Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Сравнительная морфофункциональная характеристика остеоиндуктивных свойств костного матрикса при различных методах стерилизации и консервации

ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

им. М. ГЕРАЦИ

На правах рукописи

САРКИСЯН АИДА МИХАЙЛОВНА

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЛЮРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОСТЕОИНДУКТИВНЫХ СВОЙСТВ КОСТНОГО МАТРИКСА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДАХ СТЕРИЛИЗАЦИИ И КОНСЕРВАЦИИ

14.00.16—патофизиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван — 1991

Работа выполнена в Ереванском научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии им. профессора X. А. Петросяна МЗ Республики Армения.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор А. В. Азнаурян доктор медицинских наук, профессор Л. И. Костандян

Каучный консультант:

Заслуженный деятель науки Республики Армения, доктор медицинских наук, профессор С. А. Хачатрян

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, прсфессср К. А. Дживанян доктор медицинских наук, профессор А. А. Енгибарян

Ведущая организация: Ереванский Государственный институт усовершенствования врачей.

Защита диссертации состоится „ " 1991 г,

>д ос а /

в —" часов на заседании специализированного совета

К 075.03.03 Ереванского Государственного медицинского института им. М. Гераци по адресу: 375025, Ереван, ул. Корюна, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЕрГМИ Автореферат разослан —« -1991 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, I/-

кандидат медицинских наук Д^ А. А. КазарЯН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Разработка методов стимуляции костной регенерации является слояной проблемой. Как известно, нарушения, приводящие к возникновению патологических состояний, при которых невозможна спонтанная регенерация, вызываются причинами как местного, так и общего характера. Осуществление нормального репаративного процесса без дополнительных источников реагирующих клеток или стимуляции остеогенеза становится невозможным. Определенные успехи в решении этой проблемы получены при местном воздействии на репаративную регенерацию с помощью костной аллопластики. Однако анализ результатов по применению различных видов трансплантатов для стимуляции остеогенеза показал, что практически не всегда удается позитивно воздействовать на реализацию регенерационных потенций костной ткани и получить положительные результаты с точки зрения полного восстановления целостности кости (длительная неравномерная резорбция, несинхронный остеогенез и др.). Развитие науки в этом направлении привело к интенсификации как теоретических, так и практических разработок по применению в качестве пластического материала для стимуляции остеогенеза деминерализованных костных трансплантатов, называемых костным матриксом (КМ) (Ханин и соавт., 1976; Савельев и соавт., 1982; Urist, 1965, 1970; Koskinen, 1972; Linden, 1975; Anastassiades, 1978; Sampath, Beddi, 1981; Haratas, 1984; Sato a.ürist, 1985). Последнее связано с открытием явления остеоиндукции, объясняемого рядом авторов наличием в КМ по крайней мере трех факторов, индуцирующих косте-образование: костного морфогенетического белка (КМБ), под воздействием которого происходит направленная дифференциация ме-зенхимальных клеток в хрящевые и костные, остеогеяина и индуктора хрящеобразования (Hananura, 1980; Mizutani a.ürist, 1982; Price е.а., 1983; Urist е.а., 1984; Oanalis, 1985; Muthukumaran, 1988; Urist, 1989).

В настоящее время изучаемый вопрос включает несколько направлений. Одно из них, расширившееся за последние годы,- раз* х Усиления ж " работка проблёш остеоиндуктивной активности КМ путем изыскания эффективных методов его получения, позволяющих сохранить высокий уровень стимулирующего эффекта самого индуктора' - КМБ

и всех активных компонентов КМ. В этом направлении достигнуты определенные успехи. Однако нельзя утверждать, что арсенал имеющихся методов обеспечивает условия для максимальной реализации возможностей индуктивного начала. Поэтому разработка новых, наиболее эффективных методов получения костно-пластического материала, стимулирующего остеогенез в оптимальном варианте, представляет большой научно-практический интерес. Кроме того, в доступной нам литературе мы не встретили работ, касающихся изучения остеоиндуктивных свойств КМ в процессе длительного хранения. Не указаны максимальные сроки консервирования КМ, что также является актуальной и перспективной проблемой с точки зрения дальнейшего совершенствования способов стерилизации и хранения костно-пластического материала.

Цель исследования. Разработать эффективные способы стерилизации и консервации КМ. Обосновать оптимальные варианты их сочетания с целью дальнейшего клинического применения.

Задачи исследования. I. Изучить действие слабых растворов формалина (0,5$), муравьиной кислоты (0,5$) с пергидролем (1%), нашатырного спирта (0,25$) на индуктивную активность КМ.

2. Изучить действие различных температурных режимов (-12°С, -55~60°С) и лиофилизации на индуктивную активность КМ.

3. Изучить морфологическую перестройку имплантатов КМ, стерилизованных и консервированных указанными методами в динамике после пересадки.

4. Изучить минеральный обмен в имплантатах КМ после пересадки.

