Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Механизмы фагоцитоза L-форм чумного микроба

№

На правах рукописи

ДУБРОВИНА Валентина Ивановна

МЕХАНИЗМЫ ФАГОЦИТОЗА Ь-ФОРМ ЧУМНОГО МИКРОБА

(экспериментальное исследование)

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Иркутск, 1996

Работа выполнена в Иркутском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока (директор института - д.м.н., проф., засл. деят. науки РФ Е.П. Голубинский)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор Е.П. Голубинский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Е.Г. Кирдей доктор биологических наук Л.С. Васильева

Ведущее учреждение:

Томский научно-исследовательский институт фармакологии ТНЦ СО РАМН

Защита состоится "ЛЛ " Л ¿с & д-р. .Х- 199^ г. в -¿¿Г часов на заседании диссертационного совета Д 001.41.01 при государственном учреждении "Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения Российской академии медицинских наук" по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного учреждения "Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения Российской академии медицинских наук" по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

Автореферат разослан "48 " _199 &_ г.

Ученый секретарь диссертационного совета, ¡¡р **

кандидат медицинских наук 1м / Л.Ф. Шолохов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Эпидемический потенциал чумной инфекции и в настоящее время остается достаточно напряженным. Это обусловлено существованием и в нашей стране, и на сопредельных территориях природных очагов чумы с постоянно протекающими в них эпи-зоотиями (Домарадский И.В., 1966, 1995; Классовский Л.Н. с соавт., 1981; Ларина B.C. с соавт., 1990; Наркевич М.И. с соавт., 1991 и др.).

Механизмы поддержания эпизоотий, несмотря на многолетнюю историю их изучения, до сих пор до конца не раскрыты. Из числа многочисленных гипотез на этот счет в последние годы привлекает внимание предположение об участии в циркуляции измененных, в частности L-форм, возбудителя чумы, возникающих под влиянием неблагоприятных факторов внешней среды и, возможно, являющихся формой переживания чумного микроба в межэпизоотический период в организме животного-носителя и переносчика.

Поскольку при инфицировании макроорганизма одним из его первичных защитных факторов является фагоцитоз, от исхода которого зависит дальнейшая судьба инфекции, объяснить сущность и вероятность персистенции чумного микроба в организме невозможно без достаточных знаний о механизмах и эффективности этого процесса(Василь-ева Г.И., 1990; Ледванов М.Ю. с соавт., 1994; Куклева Л.М. с соавт., 1996 и др.).

Основные работы, касающиеся фагоцитоза чумного микроба, выполнены на модели классической бактериальной формы возбудителя чумы. Материалы сравнительного изучения фагоцитоза этого микроорганизма в зависимости, например, от его вирулентности и исходного фенотипи-ческого состояния весьма немногочисленны. Не уделено пока достаточного внимания и исследованию особенностей фагоцитоза в интактном и иммунном макроорганизме. Не освещены бактерицидные механизмы фагоцитоза. Между тем, на примере L-форм туберкулезного и бруцеллезного микробов достаточно убедительно показано (Тимаков В.Д., Коган Г.Я., 1973; Прозоровский С.В. с соавт., 1981), что они вызывают, как правило, хронический инфекционный процесс, который может рассматриваться как свидетельство нарушения процесса иммуногенеза.

Таким образом, сравнительное изучение фагоцитоза вирулентных и авирулентных, типичных и измененных клеток Yersinia pestis в интактном и иммунном организме, помимо научного интереса в раскрытии механизмов и особенностей этого процесса, будет способствовать пониманию патогенеза чумы и, возможно, - экспериментальному обоснованию значения измененных форм возбудителя чумы в механизмах его циркуляции в природных очагах.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основной целью данной работы ставилось сравнительное изучение закономерностей и механизмов фагоцитоза чумного микроба разной вирулентности в исходной бактериальной и Ь-формах макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами интактных и иммунных экспериментальных животных.

Для реализации цели решались следующие задачи:

1. Исследовать фагоцитарную активность макрофагов и полиморфноя-дерных лейкоцитов экспериментальных животных в отношении чумного микроба разной вирулентности и фенотипического состояния;

2. Изучить влияние иммунизации на активность фагоцитов в отношении возбудителя чумы в Ь-форме;

3. Изучить активность лизосомальных ферментов макрофагов и поли-морфноядерных лейкоцитов при фагоцитозе чумного микроба разной вирулентности и фенотипического состояния;

4. Изучить активность ферментных систем макрофагов и полиморф-ноядерных лейкоцитов, определяющих бактерицидный потенциал фагоцитов при поглощении возбудителя чумы в бактериальной и Ь-формах;

5. Изучить интенсивность кислородзависимых процессов у субпопуляций макрофагов, изолированных в градиенте температур, в процессе фагоцитоза чумного микроба;

6. Оценить возможность и продолжительность персистенции антигенов чумного микроба в организме чувствительных к чуме животных.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые проведено комплексное исследование активности макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов в отношении чумного микроба в Ь-форме на всех основных стадиях фагоцитарного процесса.

В сравнительных опытах в стандартных условиях выявлены неизвестные ранее особенности фагоцитарной активности перитонеальных, альвеолярных макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов интактных и иммунных экспериментальных животных в зависимости от исходного состояния клеток возбудителя чумы.

Выявлено активирующее влияние предварительной иммунизации экспериментальных животных как на начальные (хемотаксис, адгезия), так и последующие (активность окислительно-восстановительных и лизосомальных ферментов макрофагов и ПЯЛ) стадии фагоцитоза чумного микроба. :

Установлено, что чумной микроб в Ь-форме, независимо от источника его получения (вакцинный или вирулентный штамм), фагоцитируется макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами менее активно, чем микробные клетки исходной бактериальной культуры, при этом он оказывает на фагоцит соответственно меньшее повреждающее действие. В процессе взаимодействия с фагоцитом индуцируется реверсия Ь-форм в форму, идентичную по культуральным, антигенным и вирулентным свойствам исходной бактериальной культуры.

