Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние бактериального и синтетического пептидогликанов на проявление различных свойств корпускулярной и субклеточной коклюшных вакцин

РГБ од

1 7 ОПТ 1996

На правах рукописи

ЕРМОЛОВА Елена Викторовна

ВЛИЯНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО И СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДОГЛИКАНОВ НА ПРОЯВЛЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ СВОЙСТВ КОРПУСКУЛЯРНОЙ И СУБКЛЕТОЧНОЙ КОКЛЮШНЫХ ВАКЦИН

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Научный руководитель кандидат медицинских наук Н.С. ЗАХАРОВА

Официальные оппоненты: - доктор медицинских наук,

профессор Л.И. КРАСНОПРОШИНА - доктор медицинских наук, профессор Б.В. ПИНЕГИН

Ведущая организация НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Заседание состоится 19 сентября 1996 г. в 14 час на заседании диссер; тационного Совета Д 001.38.01 при НИИвакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской академии медицинских наук по адресу: 103064. г. Москва, Малый Казенный пер., 5а.

Автореферат разослан 19 августа 1996 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИвакцин и сы вороток им. И.И. Мечникова.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат медицинских наук

Н.Г. КУДРЯВЦЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поиск и изучение препаратов различной природы, применение которых способствует усилению естественнного, а также поствакциналыюго иммунитета, является одной из важных задач теоретической и прикладной иммунологии .

В последние годы выявлено большое число природных и синтетических соединений, обладающих иммуномодулирующими свойствами. Одной из перспективных групп иммуномодуляторов /ИМ/ являются препараты пептидогликановой природы и их синтетические аналоги (.ГибепЬег^ Н. et а1., 1986, Иванов В.Т, 1984). Препараты данной группы растворимы п поде, слаботоксичны, не обладают митогенными, митостатическими, лимфотоксическими и канцерогенными свойствами. Проявляют противоопухолевую активность, а также стимулируют образование фактора некроза опухоли. Пептидогликаны активируют неспецифические факторы естественной резистентности (комплемент, лизоцим), повышают фагоцитарную и миграционную активность макрофагов, оказывают влияние на рецепторный аппарат макрофагов, вызывают усиление пролиферации Т- и В-лимфоцитов под влиянием митогенов, стимулируют первичный и вторичный иммунный ответ к небактериальным и бактериальным, корпускулярным и растворимым, тимусзависимым и тимуснезависимым антигенам как при пероральном так и парентеральном введении (Андриянова И. Е., 1992, Пинегин Б. В с соавт. 1994, Манько КМ. с соавт., 1988, 1989 ). Адъювантный эффект этих препаратов может быть использован при конструировании вакцинных препаратов против вирусных,

бактериальных и протозойних инфекций. Использование ИМ в сочетании с вакцинами обусловит в ряде случаев повышение эффективности специфической иммунопрофилактики за счет уменьшении дозы и числа инъекций некоторых реактогенных вакцин или повышения активности слабоиммуногенных препаратов (Николаев А. И с соаЕТ., 1989). Необходимость расширения этих исследований возрастает в связи с разработкой вакцин нового поколения: субъединичных или полученных с помощью генной инженерии или химического синтеза.

Использование в практике иммунизации детей корпускулярной коклюшной вакцины в ассоциации с дифтерийным и столбнячным компонентами нередко связано с рядом нежелательных реакций на прививку. Однако, как было показано в Японии и Англии, отмена вакцинации детей против коклюша приводит к резкому подъему заболеваемости и смертности детей от этой инфекции (Мэ КШпоп J.A. еЬ а1, 1980, Капа! К., 1980).

Поэтому в последние годы во многих странах мира проводят исследования по совершенствованию коклюшных препаратов. Единственный путь снижения нежелательных реакций при проведении профилактических прививок - усовершенствование АКДС-вакцины, и в первую очередь, коклюшного компонента Одним из перспективных препаратов является субклеточная коклюшная вакцина (СКВ), разработанная и полученная в лаборатории иммуномодуляторов НЖВС им. И. И. Мечникова, обладающая меньшей токсичностью и гистаминсенсибилизирующей активностью при достаточной иммуногенности по сравнению с корпускулярной коклюшной вакциной. СКВ содержит основные протективные антигены коклюшного микроба: коклюшный анатоксин, филаментозный гемагглютинин, агглютиногены 1, 2, 3, белок

наружной мембраны 6У кДа и небольшое количество эндотоксина. В качестве сорбента используют гидроокись алюминия - основной сорбент, применяемый в наик-й стран*' при производстве вакцин. Однако имеются данные литературы о нежелательных побочных • действиях гидроокиси алюминия (Ргш*ге1й , 1979, НапаЬое Т., 1989, ). Поэтому представляло интерес изучить в эксперименте возможность использования пептидогликана различной природы в качестве адъюванта в новой коьлюшной вакцине.

Цель исследования. , Изучить в эксперименте влияние бактериального пептидогликана, полученного из Ь. ЬшдаПсиз и синтетического пептидогликана - гликопина (аналога мурамилдипептида) на -проявление основных свойств корпускулярной и субклеточной коклюшных вакцин - протектиЕные, токсические, сенсибилизирующие свойства

Задачи исследования:

1. Определить влияние ИМ на проявление протективных свойств коклюшных вакцин.

2. Изучить влияние бактериального и синтетического пептидогликанов на проявление токсических свойств коклюшных вакцин различных видов.

