Автореферат и диссертация по медицине (14.00.28) на тему:Трансплантация стволовых клеток костного мозга в модели травматической болезни спинного мозга. Экспериментальное исследование

На правах рукописи

МУРАДОВ Жохонгиг Мамадалиевич

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА В МОДЕЛИ ТРАВМАТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СПИННОГО МОЗГА

14 00 28 - нейрохирургия 14 00 36 -аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ООЗ176634

Новосибирск - 2007

003176634

Работа выполнена в отделе нейрохирургии Федерального Государственного учреждения «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи

Научные руководители

Доктор медицинских наук, профессор Ступак Вячеслав Владимирович Доктор медицинских наук, профессор Черных Елена Рэмовна

Офигцюльные оппоненты

Доктор медицинских наук Новокшонов Александр Васильевич

отделение нейрохирургии Государственного научно-клинического центра охраны здоровья шахтеров (652509, Ленинск-Кузнецкий, микрорайон 7)

Доктор медицинских наук Кожевников Владимир Сергеевич

лаборатория клинической иммунопатологии НИИ клинической иммунологии СО РАМН (630099, Новосибирск, ул Ядринцевская, 14)

Ведущая организаг/ия

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Красноярская государственная медицинская академия» Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи (620022, Красноярск, ул Партизана Железняка, 1)

Защита диссертации состоится "_"_2007 г в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208 064 01 при Новосибирском НИИТО Росмедтехнологий по адресу 630091, Новосибирск, ул Фрунзе 17

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Новосибирского НИИТО Росмедтехнологий (630091, Новосибирск, ул Фрунзе 17)

Автореферат разослан "_" _2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования

В России вследствие травм спинного мозга ежегодно становятся инвалидами более 8 ООО человек, что составляет 547 человек на 10 млн населения (Косичкин М М , 1999) Количество таких больных увеличивается и 54,5% из них имеют длительность заболевания более 10 лет (Нестеров, В А, 1977)

В США частота встречаемости спинномозговых повреждений составляет

1 случай на 100 тыс населения в год (Hulsebosch С Е, 2002) Затраты на

лечение данной группы больных достигают до 500 тыс долл США при

параплегии и до 1 млн долл США при тетраплегии (Stover S L, Fine Р В ,

1987,Gutierrez PA et al, 1993)

Эффективность оперативных вмешательств и способов восстановления

функции спинного мозга в различные периоды травматической болезни

спинного мозга, несмотря на оптимистичные публикации, очень низка (Ступак

В В 1997, Басков А В , 1998, Щевелев И Н и соавт , 2000, Кельмаков В П ,

2002, 2005, Benzel Е С , LarsoT S J , 1986, Anderson Р А , Bohlman Н Н, 1992,

Vaccaro AR et al, 1997, Tator CH 2001) От 80% до 95% больных с

травматической болезнью спинного мозга остаются глубокими инвалидами,

требующими постороннего ухода (Косичкин М М , 1996, 1998, 1999, Berkowitz

М et al, 1998, Bracken М В , Holford Т R , 2002, Gaidenas DD et al, 2004)

Неуклонный рост частоты встречаемости и экономические затраты на

лечение данной категории больных подчеркивают социально-экономическую

важность проблемы и обосновывают поиск новых путей лечения

Перспективным направлением лечения спинномозговых повреждений

является клеточная терапия В эксперименте изучалась возможность

применения клеток оболочки обонятельного тракта (Lu J, Ashwell К, 2002),

олигодендроцитов, шванновских клеток (Bunge RP , 2001), эмбриональных и

нейрональных стволовых клеток (Карпенко Д О , 2005, Савченко С А , 2005,

Zompa Е А et al, 1997, McDonald J W et al, 1999) Авторы указывают, что

3

после пересадки наблюдается дифференцировка стволовых клеток в клетки нейронального и глиального ряда (Карпенко Д 0 , 2005, Brazelton TR et al, 2000)

Наряду с этим, широко дискутируется вопрос о возможности применения стволовых клеток костного мозга в лечении травмы спинного мозга Согласно данным ряда авторов, использование стволовых клеток в раннем периоде экспериментальной травмы спинного мозга оказывает положительное влияние на восстановление неврологического статуса и гистологической структуры в участке повреждения (Mezey Е et al, 2000, Chopp M et al, 2000, Hofstetter С Р et al, 2002, David С , et al, 2002, Padovan CS et al, 2003)

Однако возможность применения стволовых клеток костного мозга в позднем периоде травматической болезни спинного мозга, выбор вида клеток, оптимальных сроков трансплантации и их клиническая эффективность остаются неизученными, что определило цель нашего исследования

Цель исследования. На основе изучения влияния стволовых клеток на восстановление функции поврежденного спинного мозга у экспериментальных животных и исследования характеристик костно-мозговых клеток у пациентов со спинальной травмой обосновать возможность применения их в клинической практике

Задачи исследования:

1 На модели травматического повреждения спинного мозга изучить спонтанное восстановление двигательной активности и морфологическую картину зоны повреждения

2 Исследовать на модели травматического повреждения спинного мозга восстановление двигательной его функции в зависимости от типа трансплантируемых клеток и сроков их введения

3 Изучить морфологическую картину зоны повреждения спинного мозга при трансплантации различных фракций стволовых клеток костного мозга в ранние (7 суток) и поздние (21 сутки) сроки после его повреждения

4 Провести сравнительное исследование клеток костного мозга (стволовых кроветворных клеток, лимфоцитов) и возможность генерации мезенхимальных стволовых клеток у пациентов в позднем периоде травматической болезни спинного мозга и у здоровых доноров

Научная новизна

Впервые установлено, что при экспериментальном повреждении спинного мозга трансплантация мезенхимальных стволовых клеток оказывает достоверное воздействие на восстановление неврологического дефицита Положительная неврологическая динамика наблюдается при трансплантации мезенхимальных стволовых клеток как в ранние (на 7 сутки), так и в поздние (на 21 сутки) сроки после травмы

Путем морфологических исследований впервые установлено, что трансплантация мезенхимальных стволовых клеток ведет к формированию нежного рубца с большим количеством сосудов в области дефекта спинного мозга В смежных к области иссечения зонах спинного мозга отмечается меньшая выраженность кистозно-дегенеративных изменений и большее количество сосудов, чем в группе контроля

Впервые проведено сравнительное исследование клеток костного мозга (стволовые кроветворные клетки, зрелые лимфоциты и мезенхимальные клетки) больных травматической болезнь спинного мозга и здоровых доноров Выявлено отсутствие существенных изменений костного мозга (стволовых кроветворных клеток, лимфоцитов) и возможность генерации мезенхимальных стволовых клеток клетками костного мозга у больных в позднем периоде травматической болезни спинного мозга