Показано, что показатели хемотаксиса, содержания катионных белков при контакте макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов с чумным микробом в Ь-форме ниже, чем с микробом в бактериальной форме. Наоборот, активность ферментов "окислительного взрыва", глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, НАДФ*Н-оксидазы, лизосомальных ферментов (лизоцима, катепсина, кислой фосфатазы) как макрофагов, так и ПЯЛ в отношении чумного микроба в Ь-форме выше, чем в бактериальной форме. Выявленные функциональные различия важны для понимания механизмов фагоцитоза и дальнейшей судьбы чумного микроба, в частности его Ь-формы, в организме животного.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

Разработаны и внедрены в практику научных исследований новые экспериментальные приемы с использованием монослоя культуры макрофагов для сравнительной количественной оценки фагоцитоза чумного микроба в разном исходном состоянии и его завершенности, определения цитопатического действия возбудителя чумы на фагоциты, изучения активности ферментов, определяющих бактерицидный потенциал макрофагов при фагоцитозе чумного микроба, оценки способности чумного микроба персистировать в клетках системы мононуклеарных фагоцитов чувствительных к чуме животных.

Выяснены основные закономерности фагоцитарной активности макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов восприимчивых к чуме животных (морских свинок, белых мышей)

Разработанные модели и методы внедрены в практику научной работы Иркутского, Ставропольского и Ростовского-на-Дону противочумных институтов.

Результаты исследований, представленные в диссертации, использованы при составлении двух методических рекомендаций:

1. Методические рекомендации по количественной оценке цитохимических показателей ферментативной активности микро- и макрофагов крови и экссудата методом цитоспектрофотометрии. Иркутск, 1991.

2. Методические рекомендации по обнаружению антигенов чумного микроба в монослое макрофагов с помощью антител, меченных коллоидным золотом. Иркутск, 1993.

Методические рекомендации одобрены ученым советом и утверждены заместителем директора института по научной работе 23 мая 1991 г. и 28 декабря 1993 г. соответственно;

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Чумной микроб в Ь-форме независимо от происхождения менее активно, чем клетки в исходной бактериальной, поглощается фагоцитами интактных и иммунных морских свинок, оказывает более слабое повреждающее действие на фагоциты, но более активно стимулирует продукцию форм кислорода, обеспечивающих бактерицидное действие фагоцитов, и повышает активность ряда окислительно-восстановительных ферментов.

2. Снижение содержания в фагоцитирующих полиморфноядерных лейкоцитах катионных белков более выражено при поглощении чумного микроба в Ь-форме.

3. В макрофагах иммунокомпетентных органов морской свинки осуществляется реверсия чумного микроба из Ь- в 11-форму с восстановлением морфологических, антигенных и вирулентных свойств исходной культуры.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы, изложенные в диссертации, представлены на научных конференциях Иркутского противочумного института, г. Иркутск, 19921995 гг.; научной конференции "Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней", г. Ставрополь, 1993 г.; научной конференции, посвященной 60-летию Иркутского противочумного института, г. Иркутск, 1994 г; Международной конференции "Идеи Пастера в борьбе с инфекцией", г. Санкт-Петербург, 1995 г.; научной конференции, посвященной 60-летию противочумного института Кавказа и Закавказья, г. Ставрополь, 1995 г.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, иллюстрирована 32 таблицами и 11 рисунками. Список литературных источников содержит 129 наименований, в том числе 56 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы вакцинный штамм Y. pestis EV-НИИЭГ и вирулентный штамм Y. pestis И-2638 (DL50 для морских свинок 10 м.к.). Культуры чумного микроба выращивали на агаре Хоттингера pH 7.2 с добавлением в качестве стимулятора роста 0.3% гемолизированной крови барана в течение 48 ч при температурах 28 или 37°С. L-трансформа-цию чумного микроба осуществляли по методике В.Д. Тимакова, Г.Я. Каган (1973) в модификации М.П. Маевского (1990). Динамику изменения морфологии бактерий изучали методом фазово-контрастной микроскопии. Антигенный состав определяли с помошыо иммунопе-роксидазного анализа (Рудник М.П., 1984) и реакции двойной радиальной иммунодиффузии (Ouchterlony О., 1948). Антигены чумного микроба в монослое макрофагов выявляли специфическими антителами, меченными коллоидным золотом.

Эксперименты проводили с использованием беспородных морских свинок весом 300-350 г и мышей СВАхС57 BL/F1 весом 18-20 г. Количество животных в каждом опыте подбирали с расчетом получения статистически достоверных данных.

Перитонеальные макрофаги получали по общепринятой методике (Учитель И.Я. с соавт., 1978) без предварительной стимуляции или после стимуляции внутрибрюшинным введением пептона, альвеолярные макрофаги - путем отмывания средой 199 изолированных долей легкого. Субпопуляции перитонеальных макрофагов выделяли методом адгезии в градиенте температур 2, 10, 28 и 37°С (В.М. Земсков и др., 1986). Источником полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) служил перитонеаль-ный экссудат, который получали по методике J.G. Hirsch (1956).

Лизосомы перитонеальных макрофагов и ПЯЛ выделяли в соответствии с методикой А.Дж. Баррет, М.Ф. Хит (1980), частоту слияния фаго-сом с лизосомами контролировали путем прижизненного флюорохро-

мирования культуры клеток акридиновым оранжевым и последующего определения процента активных макрофагов (Frekel С. et al., 1986).

Материал для электронной микроскопии готовили по методике R.C. Graham, M.J. Karnovsky (1966). Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-3-8800. Препараты просматривали и фотографировали с помощью электронного микроскопа JEM-100S при увеличении от 3 до 300 тыс. При подготовке материала к электронно-микроскопическому исследованию применяли общепринятые методики фиксации, обезвоживания, заключения в эпоксидные смолы и контрастирования (Гер-хард и др., 1983). Для изучения ультраструктуры использовали также модифицированную нами методику R.C. Graham, M.J. Karnovsky (1966).

Фагоцитарную активность макрофагов и ПЯЛ изучали in vitro в переживающих однослойных культурах (Фрейдлин И.С., 1984,1986). Интенсивность фагоцитоза оценивали по фагоцитарному числу, проценту активных фагоцитов, цитопатическому действию бактерий и проценту завершенности фагоцитоза.

Для определения хемотаксиса макрофагов использовали метод М. Нельсона в изложении И.С. Фрейдлин (1986). Индекс хемотаксиса (XT) рассчитывали по формуле ХТ=А/В, где А - путь макрофага в сторону антигена, В - контрольной среды, и по соотношению хемотаксиса макрофагов иммунных и интактных морских свинок, выраженному в процентах.