3. Исследовать возможность применения ИМ для снижения проявления сенсибилизирующих свойств коклюшных вакцин.

4. Изучить некоторые механизмы действия на макроорганизм иммуномодуляторов, при совместном введении с коклюшными вакцинами.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований получены следующие данные: установлено, что влияние исследуемых иммуномодуляторов на организм экспериментальных животных зависит от соотношения

дои ИМ и коклюжпного антигена, а также от вида коклюшного антигена. Шюзлно, что оактериалышй и синтетический пептидгликани в определенных донах не только повышате протективное действие коклюшных вакцин но и снижают' проявление токсических и сенсибилизирующих свойств этих препаратов.

Исследуемые ИМ в различной степени влияют на активность одиного из основных ферментов пуринового метаболизма 5' -нуклеотидазу и эптоэнзим АТФ-азу макрофагов перитонеального экссудата, участвующих в механизмах их активации. Показано, что бактериальный и синтетический ПГ уменьшают иммуномодулирующее действие корпускулярной и субклеточной коклюшных вакцин, компенсируя супрессию индукции ИЛ-1 и ИЛ-2, вызываемую введением корпускулярной коклюшной вакцины.

Практическая значимость. Материалы диссертации расширяют знания о свойствах различных новых иммуномодуляторов и практическом использовании их в вакцинологии. Путем сравнения действия ПГ и ГЛ получены данные о преимуществе применения гликопина в качестве иммунопотенциирующего компонента субклеточной коклюшной вакцины. Отработаны оптимальные дозы его применения, ведущие к уменьшению протективных доз субклеточной и корпускулярной коклюшных вакцин.

Положения выносимые на заяиту.

1. Синтетический пептидогликан - гликопин (ГЛ) является перспективным иммуномодулятором, способным понижать отрицательное воздействие ка организм, вызываемое корпускулярной коклюшной вакциной (КВ).

2. Установлена возможность использования гликопина в качестве адъюванта в субклеточной коклюшной вакцине (СКВ).

Апробация диссертации:

Материалы диссертации доложены на VI Всероссийском оч-езде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов ( IL Новгород, Mai), на International Conf. on Médirai biotechnology immunization and AIDS (Leningrad,1991), на Всесоюзной научно-практической# конференции "Поствакциналыше осложнения, патогенез, профилактика, лечение" (Ленинград, 1991), на Всесоюзном обществе эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им И. И. Мечникова ( Москва, 1992), на конференции молодых ученых НИИВС им. И. И. Мечникова (Москва, 1994).

Диссертация апробирована 13.06. 96 на научной конференции отдела средств и методов иммунопрофилактики и иммунотерапии НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, 4 приняты в печать.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего ¿/.¿f источников. В начале работы приводится список используемых сокращений. Работа иллюстрирована 5 рисунками и 14 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

Характеристика бактериального пептидогликана. Пептидогликан (ПГ) - препарат, ■ полученный методом ферментативно-кислотного разрушения клеточной стенки Lactobacillus bulgaricus, с активным компонентом - фрагментом пептидогликана с Мм 10000 дальтон.

В наших исследованиях были использованы серии ПГ,

полученные из НМИоЧП г. г.-шкт Петербург.

Характеристика синтетического пептидогликана.

Лекарственный препарат гликоиин (ГЛ), приготовленный на основе глюкозаминилмурамилдинептида (ГМДП) ( -N-ацетилглюкозаминил (В-1-4) -N - ацетилыурамил - L - аланил - D - изоглшамин), получен по оригинальной методике, которая включает глнденсацию дипептида с дисахаридом, выделенным 'из (А lysodecticus. Препарат синтезирован в лаборатории химии пептидов Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина Российской АН.

Действие бактериального (ПГ) и синтетического пептидогликанов (ГЛ) изучали в диапазоне доз от 100 до 0.00001 мкг/мышь. Препараты вводили внутрибрюшинным, подкожным и пероральным методами. Большая часть работы выполнена при однократном введении препаратов. Многократное введение ПГ и ГЛ использовали только при изучении их влияния на изменение токсических свойств коклюшных препаратов( в хроническом опыте). Все исследования проводили в динамике. Основные интервалы между введением препаратов и изучением их влияния на иммунный статус организма животных - 1, 7 и 14 сутки.

Характеристика коклаиньк вакцинных препаратов,

использованных в' экспериментах.!. Коклюшная корпускулярная вакцина, приготовленная на предприяттии "Биомед" им. И. И. Мечникова, содержала убитые бактерии B.pertussis шт. 305, 312, 150. 2. Для проведения настоящих исследований нами быди получены экспериментальные серии субклеточной коклюшной вакцины (СКВ). Путем восстановления шт. 475 Bordetella pertussis из лиофильно высушенного состояния и последующего двухкратного пассажа на плотной питательной среде Борде-Жангу, а затем трехкратного пассажа на жидкой полусинтетической

питательной среде получали маточную, культуру К poi t и^лз. Маточную культуру высевали на матрацы с жидкой питательной средой, разработанной в НИИВО им. И. И. Мечникова н лаборатории экспериментальной микробиологии, Выращивали В. ригЬиги и в течении 5 суток, а затем производили сбор культуры из матрацев в бутыли. Таким образом была приготовлена нативнал взвесь В. pertussis. Затем из суспензии коклюшных бактерий центрифугированием удаляли микробные клетки. Из надосадочной жидкости (нативного супернатанта) при рН= 3. 4 + 0. ОЬ осаждали антигенный комплекс, осадок отделяли последующим центрифугированием и затем растворяли в фосфатном буфере при pH 7.2 + 0.05. Полученный антигенный комплекс

детокеицировали с помощью формалина. В результате этой работы бил получен полуфабрикат субклеточной коклюшной вакцины (т.е. несорбированный на геле гидроокиси алюминия).