5. Провести сравнительный анализ ряда параметров количественной оценки (сухого веса, зольных остатков).

6. Изучить иммунологические реакции организма реципиента на пересадку КМ, стерилизованного и консервированного различными методами.

7. Изучить влияние длительной консервации при различных режимах на индуктивные свойства КМ и установить максимальные сроки его хранения.

Научная новизна. Проведенные исследования позволили разработать эффективные и доступные способы стерилизации и консерва-

цш Ш. Впервые доказана возможность и целесообразность использования слабых растворов нашатырного спирта, как стерилизующего агента для КМ. Изучено действие слабых растворов пергидроля с муравьиной кислотой на индуктивную активность КМ. Доказано, что имплантаты ГОЛ, стерилизованные слабыми растворами указанных веществ, не оказывают токсического влияния на организм реципиента, а иммунные реакции слабо выражены и не пролонгированы. Впервые дана сравнительная оценка процессов, происходящих в имплантатах КМ, стерилизованных и консервированных предлагаемыми методами в различных вариантах после пересадки. Исследования показали, что сочетание стерилизации КМ 0,25$ раствором нашатырного спирта с последующим замораживанием при температуре -12°С в бытовом холодильнике или лиофилизацией является наиболее оптимальным вариантом. В данном случае имплантаты ИЛ обладают лучшим остеоиндуктивным эффектом. Доказана возможность длительной консервации МЛ при температуре -12°С в бытовом холодильнике. Впервые в динамике изучены остеоиндуктивные свойства КМ в процессе длительного консервирования предлагаемыми методами. При продолжительном хранении наилучшую сохранность КМ дает замораживание при температуре ~12°С и лиофилизацкя после предварительной стерилизации слабыми растворами нашатырного спирта. Установлено, что ЮЛ, стерилизованный и консервированный предлагаемыми методами, сохраняет высокий уровень индуктивной активности до четырех лет хранения.

Практическая значимость. В результаты выполнения работы разработаны и внедрены в клиническую практику эффективные и доступные способы получения КМ, что позволило улучшить результаты лечения больных с различной костной патологией. Установлена возможность длительного хранения (до четырех лет) КМ при -12°С в бытовом холодильнике и лиофилизированного, что расширяет возможности обеспечения клиник деминерализованными костными трансплантатами с сохранением высокой остеоиндуктивной активности.

Апробация работы. Об основных положениях работы доложено: на Ш Республиканской научной конференции молодых ученых травматологов-ортопедов Армении, посвященной 60-летгоо образования СССР (Ереван, 1982), на У съезде травматологов-ортопедов республик Закавказья (Ереван, 1984), на заседании Общества анато-

мов, гистологов, эмбриологов Армении (Ереван, 1986), на I симпозиуме по итогам научного сотрудничества ЕрНИИТО и КНИИТО по проблеме "Экспзриментально-клиническое обоснование применения аллогенного костного матрикса в ортопедии и травматологии" (Киев, 1988). Апробация диссертационной работы проведена на заседании Общества анатомов, гистологов, эмбриологов Армении от 24.05.1988 г. (протокол № 4) и заседании Ученого совета ЕрНИИТО от I.12.1988 (протокол й II).

Материалы диссертационной работы опубликованы в 10 работах, из коих 2 методические рекомендации.

Реализация результатов исследования. Новые способы заготовки деминерализованных костных трансплантатов внедрены в лаборатории консервации тканей Ереванского НИИ травматологии и ортопедии им.проф.Х.А.Петросяна. Заготовленные разработанными методами трансплантаты внедрены в отделениях ЕрНИИТО, Республиканской клинической консультационной больнице, клинической больнице № 6, клинической больнице Л 8, детской клинической больнице № 3, институте рентгено-радиологин и онкологии, Эч-миадзинской больнице, Дилтсанской НРБ, Абовянской больнице, Чаренцаванской ЦРБ, Арташатской больнице, Масисской больнице Минздрава Армении.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на /V3 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, изложения результатов исследований по 9 сериям, заключения, выводов и списка литературы, включающего /Г/ отечественных и ЮЧ иностранных авторов. Работа иллюстрирована 36 микрофотографиями и 31 таблицей.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Материалы и методы исследований

1Л. Постановка_экспе]зимента

Опыты проводились на 920 половозрелых крысах линии "Вистар" средней массой 150 г. Животные содержались в условиях вивария на стандартном пищевом рационе. Эксперименты проводились на единой экспериментальной модели - эктопической имплантации в мышцы передней брюшной стенки. Операцию проводили под эфирным

наркозом. Объектом изучения являлся КМ, заготовленный при различных методах стерилизации и консервации. Подготовленные фрагменты КМ промывали стерильным физиологическим раствором, разрезали на продольные кусочки весом 20-25 мг и имплантировали крысам-реципиентам. Операционное поле обрабатывали раствором йода. Рану ушивали шелком.