Адгезивные свойства фагоцитов исследовали по методу И.С. Фрейдлин (1986) в собственной модификации. Индекс адгезии определяли по соотношению (в %) количества макрофагов, прилипших к стеклянной пластинке в опытной и контрольной пробах.

Активность лизоцима (НФ 3.2.1,17) в фагоцитах оценивали по способности фермента уменьшать мутность взвеси клеток Micrococcus lu-teus и регистрировали спектрофотометрически при длине волны 600 нм (Прохорова М.И., 1982). Для определения активности катепсина Д (НФ 3.4.23.5) использовали метод M.L. Anson (1940) в модификации

A.Д. Баррета, М.Ф. Хита (1989), кислой фосфатазы (НФ 3.1.3.2) - метод в изложении М.И. Прохоровой (1982), бактерицидных катионных белков -

B.Е. Пигаревского, Ю.А. Мазинг (1981), миелопероксидазы (НФ 1.11.1.7) -В.Е. Пигаревского (1981), глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (НФ 1.1.1.49) и НАДФ.Н-оксидазы (НФ 1.6.2) - Р.П. Нарциссова (1969).

Интенсивность образования в фагоцитирующих клетках метаболитов кислорода оценивали в НСТ-тесте (Kaplow L.S., 1955; Park В.Н. et al.,

1968) и хемолюминесцентным методом (Allen R., 1972). Хемшпомине-сцентный ответ регистрировали с помощью жидкостного сцинтилляци-онного спектрометра SL-30 (Intertechnique, Франция) и оценивали по числу импульсов сцинтилляции на пробу.

Количественное содержание общего белка определяли по М.М. Бред-форду (1976).

Статистическую обработку экспериментального материала проводили в соответствии с рекомендациями И.А. Ойвина (1960) и Е.В. Монцевичготе-Эрингене (1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Чумной микроб способен персистировать в организме носителей, не вызывая клинически выраженного заболевания, однако интимные механизмы этого процесса, обусловленного характером взаимодействия микро- и макроорганизма, до настоящего времени недостаточны ясны.

В настоящей работе мы попытались изучить особенности фагоцитоза чумного микроба перитонеальными и альвеолярными макрофагами, а также полиморфноядерными лейкоцитами восприимчивого к чуме экспериментального животного - морской свинки в естественном (интакт-ном) состоянии и после специфической иммунизации подопытных животных вакцинным штаммом Y. pestis EV-НИИЭГ в зависимости от его вирулентности и фенотипического состояния. В некоторых опытах параллельно экспериментальной моделью служили фагоциты белых мышей СВАхС57 BL/F1.

С целыо получения комплексной информации исследовали практически все стадии фагоцитарного процесса: хемотаксис, адгезию, образование фаголизосом, активность лизосомальных ферментов, "окислительный взрыв", фагоцитарную активность, завершенность фагоцитоза. Параллельно оценивали распределение и продолжительность сохранения антигена чумного микроба в клетках иммунокомпетентных органов.

Основные опыты по изучению сравнительной фагоцитарной активности в отношении чумного микроба проведены в монослое перитоне-альных, альвеолярных макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов невакцинированных (интактных) и иммунизированных штаммом Y. pestis EV-НИИЭГ (за 30 суток до опыта) морских свинок.

1. Хемотаксические и адгезивные свойства фагоцитов при взаимодействии с чумным микробом

Полученные материалы позволили прийти к заключению, что по скорости хемотаксиса в направлении объекта фагоцитоза очевидным преимуществом обладают перитонеальные макрофаги, которые по этому признаку в 1.5-3.2 раза превосходят альвеолярные макрофаги. Полиморф-ноядерные лейкоциты по данному параметру занимают промежуточное положение между макрофагами исследованных видов. Различия в скорости миграции фагоцитов, обусловленные вирулентностью объекта фагоцитоза, прослеживаются только в случае перитонеальных макрофагов. Эти же макрофаги проявляют несколько большую подвижность в отношении чумного микроба в бактериальной, чем в Ь-форме. Четкой зависимости локомоторной активности альвеолярных макрофагов и ПЯЛ от вирулентности или фенотипического состояния чумного микроба установить не удается.

Хемотаксическая активность популяций перитонеальных макрофагов, выделенных путем адгезии при температурах 2, 10 и 37°С, вне зависимости от объекта фагоцитоза оказалась примерно одинаковой, и лишь макрофаги, полученные при 28°С, мигрировали в сторону микроба в бактериальной форме со значительно большей скоростью, чем в направлении клеток в Ь-форме (р<0.05).

Иммунизация морских свинок активирует хемотаксис фагоцитов в отношении чумного микроба. В наибольшей мере стимулируется подвижность в направлении антигена перитонеальных макрофагов. Альвеолярные макрофаги и полиморфноядерные лейкоциты, особенно первые, сенсибилизируются в процессе иммуногенеза в меньшей степени. В отношении клеток вакцинного (ЕУ) и вирулентного (2638) .штаммов подвижность каждого из трех испытанных фагоцитов примерно одинакова. Однако и макрофаги, и полиморфноядерные лейкоциты иммунных морских свинок в отношении чумного микроба в Ь-форме менее подвижны, чем в бактериальной форме. Вероятно, деградация клеточной стенки, свойственная бактериям в Ь-форме, обеспечивает меньшую их "привлекательность" для фагоцитов.

Особенности антигенного состава чумного микроба в бактериальной и Ь-формах (наличие фракции I в первом и отсутствие - во втором случаях), использованного для иммунизации животных, обусловливают различия в процессах, обеспечивающих иммунную перестройку фагоцитов. На модели морских свинок, вакцинированных штаммом У. резЙБ ЕУ за 1, 7, 14 и 21 сутки до постановки опыта, показано, что иммунизация животных чумным микробом в бактериальной форме вызывает более

глубокую специфическую перестройку перитонеальных макрофагов, чем иммунизация клетками в Ь-форме. Индексы хемотаксиса у альвеолярных макрофагов оказались более низкими, чем у перитонеальных, однако и в этом случае по сенсибилизирующему воздействию на макрофаги чумной микроб в Ь-форме уступал микробу в бактериальной форме.

