Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние антигенов и штаммов чумного микроба с экспрессией различных детерминант иммуногенности и вирулентности на уровень бласттрансформации лимфоцитов и активность интерлейкинов (1 и 2) при формировании иммунитета к чуме

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИЧЕСКОЕС* НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ «МИКРОБ»

На правах рукописи

ЕМЕЛЬЯНОВА Наталья Вячеславовна

ВЛИЯНИЕ АНТИГЕНОВ И ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА С ЭКСПРЕССИЕЙ РАЗЛИЧНЫХ ДЕТЕРМИНАНТ ИММУНОГЕННОСТИ И ВИРУЛЕНТНОСТИ НА УРОВЕНЬ БЛАСТТРАНСФОРМАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ И АКТИВНОСТЬ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ (1 и 2) ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ИММУНИТЕТА К ЧУМЕ

14.00,36 — аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов 1992

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб».

Научные руководители — доктор медицин« ских наук, старший научный сотрудник М. Ю. Лед-ванов, доктор биологических наук А. В. Пронин.

Официальные оппоненты: доктор медицин« ских наук, старший научный сотрудник Л. Н. Шанина, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г. М, Сергеева.

Ведущая организация — Ростовский-на-Дону госу- ■ дарственный научно-исследовательский противочумный институт.

Автореферат разослан <с£У> (реуС&^/с^ 1992 г.

Защита диссертации состоится 1993 г. в АЗчасов на заседании специализированного совета К.074.32.01 по защите диссертаций на со« искание ученой степени кандидата наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (410071, г. Саратов, Университетская, 46).

С диссертацией можно ■ ознакомиться в научной библиотеке института «Микроб».

Ученый секретарь специализированного совета . кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник 3. Л, ДЕВДАРИАНИ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Высокая контагиозность чумы, опасность заноса и быстрого распространения при наличии природных очагов этой инфекции в нашей стране и за рубежом обусловливают ,необходимость разработки эффективных профилактических мер, отвечающих современным требованиям (Козлов М. П. с соавт., 1979; Васенин А. С. с соавт., 1989; Кологоров А. И. с соавт., 1989; Топорков В. П. с соавт., 1989). В комплексе противоэпидемических мероприятий, предусмотренных при профилактике чумы в природных очагах, важное место отводится противочумной вакцинации. Поэтому внимание многих исследователей, разрабатывающих проблему чумы, сосредоточено на изучении механизмов иммунитета к ней.

В экспериментах на животных и в наблюдениях на людях, вакцинированных против чумы, показано, что в основе формирования противочумного иммунитета лежат клеточные процессы (Коробкова Е. И., 1956; Бунин К. В. с соавт., 1970; Анисимова Т. И. с соавт., 1980, '1982, 1984; Самойлова Л. В. с соавт., 1980, 1987; Горькова А. В. с соавт., 1981, 1987, 1990; Шанина Л. Н. с соавт., 1985, 1989; Мохин К. М. с соавт., 1987; Исупов И. В. с соавт., 1990; Ледванов М. Ю. с соавт., 1991).

¡В настоящее время изучены основные закономерности изменений лимфоцитов на поттуляцион'ном и субпопуляционном уровнях при формировании иммунитета к чуме. Определены сдвиги в процессах пролиферации, миграции, внутриклеточного метаболизма лимфоцитов (Ледванов М. Ю. с соавт., 1986, 1987; Тихомирова Е. И. с соавт., 1986; Герасимова ¡К. И. с соавт., 1990; Саяпина Л. В., 1991; Стукова Н. Ю. с соавт., 1991). Установлены важные механизмы функционирования моноцитарно-фагоцитарной системы (Васильева Г.,И. с соавт., 1987-4990).

Однако специфические клеточные процессы, определяющие иммунологическую эффективность противочумной вакцинации, и их соотношение с неспецифическими реакциями остаются практически неисследованными. Не разработана применительно к противочумному иммунитету реакция бласт-трансформации лимфоцитов (РБТЛ), широко используемая в современных иммунологических исследованиях в качестве критерия оценки специфических и .неспецифических клеточных процессов. Неизвестна способность отдельных антигенов и штаммов (с экспрессией различных детерминант иммуногенности и вирулентности) чумного микроба инициировать РБТЛ. Не показано также влияние иммунизации чумной вакциной на выраженность РБТЛ в ответ на антигены возбудителя чумы.

Существенной особенностью современного этапа развития иммунологии является анализ иммунологических и иммунопатологических процессов в аспекте закономерностей функционирования медиаторов иммунной системы (Чередеев А. Н„ Ковальчук Л. В., 1990; Медуницин Н. В., 1990).

Ключевыми иммуномедиаторами, обеспечивающими инициацию иммунного ответа по клеточному типу, в том числе РБТЛ, являются интерлейкин-1 (ИЛ-1) и интерлейкин-2 (ИЛ-2).

■Несмотря 1на исключительное значение йнтерлейкияов в регуляции иммунного ответа, их роль в формировании иммунитета к чуме, влияние конкретных детерминант вирулентности и иммуногенности чумного микроба на продукцию данных иммуномедиаторов не изучались.

Цель работы: Изучить влияние вакцинного штамма чумного микроба, его изогенных .производных с различной экспрессией факторов иммуногенности и вирулентности, а также антигенов возбудителя чумы на продукцию ИЛ-1 и ИЛ-2 и установить взаимосвязь между изменениями в системе ин-терлейкинов, РБТЛ и протективной активностью противочумного иммунитета.

