Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Современный проточный счетчик в службе крови

На правах рукописи

ЛЕВИНА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

СОВРЕМЕННЫЙ ПРОТОЧНЫЙ СЧЁТЧИК В СЛУЖБЕ КРОВИ.

14.00.29. - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1999

Работа выполнена в Государственном некоммерческом учреждении «Гематологический Научный Центр РАМН»

Научный руководитель:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Г.И, Козинец

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ю.А. Шарова доктор медицинских наук Г.Н. Зубрихина

Ведущее учреждение:

Российская Медицинская Академия Последипломного Образования

Защита состоится «_»_1999г. в «_» часов на заседании

диссертационного совета Д 001.45.02 в Гематологическом Научном Центре РАМН (125167 Москва, Новозыковский проезд, 4а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического Научного Центра РАМН

Автореферат разослан «_»_ 1999г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник В.Д. Реук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Клинический анализ крови является одним из наиболее распространённых клинико-лабораторных исследований в медицинской практике. Многие десятилетия при изучении гематологических показателей пользовались ручными методами. За последние 15-20 лет произошло существенное развитие технологии и аппаратуры для автоматического исследования клеток крови на принципе проточной цитометрии. Достигнут достаточно высокий уровень автоматизации этих исследований. Это касается всех стадий проведения анализа - от взятия исследуемой пробы до представления конечных результатов. В развитых странах мира автоматический анализ крови почти полностью вытеснил ручные и полуавтоматические методы. В нашей же стране доля ручного труда при выполнении клинического анализа крови остаётся ещё достаточно высокой. Использование счётчиков значительно облегчает труд работников лабораторий, повышает его производительность, а кроме того улучшает качество и точность анализов.

Преимуществами автоматического анализа крови являются: высокая производительность (до 100 и более проб в час), небольшой объём крови (12-50мкл), оценка более 20 показателей, вместо 10-12 при обычном анализе крови, графическое представление распределения клеток (гистограммы, скетограммы), высокая точность исследования, так как подсчёту подвергаются несколько тысяч клеток из одной пробы. Проточные счётчики используются при обследовании доноров (зарубежный опыт) и практически нет данных об их применении для оценки и стандартизации получаемых компонентов крови, что крайне необходимо для проведения современной компонентной терапии.

Цель настоящей работы оценить возможность использования современного проточного счётчика среднего класса «Cobas Micros 18 ОТ», в обследовании доноров и дать количественно-качественную характеристику цельной крови и получаемых из неё компонентов.

Основные задачи исследования.

1. Сравнительный анализ параметров крови доноров, полученных на гематологическом анализаторе «Cobas Micros 18 ОТ» и при световой микроскопии.

2. Количественно - качественная характеристика полученных клеточных компонентов крови с применением счётчика среднего класса «Cobas Micros 18 ОТ» и последующим анализом эритроцитов на сканирующем электронном микроскопе.

3. Оценка чистоты полученных компонентов крови (характеристика клеточных примесей) с использованием счётчика среднего класса «Cobas Micros 18 ОТ".

Научная новизна работы. Оценены результаты использования гематологического анализатора в службе крови. Получены данные:

обследования доноров крови, количественная и качественная характеристика цельной крови в мешке, чистоты фракций плазмы, концентрата эритроцитов, концентрата тромбоцитов. Дана морфофункциональная оценка эритроцитов при длительном хранении концентрата эритроцитов в растворах SAGM, Адсол и CPD.

Теоретическое н практическое значение. На основании проделанной работы даны практические рекомендации по использованию гематологического анализатора «Cobas Micros 18 ОТ" для обследования доноров крови, подсчёта гранулоцитов, эритроцитов, тромбоцитов при проведении современной компонентной терапии.

Реализация результатов исследования. Внедрение полученных результатов в практику осуществляется следующими путями:

1. Результаты исследований опубликованы в печатных изданиях, докладывались научных и научно-практических конференциях.

2. Проведено внедрение гематологического анализатора «Cobas Micros» на станциях переливания крови (7 ГКБ г.Москвы, ГНЦ РАМН).

3. Разработана «Инструкция по фракционированию консервированной крови с использованием контейнеров Оптипэк, полуавтоматических плазмоэкстракторов Оптипресс и аппаратов для стерильного соединения трубок», утверждённая Министерством здравоохранения РФ, от 29.06.1999г.