Перитонеальные макрофаги достоверно (р<0.05) превосходят альвеолярные и по адгезивной активности независимо от объекта фагоцитоза (исходные авирулентные, вирулентные клетки и их Ь-производные). С другой стороны, перитонеальные и альвеолярные макрофаги иммунных морских свинок обладают более высокой адгезивной активностью в отношении чумного микроба как в бактериальной, так и Ь-форме, чем аналогичные клетки от интактных животных. Интересен тот факт, что адгезивная способность макрофагов при фагоцитозе чумного микроба вакцинного штамма (и в бактериальной, и в Ь-форме) статистически достоверно более выражена, чем вирулентного штамма.

Адгезивная активность макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов при их взаимодействии с микробами в Ь-форме выше, чем при контакте с клетками в исходной бактериальной форме.

Как и в случае хемотаксиса, индексы адгезии у перитонеальных и альвеолярных макрофагов после вакцинации животных-доноров резко возрастает, уже через 6 ч после иммунизации достигают максимальных значений и сохраняются на высоком уровне до 7-14 суток. На 21-28 сутки показатели ИА падают до уровня контроля и ниже. Перитонеальные макрофаги по адгезивной способности в целом заметно превосходят альвеолярные. Вероятно, перитонеальные макрофаги обладают и более высоким функциональным потенциалом, чем альвеолярные, поскольку после иммунизации ИА у первых быстро возрастает более чем в два раза, тогда как у вторых - на 75-80%.

Стимулирующее влияние на адгезивную способность макрофагов оказывала иммунизация животных У. реэ^Б ЕУ и в исходной бактериальной, и в Ь-формах, однако в первом случае оно было заметно более выраженным как в отношении перитонеальных, так и альвеолярных макрофагов. Стимуляции адгезии по времени совпадает с нестерильной фазой иммуногенеза при чуме.

Различия в функциональной активности фагоцитов, выявленные при изучении их хемотаксической и адгезивной активности, обусловлены, на наш взгляд, не только физиологическим своеобразием отдельных макрофагов и ПЯЛ, но и особенностями антигенного состава чумного микроба в бактериальной и Ь-формах, в частности, возможно, наличием фракции I в первом случае и ее отсутствием - во втором.

2. Показатели фагоцитарной активности и завершенности фагоцитоза

Контакт фагоцита с чужеродным объектом, достигаемый посредством хемотаксиса и адгезии, при определенных условиях обеспечивает следующую стадию их взаимодействия - поглощение, в результате которого объект, в нашем случае - У резих, оказывается в фагосоме, которая далее сливается с лизосомой, формируя фаголизосому. Именно главным образом на этом этапе проявляется действие бактерицидных систем фагоцитов, в которых ключевую роль играют продуцируемые активные формы кислорода.

При изучении фагоцитарной активности установлено, что количество микробов, поглощенных макрофагами (перитонеальными и альвеолярными) и полиморфноядерными лейкоцитами морской свинки, если судить по фагоцитарному числу, нарастает по мере увеличения продолжительности взаимодействия с объектом фагоцитоза: через 3 ч контакта число микробов в фагоците в 1.5-2 и более раз выше, чем через 30 мин. Перитонеальные и альвеолярные макрофаги по фагоцитарной активности существенно превосходят ПЯЛ, но между собой по этому признаку различаются незначительно.

Выраженных различий в активности фагоцитов в отношении клеток вакцинного и вирулентного штаммов чумного микроба не отмечено. Обращает, однако, внимание, что и макрофаги обоих видов, и поли-морфноядерные лейкоциты по отношению к чумному микробу в Ь-фор-ме намного менее активны (р<0.01), чем к клеткам в бактериальной форме. В перитонеальных макрофагах через 3 ч инкубации с микробами вакцинного и вирулентного штаммов У. резЙБ количество поглощенных клеток в бактериальной форме было соответственно в 2.2-8.6 и в 1.2-3.4 раза больше, чем клеток в Ь-форме. У альвеолярных макрофагов коэффициенты превышения составляют соответственно 1.9-2.6 и 3.2-5.2, у ПЯЛ - 1.6 и 1.9-2.0 раза.

Предварительная специфическая иммунизация подопытных морских свинок не оказывает существенного влияния на фагоцитарную активность альвеолярных макрофагов и ПЯЛ. Перитонеальные макрофаги иммунных животных по фагоцитарному числу, особенно в случае бактерий в Ь-форме, превосходят аналогичные клетки интактных животных.

Число активных клеток в отношении чумного микроба в бактериальной форме достигало у перитонеальных макрофагов 70-100, у альвеолярных - 70-90%, тогда как в отношении микроба в Ь-форме не превышало соответственно 37-90 и 30-80%. Данное обстоятельство, видимо,

следует связать с менее низкой в отношении Ь-форм хемотаксической способностью этих макрофагов. Число фагоцитарноактивных макрофагов обоих типов от иммунных морских свинок независимо от объекта фагоцитоза достигало 100%.

Фагоцитоз макрофагами и ПЯЛ чумного микроба независимо от его вирулентности (вакцинный штамм У реэ^ ЕУ или вирулентный У. реБ-^ 2638), морфологического состояния (в бактериальной или в Ь-формах) и предварительной специфической иммунизации животных-доноров носит в большинстве случаев незавершенный характер, то есть поглощенные клетки продолжают размножаться в фагоцитах.

При взаимодействии с чумным микробом, особенно вирулентного штамма У. реБ^Б 2638, имеет место выраженное цитопатическое действие бактериальной клетки на фагоцит. Среди перитонеальных и альвеолярных макрофагов наибольшее количество поврежденных клеток регистрируется при фагоцитозе У. реэНз (и ЕУ, и 2638) в бактериальной форме. Чумной микроб в Ь-форме оказывает заметно меньший цитопати-ческий эффект, причем поглощенные бактерии частично разрушаются в фаголизосомах фагоцитов.