Задачи исследования.

1. Изучить РБТЛ у экспериментальных животных в процессе формирования противочумного иммунитета и при .воздействии изогенными штаммами с различной экспрессией факторов иммуногенности и вирулентности.

2. Изучить активность ИЛ-1 и ИЛ-2 у экспериментальных животных в процессе формирования противочумного

иммунитета и при воздействии изогенными штаммами с различной экспрессией факторов иммуногенности и вирулентности.

3. Определить значение антигенов чумного микроба (капсульиого белка, мышиного токсина, основного соматического антигена, липополисахарида и шестина) в инициация РБТЛ у интакиаых и иммунных животных, а также в модуляции активности ИЛ-1 и ИЛ-2 и in vitro.

4. Установить взаимосвязь между характером изменений в системе ИЛ-1 — ИЛ-2, РБТЛ и протективной активностью противочумного иммунитета в тесте защиты мышей при заражении их вирулентным штаммом чумного микроба.

5. Определить возможность практического использования изученных показателей для оценки специфической иммунологической 'реактивности вакцинированного организма, а также в плане характеристики биологических свойств возбудителя чумы.

Научная новизна. Впервые изучана и охарактеризована способность штаммов чумного микроба, различных по плаз-мидному составу, а также отдельных антигенов инициировать реакцию бласттрансформации лимфоцитов. Показано, что степень развития РБТЛ зависит от генетически детерминированной экспрессии чумным микробом факторов иммуногенности и вирулентности, характера используемых ■антигенов и, как правило, более выражена у вакцинированных против чумы животных, чем у неиммунных. Новыми являются данные об обратной корреляционной зависимости между количественными показателями специфической и неспецифической РБТЛ, развивающимися при воздействии ультразвуковых дезинтегратов (УЗД) штаммов чумного микроба с различным плазмидным профилем.

Установлены новые закономерности изменения активности ИЛ-1 и ИЛ-2 у неиммунных и вакцинированных против чумы мышей под влиянием антигенов и УЗД штаммов с различным 'набором факторов иммуногенности и вирулентности. Наиболее выраженной шшципрующей интерлейкины активностью обладают капсульный антиген и пестнн, а также штаммы, имеющие в своем составе продукты экспрессии плазмиды pPst и pFra. В отличие от большинства штаммов и антигенов возбудителя чумы, УЗД штамма, содержащего плазмиду pCad, вызывает более выраженную РБТЛ и большее повышение активности ИЛ-2 у невакцинированных животных, по сравнению с иммунными. Впервые обнаружена

2 Заказ 1304 3

прямая корреляционная зависимость между активность^ лЛ-2 и уровнем РБТЛ 1как в опытах со штаммами, различающимися по плазмидному составу, так и с антигенами чумного микроба. Уровень специфической РБТЛ коррелирует со степенью резистентности к чуме в тесте защиты мышей при заражении их вирулентным штаммом возбудителя чумы.

Практическая значимость работы. Определены количественные критерии РБТЛ и активности интерлейкинов 1 и 2 при воздействии основными антигенами и штаммами чумного микроба, имеющими различный набор факторов иммуно-генности и вирулентности. Показана эффективность использования данных тестов для характеристики биологических свойств возбудителя чумы и его антигенов. Установлена возможность практического 'применения РБТЛ в качестве критерия оценки специфической иммунологической перестройки вакцинированного против чумы организма. РБТЛ рекомендована для использования :на этапе доклинических испытаний новых или усовершенствованных противочумных вакцинных препаратов, при составлении рациональных схем иммунизации, а также при экспериментальной разработке патогенетически обоснованных схем совместного применения вакцин и иммуномодуляторов.

Внедрение. По материалам экспериментальных исследований составлены методические рекомендации: «Использование реакции бласттрансформации лимфоцитов экспериментальных животных и людей для изучения клеточного звена противочумного иммунитета», которые были обсуждены и одобрены Ученым Советом РНИПЧИ «Микроб» (протокол № 15 от 16 февраля 1992 г.), утверждены директором института 16 февраля 1992 1Г. Метод применяется в лабораторной работе медицинских и противочумных учреждений, о чем свидетельствуют соответствующие акты о внедрении.

Материалы диссертационного исследования используются при чтении лекций ,на курсах первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей-бактериологов противочумных учреждений России и-СНГ (при институте «Микроб»).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены:

— на итоговых научных конференциях в РНИПЧИ «Микроб», Саратов, 1990; 1991;

— на X научной .конференции «Факторы клеточного и

гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях», Челябинск, 1990;

— на Всесоюзной конференции «Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний», Звенигород, 1990;

— .иа Всесоюзной ,научной конференции «Лабораторные животные для медико-биологических и биотехнологических исследований,», Москва, 1990;

— 'На 11 .Международном симпозиуме «Реабилитация иммунной системы», Цхалтубо, 1990;

— «а Всесоюзной научно-практической конференции «Поствакцннальные осложнения: патогенез, профилактика, лечение, «Ленинград, 19—21 ноября 1931;

— (на VI Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов н паразитологов, Новгород, 1991;

— на I съезде иммунологов России, Новосибирск, 1992.