Положения выносимые на защиту.

1. Проведена апробация и разработаны рекомендации использования гематологического анализатора среднего класса для обследования доноров, а также для эффективного контроля за чистотой и качеством получаемых компонентов крови.

2. Получены данные, характеризующие эритроциты при длительном хранении концентрата эритроцитов в растворах SAGM, Адсол и CPD, свидетельствующие о достоверном снижении количества эритроцитов на 10-11% к 21-41 суткам хранения в растворе SAGM. Электронно-микроскопическое изучение эритроцитов, хранящихся в растворах SAGM, Адсол и CPD, показало однотипное изменение морфологии этих клеток - трансформация осуществлялась по пути диск-эхиноцит-сфера. Отличие заключалось в количественном соотношении различных форм эритроцитов в одни и те же сроки хранения и времени уменьшения дискоцитов. После помещения эритроцитов (на 28-42 сутки хранения) в свежую плазму, наблюдалось некоторое восстановление эхиноцитов в дискоциты, более эффективное в случае хранения клеток в растворе Адсол.

3. Количественная и качественная характеристика концентратов тромбоцитов зависит от метода их получения. Наилучшим является концентрат тромбоцитов, полученный на сепараторе крови, при котором средний выход тромбоцитов составляет 540±14х109, а примесь лейкоцитов 0,01±0,0015х109/л.

Апробация диссертации. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: V съезде специалистов по лабораторной диагностике (Москва, 1995г.); Конференции «Анализ изображения клеток системы крови: настоящее и будущее» (Москва, 1996г.); Симпозиуме «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва 1997г.); XVI Научно-практической конференции: "Морфометрия в диагностике болезней" (Москва, 1998г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 125 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных данных, заключения, выводов, списка литературы. Работа содержит 16 таблиц и 32 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы исследования.

Материалом исследования служили капиллярная и венозная кровь 339 человек, объединенных в группы:

1 группа - группа практически здоровых людей (160 доноров; 40 пожилых людей; 20 детей) - 220 человек.

2 группа - группа больных людей (20 гематологических больных; с негематологическими заболеваниями 72 человека) - 92 человека.

3 группа - группа лиц, проживающих в Брянской области, в зоне повышенной радиации - 27 человек.

Также материалом исследования служили компоненты крови: плазма (100 проб), концентрат эритроцитов (19 мешков), тромбоконцентраты и ПУЛы тромбоцитов (740 доз).

Методы исследования.

Забор капиллярной н венозной крови осуществляли в пластиковые пробирки с антикоагулянтом ЭДТА фирмы «Roche» Швейцария.

Гематологический анализатор среднего класса «Cobas Micros 18 ОТ», Hoffman-La Roche, Швейцария.

Количественный подсчёт лейкоцитов и эритроцитов периферической крови проводили с использованием камеры Горяева, производитель ЛОМО, г. Санкт-Петербург.

Морфологическая оценка проводилась в препаратах, окрашенных азур-эозином, по методике принятой в лаборатории гемоцитологии ГНЦ РАМН РФ и по Романовскому с использованием красителя ТУ 6-09-34975, производитель АО ПО «ТОС», г. Долгопрудный.

Получение компонентов крови осуществляли методом «Оптисистем», который был разработан на базе 7ГКБ г.Москвы и ГНЦ РАМН совместно с Никитиным И.К и зав.отделением заготовки крови и её компонентов Орловой Г.К.

Морфофункцноиальную оценка эритроцитов при длительном хранении концентратов эритроцитов осуществляли с использованием электронного микроскопа со сканирующей приставкой JEM-100C, фирмы JEOL (Япония). Исследования проводились совместно с вед.н.с., к.б.н. Шишкановой З.Г.

Компьютерная обработка результатов. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы Microsoft Excel 97. В каждой группе для каждого исследуемого параметра определяли среднее значение, среднее квадратичное отклонение, дисперсию, достоверность результатов по одному из критериев (t-критерий Стьюдента).