Характеристика втаммов микроорганизмов, использовалтьн в работе. Вирулентный штамм 18323 Bordetella pertussis, типичный по морфологическим свойствам, получен из ГИСК им. Л. А. Тарасевича. Игамм был лиофилько высушен. Для каждого нового опыта использовали новую ампулу.

Лабораторные животные. Основная часть работы проведена на мышах-гибридах первого поколения (СВА х C57B1/6)F1, мышах линии СВА и аутбредных мышах обоего пола с исходной массой 14-20 г, которые были получены из опытно-племенного питомника лабораторных животных АМН РФ "Светлые горы", питомника НИИВС им. И. И. Мечникова "Белый мох". Всего в экспериментах было использовано около 10 тысяч мышей.

Методы оценки влияния бактериального и синтетического пептидогликанов на проявление основных свойств коклкишых

вакцин. О влиянии 11Г и ГЛ на проявление токсических свойств коклюшных вакцин судили по действию препаратов на организм экспериментальных животных, используя следующие методы: -определения токсичности коклюшных вакцин в хроническом опыте при многократных введениях препаратов (До1слинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. - М. -1989.) -определения токсичности коклюшных препаратов по изменению массы мышей в соответствии с требованиями ВОЗ, 1982 г. -определения токсичности коклюшных вакцин в тесте стека лапки у мышей по методу Климовицкой В. Е и соавт. ,(1967 ), -определения токсичности коклюшных препаратов в тесте развития эндотоксинового шока у мышей по методу, изложенному в Методических рекомендациях по определению примесей бактериальных эндотоксинов в Бакцинах ( 1986).

О влиянии ПГ и ГЛ на проявление' сенсибилизирующих свойств коклюшных вакцин судили по действию препаратов на организм экспериментальных животных, используя следующие методы:

- определения анафилактогенной активности коклюшных вакцин по методу Климовицкой ЕЕ. и соавт. (1967).

- определения гистаминсенсибилизирумцей активности корпускулярной коклюшной вакцины по методу Ргеэ1оп N. V. (1959).

- определения гистаминсенсибилизирующей активности субклеточной коклюшкой вакцины по методу Э., (1984).

Влияние исследуемых иммуномодуляторов на проявление протективных свойств коклюшных препаратов изучали на модели экспериментального коклюшного менингознцефалита по методу Кепс1г1с Р. е1 а1 (1949).

Действие бактериального и синтетического пептидогликана и

коклюшных препаратов на активность ферментов макрофагов перитонеального экссудата исследовали, используя методы:

- выделения макрофагов перитонеального экссудата (Bruyley-Rosset М. et al. , 1976 г.),

- определения активности 5' -нуклеотидазы и АТФ-азы в суспензии жизнеспособных клеток (Dixon Т.Е. и Purdom М. , 1954), в модификации Туманян М. А. и Кирилличевой Г. Б. (1984). Актиеность 5'-н и АТФ-азы выражали в процентах по отношению к контролю.

Индукцию ИЛ-1 и ИЛ-2 определяли через 7 и 14 суток после введения коклюшных препаратов и иммуномодуляторов по методу Lachmn L. (1985).

От опытных и контрольных животных получали суспензию клеток селезенки и культивировали их в среде RPMI 1640 с 5Z эмбрионеальной телячьей сывороткой, 10 шМ HEPES, 2 тМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина и 5x10-5 меркаптоэтанола Инкубацию осуществляли в 96-луночных планшетах Costar, США, внося в каждую лунку по 250x103 слленоцитов, 500x103 или 4x103 Кон А-бластов. Для получения Кон А бластов спленоциты инкубировали в 50-миллилитровых пластиковых флаконах фирмы Costar по 20х10бклеток в 8 мл среды культивирования.

При определении ИЛ-1 готовили суспензию тимоцитов 6-10 недельных мьппей C3H/Hej (самок) в конечной концентрации 5x106 клеток/мл. В качестве неспецифических митогенов использовали Кон А-сефарозу (1 мкл/мл, "Pharmacia"). ФГА Р (0.5мкл/мл, "Difco"), в качестве стандартного препарата интерлейкина-1 использовали рекомбинантный ИЛ-1 "Биоген", в качестве стандартного препарата интерлейкина-2 - фактор роста Т-клеток (ИЛ-2) фирмы "Sigma" в дозе 10-80 ед/мл. Для инактивации Кон А

р культуру дослали 0. 1 M Jметил-D-манноииранозид.

Бремя инкубации клеток составляло для получения Кон А-СласгиБ G часов, для получения супернатанта,

обогащенного ЯЛ-S - 40 часов, при тестировании актиьнооти ил-2 ПО часчу. при тестировании активности ИЛ-1 - 05 часов. Прили<1»?рацич1 клеток оценивали по включению H - тимидина. Метку ВНОСИЛИ' За lo часов il мкКи в лунку, 1 Ku/мМ) (при тестировании ММ) или за 4 часа (2 мКи в лунку, 1 Ku/мМ) до окончгшия культивирования. Меченые клетки переносили на i:TfKJiuBuJ!u>\.4¡-h'Trk- фильтры GF/o ("Whatman") с помощью клеточного харвеетера ("Dynateoh") и просчитывали радиоактивность на оцинтилляционном В-спектро({отометре (. "Ti acor Fui opa").

