Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Функционирование и регуляция Ca2-активируемых калиевых каналов эритроцитов

Президиум ВАК России

(решение от " ^ " ^^ № ^

присудил ученую степень ДОК'ГО Р/\

—--Наук

Начальник управления ВАК России

л' & ■ ■

МИНИСТЕРСТВО ЗРАВООХРАНЕНИЯ РОССИИ СИБИРСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ТОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГИИ

ПЕТРОВА ИРИНА ВИКТОРОВНА

ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ И РЕГУЛЯЦИЯ Са2+- АКТИВИРУЕМЫХ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ

ЭРИТРОЦИТОВ

на соискание ученой степени доктора биологических наук

На правах рукописи

14.00,17 - Нормальная физиология

ДИССЕРТАЦИЯ

ТОМСК -1999

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ 3

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

1.1 Са2+- активируемые калиевые каналы эритроцитов. 12

1.1.1 Общая характеристика. 12

1.1.2 Влияние химических и физических факторов на

Са2+-

активируемые калиевые каналы. ^ 17

1.1.3 Регуляция Са2+- активируемых калиевых каналов. 20

0 А-

1.1.4 Функциональная роль Са - активируемых калиевых каналов. 24

1.2 Метаболизм кальция в эритроцитах и его регуляция. 26 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 31 2.1. Объекты исследования. 31

2.2 Взятие крови и получение эритроцитов. 33

2.3 Использованные растворы и реактивы. 33

2.4 Метод регистрации мембранного потенциала в суспензии эритроцитов. 34

2.5 Расчет параметров Са2+- индуцированного гиперполяризационного ответа эритроцитов. 35 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 39

О А-

3.1 Механизм формирования Са - индуцированного гиперполяризационного ответа. 39

3.2 Регуляция Са2+- активируемых калиевых каналов эритроцитов. 53

3.2.1 Влияние ингибиторов калиевых каналов на Са - зависимую калиевую проницаемость мембраны эритроцитов. 54

3.2.2 Роль Са2+-насоса в регуляции Са2+- активируемых калиевых каналов. 58

■ч I

3.2.3 Влияние ингибиторов кальмодулина на Са -зависимую калиевую проницаемость мембраны эритроцитов. 64

3.2.4 Регуляция Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов физико-химическими факторами 69

3.2.5 Изучение влияния агонистов адренэргических рецепторов на Са -зависимую калиевую проницаемость мембраны эритроцитов. 81

3.2.6 Исследование роли цАМФ-зависимой протеинкиназы и протеинкиназы С в регуляции Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов.

3.2.7 Изучение роли в-белков в регуляции Са2+-зависимой калиевой

88

проницаемости мембраны эритроцитов. 102

3.3 Характеристика Са2+-зависимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов при патологии 109

3.3.1 Характеристика Са2+-зависимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов у больных раком легкого. 110

9-13.3.2 Динамика параметров Са -индуцированного

гиперполяризационного ответа эритроцитов у больных раком легкого в

процессе противоопухолевой химиотерапии. 117

943.3.3 Характеристика Са -зависимой калиевой проницаемости

мембраны эритроцитов у больных с опухолями головы и шеи до и после

проведения противоопухолевой терапии. 119

3.3.4 Характеристика Са2+-зависимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов у больных раком желудка и толстого кишечника. 121

3.3.5 Сравнительная характеристика параметров Са2+-зависимой гиперполяризации эритроцитов у больных с опухолями различной локализации. 123

9-13.3.6 Сравнительная характеристика Са -индуцированного

гиперполяризационного ответа эритроцитов у больных с опухолями и

воспалительными процессами соответствующей локализации. 125

3.3.7 Характеристика Са2+-зависимой калиевой проницаемости

мембраны эритроцитов у больных микросфероцитозом. 134

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 136

ВЫВОДЫ 145

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 147

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АТФ - аденозинтрифосфат ГМК - гладкомышечные клетки ГТФ - гуанозинтрифосфат ДАГ - диацилглицерин

diS-C3-(5) - диизопропилтиодикарбоцианин иодид Ет- исходный мембранный потенциал ИТФ - инозитолтрифосфат ИФ4 - инозитолтетрафосфат