Научная и методическая работа выполнена совместно с сотрудниками лаборатории гемоцитологии ГНЦ РАМН (руководитель д.м.н., проф. Козинец Г.И.), разработка «Инструкции по фракционированию консервированной крови с использованием контейнеров Оптипэк, полуавтоматических плазмоэкстракторов Оптипресс и аппаратов для стерильного соединения трубок» выполнена совместно с Никитиным И.К., Орловой Г.К. и сотрудниками лаборатории патофизиологии ГНЦ РАМН (руководитель д.м.н., проф. Горбунова H.A.). Приношу всем глубокую благодарность за помощь в настоящей работе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Сравнение данных полученных при количественном подсчёте лейкоцитов н эритроцитов в камере Горяева н на гематологическом анализаторе «Cobas Micros 18 ОТ».

Исследование состояло из двух этапов: 1 этап - сопоставление подсчёта количества лейкоцитов и эритроцитов в камере Горяева (Санкт-Петербург, ЛОМО) и на проточном гематологическом анализаторе "Cobas Micros 18 ОТ» у здоровых и гематологически больных людей (всего п=30);

2 этап - сравнительный подсчёт лейкоцитарной формулы у доноров и негематологических больных (всего п=119) на приборе «Cobas Micros» и при визуальной оценке в световом микроскопе.

В результате исследования был произведён сравнительный подсчёт лейкоцитов и эритроцитов периферической крови у 10 здоровых людей (рис. 1,2) и у 20 гематологических больных (хронические и острые лейкозы, анемии различного генеза) (рис.3,4). Подсчёт в камере Горяева проводился параллельно с независимым экспертом.

Рис.1 Сравнительный подсчёт лейкоцитов периферической крови у здоровых людей. 9,5

3 4 5 6 7 Количество обследованных

"Лейкоциты ,

здоровых людей (кам ера Горяева) {

-Лейкоциты здоровых людей (счётчик)

Рис.2 Сравнительный подсчёт эритроцитов периферической крови у здоровых людей.

Количество обследованных

Рис.3 Сравнительный подсчёт лейкоцитов периферической крови у больных людей.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Количество обследованных больных

• Количество леГжоцитов гематологических больных (камера Горяева)

"И— Количество лейкоцитов гематологических больных (счётчик)

Рнс.4 Сравнительный подсчёт эритроцитов периферической крови у больных людей.

В результате исследований были получены сопоставимые данные.

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Количество обследованных больных

■Количество эритроцитов гематологи ческих больных (камера Горяева)

"Количество эритроцитов гематологических больных (счётчик)

Статистическую обработку не проводили, так как данный порядок цифр отличается минимально.

Был произведён также анализ лейкоцитарной формулы у 27 доноров крови, 72 негематологических больных и 20 детей из Брянской области. И при подсчёте на автоматическом счётчике, и визуально на мазке крови в световом микроскопе были получены сходные данные, однако прибор определяет только три вида клеток: лимфоциты, моноциты и гранулоциты; о наличии в крови других клеток прибор информирует флагами.

"Cobas Micros» характеризуется высокой точностью и удобством при подсчёте жидкой крови в условиях поликлиники, стационара, при больших диспансерных обследованиях. Этот прибор даёт возможность ориентироваться в лейкоцитарной формуле, а также в определении состояния форменных элементов крови при массовых обследованиях людей и выявлении патологических состояний.

Обследование доноров крови (анализ гемограмм).

Нами было обследовано 100 доноров (50 мужчин и 50 женщин) в возрасте от 20 до 50 лет. Исследования проводили на гематологическом анализаторе «Cobas Micros 18 ОТ».

Полученные показатели гемограмм, не выходили за рамки «стандартных» нормативных параметров, утверждённых Минздравом РФ. В число этих нормативных показателей, однако, не входят параметры, получаемые современными автоматическими методами исследования. Для таких показателей, в качестве стандартных, выбраны нормативные значения предлагаемые фирмой - изготовителем, используемого нами гематологического анализатора. В связи со всем выше сказанным, полученные данные могут быть использованы при обследовании доноров крови.

Исследования гематологических показателей у пожилых людей.