Статистическая обработка результатов. Полученные результаты обработаны статистически общепринятыми методами. Дх-товарность разности -средних величин оценивали по критерию Сгпюдгni'.-t при уровне значимости не более 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Для оценки влияния ИМ на проявление токсических свойств коклюшных вакцин использовали тест изменения массы мышей на 7 день после введения препаратов. Препараты вводили животным внутрибрюшинно, КВ в дозе 10 МОЕ и СКВ в дозах 100, 20 и 4 мкг/мышь в смеси с ИМ в дозах 100 и 0. 0001 мкг/мышь. Препараты считали нетоксичными, если через 7 суток среднее увеличение массы мышей составляло не менее 60% по сравнению с контрольной группой. Контрольные группы мышей получали однократно внутрибрюшинно физиологический раствор хлорида натрия.

Действие ИМ сравнивали с действием гидроокиси аллюминия (группа мышей получала СКВ в дозе ПО мкг, адсорбированной на гидроокиси алюминия).

Результаты экспериментов по определению иодострой токсичности К01слюшшдх препаратов в тесте изменения массы мышей показали, что корпускулярная коклюшная вакцина обладает более выраженными токсическими свойствами, в сравнении с СКВ. Наибольшую эффективность действия ИМ отмечали при использовании с наиболее .токсичной дозой вакцины, при этом наиболее сильное гипотоксическое действие оказывала наименьшая доза иммуномодуляторов (0.0001 мкг). Выявлено, что синтетический пептидогликан является наиболее эффективным средством для снижения проявления токсичности коклюшных препаратов, чем пептидогликан бактериальной природы. Сравнивая действие гидроокиси алюминия и иммуномодуляторов, используемых в качестве адъюваг.тов, обнаружено что гидроокись алюминия приводит к увеличению токсичности коклюшных вакцин, в то время как применение иммуномодуляторов снижает проявление токсических свойств коклюшных препаратов.

Исследование влияния иммуномодуляторов на проявление хронической токсичности СКВ, показало, что и ПГ и ГЛ устраняют токсический эффект СКВ, на 7-9 сутки, т. е. в те дни, когда наблюдалось снижение ' массы животных, при введении одного коклюшного препарата В данных исследованиях также подтверждается преимущество использования ГЛ, т. к. в ранние сроки наблюдения применение ПГ увеличивало хроническую токсичность СКВ, в то время как ГЛ на нее не влиял.

Коклюшные препараты, в том числе и СКВ, содержат некоторое количество эндотоксина. Резистентность животных к

эндотоксину, обработанных актиномицином-Д, снижается, при этом но изменяется их чувствительность к микробным 0ел1совым токсинам. При изучении влияния ГЛ на изменение чувствительности иммунизированных мышей к эндотоксиновому шоку установлено, что применение ГЛ совместно с СКВ в наибольшей из исследованных доз (100 мкг) ведет к увеличению гибёли животных от эндотоксинового шока, а наименьшая доза иммуномодулятора (0.0001 мкг) оказывает достоверное гипотоксическое действие. Гибель мышей снижалась при этом в 4 раза (рис.1).

В экспериментах, в которых изучалось влияние ИМ на проявление токсических свойств коклюшных препаратов в тексте отека лапки установлено, что отдельно введенные СКВ, ГЛ и гидроокись алюминия относятся к группе слаботоксичных препаратов. Применение гидроокиси алюминия совместно с СКВ усиливало ее токсические свойства и переводило сорбированный субклеточный коклюшный препарат в группу среднетоксичных препаратов. ГЛ введенный в разных дозах совместно с СКВ не усиливал проявления токсических свойств вакцины (.рис. 2).

Таким образом, на первом этапе работы установлено, что исследуемые иммуномодуляторы в зависимости от введенной дозы, природы ИМ, Евда коклюшной вакцины и времени прошедшего после иммунизации, способны изменять токсическое действие вакцин. Как правило, очень маленькие дозы исследуемых иммуномодуляторов способны снижать токсичность коклюшных препаратов. Из двух исследованных иммуномодуляторов наибольшей активностью обладал синтетический пептидогликан - гликопин.

Наблюдая действие ИМ на изменение проявления токсических свойств коклюшных вакцин можно предположить , что основным в механизме изменения токсичности коклюшных препаратов при

coi'.Mi" ri'iioM введении с ИГ и ГЛ, вероятно, является способность ИМ егиму.ищювать Ш'спопифические факторы резистентности макроирганинма: активация макрофагов. увеличение

цито.питичоский активности перитонецльных макрофа1'ов. активация системы комплемента, секреция цитокинов и т. д. ( Вершигора А. К. ( 1 986). Никитин А. В. С1987), Adam А. (1984), Lederer Е. (1988)). Кроме того, предполагают ( Chedid L. et al, 1983, 1984), что в некоторых медиаторах млекопитающих присутствуют структуры сходные с бактериальными и некоторые иммунобиологические свойства мурамилдипептидов могут быть обусловлены биологической мимикрией с эндогенными продуктами.

Как было указано ранее Климовицкой Е Е и соавт. (1977), внутрибрюшинное введение мышам коклюшных вакцин приводит к повышению чувствительности животных к гистамину, который является одним из медиаторов, участвующих в развитии аллергических реакций. Кроме того, у мышей, сенсибилизированных коклюшными вакцинами, повышается восприимчивость к активной и пассивной анафилаксии. В связи с этим,целью второго этапа исследований было изучение влияния иммуномодуляторов на сенсибилизирующие свойства коклюшных вакцин. Определяли изменение чувствительности мышей, иммунизированных коклюшными вакцинами к гистамину и изменение течения анафилактического шока у мышей, предварительно сенсибилизированных коклюшными вакцинами.