Разработан «Способ лечения травматических повреждений спинного мозга» (Патент № 2286160, зарегистрирован 27 10 2006 г по заявке на изобретение № 2005107988), основанный на использовании аутологичных стволовых клеток костного мозга

Практическая значимость

Результаты экспериментальных исследований могут стать основой для дальнейших работ по изысканию новых методов восстановления функции поврежденного спинного мозга с использованием стволовых клеток костного мозга

Выявленное отсутствие изменений клеток костного мозга больных с травматической болезнью спинного мозга в позднем периоде, в том числе стволовых кроветворных клеток, лимфоцитов и возможность генерации мезенхимальных стволовых клеток, позволяет применять клетки костного мозга в качестве источника стволовых клеток для аутологичной трансплантации

Положения, выносимые на защиту:

1 При моделировании повреждения спинного мозга функционально значимого спонтанного восстановления двигательной активности экспериментальных животных не отмечается

2 Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга оказывают у животных положительный эффект на восстановление двигательной функции при проведении трансплантации как в раннем (на 7 сутки), так и позднем (на 21 сутки) периоде повреждения спинного мозга

3 При трансплантации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в раннем и в позднем периоде после экспериментального повреждения спинного мозга в зоне иссечения и смежной с ней областях наблюдается меньшая выраженность кистозно-дегенеративных изменений, большее количество сосудов в сравнении с животными контрольной группы

4 Костный мозг больных с травматической болезнью спинного мозга, характеризуясь сохранным количеством стволовых кроветворных клеток, возможностью генерации мезенхимальных стволовых клеток и отсутствием изменений со стороны зрелых лимфоцитов, является полноценным источником стволовых клеток при проведении аутологичных трансплантаций

Апробация. Основные положения работы доложены на I Международной научно-практической конференции молодых ученых по вертебрологии и смежным дисциплинам Новосибирск 2005 г, Заседании ассоциации нейрохирургов г Новосибирска 2005 г, V Республиканской научно-практической конференции «Актуальные проблемы организации экстренной медицинской помощи малоинвазивные методы диагностики и лечения в экстренной медицине» г Бухара Узбекистан 2005 г, IV съезде нейрохирургов России, 2006 г, Заседании Ученого совета Новосибирского НИИТО 2005 г , 2007 г,

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе за рубежом - 3

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 47 рисунков, 14 таблиц Состоит из введения, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, содержащего 207 источник, из них 53 отечественных и 154 иностранных авторов

Личный вклад автора. Экспериментальная часть работы произведена лично автором Материал, представленный в диссертации, полностью обработан и проанализирован диссертантом Соискатель принимал непосредственное участие в курации больных с позвоночно-спинномозговой травмой

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Экспериментальная работа выполнена на 67 половозрелых крысах - самках породы Вистар На 42 животных изучено действие различных видов стволовых клеток костного мозга при непосредственном введении в участок экспериментального повреждения спинного мозга с оценкой клинических

эффектов В дальнейшем проведены морфологические исследования участка повреждения спинного мозга (табл 1)

Для решения поставленных задач использовались следующие основные методы исследования экспериментальный, клинико-неврологический, МРТ, морфологический, статистический

Содержание и экспериментальные работы на лабораторных животных проводилось в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных и других научных целей и приказом Министерства Здравоохранения СССР № 755 от 12 августа 1977 г

Таблица 1

Распределение экспериментального материала

Вид трансплантируемых клеток Кол-во животных Сроки трансплантации клеток Сроки наблюдения за животными

Нет Отработка модели повреждения 15 - 21 сутки

Нет Контрольная группа 10 - 35 суток

Мезенхимальные стволовые клетки 6 7 суток

Несепарированные стволовые клетки 6

Прилипающие к пластику клетки 6

Прилипающие к пластику клетки на плазменном сгустке 6

Мезенхимальные стволовые клетки 6 21 сутки

Несепарированне стволовые клетки 6

Прилипающие к пластику клетки 6

Всего 67

Моделирование экспериментального повреждения спинного мозга производили путем ламинэктомии на уровне ТЬ9 позвонка и открытого иссечения (транссекции) участка спинного мозга слева на протяжении 4 мм

На 7 и 21 сутки после первичного повреждения проводили слепой отбор животных и осуществляли трансплантацию стволовых клеток в зону повреждения спинного мозга через микроиглу в количестве 1 млн клеток в объеме 0,05 мл Животных выводили из эксперимента на 35 сутки с момента

экспериментального повреждения путем подачи летальных доз эфирного наркоза

Клетки костного мозга для экспериментальной работы извлекали из бедренных костей половозрелых крыс самцов, породы Вистар после забоя животных путем передозировки эфирного наркоза

Прилипающие к пластику клетки получали путем инкубации несепарированных клеток костного мозга в пластиковых флаконах в течение 24 часов

Мезенхимальные клетки костного мозга получали путем инкубации клеток костного мозга в пластиковых флаконах до получения конфлюэнтного слоя После 1-2 пассажей мезенхимальные стволовые клетки использовали для введения в зону травмы

Стандартизованную оценку двигательной активности крыс проводили по методу движения в открытом пространстве по Basso D (Basso D et al, 1995)

Морфологические исследования произведены на препаратах продольных срезов участка повреждения спинного мозга с захватом пограничной зоны повреждения толщиной 4-5 мкм Препараты были окрашены гематоксилин-эозином, рассматривались под увеличением Х160 Определяли характер рубцовой ткани и сосудистый рисунок зоны повреждения Подсчет количества кист и сосудов производили в 4 полях зрения под увеличением X 80 с вычислением их среднего количества в исследуемых группах животных

Оценка характеристик костного мозга проведена у 16 больных с травматической болезнью спинного мозга в позднем ее периоде, которые лечились в клинике нейрохирургии Новосибирского НИИТО в 2003-2005 годах в сравнении с 10 здоровыми донорами

В группе исследуемых больных 9 имели повреждение шейного отдела спинного мозга, у 7 повреждение локализовалось на грудном отделе

Распределение больных по полу, возрасту и продолжительности заболевания показано в таблице 2

Таблица 2

Распределение больных в зависимости от возраста, пола и длительности

заболевания

Распределение по полу Средний возраст, лет Средняя продолжительность заболевания, мес

М Ж 31,61±2,17 (18-56 лет) 26,39 ±5,86 (8 - 60 мес)