Было проведено обследование, 40 пожилых людей (20 мужчин и 20 женщин) в возрасте от 60 до 83 лет (средний возраст составлял 67 лет). Все они вели активный образ жизни (работали). Контрольную группу составили 40 человек (20 мужчин и 20 женщин) в возрасте от 25 до 50 лет. Материалом исследования служила периферическая кровь. Подсчёт показателей жидкой крови производился на гематологическом анализаторе. Подсчёт лейкоцитарной формулы осуществляли параллельно на счётчике и визуально в световом микроскопе. Из полученных данных видно, что нет статистической разницы при подсчёте лейкоцитарной формулы этими методами (табл.1).

Таблица 1. Показатели гемограммы у женщин и мужчин до и после 60 лет.

ЖЕНЩИНЫ МУЖЧИНЫ

Показатели до 60 лет после 60 лет до 60 лет после 60 лет

М+о М+о М±ст М+ а

Лейкоциты, 109/л 6,74±1,64 6,06±1,48 6,38±1,04 6,88±1,38

Эритроциты, 1012/л 4,46±0,25 4,29±0,27 4,78±0,28 4,66±0,45

п о Гемоглобин, £/(11 12,97±0,80 12,32±0,81 14,41±1,06 13,97±1,08

к А Гематокрит, % 37,57±1,72 37,08±2,11 41,79±2,15 41,06±3,23

а А Средний объём эритроцитов, цт3 84,44±3,74 86,42±3,65 87,5±5,21 88,38±2,56

Н И Я Среднее содержание гемолобипа в 1 эритроците, Рё 29,07±1,39 28,77±1,31 30,17±1,48 30,02±1,26

с ч Средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах, 34,52±1,88 33,28±0,87 34,54±2,65 34,01±0,83

а, т ч н к А Ширина распределения эритроцитов по объёму, % 14,35^0,74 14,28±0,72 13,59±0,73 14,43±0,64

Тромбоциты, 109/л 200,11±39,83 184,75^39,08 214,80±29,00 180,69±47,83

Средний объём тромбоцитов, цт3 8,98±0,64 8,62±0,90 8,0б±0,78 8,5±0,84

Ширина распределения тромбоцитов по объёму, % 13,51±1,21 12,27±0,98 14,42±2,36 13,27±1,16

Лимфоциты, % 33,67±7,22 39,24±4,89 31,42±8,76 27,36±4,06

Лимфоциты,, 107л 2,21*0,68 2,26±0,51 1,92±0,62 1,82±0,44

Моноциты, % 6,42±1,65 8,44±1,75 б,08±2,18 6,81±1,71

Моноциты, 107л 0,37±0,17 0,44±0,10 0,33±0,16 0,40±0,16

Гранулоциты, % 59,91±7,01 52,32±5,95 62,49±10,21 65,82±4,47

Гранулоциты, 10у/л 4,12±1,09 3,24±1,03 4,12±1,07 4,б5±0,98

м II Палочкоядерные нейтрофилы,% 2,8 9± 1,45 3,67±1,87 1,44±0,73 3,77±1,42

к Р Сегментоядерные нейтрофилы,% 57,00±5,83 52,25±7,11 60,6±7,60 61,69±6,07

о Лимфоциты,% 33,55±5,20 34,92±6,75 30,5±8,04 2б,46±5,28

с Моноциты,% 5,55±1,74 6,75±3,91 6,3±1,25 6,23±1,88

к Эозинофилы,% 2,25±1,89 3,11±2,26 1,62±1,19 2,87±1,36

О Базофилы,% - 1±0 - 1±0

II СОЭ,мм/ч 9,55±3,20 18±9,81 5,1±2,68 6,31±4,46

Как видно из табл.1, при анализе данных, полученных при подсчёте элементов жидкой крови, была выявлена тенденция к уменьшению тромбоцитов у лиц старше 60 лет, но изменения были в пределах нормы. При подсчёте лейкоцитарной формулы особых отклонений не выявлено; у отдельных лиц (женщин) была тенденция к увеличению лимфоцитов и палочкоядерных нейтрофилов, также у женщин старше 60 лет было более высокое СОЭ (до 18 мм/в час), но эти изменения были в пределах верхней границы нормы.

Таким образом, проведённое исследование показало, что нет выраженных возрастных изменений в кроветворении. Это позволяет думать о расширении границ донорства и в определённых ситуациях использовать кровь пожилых людей.

Сравнительный анализ гемограмм, полученных из капиллярной крови н из мешка (пластикового контейнера «Оптипек») одного и того

же донора.