При изучении влияния ИМ на проявление сенсибилизирующих свойств коклюшных препаратов, мышам вводили KB в дозах 100,-20 и 0,4 МОЕ, СКВ в дозах 180, 60, и 20 мкг. Действие ПГ. и ГЛ испытывали в диапазоне доз от 100 до 0,0001 мкг. Нами установлено, что с помощью ПГ и ГЛ можно уменьшить

пл'таитечшик^ихийкруюиг'- яой'-тми' КЬ и (ТА В к-У-яьтате экспериментов уетаиошшни, что ГСА КВ и СКВ зависит от дови: Чем больше- доза, тем более ьирал-на ГСА вакцины.

Полученные нам;: дапньк свидетельствуют о • том. что препараты груплн бактериал; них и синтетических IIT изменяют проявление ГСА коклюшных препаратов. Степень

глпосч-неибилиуирующкто действия ИМ зависела как' от природы иешш.эусмого иммуномодулятора, его дозы, так и от соотношения доз ИМ и кс шшшшх препаратов. Была отмечена общая закономерность действия иммуномодуляторов - снижать наиболее высокую ГСА вакцины, вызываемую большими дозами коклюшных вакцин. Изучаемые ИМ при введении' с КВ ни в одной из исследуемых доз не увеличивали ГСА вакцины. Однако, при совместном введении СКВ в дозе 60 мкг, ПГ в дозе 100 мкг вызвал увеличений гибели мышей, в то время как аналогичная доза ГЛ снижала чувствительность мышей к гистамину ( рис. 3). Отмечена интересная закономерность: бактериальный ПГ в достаточно большой дозе может провьапать сенсибилизирующие свойства даже такой дозы коклюшной вакцины, ' которя без ИМ не повыпала чувствительность животных к гистамину. У синтетического пептидогликана такое действие не выявлено. Полученные результаты свидетельствуют. о необходимости детального исследования любого иммуномодулятора при совместном введении с тем антигенным препаратом, для которого предполагается использование этого иммуномодулятора в качестве адъювакта.

При исследовании влияния ИМ чна проявление анафилактогенных свойств крклюашых вакцин, установлено, что введение ПГ в дозе 100 мкг снижало сенсибилизирующее действие

СКВ СКВ+ГЛ 1м*г СКВ+ГП 0 01 мкг СКВ»ГЛ 0.0001 мкг

Првпарвт

Рис. 1. Влияние Г71 на проявление токсических свойств СКВ в тесте развития эндотоксинового шока у мышей.

+ГЛ А|(ОН)3

0,0001 мкг

ГЛ 0.1 гл

мкг 0,0001

мкг

Препараты

Рис. 2. Влияние ИМ на проявление токсических свойств СКВ в доза 20 мкг (в тесте отека лапки у мышей).

70 : 60 50 40 30 20 10 0

скв+пг

100 мкг

скв*гтг 0,0001 мкг Препараты

скв»т

100 мкг

[Н

180 мкг СКВ ИС0 мкг СКВ Я20 мкг СКВ

СКВ»ГЛ

о.ооо!

мкг

Рис. 3. Влияние ИМ на гистамимсенсибилизирующую активность СКВ.

И5», обладающей иконкой анафилактогенной активностью в иммунизирующей человеческой дозе, на 50 7... Действие ГЛ в дозе 100 мкг и 0.0001 мкг было одинаково и снижаю гибель животных на. 20-30 X (рис.Д). Показано, что СКВ в иммунизирующей человеческой дозе не обладала сенсибилизирующим действием на организм мышей. Введение ИМ с СКВ не изменялоколичество павших животных Таким образом, в зависимости от природы, величины лозы ИМ и вакцин.. ИМ способны или уменьшать высокое сенсибилизирующее действие коклюшных вакцин , или не изменять это свойство, если оно слабо выражено.

Влияние иммуномодуляторов на снижение

гистаминсенсибилизирующего действия коклюшных препаратов можно объяснить возможным гипосенсибилизируюшдм действием, связанным с активацией дезаминирования гистамина (Бауманчс Э. А. и соавт. , 1988) или снижением чувствительности тканевых рецепторов под влиянием ИМ к медиаторам анафилаксии (Покровская С. К и соавт, 1984). Возможно, с этим связана установленная способность ИМ снижать анафилактогенное действие коклюшных вакцин.

Таким образом, результаты наших исследований показали, что одним из возможных путей снижения реактогенности КВ и СКВ может явиться использование синтетического аналога мурашлдипептида - гликопина.

Поиск и изучение иммуномодулирующих препаратов с целью повышения поствакцинального иммунитета представляет важный практический интерес. Поскольку нами была выявлена способность ПГ и ГЛ влиять на проявление токсических и сенсибилизирующих свойств корпускулярного и субклеточного коклюшных препаратов, третьим этапом работы было изучение влияния иммуномодуляторов

на важнейшее евойстю вакцин •• :*;ищедш. организм хтюгных от рччьигт: кок.чкыного мешшгиэпце^и'ш':':! при адсичсшш их вирулентно» коклюшной культурой.