Диссертация обсуждена и одобрена на расширенной научной конференци II Ла боратории клеточной иммунологии Р.НИПЧИ «Микроб».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ. \

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста к содержит: введение, пять глав, заключение, выводы и библиографический, указатель, который включает 139 отечественных и 70 иностранных источников. Работа иллюстрирована 23 рисунками и 6 таблицами.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Характеристика основных закономерностей влияния антигенов и штаммов возбудителя чумы с различной экспрессией факторов иммулогенности и вирулентности ¡на уровень РБТЛ и ахтизность интерлейкинов (ИЛ-1, ИЛ-2).

2. Зависимость бласттрансформации лимфоцитов от генетически детерминированной экспрессии чумным микробом определенных антигенов и от генотипа макроорга.низма.

3. Новые данные сравнительного анализа изменений количественных .показателей активности интерлейкинов и РБТЛ, основанного на сопоставлении влияния антигенов и штаммов чумного микроба у вакцинированных против чумы и неиммушшх животных.

4. Прямая корреляция уровня специфической антигенза-зисимой РБТЛ с активностью ИЛ-2 и со степенью резистент-

2* 5

ййсти иммунных мышей к чуме в тесте защиты их при за- -ражении вирулентным штаммом чумного микроба.

5. Доказательства эффективности использования РБТЛ для оценки уровня специфической иммунологической перестройки вакцинированного 'против чумы организма и для характеристики иммунобиологических свойств штаммов и антигенов чумного микроба.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы

Работа выполнена в экспериментах на мышах линий СВА и C57BL/6, самцах, 2-месячного возраста.

Материалом для исследования служили спленоциты, ти-моциты и сыворотка крови мышей.

В работе были использованы различные штаммы (вакцинный штамм Y. pestis EV НИИЭГ и его изоген,ные производные, селекционированные в отделе генетики- института «Микроб» Проценко О. А., депонированные в музее живых культур ВНИПЧИ «Микроб») и антигены * (капсульный антиген, «мышиный» токсин, ЛПС, основной соматический антиген, пестин) чумного микроба. Для получения кап-сульного антиг&на применялся метод выделения из солевого экстракта ацетонвысушенных клеток возбудителя чумы в процессе фракционирования сульфатом аммония (Baker Е. at al., 1952), а также метод, описанный Сердобимцевым Л. Н. (1984), в основе которого лежит применение ионообменной хроматографии >на ДЭАЭ-целлюлозе в сочетании с гель-фильтрацией. Для выделения «мышиного» токсина использовался метод высаливания сульфатом аммония (Baker Е. el at., 1952). Основной соматический антиген экстрагировался из ацетонвысушенных клеток трихлорук-сусной кислотой (Boivin A. et al., 1933). Пестин ПП был получен из уксуснокислого экстракта чумного микроба (Та-рананко Т. М., 1988). Для получения ЛИС применялся метод экстрагирования водно-фенольной смесью с последующим ультрацентрифугированием (Davies D. A. L., 1956).

В качестве иммунизирующих препаратов применяли коммерческую живую чумную вакцину EV и капсульный антиген чумного микроба (F1), вводимые подкожно.

* Антигены чумного микроба были выделены Брандзишевским Ю. В., Сердобинцевым Л. Н., Тараненко Т. М.

Ультразвуковой дезинтеграг штаммов чумного микроба получали при воздействии на микробную взвесь ультразвуком частотой 44 кГц в течение '1 минуты, повторяя процедуру трижды.

Активность интерлейкинов и показатели реакции бласттрансформации у экспериментальных животных определяли до вакцинации и на 7, 14 и 21-е сутки иммуногенеза в опытах in vitro при взаимодействии спленоцитов со штаммами и антигенами чумного микроба.

Для постановки реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) использован метод, основанный на способности стимулированных антигеном лимфоцитов увеличивать синтез ДНК> сопровождающийся включением в нее меченного тритием гимидина (Шютт X., 1987). Был применен ЗН-тимидин фирмы Amersham (США) с удельной активностью 17MeBg/mM. Количество изотопа, вносимое в одну пробу, составляло 37 GBg в 5 мкл. Подсчет радиоактивности исследуемых проб проводили на бета-спектрометре для счета бета-излучения жидким сцннтилляционным методом Mark II (Германия). Результаты выражали в индексах стимуляции, которые определялись как отношение радиоактивности включенного изотопа в культурах лнМ;фоцитов с добавлением антигенов ,к соответствующей величине в контрольных культурах со средой.

Для оценки активности и н т е р л е й к и н а — 1 использовали метод, основанный на способности ИЛ-1 вызывать комито-генный эффект у тнмоцитов интактных животных в присутствии субоптималь;ных концентраций неспецифических митоге-зюв (Oppenheim J. J., Gery J., 1982).

Величину пролиферативной активности тимоцитов определяли радиоактивным методом по уровню включения ЗН-тимидина. Результаты выражали в индексах стимуляции (ИС), представляющих собой отношение величины пролиферативной активности исследуемых культур клеток к величине пролиферапшной активности контрольных тимоцитов. Активность ИЛ-1 оценивали по величине комитогенного эффекта (КЭ), вычисляемой как отношение ИС культур, содержащих ИЛ-1 и ФГА, к ИС культур, содержащих только

ил-а.

Объектом для изучения уровней активности ИЛ-1 служили супернатанты спленоцитов, активированных in vitro антигенами, и УЗД штаммов чумного микроба.

Для тестирования активности интерлейкин а-2 (ИЛ-2)

использовали метод, основанный на его способности поддерживать рост Т-клеток активированных митогеном (Gillis S. et al„ 1978).