12 4

Как видно из представленной таблицы, мужчины составляли наибольшую группу больных и находились в наиболее работоспособном возрасте Первично все больные были оперированы в различные сроки после получения травмы Больные поступили в разные сроки ТБСМ и минимальный срок прошедший после травмы составлял 8 мес Данные сроки считаются поздним периодом ТБСМ по клинико-морфологической классификации (Угрюмов ВМ, 1961, 1962)

К моменту обращения по неврологическому статусу больные в позднем периоде ТБСМ имели следующие показатели (табл 3)

Таблица 3

Показатели неврологического статуса у больных с ТБСМ

Уровень повреядания Кол-во больных Балл по ASIA (движение) Балл по ASIA (чувствительность) Балл по Бартель Спастический синдром по Эшуорт

Шейный 9 22,16 ±3,5 46 ± 5,5 19,16 ± 3,7 3 ± 0,12

Грудной 7 50±0 112±0 27,5±2,5 2,5±0,5

У всех больных отмечались нарушения функции тазовых органов по центральному типу со сформированным автоматизмом мочевого пузыря У одного больного имелась функционирующая цистостома Трофические осложнения в виде пролежней и вялогранулирующих ран у больных отсутствовали

У пациентов на МРТ изображениях спинного мозга на момент обследования выявлялся очаг кистозно - дегенеративного изменения спинного

мозга в зоне его повреждения средним объемом 1,65 ± 0,91 см3 с формированием интрамедуллярных или субарахноидальных кист (табл. 4 и рис. 1).

Таблица 4

Средний объем участка патологического сигнала на МРТ

Уровень Характер поражения спинного мозга Средний

повреждения Интрамедуллярные Субарахноидаль- Рубцово- объем участка

кисты ные кисты спаечный дегенерации

процесс (ем3)

Шейный (п=9) 5 3 1 1,19±1,02

Грудной(п=7) 4 2 1 2Д±0,8

Итого 9 5 2 1,65±0,91

Рис. 1. МРТ изображения поврежденного отдела спинного мозга в позднем периоде ТБСМ

У всех больных по данным электрофизиологических исследований отмечались показатели полного блока проведения по соматосенсорным волокнам на уровне повреждения. При локализации повреждения на уровне шейного утолщения отмечались грубые аксональные изменения с рук.

Клетки костного мозга для их оценки и клинического применения получали путем трепанобиопсии из крыла подвздошной кости. Мононуклеарные клетки (МНК) из аспирата костного мозга получали путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла-верографина. Далее

определяли общее количество МНК, выделенных из аспирата костного мозга, относительное содержание среди них CD34+ и CD34+CD38 стволовых кроветворных клеток, а также различных субпопуляций лимфоцитов (CD3, CD-4, CD-8, CD-16, CD-20) методом проточной цитофлюориметрии Выделенные МНК культивировали 24 часа в пластиковых флаконах, после чего собирали фракцию прилипших и неприлипших клеток

Мезенхимальные стволовые клетки больных получали методом, аналогичным примененному в экспериментальном разделе Оценку поверхностных маркеров проводили в культурах после 1-2 пассажей Панель исследуемых маркеров включала оценку линейных антигенов (CD3, CD20, CD 16, CD 14), маркеров стволовых кроветворных клеток (CD34), а также мезенхимальных стромальных клеток - CD90 (Thyl) и CD73 (SH-3)

Стандартная обработка вариационных рядов включала подсчет значений средних арифметических величин (М) и ошибок средних (ш) Сравнение вариационных рядов и динамики течения осуществлялось с помощью t-теста для зависимых и независимых группировок (Стьюдента), непараметрических критериев для зависимых (критерий Уилкоксона) и независимых выборок (коэффициент Манна-Уитни) Метод статистического анализа использовали соответственно рекомендациям Гланц С (1999) Отличия считали достоверными при р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Влияние трансплантации стволовых клеток костного мозга на восстановление моторной функции спинного мозга

На первые сутки после моделирования экспериментального повреждения

спинного мозга у всех животных отмечается картина нижней параплегии

К 7 суткам с момента травмы наблюдалась незначительная положительная

неврологическая динамика разрешение плегии до глубокого пареза на

неповрежденной стороне и сохранение ее на стороне повреждения Средний

балл оценки двигательной активности в целом по группе составил 0,90 ± 0,24

12

баллов В эти сроки проявлялись трофические нарушения у всех крыс в виде похудания задних конечностей, возникновения поверхностной мацерации и неглубокой пролежневой раны в области промежности у 2 животных

К 35 суткам наблюдения средний балл двигательной активности в контрольной группе составил 2,85±0,27, (характеризуется заметными движениями двух или незначительными движениями всех трех суставов задней конечности)

После произведенной трансплантации на 7 сутки к 35 суткам исследования средний показатель двигательной активности в группе с введением мезенхимальных стволовых клеток костного мозга составил 7,0±0,80 баллов, (отчетливое движение всех трех суставов задней конечности)

У животных после пересадки прилипающих к пластику клеток костного мозга на плазменном сгустке средний показатель равнялся 5,16±1,18 баллам, что соответствовало незначительному движению в двух суставах и отчетливому движению в тазобедренном суставе

У животных после пересадки несепарированных и прилипающих к пластику клеток костного мозга средние показатели составили 1,75±0,47 и 2,58±0,58 баллов, соответственно и достоверно не отличались от показателей контрольной группы животных (2,85±0,27 баллов) (табл 5)

Таблица 5

Показатели двигательной активности животных до и после проведенной

трансплантации на 7 сутки после моделирования повреждения

Вид трансплантируемых клеток 7 сутки (М±ш) 35 сутки (М±т)

0 (контрольная группа) 0,9 ±0,24 2,85 ± 0,27*

Мезенхимальные стволовые клетки 0,75 ± 0,35 7±1,44* *

Несепарированные стволовые клетки 0,75 ±0,3 1,75±0,47*

Прилипающие к пластику клетки 0,75±0,25 2,58±0,58*

Прилипающие к пластику клетки на плазменном сгустке 0,91±0,38 5,16±1,45*#

*- достоверно по отношению к исходным значениям, # - достоверно по отношению к контролю

Трофические нарушения, возникшие у 2 животных, несколько регрессировали, но без четкой тенденции к полной их санации При болевом раздражении отмечается спастический ответ с неповрежденной стороны

После проведения трансплантации на 21 сутки, в группе животных с пересадкой мезенхимальных стволовых клеток костного мозга к 35 суткам средний балл двигательной активности составил 7,75 ± 0,54 Улучшение проявлялось как за счет здоровой, так и поврежденной стороны О положительном влиянии трансплантированной мезенхимальных стволовых клеток костного мозга говорит и отсутствие к этому сроку трофических нарушений в этой группе животных