Материалом исследования служили: капиллярная кровь взятая у донора с антикоагулянтом ЭДТА до кроводачи и венозная кровь, забранная у этого же донора в пластиковый контейнер «Оптипэк», фирмы Baxter. В контейнер производится взятие 450 мл + 10% (477гр. +47гр.) венозной крови, исключая консервант CPD (63 мл). Контроль веса является обязательным условием стабильности выхода компонентов.

Всего было обследовано 10 доноров. Полученные данные представлены в табл.2.

Как видно из табл.2, показатели цельной крови снижены по сравнению с капиллярной, за счёт разведения стабилизирующим раствором CPD.

Таким образом, основные показатели клеточного состава крови доноров и свежезаготовленной цельной крови в пластиковых контейнерах хорошо соответствовали друг другу. Снижение показателей тромбоцитов в цельной крови на величины, превышающие ожидаемые значения (связанные с разбавлением), обусловлено, вероятно, специфическими свойствами этих клеток. Полученные данные можно использовать при разработке стандартов для исследования крови доноров и компонентов донорской крови.

Оценка качества концентратов эритроцитов при длительном хранении в растворе SAGM.

Нами было произведено исследование состояния донорских эритроцитов при длительном хранении в дополнительном растворе

Таблица 2. Сравнительный анализ гемограмм, полученных из капиллярной крови и из мешка._

Показатели Исходная кровь (М±т) Кровь из мешка (М±т)

Лейкоциты, 109/л, WBC 7,02±0,38 6,03±0,37

Эритроциты, 10|2/л, RBC 4,86±0,06 4,25±0,12

Гемоглобин, g/dl, HGB 15,00±0,32 12,97±0,50

Гематокрит, %, НСТ 45,39±0,90 39,59±1,47

Средний объём эритроцитов, pni3 ,MCV 93,40±1,07 92,90±0,97

Среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците, pg, МСН 30,95±0,54 30,37±0,38

Средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах, g/dl, МСНС 32,79±0,51 32,39±0,40

Ширина распределения эритроцитов по збъёму, %, RDW 13,61±0,20 13,40±0,23

Тромбоциты, 10%, PLT 279,20±25,50 209,70±28,74

Средний объём тромбоцитов, |im3,MPV 6,61±0,В0 6,18±0,10

Тромбокрит, %, РСТ 0,184±0,02 0,131±0,02

Ширина распределения тромбоцитов по эбъёму, %, PDW 16,67±0,35 15,15±0,56

Лимфоциты, %, LYM 35,16±3,24 36,0б±3,13

Лимфоциты,, 109/л, LYM 2,42±0,18 2,07±0,10

Моноциты, %, MON 4,87±0,33 5,60±0,33

Моноциты, 109/л, MON 0,33±0,03 0,32±0,02

Гранулоциты, %, GRA 59,87±3,25 58,31±3,27

Гранулоциты, 109/л, GRA 4,31±0,41 3,57±0,39

БАСМ (раствор аденин-глгокоза-машштол). Для получения концентратов эритроцитов была взята кровь у 10 доноров (5 мужчин и 5 женщин). Количественный подсчёт концентрата эритроцитов производили на гематологическом анализаторе, а морфологические свойства эритроцитов изучали по данным сканирующей электронной микроскопии. Исследования проведены в следующие этапы времени: 0, 21, 35 и 41 сутки.

Хранились концентраты эритроцитов в холодильнике при температуре +4°С - +2°С. Полученные данные представлены в табл.3.

Таблица 3. Показатели гемограммы при длительном хранении концентрата эритроцитов в растворе БАСМ (М±т)._

Измеряемые параметры Время хранения концентрата эритроцитов (сутки)

0 21 35 41

Доноры (мужчины)

Эритроциты, 1012/л 6,47±0,15 5,80±0,14* 5,82±0,16* 5,74±0,09*

Гемоглобин, г/л 194,8±4,8 197,2±7,б 193,0±4,9 194,2±4,0

Лейкоциты, 106/л 3,02±0,25 2,72±0,50 2,20±0,37 2,10±0,32*

Доноры (женщины)

Эритроциты, 10|2/л 6,54±0,26 5,80±0,14* 5,82±0,1б* 5,74±0,09*

Гемоглобин, г/л 191,4±7,90 180,0±4,50 180,4±7,10 178,6±6,30

Лейкоциты, 106/л 3,36±0,52 2,96±0,41 2,58±0,39 2,56±0,39

Примечание. * - Р<0,05 в сравнении с «0» временем.