Уровень антиинфекционной резистентности мышей, вакцинированных различными дозами живой чумной вакцины и капсульного антигена чумного микроба, определяли при помощи теста активной защиты животных при заражении вирулентным штаммом Y. pestis 231. LD50 вычисляли по методу Кербера в модификации И. >П. Ашмарина и А. А. Воробьева (/1962).

Для обнаружения антител к Fl чумного микроба использовали систему однонаправленных серологических реакций (РИГА и РНАг) с коммерческим эритроцитарными диагно-стикумами.

Разделы работ с использованием вирулентных штаммов возбудителя чумы осуществлялись в соответствии с требованиями «Инструкции о 'противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным или подозрительным «а зараженность .возбудителями инфекционных заболеваний I—II групп», Саратов, 1979.

Статистически и анализ полученных данных проводили с использованием методов вычисления средней арифметической (М), средней ошибки средней арифметической (т), коэффициента достоверности (t) и уровня вероятности (Р) по Рокникому П. Ф. (1973). Определение доверительных интервалов (Mmin + Mmax) проводили по методу, описанному Беленьким М. Л. (1959). Для ряда показателей определяли коэффициент корреляции (г), среднюю ошибку коэффициента корреляции (Sr), его достоверность (Рокицклй П. Ф., 1973). Часть расчетов, проведенных в ходе выполнения работы, проводилась с применением специальной программы, реализованной на персональном .компьютере.

2. Результаты исследований и их обсуждение

Изучение РБТЛ проводилось в нескольких аспектах. Исследовалось влияние на инициацию РБТЛ ультразвуковых дезилтегратов (УЗД) штаммов Y. pestis с различным плаз-мидным 'составом, а также отдельных очищенных антигенов чумного микроба. Опыты ставились как с использованием неиммушных животных, так и в динамике формирования противочумного иммунитета у мышей разного .генотипа.

Для получения УЗД была использована изогснная система производных штамма У. pestis EV, содержащих разный 8

набор собственных плазмид чумного микроба и, соответственно, разную экспрессию детерминант иммуногенности и вирулентности: ЕВ НИИЗГ (рЕга +, рСас!-)-, рРэЦ-), КМ215 (рИга—, рСасН, рРб! + ), -КМ216 (рРга—, рСай—, рРэ!-}-), КМ217 (рЕга-, рСас!+, рРв^), КМ218 (<рЕга-, рСас!-, рРэ!-), КМ225 (рИга-К рСас1-, рРз^), КМ226 (рЕга + , рСа<1+, рРз1—), КМ227 (рЕга + , рСасЗ —, рРэ1 + ). Различное сочетание плазмид позволяет -наиболее полно охарактеризовать иммуномодулирующую функцию антигенов, кодируемых генами, расположенными на отдельной плазмиде.

При взаимодействии лимфоцитов, полученных от интакт-'ных (контрольных) мышей, с ультразвуковыми дезинтегра-тами изучаемых штаммов, как правило, отмечался статистически достоверный митог-енный эффект различной степени выраженности (Табл. 1).

Таблица 1

Реакция блясттрансформации (ИС) спленоцитов, стимулированных УЗД штаммов У. реяМБ ЕУ с различным плазмидним составом (М±т, р)

Исследуем!,¡е штаммы И нх плазмндмый состав Контроль Инициирующая РБТЛ Иммунизация У. ре51'1Б ЕУ

концентрация У. рсБ^ ЕУ

25Х107 мк | 25Х107 мк 25X10» мк | 25X108 мк

У. реэИ.ч ЕУ рИга рСа<! рРз! 3,73±0,12 1,35 ±0,31 6,64 ±0,27 <0,05 3,87 + 1.10 <0,05

КМ 218 2,75± 1,41 3,74 ± 0,71 9,00± 1,10 <0,05 4,33 ±0,36 <0,01

КМ 217 — рСас! — 8,11 ±1,05 9,78±0,94 2,31 ±0,84 <0,05 2,42± 1,17 <0,01

КМ 225 пГ-'гя — — 6,75 ±1,35 3,25± 1,96 5,31 ±0,84 1 7,97 ±4,06 <0,01 1 <0,001

КМ 216 ! 1,'17±0,62 1 3,97±0,48 — — рРэ! 1 1 7,59 ± 1,15 <0,001 3,49 ±0,23 <0,001

КМ 226 рРга рСас! — 5,12±0,65 5,18 ±0,76 4,57 ±0,33 <0,01 4,90±0,81 <0,01

КМ 227 рИга — РРБ! 3,57±0,59 3,2 ±0,83 6,35± 1,08 <0,05 4,14±0,43 <0,05

КА1 215 — рСас! рРк! 1,08 ± 0,27 5,70±0,61 2,63 ±0,94 <0,05 6,94 ±2,9 <0,001

У иммунизированных вакцинным штаммом Y. pestis EV мышей, наблюдалась РБТЛ более высокого уровня, по сравнению с неиммун,ными, в ответ на большинство использованных УЗД. На штамм, имеющий плазмиду pCad эта закономерность не распространялась. УЗД этого штамма обладал обратным действием. ¡При внесении его в культуру спле-ноцитов неиммунных животных выявлялась выраженная стимуляция Р'БТЛ, у иммунных мышей, напротив, был минимальный пролиферативный ответ. .Предположительно данный феномен можно связать с большей остаточной вирулентностью этого штамма.