В группах животных с пересадкой несепарированных и прилипающих к пластику клеток костного мозга показатели двигательной активности были достоверно ниже, чем в предыдущей группе Так средний балл движений в конечностях составлял в группах 2,0±0,36 и 2,33±0,37 баллов, соответственно (табл 6)

Таблица 6

Показатели двигательной активности животных до и после проведенной

трансплантации на 21 сутки после моделирования повреждения

Вид трансплантируемых клеток 21 сутки (М±т) 35 утки (М±т)

0 (Контрольная группа) 2,15± 0,21 2,85 ±0,27

Мезенхимальные стволовые клетки 1,83±0,24 7,75 ± 0,54* *

Несепарированные стволовые клетки 1,83±0,4 2,0 ±0,36

Прилипающие к пластику клетки 1,58±0,32 2,30 ± 1,37

*- достоверно по отношению к исходным значениям, # - достоверно по отношению к контролю

Морфологические исследования

У животных контрольной группы к 35 суткам область транссекции спинного мозга содержит коллагеновые волокна, имеет характеристики рубцовой ткани, с кистозными полостями числом до 18,4± 2,12 в одном поле

зрения, с малым количеством сосудов - до 5,8 ± 1,06 в поле зрения. Окружающая ткань спинного мозга обеднена сосудами. Количество их значительно уменьшилось с 20,3±1,8 в поле зрения (3 сутки наблюдения), до 7,44±2,14 (35 сутки исследования). Среднее количество кист в области спинного мозга, прилегающей к месту повреждения, в поле зрения достигает до 24,5±2,7. Область рубцовой ткани, находящейся в зоне дефекта и смежной к ней в спинном мозге четко отграничиваются друг от друга (рис. 2).

,Г« * ^

А ¡г

л. -. $ /• . . •

V-- • ■

• V

.'сг^л- — "

- -„ • .<■ - .. . . •

*ий*" --Н . - *. "" ■•* ф - '

¡•г"'*,"« '

. 'М 1 Т.». ч

г -• . у,--

^Зль ...

Г -Г щ .-..'¿Р-'* :

с*

. л"?''

Рис.2. В проксимальном отделе дефекта на фоне умеренно выраженных воспалительных изменений отмечаются дистрофические изменения. Х160. Окраска гематоксилин-эозином.

При трансплантации мезенхимальных клеток костного мозга в области дефекта спинного мозга отмечается формирование нежного рубца с большим количеством сосудов. В области дефекта количество кист меньше и кровоснабжение данной области лучше, чем в контрольной группе. Морфометрические показатели области дефекта и смежной к нему области спинного мозга показывают снижение выраженности кистозных изменений и увеличение новообразования сосудов при трансплантации мезенхимальных клеток костного мозга, со снижением количества кист до 10,11±1,14 в поле зрения и увеличением количества сосудов до 13,7±0,82 в поле зрения.

Данное свойство фракции мезенхимальных стволовых клеток костного мозга оказывает свое влияние и при трансплантации на 21 сутки после

15

экспериментального повреждения. Количество кист в зоне дефекта спинного мозга составляет 11,31±3,8 в поле зрения, количество новообразованных сосудов до 14,31±6,54 в одном поле зрения. В области спинного мозга, прилегающей к зоне травмы, количество кист составляет - 14,2±1,56, сосудов -12,15±3,46 в поле зрения (рис.3).

Рис. 3. Проксимальный отдел спинного мозга. Дегенеративные изменения в виде мелких кист. Х160. Окраска гематоксилин-эозином.

Пересадка несепарированных клеток костного мозга не оказывает выраженного репаративного воздействия на соединительнотканный рубец и на спинной мозг. Обеднение сосудистого рисунка и дегенеративные изменения в этой области сохраняются как в раннем, так и позднем периодах.

При пересадке прилипающих к пластику клеток костного мозга на 7 и 21 сутки, к 35 суткам отмечается интенсивное новообразование сосудов, которое больше выражено в зоне, приграничной к дефекту спинного мозга (рис.4). Несмотря на это, дегенеративные изменения спинного мозга не претерпевают обратного развития, кисты сохраняются и больше выражены в белом веществе спинного мозга.

Рис. 4. В области дефекта клеточная инфильтрация и новообразование сосудов. Образование рыхлой соединительной ткани. Х160, Окраска гематоксилин-эозином.

Характеристика костного мозга больных с травматической болезнью спинного мозга в позднем периоде

При оценке стволовых клеток костного мозга у больных с травматической болезнью спинного мозга в позднем периоде было выявлено, что количество мононуклеарных клеток, выделенных из аспирата костного мозга, в целом по группе имело тенденцию к повышению, а у пациентов с грудным уровнем повреждения было достоверно увеличено. Относительное и абсолютное содержание СЭ34+ клеток у больных (в целом по группе) было неизмененным, но повышалось у пациентов с грудным уровнем повреждения. Кроме того у больных отмечалось повышение доли менее зрелых кроветворных предшественников - СВ34+С038~стволовых кроветворных клеток, а также пролиферирующих С034+ клеток (табл. 7).

Выявленное увеличение количества стволовых кроветворных клеток, ассоциированное с некоторым усилением их пролиферативного потенциала, может быть связано с ослаблением негативного контроля со стороны нервной системы в результате нарушения иннервации спинного мозга после травмы. Также нельзя исключить и нарушение миграции стволовых клеток из костного мозга на периферию.

Таблица 7

Характеристика клеток костного мозга у больных с травмой спинного мозга

Параметры Доноры (п=10) Травма спинного мозга (п=16) Шейный отдел (п=9) Грудной отдел (п=7)

Выход МНК (10ь/мл) 7,50 ± 2,20 11,00 ±1,10 8,80 ± 1,60 13,00 ±1,00*"

СОЭ4+клетки (%) 5,40 ± 1,35 5,40 ± 0,60 5,0 ±0,66 5,80 ± 1,00

С034+клетки (х 106) 0,27 ± 0,07 0,54 ±0,08 0,40 ±0,09 0,71 ±0,10**

CD34+CD38 (%) 0,38 ± 0,20 1,23 ±0,20* 1,20 ±0,22* 1,50 ±0,40*

CD34+ (Go/Gi) (%) 77 ± 3,40 59 ± 4,90 * 58 ±8,70* 60 ± 6,00*

CD34+ (S/G2M) (%) 21 ±3,90 38 ± 5,40 * 40 ±9* 37 ± 6,90 *

Апоптоз CD34+ (%) 0,94 ± 0,47 3,60 ± 1,10* 2,40 ±0,90 4,70 ±2,10*

*- достоверность по сравнению со здоровыми донорами, # достоверность между больньши с шейным и грудным уровнями повреждения

