внутриклеточным калиевым раствором с ЮнМ Са+4", либо нормальным раствором Рингера.

На покоящихся В лимфошгтах мыши не удалось обнаружить Са++-чувс1^итсльныс К+-каналы.

Рис.14 Записи одиночных К+/Са4;+)-каналов при разных значениях потенциала пипетки в конфигурации cell-attached. К+(Са++)-канали активироиали добавлением Са++-ионофора (о пипетке - К+-Рингер, внешний раствор - Na+-PHHrep).

£

20мс

-=£Q

20

-JVl

и

та от

40

60

п

Напротив, почти у половины покоящихся Т лимфоцитов уменьшение концентрации внутриклеточного Са++ приводило к увеличению К+-проводимости. Последовательное добавление к этим клеткам нонофора и ЕвТА вызывало активацию К+-каналов. Природу этого эффекта мы не исследовали, однако эта активация была столь значительной, что се вряд ли можно объяснить освобождением каналов от трэппинга в них ионов Са++, что описано Оп^тег и Са11а1ап (1989). У 30% покоящихся Т клеток ни ионофор, ни ЕОТА не

Рис. 15

а. Вольт-амперная характеристика К+(Са+)-каналов, построенная по а-шлитуде одиночных каналов при различных значениях потенциала пнлепс)! (см. рис.14)

б .Запись одиночных К+(Са++)-каналов в конфигурации сеН-аПасЬе«! при линейно меняющемся потенциале пипетки от -100 до +100 мВ. (в пипетке - К.+-Рингер, внешний раствор - Ыа^-Рингер).

вызывали какого-либо эффекта. И только 20% покоящихся Т лимфоцитов обнаружило активность Са++-активируемых К.+-каналов. Это могло быть связано либо с низкой поверхностной плотностью каналов, либо с неравномерной их экспрессией на разных клетках. Добавление к этим клеткам ионофора, так же как и переход в конфигурацию июбе-ош вызывало активацию К+-каналов, а последующее добавлена» ЕСТА блокировало их.

Властные клетки исследовали после 1-3 суток культивирования с митогеном. Р лимфоциты активировали Вегетаном (10мкг/мл), а Т-лимфоциты - РНА (2.5 мкг/мл). У более чем 90% как В-бластов, так и Т-бластов была обнаружена значительная активность К+(Са++)-каиалов. У части бластов работу К+(Са++)-каи-1Лов регистрировали сразу, без какого-либо воздействия. У остальных бластных клеток К+(Са++)-каналы активировались только после добавления ионофора. На рис 13 показано, что добавление А23187 активирует эта каналы, ЕвТА подавляет их, а промывание клетки нормальным раствором Рингера (2мМ Са++) восстанавливает их активность. Ингибирование работы этих каналов ЕОТА приводило к смещению потенциала реверсии неселективных токов через фрагмент мембраны под пипеткой в положительную сторону на 10-15 мВ, т.е. происходила деполяризация мембранного потенциала клетки на 10-15 мВ. Это подтверждает калиевую природу Са++-активируемого тока.

2пА

Удш1=0мВ

I_ 4с

cell-attaclied h^zZ^A^XxJ^ii^c^^v-^A

EGTA

Рис.1б Переход из конфигурации cell-attached в inside-out вызывает активацию К+"(Са+)-каналов (при переходе увеличивается {Ca++j с внутренней стороны оторванного участка мембраны, так как во внешнем растворе 1Са++]=1мМ. а в цитоплазме-около 10"7 - 10"8 М (в пипетке - Na+-pHHrep, внешний раствор - К+-Рингер).

На рис 14 приведены записи токов через одиночные К+(Са++)-канш1Ы при разнил значениях потенциала пипетки. Проводимость этих каналов менялась от 36 пСм при потенциале пипетки -80 мВ до 52 пСм при потенциале пипетки 80 мВ (см.рис Ь), то есть они имели волы-ампернуто характеристику входящего выпрямления, что было характерно и для ранее описанных К+(Са|'+)-кдналов В-лимфоцитов человека и тимочитов кролика (Partiseti . .. с соавт., 1992, Mahaut-Smith, Sclilichter, 1989)

На рис. 16 показаны записи полученные в условиях, когда бласты находились в К"1-растворе Рингера, а пипетки заполняли Na^-раствором Рингера. Вольт-амперные характеристики каналов полученные в таких условиях свидетельствовали о К+-селективности каналов. При этом проводимость К+(Са++)-каналов была около ЮпСм при потенциале пипетки 0 мВ. При замени в пнпеточном растворе ионов С1- на ионы Asp- (калия аспартат) свойства каналов не менялись, что подтверждает их калиевую природу и исключает возможность их хлорного происхождении.