Биологическая значимость данного факта для реализации

вирулентных свойств pCädH--штаммов, очевидно, связана с

ослаблением иммунного ответа макроорганизма на возбудитель. Закономерно, что плазмида pCad (плазмнда вирулентности) обязательно присутствует у штаммов Y. pestis, способных вызывать инфекционный процесс (¡Ben-Gurion R., Shafferman А., '1981; Ferber D. М„ Brubaker R. R„ 1981; Goguen J., Yother J., Straley S., 1984; Portnoy D. A. et al„ 1984; Straley S. K., 1988).

В отношении митогениого неспецифического и антигенза-висимого специфического эффектов у штаммов, различающихся по плазмидному профилю, была выявлена следующая зависимость: .чем выше способность штамма стимулировать неспецифическую РБТЛ, тем более низкие значения индекса стимуляции определялись при постановке РБТЛ со сплено-цитами иммунных животных. Тем не менее, в случае имму-шизации животных вакцинным штаммов EV (содержащим все три 'собственные плазмиды) и последующей инициацией РБТЛ УЗД этого же штамма наблюдался достаточно выраженный пролиферативный ответ. Очевидно, это связано с одновременной экспрессией штаммом EV определенных детерминант иммуногенности.

Таким образом, обнаруженная нами зависимость РБТЛ от 'плазмидного состава, инициирующего реакцию ультразвукового дезинтеграта штамма чумного микроба, очевидно, обусловлена различной экспрессией этими штаммами отдельных антигенов..

Антигенный спектр чумного микроба представлен широким набором иммунологически активных макромолекул (Бахрах Е. Э., 1968; Вейнблаг В. И., 1974; Тараненко Т. М., 1988). С позиции современных представлений важнейшими из них являются: капсульный антиген, «мышиный» токсин, ос-

ноаной соматический антиген, липополисахарид, пестин (Бахрах Е. Э. с соавт., 1972; Дальвадянц С. М. с соавт., 1959, 1980; Сердобинцев Л. ,М., 1981; Тараненко Т. М„ 1988; Baker Е. et al„ 1952; Walker R. V. et al„ 1966; Albizo J. M., Surgalla M. J., 1970).

■Наиболее выраженная РБТЛ у иммунизированных животных отмечалась при внесении в культуру спленоцитов капсульного антигена и пестина (табл. 2). Известно, что кап-

Таблица 2

Реакция бласттраксфориации (ИС) спленоцитов, стимулированных антигенами чумного микроба (М±ш, р)

Антигены Контроль 1 Иммунизация Y. pestis EV Инициирующая РБТЛ доза антигена 5 мкг | 50 мкг 5 мкг J 50 мкг

F, 1,4 ±0,47 0,66 ±0,04 3,04±0,36 <0,05 0,70±0,18 <0,05

F2 1,08±0;17 0,71 ±0,31 0,72 ±0,20 <0,05 1,60±0,12 <0,05

LPS | 1,59±0,27 1,28±0,!9 j 11,3±0,22 <0,Ш

ОСА 0,93 ±0,25 1J!2±0,3 2,44 ±0,25 <0,051 7,77±0,14 <0,01

Пестнн 1,02 ±0,22 1,07 ±0,22 5,75 ±0,63 <0,001 2,0S±0,24 <0,01

сульный антиген является высокоиммуноген.ным для мышей. Он единственный из известных структурных компонентов чумного микроба способен создавать при иммунизации 100% защиту мышей от последующего заражения Р1+ вирулентными культурами возбудителя. Что касается пестина, то он представляет собой эффективный диагностический аллерген (Коробкова Е. И. с соавт., 1970; Тараненко Т. М„ 1988). В его препаратах обнаружено по меньшей мере 6 имму.нохи-мически активных компонентов, в том числе ОСА и ЛПС (Тараненко Т. М., 1988). Однако нами показано, что ОСА и ЛПС У. реэШ обладают умеренной РБТЛ-инициирующей активностью у иммунных мышей. По-видимому, за аллергическую активность пестина ответственны и какие-то другие белковые компоненты.

По результатам наших исследований индекс стимуляции в РБТЛ зависел не только от свойства инициирующего реакцию антигена, но и от срока, прошедшего с момента вакцинации, дозы и природы иммунизирующего препарата. Максимальная величина РБТЛ отмечалась за 21-е сутки после иммунизации живой чумной вакциной в дозе 106 микробных клеток и на 14-е сутки при введении капсульного антигена в дозах 12,5—25 мкг. На ранних сроках иммуногенеза достоверная РБТЛ тестировалась, .как правило, при использовании значительных доз вакцины (107 м. кл.). В более поздние сроки (2 недели иммуногенеза) выраженная РБТЛ определялась у животных, иммунизированных меньшими дозами (105 м. кл.), и, наконец, спустя 21 день после иммунизации наиболее значительные изменения РБТЛ отмечались, как и в ранние сроки, от больших доз вакцины.

Обращает внимание, что при достаточно больших дозах антигенов Y. pestis, применяемых как in vitro, так и in vivo, наблюдались процессы инактивации РБТЛ. iB частности, иммунизация мышей капсульным антигеном чумного микроба в дозе 50 мкг сопровождалась снижением индекса стимуляции РБТЛ. Данные наших экспериментов согласуются с результатами работ других исследователей, показавших, что введение больших доз антигенов Y. pestis может вызывать иммунопаралич (Spivak et al., 1958). Такая зависимость иммуногенеза от доз живой чумной вакцины согласуется и с данными о динамике размножения вирулентного штамма в макроорганизме, персистенции антигенов Y. pestis (Самойлова Л. В., с соавт., '1980, 1987) и соответствует общим представлениям об иммунобиологической перестройке.