Исследование относительного содержания отдельных субпопуляций лимфоцитов показало, что у больных с травмой спинного мозга субпопуляционная структура сохранялась неизменной Умеренное снижение С04+ Т-клеток было статистически незначимым, Т-клетки больных со спинальной травмой характеризовались схожими с донорами показателями апоптоза в нестимулированных и аСОЗ-стимулированных культурах, одинаковой интенсивностью пролиферативного ответа при стимуляции аСЭЗ, а также распределением Т-клеток по клеточному циклу в нестимулированных и СОЗ-активированных культурах мононуклеарных клеток Аналогичные данные были получены в отношении относительного содержания СЭ20+ В-клеток и С016+ НК клеток Содержание их у больных не отличалось от такового у здоровых доноров При сравнении анализируемых параметров в группах больных с грудным и шейным уровнями повреждения различий также не было выявлено

В качестве дополнительной характеристики клеток костного мозга у всех

больных была предпринята попытка получения мезенхимальных стволовых

клеток путем культивирования фракции прилипших к пластику клеток в среде

ОМЕ М, дополненной 15% фетальной телячьей сывороткой Рост

фибробластоподобных мезенхимальных клеток наблюдался у 11 из 15

18

пациентов Необходимый для конфлюентного слияния период времени (до нулевого пассажа) варьировал от 7 до 28 дней Фенотипическая характеристика мезенхимальных стволовых клеток, проведенная у 4 пациентов после 1-2 пассажей, представлена в таблице 8 Видно, что мезенхимальные стволовые клетки не экспрессировали линейных маркеров Т-клеток (СОЗт), В-клеток (СБ20+), НК-клеток (С016+), стволовых кроветворных клеток (СБ34+) и НЬА-БЯ молекулы, однако в подавляющем большинстве несли на своей поверхности характерные для мезенхимальных стволовых клеток СЭ90 (ТЬу 1 антиген) и СБ73 (БН-3 и БН-4)

Таблица 8

Фенотипическая характеристика мезенхимальных стволовых клеток костного мозга у больных с травмой спинного мозга

Маркеры Б-ойВ Б-ая Л Б-ойТ Б-ая Щ

СОЗ "клетки, % 0,46 0,50 0,60 0

С020+клетки, % 0,46 0,70 1,80 0,10

С016+ клетки, % 0,82 0,90 1,70 0,10

С034+, % 1,01 0,80 0,74 0,80

Ш.А-ИС, % 1,10 2,00 13 1,40

СЭ90+ (ТЬу-1), % 72 81 56 49

С073+Л (8П-3 и 5Н-4), % 97 99 97 62

Таким образом, нами установлено, что сохранное количество стволовых кроветворных клеток, зрелых лимфоцитов и возможности генерации мезенхимальных стволовых клеток определяют возможность применения аутологичных стволовых клеток костного мозга в клеточной терапии

ВЫВОДЫ

1 Спонтанное восстановление двигательной активности крыс породы Вистар при моделировании повреждения спинного мозга на 35 сутки после травмы достигает 13,6% от нормы и является функционально неполноценным

2 При трансплантации мезенхимальных клеток и прилипающих к пластику клеток костного мозга на плазменном сгустке достигается наибольшее восстановление двигательной активности, достигающее от 25% до 37%, (относительно животных без повреждения)

19

3 При трансплантации мезенхимальных клеток костного мозга на 7 сутки и 21 сутки после экспериментального повреждения к 35 суткам в зоне дефекта и смежной с ней области спинного мозга отмечается образование глиального рубца с меньшим количеством кист и большим количеством сосудов по сравнению с контрольными животными

4 Костный мозг больных в позднем периоде травматической болезни спинного мозга характеризуется сохранным количеством стволовых кроветворных клеток, отсутствием количественных и функциональных изменений со стороны зрелых лимфоцитов и возможностью генерации мезенхимальных стволовых клеток, что указывает на его потенциальную полноценность как источника стволовых клеток для аутологичной трансплантации

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Костный мозг больных в позднем периоде травматической болезни спинного мозга может применяться для проведения аутологической трансплантации в виду сохранения основных характеристик и возможности выделения мезенхимальных стволовых клеток

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Черных Е Р , Шевела Е Я , Леплина О Ю , Тихонова М А , Останин А А , Кулагин А Д , Пронкина Н В , Мурадов Ж М , Ступак В В , Козлов В А Характеристика клеток костного мозга в условиях нарушенной иннервации при травматическом повреждении спинного мозга // Клеточные технологии в биологии и медицине - 2006 - № 1 - С 8-11

2 Ступак В В , Мурадов Ж М Моделирование и оценка экспериментального спинномозгового повреждения в раннем периоде // Сборник материалов XV научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» Новосибирск - 2005 - С 352 - 353

3 Ступак В В , Сизиков М Ю Мурадов Ж М Клинико - радиологическая характеристика позднего периода позвоночно-спинномозговой травмы // Материалы Евразийского радиологического форума Астана 2005 - С 164 — 166

4 Мурадов ЖМ Этические аспекты применения клеточных технологий// Материалы Республиканской научно-практической конференции «Остеоиндуктивные подходы в травматологии и ортопедии» Ташкент Узбекистан, 2005 - С 153 - 154

5 Мурадов Ж М Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток при экспериментальном повреждении спинного мозга в позднем периоде // Материалы V Республиканской научно-практической конференции «Актуальные проблемы организации экстренной медицинской помощи малоинвазивные методы диагностики и лечения в экстренной медицине» Бухара Узбекистан 2005 - С 499-501

6 Мурадов Ж М Сравнительная динамика восстановления двигательной активности при экспериментальном повреждении спинного мозга и применении мезенхимальных стволовых клеток костного мозга // Материалы юбилейной Всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения» Санкт-Петербург 2006 - С 78

7 Мурадов Ж М, Зайдман А М , Черных Е Р , Ступак В В Двигательная активность крыс при экспериментальном повреждении спинного мозга и применении мезенхимальных стволовых клеток //Материалы IV съезда нейрохирургов России Москва 2006 - С 79-80

Изобретение

«Способ лечения травматических повреждений спинного мозга» (Патент

№ 2286160 (зарегистрирован 27 10 2006 г)

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

МНК - мононуклеарные клетки

МРТ - магнитно-резонансная томография

НК - нормальные киллеры

ТБСМ - травматическая болезнь спинного мозга

ASIA - Американская ассоциация изучения травмы спинного мозга

Отпечатано с оригинал-макета в типографии Новосибирского НИИТО Росмедтехнологий, ул Фрунзе, 17 Оригинал-макет подготовлен компьютерной группой Новосибирского НИИТО Заказ № 886 формат 60x90/16 печл 1,5 тираж 100 Гарнитура Times New Roman

По сведениям М.М. Косичкина (1999) в России ежегодно инвалидами вследствие травмы спинного мозга становятся более 8 ООО человек, что составляет 547 человек на 10 млн. населения. Число таких инвалидов постоянно увеличивается за счет того, что 54,5% из них имеют сроки заболевания более 10 лет (Нестеров В.А., 1977).