[Ca2+]j - внутриклеточная концентрация ионов кальция

[Са2+]о - внеклеточная концентрация ионов кальция

К+(Са2+)-канал - кальций-активируемый калиевый канал

Са2+- АТФаза - Mg2+ -зависимая, Са2+ -активируемая аденозинтрифосфатаза

СССР - карбонил-ш-хлорфенилгидразон

МП - мембранный потенциал

МСЦ - микросфероцитоз

НА - норадреналин

ОГШ - опухоли головы и шеи

pHj - рН цитоплазмы клеток

рНо - рН среды инкубации

ПК-С - протеинкиназа С

ПОЛ - перекисное окисление липидов

SITS - 4-ацетамидо-4'-изотиостильбен-2,2- дисульфоновая кислота ТЭА - тетраэтиламмоний

ХНЗЛ - хронические неспецифические заболевания легких цАМФ - циклический, 3:5-аденозинмонофосфат цАМФ-ПК - цАМФ-зависимая протеинкиназа ЭДТА - этилендиамидтетраацетат

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В середине 70-х годов было установлено, что так называемый "Оагск^'-эффект, связанный с утечкой калия из АТФ-истощенных эритроцитов, обусловлен присутствием в мембране этих клеток высокоселективных Са2+-активируемых калиевых каналов (К+(Са2+)-каналы).

В последующих исследованиях наличие К+(Са2+)-каналов было показано в разных типах клеток.

К (Са )-каналы высокой проводимости, обнаруженные в нейронах, клетках гладкой и скелетной мускулатуры, кардиомиоцитах, эпителиоцитах различного типа, нейтрофилах, лимфоцитах [236], изучены в большей степени. Они играют важную роль в электрогенезе нейронов и гладкомышечных клеток, обеспечивая фазы реполяризации и следовой гиперполяризации мембраны. Наряду с этим К+(Са2+)-каналы участвуют в реализации эффекта возбуждения внутриклеточных сигнальных систем [236].

Установлено, что

К (Са )- каналы высокой проводимости регулируются цАМФ-зависимой протеинкиназой (цАМФ-ПК) и

кальмодулином [56].

+ 2+

К (Са )-каналы эритроцитов относятся к каналам низкой

-у,

проводимости [198, 216]. Кроме эритроцитов, К (Са )-каналы низкой проводимости обнаружены в клетках феохромацитомы [289] и скелетной мускулатуры [128]. Сведения об этих каналах немногочисленны. Последнее отчасти связано с рядом трудностей, возникающих при изучении К+(Са2+)-каналов: сложностью выделения Са2+-зависимой компоненты калиевого тока при электрическом способе регистрации токов, изменением характеристик каналов при энзиматическом выделении клеток, слабой зависимостью каналов низкой проводимости от мембранного потенциала (МП). В связи с этим важным является изучение К (Са )-каналов низкой проводимости на естественных моделях, примером которых может служить эритроцит. Мембрана безъядерных эритроцитов является уникальным объектом для

исследования механизмов функционирования плазматических мембран. Наличие в мембране этих клеток только одного типа каналов - Са -активируемых К+-каналов, позволяет проводить исследования на суспензии интактных эритроцитов.

Для К+(Са2+)-каналов эритроцитов показано, что они играют определенную роль в изменении деформируемости клеток: Са2+-индуцируемое снижение деформируемости эритроцитов устраняется при выравнивании градиента ионов калия [163].

Согласно мнению Ргееётап 1.С. е1 а1. [175] увеличение Са -индуцированной калиевой проницаемости мембраны эритроцитов является наиболее ранним событием в каскаде цитотоксических реакций, вызванных повышением внутриклеточной концентрации ионов кальция. Утечка ионов калия приводит к сжатию клеток, переходу их в предгемолитическое состояние и, наконец, к окончательному гемолизу.

2+

Однако имеются данные, что в некоторых случаях увеличение Са -зависимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов предохраняет их от гемолиза [196, 197].

Так, при действии на эритроциты комплекса терминальных белков комплемента (С5Ь 6, 7, 8, 9) наблюдается набухание и лизис клеток. В этих условиях Са2+-индуцированный выход ионов калия является стадией, лимитирующей лизис эритроцитов [196]. Подтверждение этой защитной

Л-)-

роли К (Са )-каналов для эритроцитов получено Атауллахановым Ф.И. с соавт. [2, 3] с использованием математических моделей. Согласно мнению этих авторов, набухание эритроцитов может сопровождаться увеличением

О АСа -зависимой калиевой проницаемости мембраны клеток, что приведет к

восстановлению их объема. Кроме того, при некоторых наследственных

анемиях, например, серповидноклеточной, показана роль К (Са )-каналов в

патогенезе заболевания: повышенная

Са2+

-зависимая калиевая

проницаемость мембраны эритроцитов приводит к их дегидратации, снижению деформируемости и гемолизу [121, 133,134].