Проведенный корреляционный анализ индекса бласттранс-формации и уровня антиинфекционной резистентности (прч заражении животных вирулентным штаммом возбудителя чумы) показал наличие прямой зависимости между величиной РБТЛ и LD50. ¡B то же время не обнаружено корреляции между LD50 и титрами антител к капсульному антигену. Учитывая результаты наших исследований, а. также данные литературы, подтверждающие отсутствие четкой корреляции между титрами антител и уровнем антиинфекционной резистентности (Шанина Л. Н., 1989), а также слабую протек-тивную активность противочумной сыворотки (Брандзишев-ский Ю. В. с соавт., 1983), можно сделать заключение о незначительной роли гуморального звена и ведущей — клеточного в формировании иммунитета к чуме. 12

В настоящее время доказано, что способность реагировать (или не реагировать) на какой-либо конкретный антиген, а также высота иммунного ответа генетически детерминированы. Молекулярно-генетические механизмы регулируют генетический контроль синтеза иммуноглобулинов и ре-цепторных молекул лимфокинов, осуществляющих распознавание антигенов. Нами обнаружена ¡более высокая активность в РБТЛ спленоцитов мышей линии С57ВЬ/6, (па сравнению с СВА), а также более выраженная способность к формированию протективного иммунитета (под действием живон вакцины и капсуль ного антигена). Последнее согласуется с данными И. В. Исупова с соавт. (1990), которые показали, что именно у мышей линии С57ВЬ/6 наблюдались наиболее выраженные процессы активации тимоцитов и макрофагов под влиянием как капсульного антигена, так и живой чумной вакцины. Высокий уровень иммунологической защиты инбредных мышей линии С57ВЬ/6 был отмечен Е. И. Тихомировой с соавт. (1990).

Резюмируя изложенное выше, можно сделать заключение, что бласттрансформация лимфоцитов зависит как от генотипа макроорганизма, так и от генетически детерминированной экспрессии чумным микробом определенных антигенов. Корреляция РБТЛ с уровнем антиинфекционной резистентности свидетельствует о высокой информативности данного критерия и возможности эффективного использования его для тестирования уровля клеточшого иммунитета и характеристики биологических свойств возбудителя чумы и его антигенов.

В результате выполненных исследований по изучению влияния на активность и н т е р л е й к и н а-1 отдельных антигенов и штаммов чумного микроба с различной экспрессией детерминант вирулентности и иммуногенности получены и представлены в обобщенном виде следующие основные данные.

И::учение препаратов, включающих комплекс антигенов (УЗД штаммов с различным плазмидным составом), пока-' зал, что УЗД большинства штаммов обладали способностью индуцировать продукцию ИЛ-1 у невакцинированных мышей (табл. 3).

Наибольшая активность ИЛ-1 обнаруживалась у интакт-ных мышей под влиянием УЗД штамма КМ217, содержащего плазмиду рСа(1. Иммунизация мышей вакцинным штаммом ЕУ сопровождалась, как правило, увеличением активности

Влияние иммунизаци» мышей вакцинным штаммом ЕУ на комитогенный эффект тестируемых на активность ИЛ-1 супсрнатантов спленоцитов после их контакта со штаммами и антигенами чумного микроба

Штаммы

Отношение индекса пролиферации тимоцитов в присутствии ФГА к индексу пролиферации без ФГА

Контроль

Иммунизация

У. ревНБ ЕУ КМ 2115 КМ 216 КМ 217 КМ 218 КМ 225 КМ 226 И, Г, ЬРБ ОСА Псстин

1,17±0,11 1,38±0,09 1,48±0,12 2,20±0,17 1,32 ±0,09 1,70±0,14 1,52±0,11 2,00±0,13 (1,26 ±0,07 1,64 ±0,21 1,40 ±0,07 1,91 ±0,08

3,86 н 1,87= 1,20= 2,93 = 3,06 н 1,75=1 2,12=! 3,00:! 1,41 н 2,08=! 1,66:! 1,33=!

:0,45 :0,29 = 0,17 :0,24 :0,12 0,05 : 0,07 : 0,08 :0,11 : 0,13 : 0,09 :0,14

Р

ИЛ-1 спленоцитов. Максимальные значения активности ИЛ-1 были зарегистрированы на 21-й день иммуногенеза при добавлении к опленоцитам УЗД штамма У. ревИэ ЕУ, несущего все три собственные плазмиды (рСас!, рРга, рРв!:).

Исследование отдельных очищенных антигенов чумного микроба (капсульного антигена, «мышиного» токсина, ЛПС, ОСА, пестина) показало, что в клетках спленоцитов неиммунных животных капсульный антиген, ЛПС и пестин оказывали ИЛ-1 инициирующее действие. Аналогичные данные были получены при исследовании активности ИЛ-1 спленоцитов мышей, иммунизированных вакцинным штаммом ЕУ. Максимальный ИЛ-1 — активирующей способностью у иммунных животных обладал капсульный антиген.

. Таким образом, представленные данные свидетельствуют, что антигены чумного микроба оказывают выраженное влияние на способность макрофагов мышей синтезировать ИЛ-1. Существенной инициирующей активностью обладает капсульный антиген, пестин, ЛПС, а также некоторые неиден-тифицированные антигены, кодируемые плазмидой рСас1.