ймю проведено 9 серий экспериментов:

- в I серии КМ заготавливался в стерильных условиях и подвергался замораживанию при -12°С;

- во П серии КМ замораживался при -12°С после стерилизации 0,25$ раствором нашатырного спирта;

- в Ш серии КМ замораживался при -12°С после стерилизации 0,5$ раствором муравьиной кислоты с 1$ раствором пергидроля;

- в 1У серии КМ замораживался при -55-60°С после стерилизации 0,5$ раствором муравьиной кислоты с 1$ раствором пергидроля с последующим хранением при -40°С;

- в У серии КМ стерилизовался и консервировался в 0,5$ растворе формалина;

- в УТ серии КМ подвергался лиофилизации после стерилизации 0,5$ раствором муравьиной кислоты с 1$ раствором пергидроля;

- в УП серии КМ подвергался лиофилизации после.стерилизации 0,25$ раствором нашатырного спирта;

- в УШ серии КМ подвергался длительной консервации при -12°С

в течение 2, 3 и 4 лет после стерилизации 0,25$ раствором нашатырного спирта;

- в IX серии КМ лиофилизировался после стерилизации 0,25$ раствором нашатырного спирта и подвергался длительному хранению

в течение I, 2, 3 и 4 лет. 1.2. Мето2ика_заготовки_костного матрикса В качестве донорского материала использовались бедренные кости крыс, которые забирались сразу после декапитацта (под эфирным наркозом). Изъятые кости очищались от мягких тканей, надкостницы, костного мозга и помещались в эфир для обезжиривания с последующей выдержкой в течение 2 часов. Затем подвергались деминерализации в 0,6 Н растворе соляной кислоты при температуре 0+4°С в бытовом холодильнике. Контроль за деминерализацией проводился органолептически, с помощью гистохими-

ческой реакции на кальций по Косса и методом сжигания. Полная деминерализация происходила в течение 2 суток. Затем полученные деминерализованные тразсплантаты многократно отмывались от кислоты физиологическим раствором хлорида натрия до установления рН в пределах 6-6,5 и подвергались стерилизации в течение 30 минут соответствующими растворами. После этого они промывались стерильным физиологическим раствором с добавлением антибиотиков из расчета I млн.ед. на I л, расфасовывались в стерильные флаконы и подвергались консервации. В серии с формали-низированным ЕМ полученные деминерализованные трансплантаты промывали 0,5$ раствором забуференного формалина (рН=7,0) и затем помещали в такой же раствор формалина для консервации.

1.3. Мето,2ы_исследования

Анализ полученных данных проводился гистологическими, гистохимическими, количественными, биохимическими и иммунологическими штодами. Тестировка проводилась на 7, 14, 21, 30, 60 и 90 сутки. Забой животных производился под эфирным наркозом,. Изъятые тканевые блоки подвергались фиксации в 10% растворе формалина или Карнуа, декальцинировались в 5% растворе три-хлоруксусной кислоты при температуре 0+4°С и после проводки заливались в парафин. Срезы толщиной 7-10 мк окрашивали гематоксилин-эозином и пикрофуксином по ван Гизону. Для выявления гликогена и нейтральных гликозаминогликанов проводили 111ИК-реакцию с использованием для ферментативного контроля амилазы. Кислые гликозоаминогликаны окрашивали толуидиновым синим. В криостатных срезах определялась щелочная фосфатаза (!Щ>) по методу Гомори, сукцинат- и лактатдегддрогеназы (ЛДГ, СДГ) - по методу Нахласа. Кроме того, были проведены количественные исследования показателей сухого веса имплантатов, зольных остатков, содержания кальция и некоторых микроэлементов, таких как магний, медь, железо. Озоление образцов производилось в муфельной печи при температуре 800°С в течение I часа. Кальций и микроэлементы в образцах золы изучались методом атомной абсорбционной спектрофотометрии на аппарате адб-1 (ГДР). В динамике у ряда животных исследовались некоторые биохимические показатели в сыворотке крови: сиаловые кислоты - по Гессу, активность'!® и неорганический фосфор - по Гомори и Боданскому,

кальций и магний с помощью диагностических чехословацких наборов фирмы "Лахема". Иммунологическая активность КМ определялась при сравнении уровней Т-лимфоцитов (Т-РОК) по методике йопйа1 е.а. (1972), В-ЛИМфоЦИТОВ (В-РОК) -ПО Мепаев (1973), показателя повреждения нейтрофилов (ППН) по методу Фрадкина (1975) и реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТ) по методу Нип§ег£огй (1965).

Статистическая обработка проводилась по методу Стъюдента-Фишера с помощью ЭШ-1022.