Нами установлено, чги при совместном внутрибркыишюм введении ГЛ с корпускулярной коклюшной вакциной ее защитные свойства усиливаются, при этом наиболее выраженное стимулирующее действие ГЛ проявляется при введении с наименее иммуногенной дозой вакцины (0,02 мкг). Эти данные указывают на возможность сяихь-ш'л защитной дозы вакцины. Особый интерес вызывает факт повышения защитного действия КВ в дозе 0.02 МОЕ при одновременном псроралыюм введении ГЛ в дозе 100 мкг.

При изучении влияния ИМ на протективные свойства СКВ установлено, что ¿ффективность использования ПР и ГЛ зависит от соотношения с дозами СКЬ. Применение ГЛ позволяет снизить защитную дозу вакцины в 10 и даже в 100 раз. Также показано, что адъювантный эффект ИМ значительно превышает эффективность гидроокиси алюминия при введении с СКВ (табл 1).

Таблица 1.

Изменение защитной активности СКВ при использовании гликопина.

СКВ, доза Доза ИМ Отношение выживших Кол-во выживших

(мкг/мышь) (мкг) к езятым в опыт мышей в 7.

1.25 АЬ(0Н)3 36/40 00

0.125 20/40 50

0.0125 16/40 40 Гликэпин

1.25 0.1 26/40 ГО

0.125 0.1 32/40 30*

0. 0125 0. 1 3/40 20

1.25 0.001 20/40 ;:ю

0. 125 0. 001 32/40 80*

0.0125 0.001 28/40 70а

1.25 . 0.00001 40/40 100

0.125 0.00001 36/40 90*

0.0125 0.00001 32/40 '80*

Примечание: * - достоверность различия по х2 по сравнению с введением СКВ.

По мнению (Вгоуп аь е1 а1, 1985) одним из механизмов протективного действия пептидогликанов является усиление хемокинеза полиморфноядерных лейкоцитов. Манько К М. и соавт. (1989) установлено, что ГМДП оказывает иммуностимулирующее действие главным образом на макрофагальное звено кммунного ответа и на пролиферацию Т- и В-лимфоцитов.

Влияние ИМ на макрофагальное звено иммунного ответа подтверждено результатами наших исследований. Показано изменение активности двух ферментов мембранной локализации макрофагов перитонеального экссудата (ШЭ). Один из них - 5'-нуклеотидаза является одним из ферментов, который регулирует внутриклеточное содержание аденозина (Р^гащеИ С. еЬ а1, 1981). Продукт 5'-нуклеотидазы - аденозин в настоящее время рассматривается как один из основных физиологически): регуляторов иммунологических процессов (Вагапк1еиег .1. е1 а1, 1985: ¡НсЬ Я.Е. еЪ а1, 1986; Елисеев В. К и соавт. 1991).

Ма+, К+-аденозинтрифосфатаза'СЛТФ-аза) также является ферментом, чей активный центр -локализован в мембране, она

мотет функционировать как фермент и как молекулярный насос, катализирует гидролитическое раеашлени«--- АТФ до АДФ и фосфата, высвобождающаяся при атом свободная энергия используется для перекачивания ионов калия из окружающей среды внутрь метки, а ионов натрия из ¡тетки в окружающую среду.

Использование ИМ совместно с вакцинами приводит к изменению ферментативной активности МПЭ при введении обеих исследуемых вакцин, причем действие ИМ при введении с СКВ менее выражено, йммуномодулирующая активность ЛГ проявлялась в большей степени при введении с корпускулярной вакциной, а гликопина - с субклеточной коклюшной вакциной. При сравнительной характеристике изменения активности ферментов от использованной дозы ИМ выявлена следующая тенденция: если на активность 5' -н в большей степени оказывают действие ИМ в дозе 0.0001 мкг, изменение активности АТФ-азы под действием комплекса ИМ- вакцина практически не зависит от дозы ИМ (рис. 5).

Согласно данным Туманян М. А. и соавт (1986), снижение активности 5'-н МПЭ через 1 сутки после подкожного введения различных препаратов свидетельствует об их иммуностимулирующих, а повышение об иммуносупрессивных свойствах. Исходя из этого, полученные нами данные свидетельствуют, что и корпускулярная и субклеточная коклюшные вакцины оказывают на макроорганизм значительное иммуностимулирующее действие. Использование бактериального и синтетического ИМ при введении с вакцинами приводит, в основном, к снижению иммуномодулирующего действия вакцин.

Можно предположить, что исследуемые иммуномодуляторы оказывают влияние на цитоплазматическую мембрану макрофагов

. во • 70 60 И 40 30 20 10 О

10 МОЕКВ «ПГ 100 мкг +ПГ 0,0001 мкг +ГЛ 100мкг +ГЛ 0,0001 мкг

Препараты

Рис. 4. Влияние ПГ и ГП на анафилогенные свойства КВ.

♦ПГ 0,0001 мкг Препараты

♦ГП0.0001 мкг

100 80

а! 60 * 40

20

о

+ПГ0,1мкг

+ПГ 0,0001 мкг Препараты

+ГЛ 0,1 мкг

+ГЛ 0,0001 мкг

Рис. 5. Изменение активности 5'-нуклеотадазы МПЭ при введении коклюшных вакцин и ИМ.

+ПГ 0.1 мкг

+ГЛ 0.1 мкг

1 Уманикий В. Ю. и еоавт, Ю86). создают условии для внутриклеточной концентрации аденозина. являясь ингибитором Функциональной активности иммушжомпетентних клеток, в т. ч. и макрофагов. Кроме того, возможно влияние ИМ на перераспределение макрофагов в организме, накопление в перитонеалыюм экссудате клеток с высокой и низкой Функциональной активностью (Зе исков КМ., 1937).