В отношении и н т е р л е й.к ин а-2 нами было показано, что УЗД большинства изученных штаммов обладали способностью индуцировать продукцию ИЛ-2 у невакцинированных мышей (Табл. 4). Наибольшая активность ИЛ-2 обнаружи-14

Индексы стимуляции СопА-бластов под действием супернатантов спленоцитов, содержащих ИЛ-2, индуцированный УЗД различных штаммов чумного микроба

Штаммы

Индексы стимуляции СопА-бластов под действием супернатантов спленоцитов, стимулированных штаммами и антигенами чумного микроба _

Контроль

Иммунизация

У. реэНэ ЕУ КМ 215 КМ 216 КМ 217 КМ 218 КМ 225 КМ 226 КМ 227 Р,

ЬРБ ОСА Пестин

4,74: 1,27: 1,48: 6,1 :

3,86 6,24: 4,33: 3,72: 0,8 : 0,96: 1,46: 1,13: 1,27:

; 0,29 :0,14 :0,.42 ±0,51 ±0,07 ±0,34 Ь 0,42 г 0,12 г0,22 = 0,12 ±0,35 ±0,12 :0,24

7,85±0,21 3,74 ±0,92 7,69 ±0,24 3,42±0,78 6,21 ±0,11 6,42 ±0,74 5,68 ± 0,24 7,46 ±0,95 6,17 ±0,34 3,72±0,07 7,77±0,49 5,53 ±0,55 11,56 ±0,69

<0,01 <0,05 <0,05 <0,01 <0,01 <0,02 <0,05 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,02 <0,01

валась у ннтактных мышей под влиянием УЗД штамма КМ217, содержащего плазмпду рСас!.

При воздействии УЗД штаммов чумного микроба на спле-ноциты, полученные от иммунных мышей, отмечалось статистически достоверное (р<0,05) увеличение активности ИЛ-2, по сравнению с активностью, зарегистрированной при воздействии УЗД на спленоциты интактных мышей. Наименьшая активность ИЛ-2 тестировалась в культурах спленоцитов иммунных мышей при внесении в них УЗД штамма КМ217, имеющего только плазмиду рСаё. Важно отметить, что индекс пролиферации СопА-бластов (при добавлении супернатантов спленоцитов неиммунных животных), стимулированных данным штаммом чумного микроба, был выше, чем у вакцинированных живой чумной вакциной. Результаты этих исследований согласуются с описанным выше фактом инициации штаммом КМ217 у иммунных животных значительно меньшей Р;БТЛ, чом у неиммунных.

Изученные антигены чумного микроба оказывали выраженное влияние на способность спленоцитов неиммунных и иммунных животных (в большинстве случаев) синтезировать ИЛ-2.

Прямая зависимость между активностью ИЛ-2 и уровнем РБТЛ прослеживалась в большинстве проведенных нами

исследований и касалась как УЗД штаммов чумного микроба, так и отдельных антигенов. Так, у /неиммун-ных животных коэффициент корреляции между активностью ИЛ-2 и уровнем Р:БТЛ составлял 0,75±0,13 (р<0,05), тогда как у мышей, иммунизированных вакцинным штаммом ЕУ, он был существенно выше 0,85±¡0,15 (р<0,05). В то же время нам не удалось выявить четкой корреляции между уровнем РБТЛ и активностью ИЛ-1. Более того, в ряде случаев высокие цифры активности ИЛ-1 сопровождались низким уровнем РБТЛ. Особенно отчетливо это проявилось на примере штамма КМ217, содержащего плазмиду рСаё.

Таким образом, .комплексный анализ данных по воздействию очищанных антигенов и УЗД штаммов чумного микроба на активность ИЛ-|1 и ИЛ-2 и на уровень антиген-индуциро-ванной пролиферации лимфоцитов в процессе формирования противочумного иммунитета (при сопоставлении с тестом защиты мышей при заражении вирулентным штаммом чумного микроба) позволил выявить ключевое значение данных им-муномедиаторов в становлении (невосприимчивости макроорганизма к чумной инфекции. Реакция бласттрансформации лимфоцитов рекомендуется в качестве чувствительного объективного критерия, отражающего уровень специфических процессов клеточного противочумного иммунитета. Полученные сведения могут иметь важное значение при оценке иммунобиологических свойств разлых штаммов и антигенов чумного микроба, а также результатов испытаний новых серий чумной вакцины, при разработке новых патогенетически корректных схем совместного применения вакцин и иммуно-модуляторов.

Выводы

1. Различные по плазмидному составу штаммы чумного микроба, а также отдельные очищенные антигены (капсуль-ный антиген, «мышиный» токсин, основной соматический антиген, ЛПС, пестин) обладают способностью инициировать неспецифическую реакцию бласттрансформации лимфоцитов у неиммунных мышей. Максимальную стимуляцию РБТЛ среди моноплазмидных штаммов 'вызывает штамм КМ217, содержащий .плазмиду вирулентности рСаё. Из антигенов наибольшую митогенную активность проявляет капсульный антиген.

2. У иммунизированных вакцинным штаммом ЕУ мышей

(по сравнению с неиммунными), в ответ на большинства УЗД штаммов и антигенов чумного микроба, инициируется более высокий уровень специфической РБТЛ. Исключением является УЗД штамма КМ217, содержащего плазмиду рСас1, который вызывает у неиммунны.х животных более выраженную РБТЛ, чем у иммунных.