При изучении динамики фагоцитоза на ультраструктурном уровне отмечено, что макрофаги интактных и иммунных животных наиболее активно поглощают чумные микробы (и в бактериальной, ¡1 в Ь-формах) в первые 30 мин контакта с ними. На этом этапе фагоцитоза бактерии в Ь-форме можно наблюдать на поверхности макрофагов, на стадии поглощения многочисленными псевдоподиями, а также внутри некоторых фаголизосом. Через 3 ч контакта количество бактерий в Ь-форме внутри фаголизосом увеличивается, некоторые микробные клетки находились в стадии деления. Таким образом, по морфологическим данным можно говорить о размножении микробов в фаголизосомах макрофагов. В фагоцитах от иммунных животных происходит частичная деструкция некоторых микробов с одновременным размножением других. Часто этот процесс протекает в одной фаголизосоме.

В структуре макрофагов уже в начальные сроки фагоцитоза клеток вирулентного штамма У. резне 2638 в Ь-форме наблюдали более или менее выраженные изменения, которые проявлялись расслоением плаз-молеммы и появлением в цитоплазме большого количества пузырьков разного размера. В более поздние сроки в макрофагах интактных животных происходят еще более глубокие внутриклеточные изменения, такие как вакуолизация цитоплазмы, разрушение (деструкция) митохондрий, разрыв мембраны фаголизосом. Хроматин ядра концентрируется по пе-

риферии ядерной мембраны. Вокруг фаголизосом, содержащих бактерии, наблюдали уплотнение цитоплазмы. Наличие таких изменений позволяет сделать вывод о раннем цитопатическом действии на фагоцит клеток вирулентного штамма Y. pestis как в исходной бактериальной, так и в полученной из них L-форме.

При фагоцитозе макрофагами клеток вакцинного штамма Y. pestis ЕВ как в бактериальной, так и L-форме проявления их цитотоксичнос-ти и деструкция фагоцитов были менее выражены и наступали в несколько более поздние сроки, чем при фагоцитозе вирулентных клеток чумного микроба.

В отношении макрофагов иммунных морских свинок цитопатичес-кий эффект как исходных бактериальных, так и L-форм выражен в меньшей мере, чем макрофагов интактных животных.

3. Показатели активации фагоцитов по их хемилюминесцен-ции, реакции восстановления нитросинего тетразолия, активности миелопероксидазы и содержанию катионных белков

В бактерицидных процессах, осуществляемых на уровне фаголизосом, ключевую роль играют активные формы кислорода - супероксидный анион (О2'), перекись водорода, радикалы гидроксила и гипохлорит (НС10"), - продукция которых связана с резким увеличением потребления кислорода клетками - так называемым окислительным, или респираторным, взрывом. Важно при этом иметь в виду уже установленные факты о неодинаковом влиянии на окислительно-восстановительные процессы, протекающие в фаголизосоме, фракция I и II чумного микроба. Показано, в частности, что фракция I вызывает метаболические сдвиги, связанные с расщеплением перекиси водорода, генерируемой из супероксида неферментативным путем, что снижает эффективность функционирования миелопероксидазной реакции (Стукова Н.Ю., 1991). В то же время в небольших дозах "мышиный" токсин способен in vivo стимулировать кислородзависимый метаболизм, наработку биоксидантов и бактерицидную активность макрофагов перитонеального экссудата (ИсинЖ.М. с соавт., 1987). Под действием токсина возрастает активность миелопероксидазы, супероксидисмутазы и каталазы (Голубин-скийЕ.П. с соавт., 1993; Стукова Н.Ю., 1991).

Полученные нами материалы свидетельствуют о том, что кинетика хемилюминесцентного ответа ПЯЛ экспериментальных животных на Y. pestis характеризовалась двумя фазами - интенсивной вспышки при добавлении фагоцитируемого объекта и постепенного затухания. Однако

длительность фаз и интенсивность процесса у ПЯЛ морских свинок и белых мышей характеризовались, с одной стороны, как некоторыми общими закономерностями, так и видовыми особенностями, а, с другой стороны, в значительной степени зависели от свойств объекта фагоцитоза.

У полиморфиоядерных лейкоцитов интактных морских свинок при фагоцитозе чумного микроба в бактериальной форме ХЛ достигала максимума через 15-18 мин, тогда как в Ь-форме значительно позднее -через 30-40 .мин. Вместе с тем при фагоцитозе чумного микроба в Ь-форме хемилюминесцентный ответ был заметно более интенсивным, чем в случае бактериальной формы. Так, максимальное значение ХЛ при фагоцитозе Ь-форм составило 5090±271 импульсов на 5х10б ПЯЛ за 0.1 мин, а при поглощении бактериальных форм - 3778±409.

Хемилюминесцентный ответ ПЯЛ белых мышей при фагоцитозе У. рев^ был несколько иным. У лейкоцитов интактных животных ХЛ по степени выраженности при контакте с чумным микробом в бактериальной и Ь-формах была примерно одинаковой, причем хемилюминесцен-пия достигает максимума через 11-14 и затухает через 60 - 100 мин -заметно быстрее, чем у ПЯЛ морских свинок. У ПЯЛ иммунных белых мышей хемилюминесценция при взаимодействии с У. рев^в оказалась более высокой, чем у лейкоцитов интактных животных. Важно при этом заметить, что хемилюминесцентный ответ ПЯЛ иммунных белых мышей на чумной микроб в Ь-форме в 1.5 раза интенсивнее, чем на микроб в бактериальной форме.

Полученные результаты позволили заключить, что при фагоцитозе чумного микроба и в бактериальной, и в Ь-формах независимо от вида экспериментального животного увеличивается продукция активных форм кислорода, обеспечивающих бактерицидность ПЯЛ. Чумной микроб в Ь-форме при поглощении его лейкоцитами провоцировал более интенсивный "окислительный взрыв" и, следовательно, более интенсивную выработку активных форм кислорода, чем в бактериальной форме. Поскольку главное различие между чумными микробами в бактериальной и Ь-формах состоит в отсутствии у последних фракции I, имеются основания предполагать, что Ф1 оказывает блокирующее, вернее, - ингиби-рующее влияние на "окислительный взрыв", тем самым снижая выработку АФК и, как следствие, - бактерицидную способность фагоцитов.