К настоящему времени известно, что иммуномодуляторы действуют такле на способность иммунокомпетентных клеток индуцировать продукцию различных медиаторов иммунных реакций, в том числе и интерлейкинов (ИЛ). Нами установлено, что КВ обуславливает супрессию индукции, как ИЛ-1, так и ИЛ-2 на 7 сутки после введения, только к 14 суткам активность ИЛ-1 и ИЛ-2 приближается к контрольному уровню. При введении СКВ наблюдается резкая стимуляция индукции ИЛ-1, - которая сохраняется до 14 суток, при этом значения индукции ИЛ-2 в оба срока исследования не отличались от контрольных.

Отдельно введенные ИМ оказывали разноплановое действие на индукцию как ИЛ-1, так и ИЛ-2. Применение ИМ в большей дозе (0,1 мкг) огазывало сильно выраженное стимулирующее действие только к 14 суткам, а в меньшей дозе (0,0001 мкг) уже к 7 суткам. Это свидетельствует о том,. что ИМ в меньшей дозе оказывают более сильное влияние на ИЛ-1- индуцирующую функцию спленоцитов на более ранних сроках. При изучении влияния ИМ на индукцию ИЛ-2 было замечено, что наиболее активным оказался ГЛ в дозе 0.0001 мкг, который усиливал индукцию ИЛ-2, в то время как применение бактериального ПГ оставляло эти показатели на уровне контроля. При введении ИМ. с КВ ГЛ в дозе 0.0001 мкг также проявляет большую активность, при этом применение ПГ

усиливает супрессирующте дейс'ГЕие ИВ. а применение ГЛ остаг,./Я'от значения индугадеи ИЛ-1 Олюдоуи к контролю во веч; сроки исследования. Аналогичные розу иьтаты получены и при изучении индукции ИЛ-2. В этом случае ГЛ в дозе 0.0001 мкг также проявляет большую активность, снимая на 14 сутки супресеирующее действие KB на интерлейкин-2. При введении с СКВ ГЛ в дозе 0.0001 мкг также наиболее активен, ок вызывает усиление индукции Ю;-1 в значительно меньшей дозе чем Iff (0,1 мкг).

Результата наших исследований показывают, что с помощью ИМ возможно уменьшить побочное действие как корпускулярной, так и субклеточной коклюшной вакцины при одновременном увеличении их защитной активности. Установлено, что при разработке э<йективных субклеточных коклюшных вакцин с низкой реактогенностью может быть использован синтетический иммуномодулятор - глккопин.

ВЫВОДЫ

1. Полученные результаты свидетельствуют ' о перспективности применения бактериального (ПГ) и синтетического (ГЛ) пептидогликанов в качестве иммуномодуляторов способных усиливать иммуногенность корпускулярной и субклеточной коклюшных вакцин и уменьшать токсическое и сенсибилизирующее действие этих препаратов на организм животных.

2. Установленное антитоксическое действие ИМ зависит от сочетания ■ доз ИМ, вакцины и времени прошедшего после иммунизации. Применение различных методов определения

токсичности коклюшных вакцин, позволило выявить преимущества ГЛ, который в исследуемых дозах или не увеличивал проявления токсичности коклюшных препаратов или значительно уменьшал се.

3. Отмечена возможность применения ИМ для снижения ГСЛ коклюшных вакцин. Эффект снижения гиетаминсенсибилизирующих свойств зависит от . оптимального соотношения доз коклюшных вакцин и их вида. Применение 1!Г в большей дозе может приводить к повышению сенсибилизирующих свойств коклюшных вакцин, тогда как ГЛ такое действие не оказывает.

4. Показана высокая анафилактогенная активность . корпускулярной коклюшной вакцины, в сравнении с субклеточной

коклюшной вакциной, у которой этой активности не выявлено. Примененение ПГ и ГЛ снижало проявление анафилактогенных свойств КВ и не изменяло этой активности у СКВ.

5. Установлено, что ПГ и в большей степени ГЛ при введении с КВ и СКВ оказьшали выраженное иммуномодулирувщее действие, которое, в зависимости от доз вакцин и вида иммуномодулятора, проявлялось в повышении протективных свойств коклюшных вакцин, что позволяет уменьшить защитную дозу вакцины.

6. Показано, что применение гидроокиси алюминия усиливает токсическое действие коклюшных препаратов, в то время как введение ИМ уменьшает это действие. Влияние ИМ на протективные свойства СКВ сравнимо, или в зависимости от дозы, даже превышает адъювантные свойства гидроокиси алюминия.

7. Изученные ИМ при введении в организм оказывают непосредственное влияние на ферменты цитоплазматической мембраны макрофагов 5' - нуклеотидазу и АТФ-азу, и нормализуют секрецию ИЛ-1 и ИЛ-2 .

!.'>. Отмочено преимущественное использование синтетического ИТ - гликопинэ. лричем с одной стороны ГЛ может быть использован для усовершенствования 'корпускулярной коклюшной вакцины с целью уменьшения ее отрицательного действия и увеличения защитной активности вакцины, а с другой стороны ГЛ может быть использован как адъюЕант в новой субклеточной коклюшной вакцине.

Список опубликованных работ.