3. При воздействии УЗД штаммов чумного микроба с различным плазмидным профилем количественные показатели неспецифической и специфической РБТЛ находятся в обратной корреляционной зависимости.

4. Бласттрансформация лимфоцитов зависит как от генетически детерминированной экспрессии чумным микробом определенных антигенов, так и от генотипа макроорганизма. Наибольшей активностью в РБТЛ по отношению к антигенам чумного микроба обладают лимфоциты мышей линии С57ВЬ/6.

5. Антигены чумного микроба способны индуцировать продукцию интерлейкина-1 у неиммунных и в большей степени у вакцинированных штаммом ЕУ мышей. Наиболее выраженной ИЛ-1-инициирующей активностью обладают кап-сульный антиген, пестин, а также УЗД штамма, содержащего плазмиду рСас!.

6. Активность интерлейкина-2 под влиянием большинства антигенов и штаммов чумного микроба увеличивалась у вакцинированных против чумы мышей в большей степени, чем у неиммунны.х. УЗД штамма, содержащего плазмиду рСас!, напротив, вызывает большее повышение активности ИЛ-2 у невакцинированных животных, по сравнению с иммунными. Наибольшую активность ИЛ-2 индуцируют штаммы, имеющие в своем составе продукты экспрессии плазми-ды рРэ^ а также штаммы несущие антигены кодируемые плазмидой рРга.

7. Установлена прямая корреляционная зависимость между активностью ИЛ-2 и уровнем РБТЛ как в опытах с применением УЗД штаммов, различающихся по плазмидному составу, так и отдельных антигенов чумного микроба.

8. Уровень специфической РБТЛ коррелирует (в отличие от титров антител) со степенью резистентности иммунных животных к чуме, выраженной в Ь050.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Емельянова Н. В., Ледванов М. Ю„ Пронин А. В., Санин А. В. Изменение активности интерлейкина-1 и интерлейкина-2 под воздействием антигенов чумного микроба//Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. X научи, конф. — Челябинск, 1990. — С. 50.

2. Емельянова Н. В., Ледванов М. Ю., Пронин А. В. Влияние различных штаммов чумного микроба на продукцию интерлейкина-1 и интррлейкина-2//Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний (Звенигород, 1990): Тез. докл. всесоюзн. конф. — М., 1990.— С. 50.

3. Ледванов М. Ю., Дроздов И. Г., Герасимова К. И., Стукова Н. Ю., Симонова Н. Г., Емельянова Н. В., Чело-па Л. А. Комплексная оценка (иммуномониторинг) иммунологической безвредности вакцин//Поствакцинальные осложнения: патогенез, профилактика, лечение (Ленинград, 19—21 ноября 1991 г.): Материалы Всесоюзной научно-практической конференции. — М., 1991. — С. 62.

4. Ледванов М. Ю., Дроздов И. Г., Стукова Н. Ю„ Емельянова Н. В., Симонова Н. Г., Таран В. И., Лазовский Ю. В., Кулпченко М. А., Тихомирова Л. А., Шве-дун Г. П., Кравцов А. Л., Б р а н д з и ш е в с к и й Ю. В. Использование лабораторных животных в экспериментах по созданию систем иммунологического мониторинга вакцинного и инфекционного процессов при чуме//Лабораторные животные для медикобиологическнх и биотехноло-гнческих исследований (п/о Отрадное, 20—22 ноября 1990 г.): Тез. докл. Всесоюзн. конф. — М., 1990. — С. 109.

5. Ледванов М. 10., Наумов А. В., Герасимова К. И., Симонова Н. Г., Стукова Н. 10., Емельянова Н. В., Кравцов А. Л., Дроздов И. Г. Клинико-шмунологические методы диагностики и прогнозирования эффективности иммунореабилитации людей с вторичными поствакцинальными иммунодефицитами//Реабилитация иммунной системы (Дагомыс, 9—»М октября 1990 г.): Тез. докл. II Междунар. симп. — Цхалтубо, 1990. — С. 35.

6. Емельянова Н. В., Ледванов М. Ю., Дроздов И. Г., Пронин А. В., Ш в е д у н Г. П., Б р а н д з и ш е в с к и й Ю. В., Та-раненко Т. М. Использование реакции бласттрансформации лимфоцитов для оценки иммунологической . эффективности противочумной вакцинации//^! Всероссийский съезд микробиологов и паразитологов (г. Н. Новгород, 1991 г.): Тез. докл. — Москва. — ,1991. — Т. II,—С,П.

7. Ледванов М. Ю„ Емельянова Н. В., Пронин А. В., Шведун Г. П., Дроздов И. Г., Б р а н д з и ш е в с к и й Ю. В., Андреева И. П, Степанов А. С., Селезнева А. Г. Иницияция реакции бласттрансформации лимфоцитов различными антигенами и штаммами чумного микроба у иммунизированных У. рез!1Э ЕУ мышей// Актуальные проблемы и задачи биохимии, диагностики и иммунопрофилактики особо опасных инфекций, Саратов. — 1991 г. — С. 44—51.

8. Ледванов М. Ю., Дроздов И. Г., Пронин А. В., Стукова Н. Ю., Шведун Г. П., Емельянова Н. В., Лазовский Ю. В., Герасимова К. И., Киреев М. Н. Механизм формирования противочумного иммунитета у людей и экспериментальных животных// Тез. докл. 1 съезда иммунологов России. — Новосибирск. — 1992 г.— С. 53.