2. Результата исследований

2.1. 0стеогау1£кт1шше_свойства задало тонного при -12°С

В данной серии экспериментов, где ИЛ не подвергался воздействию каких-либо стерилизующих веществ, перестройка импланта-тов характеризуется быстрым течением и гшолным замещением новообразованной костной тканью. Резорбция шгглантатов происходит синхронно с замещением без выраженного хондрогенеза. Индукционный остеогенез протекает преимущественно по пути образования грубоволокнистой кости, первые очаги которой появляются уже на 7 сутки. В дальнейшем участки грубоволокнистой кости сливаются с образованием обширных полей и последующей их остеониза-цией. Полный остеогенез завершается в исследуемые сроки с образованием пластинчатой кости и сформированным костномозговым каналом, что говорит о наличии полноценного остеогенеза.

Количественные исследования подтверждают данные морфологических исследований и свидетельствует об интенсивности и равномерности остеогенеза. На 14-е сутки после имплантации очевиден неоостеогенез, который выракается в заметном содержании золы, резко возраставшей на 21 и 30 сутки (табл.1). Это подтверждается накоплением и нарастанием на эти сроки кальция и некоторых специфических для костной ткани микроэлементов, таких как магний, медь и железо, которые играют исключительно важное значение в процессе дифференцировки новообразованной костной ткани (Касавина, Торбенко, 1975). Исследования показали, что накопление кальция и микроэлементов связано с функциональной активностью остеогенных клеточных элементов и соответствует характеру происходящих в данный период морфологических процессов. Содержание кальция достигает максимального зна-

Таблица I

Сравнительная динамика нарастания зольных остатков имплан-татах КМ, заготовленных различными методами (мг/ЮО мг сухого веса

Серии Сроки наблвдений (в сутках) . экспе- _

римен-тов " 14 21 30 60 90

I 2,5*0,6 11,3*1,4 21,8*2,4 23,7*2,0 29,3*1,2

1,0*4,0 8,1*14,5 16,4*27,2 19,2*28,2 26,6*32,0

2 1,4*0,1 8,6*1,2 19,4*3,4 27,0*2,1 29,1*3,7

1,2*1,67 5,9*11,3 11,7*27,1 22,3*31,7 20,7*37,5

3 0,9*0,2 7,2*0,9 10,9*1,6 20,6*2,7 29,5*1,0

0,24-1,6 5,2*9,2 7,3*14,5 14,5*26,7 27,2*31,8

4 - 1,1*0,3 8,1*1,5 19,4*3,4 23,6*2,1

0,4*1,8 4,7*11,5 11,7*27,1 18,8*28,4

5 — 0,5*0,1 1,6*0,4 4,3*0,7 13,7*2,7

0,3*0,7 0,7*2,5 2,7*5,9 7,6*19,?

6 4,9*0,5 11,7*1,6 19,5*1,0 22,7*1,8 29,4*1,8

3,8*6,0 8,1*15,3 17,2*21,8 18,6*26,8 25,3*33,5

7 8,7*1,9 20,7*2,2 23,6*0,7 30,3*2,4

4,4*13,0 15,7*25,7 22,0*25,2 24,9*35.7 37,6*48,0

чения на 30 сутки, превышая контрольные показатели и соответствуя данным морфологических исследований, когда наблюдается образование большого количества коллагеновых волокон и молодой остеоидной ткани, активной пролиферацией клеточных элементов. Максимальное содержание магния соответствует 21 суткам, что связано с интенсификацией окислительно-восстановительных процессов, о чем свидетельствует активное накопление ЛИГ и СДГ в имплантатах на этот период. Показатели меди и железа высокие на 30 сутки, однако накопление железа на ранние сроки постим-платационного периода превышает контрольные показатели, что в определенной степени является показателем степени васкуляриза-

ции имплантата (Скоблин, Белоус, 1968). На 90 сутки содержание кальция и микроэлементов снижается до нормального уровня, что соответствует морфологическим данным образования дифференцированной костной ткани.

Результаты иммунологических исследований показали незначительные сдвиги в постимплантацнонном периоде, которые выражаются в усилении ППН, РБТ и уровня Т-РОК на ранние сроки исследований.

Биохимические исследования установили высокий уровень ЩФ и сиаловых кислот также на ранних сроках исследований, что соответствует активным процессам резорбции и замещения импланта-тов остеобластической тканью. На эти же сроки отмечается и повышение кальция в сыворотке крови, уровень которого изменяется синхронно с повышением сиаловых кислот и ЩФ, что подтверждает наличие интенсивного остеогенетического процесса.

2.2. 0стеоинд2ктивще_свойства замороженного при -12°С, стерилизованного_0д2£^?ас^^

В данной серии морфологическая картина перестройки КМ, в основном, аналогична предыдущей. Интенсивность остеогенеза высокая. Остеогеяез наблюдается во всех случаях и в большом объеме. Перестройка имплантатов характеризуется быстрым течением. Резорбция протекает синхронно с замещением при быстром врастании кровеносных сосудов без выраженного хондрогенеза. Полный остеогенез завершается в исследуемые сроки с образованием пластинчатой кости с геиопоэзом. Количественные исследования также свидетельствуют о равномерности и интенсивности остеогенеза. Нарастание сухого веса, зольных остатков, накопление кальция и микроэлементов адекватно" дифференцировочным процессам и организации костного регенерата. Максимальное накопление кальция и микроэлементов наблюдается на 30 сутки, т.е. в тот период, когда в имплантатах отмечается пиковое развитие остеогенетичес-ких процессов. Наличие полноценного остеогенеза подтверждается данными биохимических исследований, которые показали некоторое повышение уровня ЩФ и сиаловых кислот на ранних стадиях индукционного остеогенеза, соответствуя активным процессам резорбции и замещения новообразованной костной тканью. Изменения иммунологических показателей характеризуются теми же закономерностями

- 10 -

и интенсивностью, что и в предыдущей серии экспериментов.