Дополнительные материалы для выяснения механизмов фагоцитоза чумного микроба получены при исследовании окислительной активности макрофагов и ПЯЛ в НСТ-тесте, результаты которого оценивали параллельно по степени восстановления нитросинего тетразолия в форма-зан и количеству формазанположительных клеток. Полученные матери-

алы позволили констатировать, что фагоцитоз чумного микроба перито-неальными, альвеолярными макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами независимо от вирулентности штаммов индуцирует существенный рост активности кислородзависимого метаболизма в фагоцитах всех трех видов. Показатели НСТ-теста у макрофагов и ПЯЛ, фагоцитирующих У реБ^Б в бактериальной форме, оказались существенно ниже, чем в случае поглощения ими чумного микроба в Ь-форме. Предварительная специфическая иммунизация экспериментальных животных повышает функциональные способности макрофагов и ПЯЛ, что проявляется дальнейшей активацией продукции активных форм кислорода.

Характеристику бактерицидных факторов фагоцитов морской свинки при поглощении чумных микробов дополняют материалы изучения миелопероксидазы и неферментных катионных белков полиморфноя-дерных лейкоцитов в присутствии клеток авирулентного (У. рев^ ЕУ) и вирулентного (У. реБЙБ 2638) штаммов чумного микроба. Нами показано, что активность миелопероксидазы и содержание неферментных катионных белков в ПЯЛ морских свинок в процессе фагоцитоза чумного микроба прогрессивно снижаются по мере увеличения продолжительности контакта фагоцита с микробом. Специфическая иммунизация морских свинок несколько повышает общий уровень активности миелопероксидазы ПЯЛ по сравнению с тем, что имеет место у лейкоцитов интактных животных, однако и в этом случае тенденция снижения активности миелопероксидазы с увеличением продолжительности взаимодействия с микробом сохраняется. Подобная тенденция носит универсальный характер, поскольку она примерно в равной мере наблюдается при фагоцитозе вирулентных и авирулентных клеток, микробов в бактериальной и Ь-формах.

Приведенные материалы затруднительны для однозначной оценки. Очевиден, однако, тот факт, что при поглощении чумного микроба -вирулентного или авирулентного, в бактериальной или Ь-форме - в фагоците развивается целый каскад взаимосвязанных реакций, направленных на ограничение патогенных функций микроорганизма. В качестве одной из таких реакций, безусловно, следует рассматривать и активацию кислородозависимого метаболизма, поскольку накопление активных форм кислорода повышает бактерицидные функции фагоцита по отношению к чужеродному агенту. Не совсем ясно с этой точки зрения то обстоятельство, что фагоцитоз У. реБЦв в Ь-форме сопровождается более высокими показателями, характеризующими окислительно-восстановительные процессы в фагоцитах, чем клеток в бактериальной форме. Вполне вероятно, что эти различия обусловлены не только неодинаковой стимуляцией физиологических функций фагоцитов. На наш взгляд, при-

чиной этого явления может быть ингибирующее действие на кислород-зависимые механизмы фракции I, носителем которой является У. реБЙБ в бактериальной форме.

4. Активность глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и НАДФ*Н-оксидазы

Для выяснения вопроса, влияет ли чумной микроб и каким образом на активность некоторых ферментов, участвующих в реакциях окислительного взрыва у фагоцитов, мы изучили активность одного из ключевых ферментов пентозомонофосфатного цикла - глюкозо-6-фосфат-де-гидрогеназы, катализирующей окисление глюкозо-6-фосфата, и Н АД Ф • Н - о кс ид аз ы, обеспечивающей регенерацию нуклеотидфосфата. Объектом исследования служили перитонеальные и альвеолярные макрофаги, полиморфноядерные лейкоциты, а также перитонеальные макрофаги субпопуляций, полученных в градиенте температур 2, 10, 28 и 37°С.

Результаты проведенного исследования показали, что фагоцитоз чумного микроба макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами сопровождается активацией глюкозо-б-фосфат-дегидрогеназы, что свидетельствует об усилении окисления глюкозы в гексозомонофосфатном шунте и, как следствие, - активной наработке восстановленной формы НАДФ. Одновременно с активацией глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы повышается активность НАДФ«Н-оксидазы, что обеспечивает регенерацию НАДФ, усиление окислительного метаболизма и соответственно -повышение бактерицидного эффекта в отношении поглощенных микроорганизмов.

В процессе иммуногенеза происходит перестройка ферментативных систем, обеспечивающих антимикробное действие фагоцитов, о чем свидетельствует более высокий уровень активности глюкозо-б-фосфат-дегидрогеназы и НАДФ*Н-оксидазы в макрофагах и ПЯЛ иммунных морских свинок.

Представляет несомненный интерес выявленная нами закономерность, проявляющаяся в неодинаковой активности глюкозо-6-фосфат-дегид-рогеназы Н А Д Ф • Н - о кс и даз ы у субпопуляций фагоцитирующих макрофагов, полученных в градиенте температур: активность обоих ферментов постепенно возрастает по мере повышения температуры, при которой осуществлялась адгезия макрофагов.

Активация кислородзависимого метаболизма обеспечивает фагоцитам более высокий уровень бактерицидной способности, которая, однако, носит дифференцированный характер в зависимости от исходных свойств микроорганизма. Эксперименты, проведенные с К Ш1агеп515, показали,

что, хотя характер и динамика изменения активности глюкозо-6-фос-фат-дегидрогеназы и НАДФ»Н-оксидазы при фагоцитозе туляремийно-го микроба сходны с отмеченными при поглощении У. ревЙБ, активация обоих ферментов в макрофагах и ПЯЛ при фагоцитозе туляремийного микроба происходит значительно интенсивнее, чем в случае чумного микроба. С другой стороны, в макрофагах и ПЯЛ, фагоцитирующих чумной микроб в Ь-форме, зарегистрированы существенно более высокие показатели активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и НАДФ*Н-оксидазы, чем при фагоцитозе микроба в бактериальной форме. Это обстоятельство свидетельствует, видимо, о неспособности У. резЙБ в Ь-форме ингибировать кислородзависмый метаболизм фагоцитов, что может отражаться на его дальнейшей судьбе в макроорганизме.

5. Активность лизосомальных ферментов фагоцитов

Принято считать, что окислительную деградацию фагоцитированных микробов облегчает расщепление их лизосомальными ферментами, которые сами при этом модифицируются. Известно, например, что чумной микроб способен снижать активность ряда ферментов макрофагов, в том числе лизоцима, 5'-нуклеотидазы, и уменьшать количество кати-онных белков (Зонова И.В., 1989; Руднев С.М., 1989).