Если учесть, что госпитальная смертность в раннем периоде травмы составляет 16,3% (Дралюк М.Г. с соавт., 1993), то естественно, количество травмированных намного больше, чем получивших инвалидность.

В США встречаемость спинномозговых повреждений достигает до 1 случая на 1000 населения в год (Hulsebosch С.Е., 2002). Так, по данным Berkowitz М. et al. (1992) и Kakulas В.А. (1999) в настоящее время в США проживает около 400 000 больных с повреждениями спинного мозга и ежегодно регистрируется до 10-15 тыс. новых случаев, большая часть из которых приходится на возрастную категорию от 16 до 31 года. Затраты на лечение данной группы больных составляют 500 тыс. долл. США при параплегии и 1 млн. долл. США при тетраплегии (Stover S.L., Fine Р.В., 1987; Gutierrez P.A. etal., 1993).

Рост частоты встречаемости и экономические затраты на лечение данной категории больных подчеркивают социально-экономическую важность проблемы и обосновывают поиск новых путей лечения ТБСМ.

Эффективность многочисленных оперативных вмешательств и способов восстановления функции спинного мозга в различные периоды травматической болезни спинного мозга, несмотря на оптимистичные публикации, очень низка (Ступак В.В., 1997; Басков A.B., 1998; Щевелев И.Н. и соавт., 2000; Кельмаков В.П., 2002, 2005; Benzel Е.С., LarsoT S.J., 1986; Anderson P.A., Bohlman H.H., 1992; Vaccaro A.R. et al., 1997; Tator C.H., 2001). Об этом свидетельствует то, что почти все больные с ТБСМ от 80% до 95% остаются глубокими инвалидами, требующими постороннего ухода (Косичкин М.М., 1996, 1998, 1999; Bracken М.В., Holford T.R., 2002; Berkowitz М. et al., 1998; Gardenas D.D. et al., 2004).

Гибель клеточных и волоконных структур (нейронов и глии) в первичном очаге повреждения спинного мозга, продолжение и распространение процесса вторичного повреждения на значительное расстояние обусловливают клиническую картину травматической болезни спинного мозга (Басков A.B. и др., 2002; Beattie M.S. et al., 2000).

Перспективным направлением лечения патологии центральной нервной системы является клеточная заместительная терапия. Проводились клинические исследования по применению эмбриональных стволовых клеток при детских врожденных патологиях (Кафанова М.Ю. и соавт., 2000), ишемическом и геморрагическом инсульте (Семченко В.В. и соавт., 2004; Chen J. et al.,2001), черепно-мозговой травме (Рабинович С.С. и соавт., 1999; Савченко С.А., 2005), болезни Паркинсона (Cova L. et al., 2004).

При травме спинного мозга исследована возможность применения клеток миелиновой оболочки обонятельного тракта (Lu J., Ashwell К., 2002), олиго-дендроцитов, шванновских клеток (Bunge R.P., 2001), эмбриональных и нейральных стволовых клеток (Карпенко Д.О., 2005; Савченко С.Д., 2005; Zompa Е.А. et al., 1997; McDonald J.W. et. al., 1999). Авторы указывают, что после пересадки отмечается дифференцировка стволовых клеток в клетки нейронального и глиального ряда (Карпенко Д.О., 2005; Brazelton T.R. et al., 2000).

В экспериментальной биологии и медицине широко дискутируется вопрос полипотентности стволовых клеток костного мозга. По данным ряда авторов, их использование в раннем периоде травматической болезни спинного мозга оказывает положительное влияние на неврологическое восстановление и ги сто структуру очага повреждения (Mezey Е. et al., 2000; Hofstetter С.Р. et al., 2002; Padovan C.S. et al., 2003; Chopp M. et al., 2000; David C. et al., 2002).

Однако, возможность применения стволовых клеток костного мозга в позднем периоде травматической болезни спинного мозга, выбор вида клеток, оптимальных сроков трансплантации и их эффективность остаются не изученными, что и определило цель нашего исследования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучить влияние трансплантации стволовых клеток на восстановление спинного мозга в экспериментальной модели его повреждения и исследовать характеристики костно-мозговых клеток у пациентов позднем периоде спинальной травмы.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. На модели травматического повреждения спинного мозга изучить спонтанное восстановление двигательной активности животных и морфологическую картину зоны повреждения.

2. Исследовать на модели травматического повреждения спинного мозга восстановление двигательной его функции в зависимости от типа трансплантируемых клеток и сроков их введения.

3. В эксперименте изучить морфологическую картину зоны повреждения спинного мозга при трансплантации различных фракций стволовых клеток костного мозга в ранние (7 суток) и поздние (21 сутки) сроки.

4. Провести сравнительное исследование клеток костного мозга (стволовых кроветворных клеток, лимфоцитов) и возможность генерации мезенхимальных стволовых клеток у пациентов в позднем периоде травматической болезни спинного мозга и у здоровых доноров.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые установлено, что при экспериментальном повреждении спинного мозга трансплантация мезенхимальных стволовых клеток оказывает достоверное воздействие на восстановление неврологического дефицита. Положительная неврологическая динамика наблюдается при трансплантации мезенхимальных стволовых клеток как в ранние (на 7 сутки), так и в поздние (на 21 сутки) сроки после травмы.

Путем морфологических исследований впервые установлено, что трансплантация мезенхимальных стволовых клеток ведет к формированию нежного рубца с большим количеством сосудов в области дефекта спинного мозга. В смежных, к. области иссечения зонах спинного мозга отмечается меньшая выраженность кистозпо-дегенеративных изменений и большее количество сосудов, чем в группе контроля.

Впервые проведено сравнительное исследование клеток костного мозга (стволовые кроветворные клетки, зрелые лимфоциты и мезенхимальные клетки) больных травматической болезнь спинного мозга и здоровых доноров. Выявлено отсутствие существенных изменений костного мозга (стволовых кроветворных клеток, лимфоцитов) и возможность генерации мезепхимальных стволовых клеток клетками костного мозга у больных в позднем периоде травматической болезни спинного мозга.