2.3. 0стеоинд2кттаные_свойства замороженного при -12°С, стерилизованного_0л5^ раствором муравьиной_кислоты_с_1^ раствором пергидроля

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что в данной серии КМ вызывает индукцию остеогенеза, который характеризуется теми же закономерностями и завершается формированием органотипической кости с гемопоэзом. Однако, несмотря на общие закономерности, отличается по характеру, скорости резорбции и замещения, интенсивности заместительного остеогенеза.

Использование оптимальных концентраций муравьиной кислоты с пергидролем, т.е. наименьших концентраций, обеспечивающих стерилизующий эффект, с целью снижения повреждающего действия на структуру КМ, обеспечило удовлетворительные результаты. Не отмечено определенных особенностей постимплантационного периода, за исключением того, что на ранних сроках наблюдаются некоторые различия в характере остеогенетических процессов, выражающиеся в более медленной резорбции и замещении. Большее развитие по сравнению с предыдущими сериями получает хондрогенез. В дальнейшем наблюдаемая разница в организации костных регенератов постепенно выравнивается и на более поздние сроки (6090 сутки) сформирована пластинчатая кость с гемопоэзом, однако в центральных участках сохраняются очаги нерезорбированного КМ, где продолжаются процессы перестройки. Анализ количественных показателей выявил некоторые колебания в нарастании сухого веса имплантатов на 30-90 сутки, что, очевидно, связано с дальнейшей дифференцировкой новообразованной костной ткани, формированием новых полостей резорбции и сосудистых каналов. Содержание золы во все исследуемые сроки нарастает, однако на 14-30 сутки показания зольных остатков на 100 мг сухого веса ниже, а на 6090 сутки соответствуют предыдущим сериям. Следует отметить,что показатели кальция и микроэлементов, достигая максимального значения к 30 суткам, не превышают данных, характерных для ин-тактной кости.

Биохимические исследования показали, что на протяжении всей динамики уровень сиаловых кислот изменяется незначительно. Показания ЩФ сохраняются высокими до 21 суток, коррелир7я с ак-

тивизацией клеточных элементов типа фибробластов и остеобластов, накоплением нейтральных и кислых гликозоаминогликанов, гликогена, подъема активности ферментов. Содержание кальция, фосфора неорганического и магния наиболее высокие на 14 сутки, что свидетельствует о мобилизации этих минеральных компонентов в период активной перестройки КМ.

2.4. Остеоинд£ктивные_свойства заложенного при -55--60°С с последующим ранением при -40°С

Изучение влияния более низких температурных режимов (-55--60°С) на индуктивную активность ЮЛ выявило их отрицательное воздействие на реализацию стимулирующего эффекта индуктора остеогенеза. Остеоиндуктивные свойства не теряются, но ослабевают в довольно значительном объеме, в связи с чем пролонгируются сроки гистогенеза и дифференцировки новообразованной костной ткани. Особенно характерна замедленная и менее выраженная резорбция. В значительно большем объеме происходит хон-дрогенез, а, следовательно, и энхондральный остеогенез, что приводит к более длительным срокам перестройки. Отмечается полиморфизм процесса и в исследуемые сроки не происходит полной трансформации имплантатов, а новообразованная кость менее организована .

Анализ количественных данных показал, что гистогенез и диф-ференцировка новообразованной костной ткани отличаются от предыдущих серий, что отчетливо проявляется при сопоставлении показателей зольных остатков на 21-30 сутки, подтверждающих тот факт, что процессы резорбции и замещения идут намного медленнее. Хотя на 60 и 90 сутки содержание золы возрастает, эти показатели ниже, чем в предыдущих сериях. Накопление кальция и микроэлементов отстает по срокам, пиковое нарастание их наблюдается к 60 суткам, что также подтверждает наличие слабо выраженного и пролонгированного остеогенеза. Биохимические исследования показали, что на протяжении всей динамики отмечаются некоторые колебания в содержании сиаловых кислот и ЩФ, показания которых являются информативной оценкой стадии резорбции и замещения в процессе остеогенеза. Повышение их уровня свидетельствует о выраженной остеобластической реакции. Колебания в содержании сиаловых кислот и Щф свидетельствуют о том, что

остеогенез в данной серии протекает неравномерно, стадийно. Это подтверждается и снижением неорганического фосфора на 30 сутки.