Указанные обстоятельства побудили нас изучить активность лизосомальных ферментов, существенно определяющих киллерную способность фагоцитов - лизоцима, катепсина Д и кислой фосфатазы. Опыты проводили с использованием перитонеальных макрофагов и полиморфноя-дерных лейкоцитов интактных и параллельно - вакцинированных морских свинок в процессе формирования у них иммунитета к чуме.

Проведенные эксперименты показали, что в фагоцитирующих чумной микроб перитонеальных макрофагах интактных морских свинок возрастает, по сравнению с контрольными значениями (не фагоцитирующие клетки), активность катепсина Д и особенно лизоцима, но заметно снижается активность кислой фосфатазы.

Динамика изменения активности лизосомальных ферментов ПЯЛ интактных морских свинок носит несколько иной характер, чем у макрофагов. Характерной особенностью ПЯЛ является высокий уровень у них активности лизоцима, который почти на порядок выше, чем в макрофагах (10.07-17.54 против 3.25-6.25), а при фагоцитировании чумного микроба еще более возрастает. В отличие от макрофагов, в фагоцитирующих ПЯЛ интактных животных возрастает активность не только катепсина Д, но и кислой фосфатазы.

Иммунизация морских свинок против чумы достоверно (р<0.05) повышала активность лизосомальных ферментов как в не фагоцитирую-

щих перитонеальных макрофагах, так и при фагоцитозе У. ревШ. Вместе с тем и на новом, более высоком уровне, основные закономерности, отмеченные при рассмотрении результатов опытов с макрофагами ин-тактных животных, сохранялись.

Выявлены определенные различия в ответной реакции макрофагов и ПЯЛ при взаимодействии с У. рез^ в бактериальной и Ь-формах. Наиболее существенным отличительным признаком является тот факт, что активность всех трех лизосомальных ферментов - лизоцима, катеп-сина Д и кислой фосфатазы - в фагоцитирующих У. резне ЕУ перитонеальных макрофагах и полиморфноядерных лейкоцитах интактных и иммунных морских свинок была закономерно более высокой в случае поглощения чумного микроба в бактериальной, чем в Ь-форме. Исключение составляют полиморфноядерные лейкоциты интактных морских свинок, в которых активность катепсина и фосфатазы возрастала более интенсивно при фагоцитозе чумного микроба в Ь-форме.

Отмеченные различия в активности лизосомальных ферментов макрофагов и ПЯЛ, обусловлены, вероятно, неодинаковой ролью исследованных фагоцитов в иммуногенезе и судьбе поглощенного материала. Известно, что полиморфноядерные лейкоциты осуществляют уничтожение и деградацию фагоцитированных объектов, в чем задействованы благодаря своим бактерицидным свойствам лизоцим и кислая фосфата-за. В макрофагах, помимо киллинга, осуществляются обработка и подготовка антигенов для представления лимфоцитам, благодаря чему, возможно, активируется катепсин Д, осуществляющий внутриклеточный протеолиз.

Более выраженное стимулирующее влияние на активность лизосом-ных ферментов фагоцитов, в частности лизоцима и катепсина Д, У. рез-113 в бактериальной форме, связано, по-видимому, и с различиями в антигенном составе чумного микроба в бактериальной и Ь-формах, который, безусловно, полнее в первом случае.

6. Персистенция антигенов чумного микроба в организме морской свинки

Известно, что чумной микроб способен персистировать в организме не только теплокровных, особенно зимоспящих, но и холоднокровных, в частности блох. Распространение возбудителя чумы через укус блохи требует высокого его содержания в организме хозяина. С учетом этого на первый план выдвигаются факторы, обеспечивающие диссеминацию чумного микроба в организме и размножение в клетках, обладающих фагоцитарными свойствами (Л.М. Куклева, 1986). Недостаточная изученность причин сохранения и размножения возбудителя чумы в макро-

фагах затрудняет понимание особенностей патогенеза чумы, что в свою очередь ставит задачу дальнейшего изучения участия отдельных свойств возбудителя в обеспечении его характерной особенности - способности к размножению в организме хозяина.

В нашей работе мы попытались, насколько это возможно при современных методических подходах, исследовать фагоцитарную реакцию организма восприимчивого к чуме животного на внедрение чумного микроба с разными исходными свойствами.

Как и в предыдущих разделах, опыты проведены с использованием в качестве экспериментальной модели морских свинок (весом 300-350 г). Инфицирующим материалом служили вакцинный (У. реБ^Б ЕУ) и вирулентный (У. ре5ЙБ 2638), которые были представлены в исходной бактериальной и Ь-формах. Наличие в иммунокомпетентных органах антигенов чумного микроба определяли гистохимическим методом с помощью специфических антител, меченных коллоидным золотом, в мазках-отпечатках органов или монослое макрофагов.

Полученные данные свидетельствуют о наличии довольно сходных тенденций в характере распределения антигенов вакцинного и вирулентного штаммов чумного микроба в органах и тканях животного, но при некоторых, иногда существенных, различиях в скорости этого процесса, обусловленных вирулентностью и фенотипическим состоянием использованных для заражения микробов.

Наличие антигенсодержащих клеток в иммунокомпетентных органах морских свинок удалось зафиксировать уже через 3 часа после инфицирования животных, причем в сроки, ближайшие к моменту заражения, преимущество по числу антигенсодержащих клеток регистрируется при поглощении микробов вирулентного штамма и в бактериальной форме. При введении морским свинкам вакцинного штамма чумного микроба максимальное количество антигенсодержащих клеток зафиксировано на 7 сутки после инфицирования животных, а через 21 сутки во всех иммунокомпетентных органах встречались лишь единичные антигенсодержа-щие клетки, либо их вовсе не было.

При заражении морских свинок вирулентным штаммом чумного микроба к 5 суткам во всех органах и тканях отмечен резкий рост (по сравнению с показателями через 24 ч - в 1.3-4.3 раза) числа антигенположи-тельных клеток, особенно в случае введения животным возбудителя чумы в исходной бактериальной форме. Через 7 суток, однако, в органах и тканях морских свинок, зараженных чумным микробом в бактериальной форме, число антигенсодержащих клеток резко снижается, зато столь же стремительно возрастает количество антигенпозитивных клеток в органах животных, получивших У. реэПэ 2638 в Ь-форме. Через 7 суток

количество антигенсодержащих клеток в органах животных, получивших Ь-форму, в 2.2-3.8 раза превосходило соответствующие показатели у животных, инъецированных чумным микробом в исходной бактериальной форме. Клинически подобное явление коррелировало с гибелью подопытных животных, которая при заражении их У. реет в Ь-форме в большинстве случаев наступала на 5-6 сутки.