Как видно из табл.3, результаты исследований свидетельствуют о достоверном снижении на 11-12% количества эритроцитов соответственно к 21-41 суткам хранения у доноров (мужчин и женщин). Показатели гемоглобина у доноров-женщин снижается к 21 суткам хранения на 6%, к 41 суткам - 6,7%, гемоглобин у доноров-мужчин остаётся практически неизменным. Достоверности в снижении концентрации гемоглобина нет (Р>0,05). Снижение лейкоцитов у доноров (мужчин и женщин) наблюдается на 21 сутки хранения (9,9%, 11,9%) соответственно. К 35 суткам хранения количество лейкоцитов снижается у мужчин на 27,1%, у

женщин на 23,2%, однако данные не достоверны. На 41 сутки хранения количество лейкоцитов у женщин практически не меняется по сравнению с «35» сутками (0,8%), у мужчин к 41 суткам по сравнению с «0» падение лейкоцитов достигает 30,4%, (Р<0,05).

По данным электронной микроскопии количество дискоцитов на 21 сутки наблюдения значительно снижено, как у мужчин, так и у женщин (на 84%) в основном за счёт увеличения эхиноцитов. Эта тенденция сохранялась в последующие изучаемые сроки хранения эритроцитов: на 41 сутки количество дискоцитов достоверно было сниженным (на 93%) относительно «0» суток, в сравнении с 35 сутками более, чем в 2 раза (рис.5,6). Известно, что эхиноциты способны к обратной трансформации, восстанавливая свою дисковидную форму, при помещении их в свежую плазму. Количество сфероцитов достоверно увеличивалось у мужчин и женщин к 21 суткам наблюдения на 11,6% и 10% соответственно, в последующие сроки достоверных изменений в их содержании не отмечалось. Сфероциты не способны к обратной трансформации, и являются предгемолитическими формами. Разницы в количественном распределении форм эритроцитов не обнаружено у доноров-мужчин и женщин.

Рнс.5 Количественное изменение эритроцитов по формам при длительном хранении концентрата эритроцитов в растворе БЛОМ (мужчины).

М1Р~

т

21 35

Время хранения (сутки).

■ Сфероциты □ Эхиноциты О Дискоциты

Рнс.6 Количественное изменение эритроцитов по формам при длительном хранении концентрата эритроцитов в растворе БАвМ (женщины).

21 35

Время хранения (сутки)

41

9-

ШСфероциты!

□ Эхиноциты!

□ Дискоциты ;

Таким образом, проведённые исследования с помощью проточного счётчика «Cobas Micros 18 ОТ» свидетельствуют о том, что по мере хранения концентрата эритроцитов в растворе SAGM в течение 41 суток количество эритроцитов достоверно снижается на 11-12%, как у мужчин, так и у женщин. Наличие в обеих группах морфологических изменений в виде эхиноцитоза, как одной из обратимых стадий качественных изменений эритроцитов, позволяет считать SAGM достаточно адекватным раствором для длительного хранения эритроцитов.

Оценка качества концентрата эритроцитов при длительном хранении в растворе Адсол (42 суток) и CPD (28 суток).

Для получения концентратов эритроцитов была взята кровь у 13 доноров. Количественный подсчёт концентрата эритроцитов производился на гематологическом анализаторе, а морфологические свойства эритроцитов изучались на сканирующем электронном микроскопе. Исследования проведены в следующие этапы времени: 0, 7, 14,21, 28, 35 и 42 сутки. Хранились концентраты эритроцитов в холодильнике при температуре +4°С - -f-2°C.

Установлено, что при длительном (42 суток) хранении концентрата эритроцитов в растворе Адсол, количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, величины гематокрита, а также средний объём эритроцитов, среднее содержания гемоглобина в 1 эритроците, средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах и ширина распределения эритроцитов по объёму достоверно не изменялись в течение всего срока наблюдения. В группе исследований (хранение эритроконцентрата в растворе СРБ) также не отмечалось существенных изменений этих показателей в динамике хранения, при относительно увеличенных (на 35-40 %) выше перечисленных показателей в сравнении с предшествующей группой.