Данные о влиянии на К+(Са2+)-каналы низкой проводимости физико-химических факторов (рН, изменений объема клетки), особенностях регуляции и роли в патологических процессах единичны или отсутствуют.

Целью настоящего исследования явилось изучение оперирования и механизмов регуляции Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов.

Для достижения указанной цели решались следующие задачи:

1. Исследовать роль ион-транспортирующих систем (К+(Са2+)-каналов, анионного транспортера, Са2+-насоса) в формировании Са2+-индуцированного гиперполяризационного ответа эритроцитов.

2. Изучить влияние блокаторов К+-каналов, рН, изменений объема клетки, температуры на функционирование К+(Са2+)-каналов эритроцитов.

3. Исследовать адренэргическую регуляцию К+(Са2+)-каналов эритроцитов.

4. Изучить роль ГТФ-связывающих белков в регуляции Са2+-зависимой калиевой проводимости мембраны эритроцитов.

5. Исследовать вклад кальмодулин-зависимой и С-киназной ветвей Са2+-

_1_ 9+

сигнальной системы в регуляцию К (Са )-каналов эритроцитов.

6. Изучить роль цАМФ-зависимой сигнальной системы в регуляции Са -зависимой калиевой проводимости мембраны эритроцитов.

7. Исследовать особенности Са2+-зависимой калиевой проводимости эритроцитов у больных с неопластическим процессом в сравнении с больными воспалительными заболеваниями

8. Исследовать функционирование К+(Са2+)-каналов эритроцитов у больных с микросфероцитозом.

Положения, выносимые на защиту:

1. В формировании Са -индуцированного гиперполяризационного ответа

2+ 2+ эритроцитов участвуют Са -активируемые калиевые каналы, Са -АТФаза и

СГ /НС03~-транспортер.

2. Однократная нагрузка эритроцитов ионами кальция переводит Са -

АТФазу в состояние длительно поддерживаемой повышенной активности,

+ 2+

что имеет важное регуляторное значение для К (Са )-каналов.

2+

3. Один из важнейших путей регуляции К (Са )-каналов опосредован белками цитоскелета эритроцитов: деформации цитоскелета при набухании или сжатии эритроцитов снижают Са2+-зависимую калиевую проницаемость мембран эритроцитов.

4. Возбуждение адренэргических рецепторов модифицирует Са -зависимую калиевую проницаемость мембраны эритроцитов. Реализация эффектов катехоламинов осуществляется через ос-и Р-адренэргические рецепторы и опосредована стимуляцией цАМФ-зависимой и С-киназной систем регуляции, а также взаимодействием между ними. ГТФ-связывающие белки мембраны эритроцитов могут оказывать непосредственное воздействие на К+(Са2+)-каналы.

5. Нарушения структурно-функционального и метаболического статуса эритроцитов, отмечаемые при ряде патологических состояний, существенно модифицируют Са -зависимую калиевую проницаемость мембраны клеток. При развитии опухолевого или воспалительного процесса в организме отмечаются однонаправленные изменения Са2+-зависимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов, свидетельствующие о неспецифичности нарушений состояния эритроцитарной мембраны при этих патологиях. При наследственно обусловленной анемии (микросфероцитозе) Са2+-зависимая калиевая проводимость эритроцитов существенно возрастает, что связано со значительными нарушениями белков цитоскелета.

Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное изучение

2+

функционирования и регуляции К (Са )-каналов эритроцитов. Установлено, что в формировании гиперполяризационного ответа эритроцитов, вызванного увеличением внутриклеточной концентрации ионов кальция, кроме К+(Са2+)-каналов, участвуют Са -насос, обеспечивающий восстановление МП, а также анионный транспортер, оперирующий в режиме однонаправленного

переноса. Больший Са2+-индуцированный гиперполяризационный ответ эритроцитов человека на одинаковую концентрацию ионов Са2+ по сравнению с эритроцитами крысы обусловлен более низкой скоростью транспорта анионов в режиме однонаправленного переноса. Показано, что активность Са2+-АТФазы существенным образом влияет на Са2+-зависимую К+ проницаемость мембраны эритроцитов. Амплитуда гиперполяризационного ответа, вызванного повторным увеличением входящего потока кальция, уменьшается в зависимости от времени, прошедшего после первого ответа. Установлено, что обнаруженный феномен связан со снижением внутриклеточной концентрации ионов кальция

•у,

вследствие перехода Са -насоса мембраны эритроцитов в более активное состояние.