Разработан «Способ лечения травматических повреждений спинного мозга» (Патент № 2286160, зарегистрирован 27.10.2006 г по заявке на изобретение № 2005107988), основанный на использовании аутологичных стволовых клеток костного мозга.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Результаты экспериментальных исследований могут стать основой для дальнейших работ по изысканию новых методов восстановления функции поврежденного спинного мозга с использованием стволовых клеток костного мозга.

Выявленное отсутствие изменений клеток костного мозга больных с травматической болезнью спинного мозга в позднем периоде, в том числе стволовых кроветворных клеток, лимфоцитов и возможность генерации мезенхимальпых стволовых клеток, позволяет применять клетки костного мозга в качестве источника стволовых клеток.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. При моделировании повреждения спинного мозга функционально значимого спонтанного восстановления двигательной активности экспериментальных животных не отмечается.

2. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга оказывают у животных положительный эффект на восстановление двигательной функции при 8 проведении трансплантации как в раннем (на 7 сутки), так и позднем (на 21 сутки) периоде повреждения спинного мозга.

3. При трансплантации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в раннем и в позднем периоде после экспериментального повреждения спинного мозга в зоне иссечения и смежной с ней областях наблюдается меньшая выраженность кистозно-дегенеративных изменений, большее количество сосудов в сравнении с животными контрольной группы.

4. Костный мозг больных с травматической болезнью спинного мозга, характеризуясь сохранным количеством стволовых кроветворных клеток, возможностью генерации мезенхимальных стволовых клеток и отсутствием изменений со стороны зрелых лимфоцитов, является полноценным источником стволовых клеток.

Основные положения работы доложены на: I Международной научно-практической конференции молодых ученых по вертебрологии и смежным дисциплинам. Новосибирск. 2005 г.; Заседании ассоциации нейрохирургов г. Новосибирска. 2005 г.; V Республиканской научно-практической конференции «Актуальные проблемы организации экстренной I медицинской помощи: малоинвазивные методы диагностики и лечения в экстренной медицине» г. Бухара. Узбекистан. 2005 г; IV съезде нейрохирургов России, 2006 г.; Заседании Ученого совета Новосибирского НИИТО. 2005 г., 2007 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе центральной печати - 1, за рубежом - 3. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа изложена па 110 страницах. Содержит 47 рисунков, 14 таблиц. Состоит из введения, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, содержащего 207 источника, из них 53 отечественных и 154 иностранных авторов.

выводы

1. Спонтанное восстановление двигательной активности крыс породы Вистар при моделировании повреждения спинного мозга на 35 сутки после травмы достигает 13,6% от нормы и является функционально неполноценным.

2. При трансплантации мезенхимальных клеток и прилипающих к пластику клеток костного мозга на плазменном сгустке достигается наибольшее восстановление двигательной активности, достигающее от 25% до 37%, (относительно животных без повреждения).

3. При трансплантации мезенхимальных клеток костного мозга на 7 сутки и 21 сутки после экспериментального повреждения к 35 суткам в зоне дефекта и смежной с ней области спинного мозга отмечается образование глиального рубца с меньшим количеством кист и большим количеством сосудов по сравнению с контрольными животными.

4. Костный мозг больных в позднем периоде травматической болезни спинного мозга характеризуется сохранным количеством стволовых кроветворных клеток, отсутствием количественных и функциональных изменений со стороны зрелых лимфоцитов и возможностью генерации мезенхимальных стволовых клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как показывают данные широкомасштабных исследований, хирургический и медикаментозный подход при остром травматическом повреждении спинного мозга ограничен фактором времени. Даже при проведении адекватной декомпрессии и стабилизации поврежденного отдела позвоночника, вопрос полного прекращения течения патологических процессов в участке повреждения спинного мозга остается проблемным (вегИаг! К.А. е1 а1., 1995; РошШ1аП V. е1 а1., 2000).

Основной точкой приложения медикаментозного лечения является острый период травмы, когда активность патофизиологических процессов высока и имеется возможность разорвать патологическую цепь. Промежуточный и поздний период ТБСМ, как ни печально практически остается прерогативой реабилитологов и невропатологов.

Поддерживающее нейротропное и реабилитационное лечение, хотя увеличивает адаптационные возможности и двигательную активность, но не оказывает существенного влияния на двигательное и чувствительное неврологическое восстановление. Присоединение или нарастание кистозной дегенерацией или атрофии спинного мозга, приводит к ухудшению и без того тяжелого состояния.

В связи с этим на современном этапе разработка новых эффективных методов лечения больных, направленных на восстановление функции травмированного мозга в позднем периоде ТБСМ, остается чрезвычайно актуальной и является одним из реальных путей улучшения качества жизни пациентов на данных этапах лечения и улучшения клинических результатов этой тяжелейшей группы больных.

В данной работе приведены результаты экспериментального исследования трансплантации СККМ в зону повреждения спинного мозга на 67 крысах породы Вистар и оценка характеристик костного мозга больных травматической болезнью спинного мозга в позднем периоде.

Нашими исследованиями показано, что при моделировании экспериментального повреждения спинного мозга с сохранением 50% ткани поперечника спинного мозга к 7 суткам с момента травмы отмечается незначительная положительная неврологическая динамика: разрешение плегии до глубокого пареза на неповрежденной стороне и сохранение отсутствия движений в конечности на стороне повреждения. Средний балл оценки двигательной активности в целом по группе составил 0,9 ± 0,24 баллов. К 35 суткам наблюдения средний балл двигательной активности по группе равен 2,85 ± 0,27 баллам, что составляет 13,6% от нормы.

Динамика моторных функций у экспериментальных животных совпадает с течением травматической болезни спинного мозга в клинике, где кроме непосредственного травматического повреждения, имеется развитие нарушения кровообращения и ишемическое повреждение сохраненных проводниковых путей и серого вещества спинного мозга и расширение их в дистальном и проксимальном направлениях.

Причиной стойкого неврологического дефицита у животных, на наш взгляд, наряду со структурными изменениями в зоне повреждения, является и формирование стереотипа нарушенной походки, так как мышечно-связочный аппарат животных в попытке компенсации «выпавших» функций приспосабливается к применению сохранившихся мышечных групп. Данный параметр не срабатывает при переносе на травматическое повреждение у человека, так как некоторые тонкие движения (кистей, стоп), некомпенсируемы и остаются на прежнем уровне. Клинические примеры показывают, что при восстановлении у больных контролируемых движений плечевого пояса (сгибание, разгибание), основные движения кистей, предплечий остаются без динамики в течение многих лет и можно сказать, не подвержены тренировке (Беляев В.И., 2001; Леонтьев М.А., 2003).