Электронно-микроскопическое изучение эритроцитов, хранящихся в растворе Адсол и СРО, показало однотипное изменение морфологии этих клеток: транформация осуществляется по пути диск-эхиноцит-сфера. Отличие заключалось в количественном соотношении различных форм эритроцитов в одни и те же сроки хранения и времени истощения дискоцитов.

Рнс.7 Количественные изменения эритроцитов по формам при хранении концентрата эритроцитов в растворе - Адсол.

■ Сфероциты

□ Эхиноциты

20%-Х -Ч

О Дискоциты

0%-К-

т

к

0 7 14 21 28 35 42

Время хранения (сутки)

В растворе Адсол (рис.7) отмечено снижение дискоцитов на 7 сутки в основном за счёт увеличения эхиноцигов, находящихся в 1-ой стадии трансформации, то есть с кренацией мембраны эритроцитов, которые

способны быстро восстанавливать свою форму. На 14-е сутки количество днскоцитов заметно уменьшилось за счёт увеличения эхиноцитов 1-11 -ой стадий трансформации. В это г период увеличивается число сфероцитов с большими отростками. В последующие сроки хранения концентрата эритроцитов изменения касались главным образом морфологии сфероцитов; преобладали гладкие формы. Максимальные морфологические изменения отмечены на 42 сутки хранения.

Известно, что эхиноциты и сфероциты с большими отростками обратно трансформируются и восстанавливают свою дисковидную форму, при помещении их в свежую плазму. В то же время гладкие сфероциты, а также сфероциты с малым количеством истонченных отростков, не способны к обратной трансформации, при помещении их в свежую плазму, они могут лишь гемолизировагься и элиминироваться из кровотока. Результаты проведённого нами исследования по изучению способности эритроцитов к обратной трансформации, свидетельствуют о том, что на 28 сутки хранения в растворе Адсол (рис.8) количество восстановленных дискоцитов достигло 69% (до помещения в плазму - 17%). В дальнейшем, способность восстанавливать свою форму была слабее.

Рис.8 Количественная характеристика обратной трансформации эритроцитов (Адсол) в донорской плазме.

100%т

80%

60%

40%-

20%-

0%-

К

I

И=1

I

■ Сфероциты 1

□ Эхиноциты

□ Дискоциты;

28 (1) 28 (II)

35 (1) 35 (11) Время хранения (сутки)

42(1) 42(11)

I, II - группы исследования до и после инкубирования эритроцитов в донорской плазме.

Результаты, полученные при аналогичном исследовании эритроцитов, хранящихся в растворе СРО (рис.9), свидетельствуют о менее выраженном

процессе восстановления формы эритроцитов: количество дискоцитов было меньшим в 2,5-3 раза, а сфероцитов - больше на 20-25%. Увеличение предгемолитических форм (сфероцитов) согласуется с более выраженным процессом гемолиза по показателям свободного гемоглобина и деформируемости эритроцитов в растворе СРБ.

Рнс.9 Количественное распределение эритроцитов по формам при хранении концентрата эритроцитов в растворе СРБ.

Время хранения (сутки)

28(а) - исследование проведено после инкубирования эритроцитов в плазме доноров.

Таким образом, изучение динамики изменений количественного и качественного состояния эритроцитов, свидетельствует о лучшей сохранности эритроцитов хранимых в растворе Адсол. Результаты исследований показывают менее выраженные процессы гемолиза по показателям выхода гемоглобина, деформируемости эритроцитов, содержанию АТФ и сатурации кислорода в сравнении с СРО.

Количественная характеристика концентратов тромбоцитов, полученных различными методами.

Было проведено количественное исследование концентратов тромбоцитов (КТ), полученных различными методами. Всего было исследовано 240 КТ. Из них: 100 КТ - получены из отдельных доз цельной крови с последующим её фракционированием на центрифугах и

выделением лейкотромбоцигарного слоя «ручным» методом; 100 КТ получены с использованием метода «Оптисистем»; 20 КТ выделены методом 4-х кратного ТЦФ; 20 КТ получены с использованием сепараторов крови CS 3000 Plus (Baxter). Подсчёт, количества тромбоцитов и примеси лейкоцитов в концентратах тромбоцитов, производили на гематологическом анализаторе «Cobas Micros 18 ОТ».