Впервые подробно изучены особенности регуляции К+(Са2+) -каналов эритроцитов. Установлено, что важная роль в этом процессе принадлежит белкам цитоскелета клеток. Исследованы механизмы адренэргической регуляции Са -зависимой калиевой проводимости мембраны эритроцитов. Показано, что (З-адренэргические эффекты реализуются через активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы, а протеинкиназа С оперирует изменением Са2+-зависимой К+-проводимости при стимуляции а-адренэргических рецепторов.

Активация ГТФ-связывающих белков изменяет функционирование К+ (Са )-каналов эритроцитов путем прямого взаимодействия с олигомерным комплексом самого канала.

Впервые изучены параметры Са2+-индуцированной гиперполяризации эритроцитов больных раком легкого, с опухолями головы и шеи (ОГШ), раком желудка и толстого кишечника и больных с воспалительными процессами соответствующих локализаций. Применение кластерного анализа позволило выявить неоднородность группы больных раком легкого по характеристикам гиперполяризационного ответа эритроцитов и связать эти различия с морфологической формой рака легкого. Показано, что

характеристики Са2+-зависимой гиперполяризации эритроцитов больных с воспалительными процессами изменяются в том же направлении, что и у больных с опухолями, отличаясь от последних степенью выраженности. Впервые установлено, что в эритроцитах больных с микросфероцитозом существенно повышена Са2+-зависимая калиевая проводимость, а также активность Са2+-АТФазы.

Научно-практическая значимость работы. Теоретическое значение работы состоит в том, что получены новые сведения фундаментального характера, имеющие принципиальное значение для понимания механизмов функционирования и регуляции К (Са )-каналов эритроцитов, изучена природа Са2+-индуцированного гиперполяризационного ответа эритроцитов. Установлено, что в

Са2+ -зависимых изменениях мембранного потенциала эритроцитов принимают участие К+(Са2+)-каналы, Са2+-насос и анионный транспортер.

Данные, полученные в настоящей работе, позволили определить пути

+ 2+

регуляции К (Са )-каналов эритроцитов. Установлено, что большое регуляторное значение для этих каналов имеют белки цитоскелета, а также сигнальные системы, возбуждающиеся при стимуляции адренэргических рецепторов.

Полученные данные имеют значение для выяснения роли

К (Са )-

каналов эритроцитов в развитии патологических состояний, связанных с нарушением структурно-функционального статуса мембраны этих клеток. Результаты работы могут быть использованы для выяснения мембранотропных эффектов лекарственных препаратов, применяемых в клинике.

Основные положения работы используются в курсе лекций и на практических занятиях, проводимых на кафедре биофизики и нормальной физиологии Сибирского государственного медицинского университета, на кафедре физиологии человека и животных Томского государственного университета. Методические приемы и полученные данные используются в

научных исследованиях, проводимых на кафедре биофизики СГМУ и в НИИ фармакологии ТНЦ

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на Всесоюзной конференции "Обмен кальция в физиологии и патологии сердечно-сосудистой системы" (Томск, 1988), Первом Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996), III Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Санкт-Петербург, 1996), I съезде онкологов стран СНГ (Москва, 1996), 7-м национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1997), 3-м съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997), II Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1998).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ Автор выражает глубокую признательность директору Института фармакологии Томского научного центра СО РАМН академику РАМН, д.м.н., профессору Е.Д.Гольдбергу, член-корр. РАМН, д.м.н., профессору В.В.Новицкому, с.н.с., д.м.н. Е.А.Степовой за оказанное содействие в проведении настоящего исследования.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Ионные каналы, регулирующие потоки ионов через клеточную мембрану впервые появляются уже у прокариотических организмов. Эти ион-транспортирующие системы быстро развиваются у эукариот, для которых характерны формирование цитоплазматических компарта