Во все сроки наблюдения, начиная с 6 ч после введения инфицирующей дозы, отмечено разрушение макрофагов и выход чумного микроба в межклеточное пространство, что особенно выражено на 7 сутки после введения антигена как в бактериальной, так и в Ь-формах.

Полученные данные дают основание считать, что после введения морским свинкам чумного микроба в Ь-форме реверсия его в исходную бактериальную форму происходит очень быстро - в течение 3-6 ч, но до 5 суток количественно ревертанты несколько уступают клеткам, с самого начала находившимся в бактериальной форме, то есть клеткам исходной культуры. Лишь на 7 сутки ревертанты размножаются в макрофагах более активно, чем чумные микробы исходного штамма, что приводит к развитию инфекционного процесса и более быстрой гибели макроорганизма.

Следовательно, в организме теплокровного хозяина довольно быстро происходит реверсия чумного микроба из Ь-формы в обычную бактериальную форму, что сопровождается генерализацией инфекции с возникновением бактериемии. По мнению Л.Н. Классовского с соавт. (1981), при наличии благоприятных экологических условий единичные зверьки с генерализованной чумой могут положить начало развитию новой эпизоотической волны. С подобной версией можно, видимо, согласиться, однако она, тем не менее, не отвечает на вопрос, каким образом могут появиться первые особи с генерализованной инфекцией. Однозначного ответа на этот вопрос пока нет. В связи с этим следует, на наш взгляд, снова обратиться к роли в персистенции чумного микроба его фракции I. С позиций полученных нами данных представляется до некоторой степени односторонним взгляд (Пустовалов, 1984), согласно которому Ф1, как один из факторов вирулентности, связана не с устойчивостью чумного микроба к захвату фагоцитами, а с его способностью выживать и размножаться внутри клетки. Если принять во внимание наши материалы о том, что отсутствие у чумного микроба в Ь-форме фракции I снижает способность фагоцитов к хемотаксису и адгезии, нельзя исключить того, что именно в таком виде возбудитель чумы как достаточно инертный чужеродный агент может какое-то, иногда продолжительное, время переживать в организме животного, а при благоприятных условиях реверсировать в вирулентную форму.

выводы

1. Хемотаксис перитонеальных, альвеолярных макрофагов и полиморф-ноядерных лейкоцитов в направлении чумного микроба в Ь-форме осуществляется менее активно, чем в сторону клеток в бактериальной форме. Адгезивная активность макрофагов и полиморфноядер-ных лейкоцитов при их взаимодействии с микробом в Ь-форме выше, чем при контакте с клетками в исходной бактериальной форме. Чумной микроб в Ь-форме уступает клеткам в бактериальной форме по повреждающему действию на фагоциты.

2. При фагоцитозе чумного микроба в Ь-форме у макрофагов и поли-морфноядерных лейкоцитов выявлена тенденция к снижению активности лизосомальных ферментов (лизоцима, катепсина Д, кислой фосфатазы, миелопероксидазы). Показатели хемилюминесценции, НСТ-теста, активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и НАДФ*Н-оксидазы при фагоцитозе чумного микроба в Ь-форме выше, чем при поглощении клеток в бактериальной форме.

3. При фагоцитозе чумного микроба в бактериальной и Ь-формах пери-тонеальными макрофагами субпопуляция, полученная методом адгезии при температуре 37°С, по интенсивности кислородзависимых метаболических процессов, в частности активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и НАДФ*Н-оксидазы, превосходит аналогичные клетки, изолированные при 2, 10 и 28°С.

4. Предварительная иммунизация экспериментальных животных активирует функциональные способности макрофагов и полиморфноя-дерных лейкоцитов на всех (изученных) этапах фагоцитоза чумного микроба как в бактериальной, так и Ь-формах. •

5. Фагоцитоз чумного микроба макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами интактных и иммунных морских свинок носит преимущественно незавершенный характер; показатели завершенности фагоцитоза при поглощении микроба в Ь-форме выше, чем клеток в бактериальной форме.

6. В макрофагах иммунокомпетентных органов морской свинки чумной микроб в Ь-форме уже в первые (З-б) после инъекции часы реверсирует в исходную бактериальную форму.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Роль некоторых кислородзависимых систем при фагоцитозе чумного микроба// Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней.- Ставрополь, 1993.- С. 205-207 (с соавт.)

2. Фагоцитоз Ь-форм чумного микроба макрофагами восприимчивых к чуме животных// Актуальные проблемы профилактики особо опасных и природноочаговых инфекционных болезней.- Иркутск, 1994.-С. 30 (с соавт.)

3. Кислородзависимый метаболизм при фагоцитозе Л-форм чумного микроба// Актуальные проблемы профилактики особо опасных и природноочаговых инфекционных болезней,- Иркутск, 1994.- С. 31-32 (с соавт.)

4. Состояние бактерицидных систем макрофагов при фагоцитозе Л-форм чумного микроба//Тезисы международной конференции "Идеи Пас-тера в борьбе с инфекцией",- Санкт-Петербург, 1995. - С. 83-84 (с соавт.)

5. Эффективность применения серологических методов при исследовании органов диких животных, зараженных чумой в эксперименте// Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных болезней.- Ставрополь, 1993,- С. 266-267 (с соавт.)

6. Активность НАДФ*Н-оксидазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы при фагоцитозе туляремийного микроба// Журн. микробиол., эпиде-миол. и иммунобиол,- 1995.- № 2.- С. 77-79 (с соавт.)

7. Фагоцитоз Л-форм чумного микроба// Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний,- Ставрополь, 1995.- С. 83-84 (с соавт.)

8. Фагоцитоз Л-форм чумного микроба макрофагами и полиморфноя-дерными лейкоцитами// Инф. бюллетень,- Саратов, 1995,- № 4.-С. 45-46 (с соавт.)

Подписано к печати 13.11.96 Заказ 56-94 Тираж 100 экз. отпечатано: Информационно-издательский центр