При проведении трансплантационного лечения в раннем периоде (на 7 сутки) наибольший прогресс у животных отмечается в группе пересадки мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, баллы по движению были равны 7,0±0,8. Прогресс проявляется в виде отчетливого движения во всех трех суставах задней конечности.

В группе пересадки прилипающих к пластику клеток костного мозга на плазменном сгустке средний балл по группе равнялся 5,16±1,18 и характеризовался как незначительное движение в двух суставах и выраженное движение в тазобедренном суставе.

О функционально значимых результатах в этих группах свидетельствуют и отсутствие трофических нарушений у животных.

В группах животных с пересадкой несепарирированных и прилипающих клеток костного мозга средний балл был равен 1,75±0,47 и 2,58±0,58 баллов соответственно и достоверно не отличался от контрольной группы животных (2,85 ± 0,27 баллов), что указывает на отсутствие достоверного положительного влияния на регресс неврологического дефицита данных фракций клеток.

Морфологические исследования в динамике экспериментального повреждения спинного мозга были проведены с целью выявления санационных процессов в зоне его травмы в контрольной группе животных.'

По данным Кривицкой Г.Н. (1994) основным проявлением травмы спинного мозга является его отек, который может быть острым обширным, распространенным и долго длящимся вторичным. Еще одной характерной особенностью является образование в нем кист. Микрокисты формируются уже к 6 сут после повреждения спинного мозга и заканчиваются к 2,5-3 мес. На месте ишемического некроза кистообразование затягивается на месяцы и годы, Кисты локализуются в зоне травмы, а также на 4-6 сегментов краниальнее или каудальнее, преимущественно в дорзальных отделах спинного мозга, Сообщений с центральным каналом, как правило, они не имеют.

Нами в эксперименте морфологически выявлена определенная закономерность изменений структуры области дефекта и прилежащего спинного мозга. К 35 суткам после экспериментального моделирования повреждения спинного мозга, отмечается отсутствие отека в области смежной к зоне иссечения спинного мозга, с развитием кистозной дегенерации и обеднением сосудистого рисунка, также отмечается стойкое отграничение зоны рубца и прилежащей к ней «здоровой» ткани спинного мозга.

Исходя из результатов морфологических исследований, можно сказать, что одной из основных причин неврологического дефицита при повреждении ткани спинного мозга является нарушение микроциркуляции в приграничной дефекту области спинного мозга, что ведет к нарушению поступления клеточных элементов для обеспечения процессов санации и регенерации в зоне его повреждения.

Именно гематогенные макрофаги и собственные макрофаги нервной системы, образованные из микроглиальных клеток в зоне повреждения спинного мозга участвуют в удалении миелинового детрита и ускоряют процессы санации и регенерации в участке повреждения (Fenrich К., Gordon Т., 2004).

По клиническим данным Miklossy J. (1991), Buss А. (2004) иммуно-гистохимическая реакция на миелиновый белок постепенно сохраняется и постепенно снижается в течение многих лет. Через несколько месяцев после травмы в зоне повреждения выявляется миелиновый детрит и даже кольцевидные тени. К трем годам, в кортикоспинальном тракте, выявляются участки с наличием миелиновых белков. Только через 8 лет отмечалось полное исчезновение миелина с дегенерировавших участков спинного мозга. Данный фактор является источником тормозящим регенерацию поврежденных и функционирование сохраненных аксонов спинного мозга, в результате воздействия продуктов распада NOGO, MAG (миелин ассоциированный гликопротеин).

Малашхия Ю.А. (1986), в спинномозговой жидкости обнаружены коммитированные кроветворные клетки предшественники, которые явлются источниками толерантных к антигенам нервных ткани лимфоцитов и их субпопуляций, а также источниками мононуклеарных клеток в ЦНС. На основании этих данных можно предположить, что они мигрируют в ткань ЦНС и участвуют в осуществлении иммунитета и регенерации в норме и при патологических состояниях.

Исходя из вышеуказанных литературных данных и результатов собственных морфологических исследований, указывающих на то, что применение мезенхимальных стволовых клеток костного мозга приводит к увеличению количества сосудов и уменьшению количества кист в участке повреждения спинного мозга, нами предположен возможный вариант их воздействия в участке повреждения спинного мозга. Он заключается в активной санации клеточными факторами иммунитета участка повреждения спинного мозга от миелинового детрита, уменьшая, таким образом, выраженность воздействия факторов, тормозящих регенерацию поврежденных и функционирование сохранившихся аксонов в участке повреждения.

При трансплантации различных фракций стволовых клеток наиболее выраженный протекторный эффект (при введении на 7 сутки после травмы) и восстанавливающий эффект (при введении на 21 сутки) отмечается со стороны мезенхимальных стволовых клеток. Об этом свидетельствует то, что при проведении трансплантационного лечения морфологически в группе животных отмечается снижение выраженности дистрофических изменений в зоне дефекта и приграничной к дефекту области спинного мозга.

Наши данные коррелируют с результатами экспериментальных исследований Bossolasco P., Cova L., Calzarossa С., et al., (2004), которые изучили потенциал нейрогенной дифференциации различных фракций костного мозга in vitro и указали ее наибольшую выраженность в группе с введением мезенхимальных стволовых клеток.

Отсутствие улучшения в неврологической и морфологической картине у экспериментальных животных при введении других видов стволовых клеток, вероятнее всего, связано с наличием на мембране несепарированных и прилипающих к пластику клеток антигенов гистосовместимости, которые привели к иммунной реакции против них.

Для определения возможности применения в клинической практике нами изучены свойства клеток костного мозга у больных с ТБСМ в позднем периоде, которые остаются во многом неисследованными. Нами исследованы фенотипические и функциональные характеристики стволовых клеток и лимфоцитов костного мозга у больных со спинальной травмой в позднем периоде заболевания,

При оценке функциональной полноценности стволовых клеток костного мозга у больных с травматической болезнью спинного мозга в позднем периоде, выявлено, что количество МНК, выделенных из аспирата костного мозга, в целом по группе имело тенденцию к повышению, а у пациентов с грудным уровнем повреждения было достоверно увеличено. Относительное содержание СВ34+ клеток у больных было сходным с таковым у здоровых доноров, У больных со спинальной травмой отмечается увеличение в костном мозге количества СБ34' клеток и увеличение среди них относительного содержания С034+С038~ стволовых кроветворных клеток и увеличение доли пролиферирующих клеток.

Таким образом, сохранное количество стволовых кроветворных клеток, неизмененной их структура и функция зрелых лимфоцитов и возможности генерации МСК определяет возможность применения стволовых кроветворных клеток в клеточной терапии.