Анализ иммунологических исследований показал, что эктопическая имплантация КМ в данной серии вызывает более выраженную реакцию организма. Если в предыдущих сериях чувствительность лимфоцитов к трансформирующему действию фитогемагглютинина (ФГА) не превышала контрольные показатели, то в данной серии отмечается выраженная тенденция интенсификации процесса на 21 сутки. Отличается также и динамика Т- и В-лимфоцитов. Уровень Т-РОК и В-РОК остается высоким до 21 суток.

2.5. 0стео1щщктивные_свойства КМ„_ стермизованного_к_кон-седвированного_в_0А5^ £аство£е_формалина

Иначе протекает постимплантационный период в имплантатах формалинизированного КМ. Резорбция замедлена, слабо выражена. Имплантаты медленнее васкуляризуются и.перестраиваются. Вплоть до месячного срока сохраняется лимфоидная инфильтрация, накопление гигантских клеток инородных тел и эозинофильных лейкоцитов. В целом индукционный остеогенез отличается относительной полиморфностью процесса. К концу эксперимента часть имплантата представлена пластинчатой костью, однако имеются нерезервированные участки КМ, множественные очаги грубоволокнистой кости, в которых продолжаются процессы перестройки. Замедленная трансформация формалинизированных имплантатов КМ очевидна и по количественным показателям. Значения зольных остатков намного ниже предыдущих серий на соответствующие сроки исследований. Уровень •кальция во все исследуемые сроки ниже контрольных показателей, а содержание микроэлементов до конца эксперимента превышает норму, что подтверждает наличие продолжающегося процесса перестройки. Биохимические исследования показали, что на протяжении всей динамики отмечаются колебания в1 содержании сиаловых кислот и ЩФ. Максимальное повышение ЩФ отмечается к 30 суткам, когда в имплантатах наблюдается появление новых очагов скоплений ме-зенхимоподобных клеток и выражена остеобластическая реакция. Изучение особенностей иммунологических реакций организма показало, что имплантация формалинизированного КМ вызывает более выраженные и пролонгированные иммунологические сдвиги в пост-имплантационном периоде, что связано с цитотоксическим и де-

натурируюцим воздействием формальдегида на ткани и согласуется с данными ряда исследований (Фейгельман, 1975, i960; Савельев с соавт., 1981, 1983). Начиная с 7 суток отмечается резкое повышение реакции ППН, которая остается высокой вплоть до 30 суток исследований. Уровень Т-РОК высокий до 60 суток. Максимальное повышение B-РОК отмечается на 21-30 сутки. РБТ лимфоцитов интенсифицируется с 14-х суток и продолжает возрастать на последующие сроки, однако на 60 сутки наблюдается снижение чувствительности лимфоцитов к действию ФГА.

Таким образом, консервация КМ в слабых растворах формалина значительно снижает стимулирующий эффект, в связи с чем замедляется трансформация- имплантатов в новую кость. Проявление остеоиндуктивных свойств в формалинизированном КМ не в полной мере, очевидно, связано со свойством формальдегида при взаимодействии с белками связывать их в крупные нерастворимые комплексы, что затрудняет контакт соединительных клеток с индуктором, чем можно объяснить пролонгацию остеогенеза во времени (Ханш и соавт., 1978).

2.6. Остеошрщ^тивные^войства, лиофтаизированното_КМ,„стерилизованного 0,5^_раствором_м2равьшой кислоты с ^_раствором перпрроля

Результаты проведенных исследований показали преимущество лиофилизированного КМ. Характерной особенностью остеогенеза в данной серии является высокая интенсивность процесса, приводящая к формированию участков грубоволокнистой кости уже на 7 сутки. Имплантаты замещаются равномерно, синхронно с резорбцией, что приводит к формированию костномозгового канала к 30 суткам и более быстрому ремоделированию грубоволокнистой кости с образованием пластинчатой. Более ранняя перестройка имплантатов очевидна и по количественным показателям. Содержание зольных остатков на 100 мг сухого веса намного превышает значения всех предыдущих серий, особенно на ранние сроки исследований. Аналогичную динамику имеют нарастание кальция и микроэлементов, четко отражающие процессы перестройки, происходящие в имплантатах и позволяющие объективно подходить к выбору наиболее эффективных методов их получения. Незначительные иммунологические сдвиги в постимплантационном периоде и равномерное

повышение биохимических показателей на .ранних сроках подтверждают наличие полноценного остеогенеза.

2.7. 0стеошд2кттаные_свойства лиофилиз^ованного_КМ^стерилизованного 0,25| раствором нашатырного спирта

Наиболее оптимально остеогенез протекает в имплантатах лио-филизированного КМ, после стерилизации 0,25% раствором нашатырного спирта. Значительно интенсифицируется стимулирующий эффект, ускоряется трансформация имплантатов в новую кость. Это подтверждается накоплением в имплантатах КМ зольных остатков с адекватным содержанием кальция и микроэлементов. Содержание золы на 60 сутки соответствует уровню такового на 90 сутки в имплантатах предыдущей серии, а к концу эксперимента эти показатели превышают их содержанке почти в 1,5 раза.