Аналогичные эксперименты были проведены и с ЛПС и -липопептидом. Во всех случаи* В-лнмфобласты имели большое количество К+(Са++)-каналов, поскольку почти во всех случаях небольшой фрагмент мембраны (около 0.25 мкм2), попавший в зону контакта с измерительным микроэлектродом имел 1-3 К+(Са+" + )-канала.

Таким обра >м, блаеттрансформацня как В, так и Т лимфоцитов сопровождается экспрессией большого количества К+(Са++)-каналов. Наличие Са++-активируемых К^-каналов объясняет гнперполнрнзацию мембраны при активации лимфоцитов митогенамн. Гинерподярнзашш связана с увеличением концентрации свободного кальция в цитоплазме.

ВЫВОДЫ

1.При инициации делений и дифферениировки В лимфоцитов иммуностимулятором Вегетаном не происходит быстрых (1-10 минут) изменений электрофизиологических параметров клеточной мембраны (трансмембранные токи ионов, ионные каналы, электрический потенциал), которые, как правило, принимают участие в трансмембранной передаче ранних сигналов активации в лимфоцитах.

2. Бл2стгронсфоры:ч!"ч В лимфонитой поп нлиянием иммуностимулятора Вегетана сопровождается 17-кратным увеличением калиевой чрогюдимости. Этот эффект ».вляетси не причиной, а следствием активации.

3.Рост К^-проводимости связан не просто с увеличением размера клеток и площади поверхности мембраны, но и с 6-кратным повышением поверхностной плотности каналов. При этом проводимость одиночных К*-каналов не изменяется.

4. Рост К+-проводимости в клетках, активированных Вегетаиом, происходит за счет дополнительной экспрессии потенциал-зависимых К4-кпналов задержанного выпрямления п-типа, которые имеют проводимость 15-17 пСм, открываются при потенциале мембраны более -40 мВ и инактивирутотся тетраэтиламмонием.

5.При бласттраисформации В лимфоцитов под влиянием Вегетана наряду с экспрессией новых потенциал-зависимых К+-каналов, в клеточной мембране появляется большое количество Са++-активируемых К+-к,. налов, которые имеют вольт-амперную характеристику входящего выпр мления и проводимость, меняющуюся от 36 пСм при потенциале пипетки -80 мВ до 52 пСм при потенциале пипетки 80 мВ.

6. Обнаруженные Са++-активируемые К+-каналы активируются при повышении внутриклеточной концентрации Са++ (например, Са++ с мономицином), инактивирутотся при связывании Са++ в присутствии ЕОТА. Повышение внутриклеточной концентрации свободных ионов Са++ при активации лимфоцитов приводит к активации Са++-активируемых К+-каналов и гиперполяризации клеточной мембраны.

7.Характерные свойства мембраны В-бластов, активированных вегетаиом, оказались подобными "свойствам В- и Т-лимфобластов, активированных известными митогенами: ЛПС, липопептидом и ФГА. Вес исследованные типы лимфобластов отлим;лись повышенным содержанием в мембране потенциал-зависимых К+-каналов п-типа и Са++-зависимых К+-канаяов.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1. Мальцев В.А., Маляев А.А., Каримов Д.П. Стационарные свойства калиевой проводимости мембраны Т-клеток человека. - Тезисы Всесоюзного симпозиума "Ионные каналы в биологических мембранах" (Карадаг, 24-27 апреля 1990) под рел. Брежестовского П.Д., Москва, типография ВАСХНИЛ, стр.50.

2. Maltsev V.A., Karimov D.P., l.Ataullakhanov R.I., Bessler W.G. Patch-clamp studies of membrane conductance upon 3 cell activation induced by lipopolysaccharidc, a synthetic lipopeptide analogue of bacterial lipoprotein and a new plant immimostimulant vitan PhysChemBiol & Med, 1994, N2, V< p.l2i-l3i