1. Изменение активности 5'-нуклеотидазы и ЛТФ-азы в макрофагах перитонеального экссудата в опытах in vivo и in vitro. Ермолова Е. В. , Соловьева М. С., Кирилличева Г. Б.// Сб. трудоЕ НИИЗМ им. К. Ф. Гамалеи "Иммуномодуля горы в инфекционной патологии." - Москва - 19S9. - С. 24.

2. Ферменты пуринового метаболизма макрофагов как показатель естественной резистентности организма Кирилличева Г. Б. , Соловьева М. С. , Батурина И. Г. , Ермолова Е. В., Туманян НА.// Тезисы XVII съезда Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И. И. Мечникова. -Алма-Ата -1989. - С. 57.

3. Разработка вакцин ноеого поколения: некоторые итоги и перспективы. Захарова Е С. , Шмелева Е. И. , Радавский Ю. Л. , Мерцалова Е У. , Ремова Т. К , Баранова И. Г. , Озе редко в екая м. а , Брицина М. R , Шепелева И. Б., Ермолова Е. В. , Андронова Т. М. // Тезисы докладов VI Всероссийского съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. - Н. Новгород. - 1991.- С. 174.

с

4. Сравнительное изучение иммунобиологических свойств пептидогликанов различного происхождения. Захарова Е С., Шепелева И. Б. , Брицина М. В. , Елкина С. И., Андронова Т. М.,

Ермолова Е. 11// «¡at - 1991.- С. 52.

!j. The biotechnology of a generation of acellular PerUusis vaccine. Zakharova N. , Shepeleva I. , Romova T. , Baztianova I., Ermolova E.// International Coni'. on Medical bioteolinology immunization and AIDS. - 1991.- S. 6.

G. Development of a vaccine prepations for the prophylaxis and diagnosis of air-borne droplet infections and enteric infections with the use of bacterial peptidog1icans and their synthetic analogues. Zakharova N. , Shepeleva 1. , Ermolova £., Elkina S. , Remova T. , Bazhanova I. , Ozeretskovskaya M. , Ketlinsky S.// International Conf. on Ktedical biotechnology immunization and AIDS. - 1991,- S. 8.

7. Возможность использования гликопина для повышения эффективности бактериальных вакцин. Захарова Е О., Елкина С. Л , Брицина М. В. , Шепелева Я Б., Калина Н. Г. , Ремова Т. Е, Ермолова Е. R , Баранова И. Г. , Батуро А. П., Боровкова В. М. // Материалы научной конференции "Актуальные вопроси медицинской биотехнологии". - Томск. - 1991. - С. 120.

8. Пути подхода к повышению безопасности коклюшного компонента АКДС-вакцины. Ермолова Е. В. , Захарова а С., Иэпелева И. Б., Брицина М. В. , Баранова И. Г. , Ремова Т. Н., Озерецковская ПК// Материалы Всесоюзной научно-практической конференции "Поствакцинальные .осложнения, патогенез, профилактика, лечение". - Ленинград. - 1991. - С. 36.

9. Влияние иммуномодуляторов различного происхождения на гистаминсенсибилизирующую активность корпускулярной коклюшной вакцины. Захарова К. С. , Шепелева И. Б. , Брицина М. В. , Власов Г. С. . Калина И. Г., Елкина С. И. , Ремова Т. Е , Ермолова Е. Е , Бажанова И. Г. // ЖКЗИ. - 1992, N. 3. - С. 66.

10. Повышение иммуногенности бактериальных антигенов под влиянием одного из дериватов мурамилдипептида. Брицина М. В. , Шепелева И. В. . Батуро А. П. , Елкина С. И. , Калина Н. Г. , Андронова Т. М. , Ермолова Е. В. , Захарова Е С. , Иванов R Т. // ЖМЭИ. - 1992, N. 5-6. - С. 43.

И. Бесклеточная коклюшная вакцина на основе природного компонента антигенов, выделенных из супернатанта'синтетической среды культивирования. Захарова Е С. , Ремова Т. Е , Баранова iL Г. , Озерецковская М. Е , Брицина Ы. В., Шмелева Е. И., Мерцалова Е У. , Ермолова Е. В. , Сухинова Е. Е. , Булк R Ф. , Сиротинский A. R , Полуянов А. Г., Свиридов В. R , Вартанян fü П. //Принята в печать в ЖМЭИ. - 1996.

12. Поливалентный комплекс В. pertussis как основа бесклеточной коклюшной вакцины. Захарова Е С. , Баранова И. Г. , Ремова Т. Е , Шмелева Е. И. , Мерцалова Е У., Озерецковская М. Е , Брицина М. R , Ермолова Е. R , Зайцев Е. М. //Принята в печать в ЖМЭИ. - 1996.

13. Экспрессия протективных антигенов В. pertussis в процессе размножения бактерий в среде определенного химического состава. Шмелева Е. И. , Мерцалова Е У., Сухинова Е. Е. , Кириллов Г. А., Ремова Т. Е , Баранова И. Г., Озерецковская М. Е , Брицина М. R , Ермолова Е. R , Захарова Е С. //Принята в печать в ЖМЭИ. - 1996.

14. Иммуномодулирующая акимвность бесклеточной коклюшной вакцины и АВДС-вакцины, содержащей БКВ (АКДСб). Сочетанное применение с анатоксином стафилакокковым очищенным (ACO). Семенова И. Б. , Ремова Т. Е Бажанова И. Г. , Ермолова Е. В. , Захарова ЕС.// Принято в печать.-Тез. докл. Всерос. VII съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. -Москва. - 1997.