2.8. Остеоинд£ктивные_свойства М_Б_Рб32;льтате длительного 2д)анента_при_тешературе_-12°Са после стерилизации_0^25^_раст-вором нашатырного спирта

При продолжительном хранении КМ в бытовом холодильнике при -12°С в течение одного года остеоиндуктивные свойства не ослабевают, о чем свидетельствуют данные морфологических и количественных исследований. Содержание зольных остатков в исследуемые сроки соответствует значениям контрольных показателей (табл.2). Не отмечено существенных различий в характере пост-имплантационного периода на второй год хранения. Процессы дифференцировки заканчиваются образованием пластинчатой кости с гемопоэзом. На третий и четвертый год хранения остеоиндуктивные свойства снижаются, однако незначительно, что подтверждается количественными показателями результатов экспериментов и доказывает положительное влияние хранения при -12°С в течение длительного времени на индуктивную активность КМ.

2.9. 0стеощп2кт1ганые_свойства лиофилизированного_Щ,„стерилизованного 0,252 раствором нашатырного спирта_в_р£зультате длительного хранения

На основании сравнительного анализа морфологических и количественных исследований можно судить об идентичности процессов заместительного остеогенеза при имплантации лиофилизированного КМ, хранившегося в течение одного тода, с контрольными показателями (табл.3). Перестройка по всем параметрам аналогична

Таблица 2

Показатели сухого веса и содержания зольных остатков в имплантатах КМ при продолжительном хранении при -12°С

Сроки Сроки наблюдений (в днях)

коне ер- --

вации 30 90

сухой вес в % зола, мг/100 мг сух.веса сухой вес, в % зола, мг/100 мг сух.веса

I год 38,1*2,3 19,51*1,0 45,2*5,3 28,4*1,8

32,8+43,4 17,2*21,8 33,0*57,4 23,3*33,5

2 года 34,6*2,7 18,7*2,2 44,2*3,4 24,6*0,7

28,4*40,8 15,7*25,7 35,7*52,7 22,0*27,2

3 года 36,0*1,7 14,8*1,9 47,3*2,6 22,7*1,8

32,0*40,0 10,5*19,1 41,2*53,4 18,6*26,8

4 года 37,0*2,7 13,7*2,7 43,3*1,2 20,6*2,7

30,1*43,9 7,6*19,8 40,5*46,1 14,5*26,7

контроль 34,5*2,38 19,4*3,4 44,2*3,7 29,1*3,7 .

29,0*40,0 11,7*27,1 35,75*52,65 20,7*37,5

контрольной серии. Без выраженных изменений сохраняется остео-индуктивная активность ИЛ через два года хранения. На третий и четвертый год незначительное ослабление индуктивной активности КМ очевидно по снижению интенсивности резорбции и васкуля-ризации на ранних сроках исследований. Однако к 30 суткам отмечается активизация клеточных элементов и перестройки имплан-татов с дальнейшей дифференцировкой в новообразованную пластинчатую кость с гемопоэзом.

Таким образом, на основании совокупности методов исследования, даших определенную информацию о течении постимплантацион-ного периода в имплантатах костного матрикса, заготовленных различными способами, создалась объективная оценка, служащая общим критерием. Это позволило разработать наиболее эффективные способы стерилизации и консервации, наиболее бптимальные варианты их сочетания и возможность выбора метода с целью длительного консервирования и успешного применения в клинике.

Таблица 3

Показатели сухого веса и содержания зольных остатков в имплантатах лиофилизированного КМ при продолжительном

хранении

Сроки консервации Сроки наблюдений (в днях)

30 90

сухой вес в % зола, мг/100 мг сух.веса сухой вес в % зола, мг/100 мг сух.веса

I год 36,6*4,6 23,6*2,1 35,6*4,6 40,2*3,4

25,0*48,2 18,8*28,4 25,0*46,2 35,7*44,7

2 года 43,5*2,4 20,7*2,2 43,3*1,2 37,8*2,6

38,08-49,0 15,7*25,7 40,5+46,1 30,5*45,1

3 года 35,8*1,5 17,8*1,9 35,3*1,2 31,4*1,9

32,3*39,3 12,5*23,1 32,5*38,1 24,3*38,5

4 года 37,8*2,3 14,5*3,0 43,0*3,6 29,3*1,2

33,6*42,0 7,7*21,3 34,7*51,3 26,6*32,0

контроль 33,2*2,1 23,6*0,7 38,2*2,3 ' 42,8*2,3

28,3*38,1 22,0*25,2 32,8*43,4 37,6*48,0

вывода

1. Решающим фактором, определяющим степень остеоиндуктивной активности КМ, является выбор стерилизующего агента и метода консервации.

2. Наиболее оптимальными методами консервации КМ, способствующими совершенному и активному остеогенезу с адекватной динамикой минеральных компонентов и микроэлементов является лио-филизация и консервация при температуре -12°С.

3. Замораживание КМ-при температуре -55-60°С с последующ™ хранением при -40°С приводит к более медленной и поздней перестройке трансплантатов и образованию новой костной ткани.

4. Консервация КМ 0,5^ раствором формалина приводит к снижению индуктивной активности. Перестройка КМ длительна во времени, менее интенсивна, а новообразованная кость .меньше по

объему и менее организована. Остеоиндуктивные свойства форма-линизированного КМ оказались самыми низкими. Постимплантаци-онный период сопровождается более выраженной и пролонгированной иммунологической реакцией организма реципиента.

5. Стерилизация КМ 0,25$ раствором нашатырного спирта является наиболее подходящим методом, сохраняющим в трансплантатах индуктивную активность в максимальной степени. По своим свойствам они не отличаются от трансплантатов, заготовленных в стерильных условиях.

6. Сочетание стерилизации КМ 0,25$ раствором нашатырного спирта с последующей лиофилизацией является наиболее оптимальным вариантом. В данном случае трансплантаты обладают лучшим остеоиндуктивным эффектом и при хранении способствуют наилучшей сохранности.

7. Консервация КМ при температуре -12°С в бытовом холодильнике и методом лиофилизации обеспечивает сохранность биологической полноценности трансплантатов вплоть до четырех лет . хранения.

8. Разработанные способы стерилизации и консервации являются высокоэффективными, дают возможность создать неограниченный запас ценного пластического материала, длительно пригодного для "трансплантации. Применение в клинической практике костного матрикса, заготовленного такими способами, позволит стимулировать остеогенез в оптимальном варианте и улучшить результаты лечения больных с различной костной патологией, что дает полное основание рекомендовать его для широкого клинического применения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Показатель повреждения нейтрофилов (ППН) ин витро после воздействия костноматричных антигенов в эксперименте.- Тез.

Ш Респ.научной конф.молодых ученых травматологов-ортопедов Армении, посвящ.60-летию образования СССР. Ереван, 1982, с. 43-45 (соавт.В.В.Козлова, Л.И.Костандян).

2. Сравнительная оценка ППН периферической крови после применения антигенов формалинизированного и замороженного костного матрикса.- Тез.Ш Закавказской конф.морфологов, посвящ.60-

- 18 -

летию образования СССР, 1-3 декабря 1982 г. Ереван (соавт. В.В.Козлова).

3. Сравнительная характеристика морфологических, иммунологических и количественных критериев оценки остеогенеза в результате эктопической имплантации формалинизированного и замороженного костного матрикса.- Тез.У Съезда травматологов-ортопедов республик Закавказья. Ереван, 1984, с.159-161 (соавт. В.В.Козлова, Л.И.Костандян, С.К.Чопикян, Э.С.Гарибян).

4. Количественная характеристика различных популяций клеток иммунологического ряда у больных при имплантации костного матрикса с целью стимуляции остеогенеза.- Тез.У съезда травматологов-ортопедов республик Закавказья. Ереван, 1984, с.182-185 (соавт.И.А.Осепян, В.В.Козлова, С.К.Чопикян, В.П.Айвазян, Э.С.Гарибян, В.Х.Амирбекян).

5. Заготовка и консервация губчатого и трубчатого костного матрикса.- Методические рекомендации. Ереван, 1984, 8 с. (соавт. И.А.Осепян, В.В.Козлова, В.П.Айвазян, С.К.Чопикян).

6. Некоторые показатели оценки эктопического остеогенеза в зависимости от методов стерилизации и консервации костного матрикса.- Сб.научных тр. "Опухоли костей скелета и их лечение"/ под ред.проф.А.С.Имамалиева.- М., 1986, с.46-48 (соавт.В.В.Козлова, Э.С.Гарибян, С.К.Чопикян).

7. Оценка некоторых способов стерилизации и консервации костного матрикса.- Сб.мат.докл.респ.научной конф.молодых травматологов-ортопедов, посвящ.70-летию Beл.Окт.Соц.Рев., Тбилиси, 1987, с.220-223 (соавт.Р.Карапетян, Н.Геворкян).

8. Остеоиндуктивные свойства деминерализованных костных трансплантатов в зависимости от методов стерилизации и консервации,- Ж.Эксперимент.и клинич.медицина, 1989, 3, с.273-276

(соавт. JI. И. Костандян).

9. Способ химической стерилизации деминерализованных костных трансплантатов.- Методические рекомендации. Ереван, 1987 (соавт. Л.И.Костандян).

10. Сравнительная оценка остеоиндуктивнык свойств деминерализованных костных трансплантатов, заготовленных различными способами.- Некоторые вопросы травматологии. Сб.научн.тр. Ереван, 1989, с.21-26 (соавт. Л.И.Костандян, А.В.Азнаурян).

л . ^