На рис.10, 11 видно, что наибольший выход тромбоцитов от одного донора достигается получением концентрата тромбоцитов методами: сепараторного выделения - 540±14х109/л и 4-х кратного ТЦФ -244±8х109/л. Примесь лейкоцитов в этих КТ, составляет при сепараторном выделении - 0,01±0,0015x109/л, при 4-х кратном ТЦФ выше -0,5±0,08х109/л. Выход тромбоцитов из единичных доз лейкотромбоцитарного слоя (JITC): с применением «Оптисистем» выше б8±2х109/л, чем при обычном методе выделения 55±2х109/л (пересчёт на вес мешка). Примесь лейкоцитов ниже в КТ, полученном методом «Оптисистем» 0,2±0,01х109/л, за счёт автоматического выделения J1TC, при «ручном» способе она равна 0,5±0,02х109/л.

Рнс.10 Количество тромбоцитов в концентрате тромбоцитов, полученных различными методами.

Из отдельных "Optisystem" 4-кратный Сепараторы доз ТЦФ

Методы получения КТ.

Piic.11 Количество примеси лейкоцитов в концентратах тромбоцитов, полученных различными методами.

Из отдельных "Optisystem" 4-кратный ТЦФ Сепараторы дев

Методы получения ICT.

Качественный состав, полученных различными методами концентратов тромбоцитов (КТ) определяет их дифференцированное использование. Многократные переливания КТ увеличивают риск сенсибилизации. Получение КТ на сепараторах крови в большой дозе и с минимальной примесью лейкоцитов, обеспечивает высокий постгрансфузионный прирост тромбоцитов и хорошую эффективность.

Количественная характеристика концентратов тромбоцитов, полученных из 1,3,4 и 5 доз лейкотромбоцнтарного слоя (JITC) методом «Оптисистем».

Нами были исследованы концентраты тромбоцитов, полученные из 1 (п=100), 3 (п=250), 4 (п=200) и 5 (п =50) доз J1TC методом «Оптисистем». Всего использовано 600 КТ. Подсчёт, количества тромбоцитов и примесей, полученных при выделении единичных и пулированных концентратов тромбоцитов, производился на гематологическом анализаторе «Cobas Micros». Полученные данные представлены на рис.12, 13.

Рис.12 Количество тромбоцитов, полученных из 1,3,4 и 5 доз ЛТС.

Рнс.13 Примесь лейкоцитов в КТ, полученных из 1,3,4 и 5 доз ЛТС.

Единичная доза ПулшЗЛТС Пул ш 4ЛТС Пулш5ЛГС

Как видно из рис.12, 13 наиболее высокий выход тромбоцитов и минимальную примесь лейкоцитов позволяют получить объединённые в пул ЛТС. Большой разброс выхода тромбоцитов из единичного ЛТС

заставил многих отказаться от их получения, что произошло и в банках крови Европы.

Таким образом, гематологический анализатор среднего класса «Cobas Micros 18 ОТ», характеризуется высокой точностью, производительностью до 45 образцов в час, что важно при массовых обследованиях доноров крови. Ценным в аппарате, является распечатка результатов. Использование анализатора в службе крови, позволяет определить различного рода примеси при получении тех или иных компонентов крови, т.е. внести определённую стандартизацию в оценку качества получаемых компонентов крови.

ВЫВОДЫ.

1. Гематологический анализатор среднего класса «Cobas Micros 18 ОТ" может быть использован в службе крови, он существенно оптимизирует процесс обследования доноров и обеспечивает эффективный количественный контроль за чистотой и качеством получаемых компонентов крови.

2. При обследовании крови здоровых людей (доноров) на гематологическом анализаторе «Cobas Micros 18 ОТ» получены гемограммы, не отличающиеся от общепринятых показателей нормы.

3. С помощью счётчика «Cobas Micros 18 ОТ» выявлены различия в показаниях гемограмм из капиллярной крови и мешка -контейнера одного и того же донора, обусловленые разведением крови стабилизирующим раствором. В лейкоцитарной формуле (из мешка) отмечалась тенденция к снижению абсолютных значений моноцитов на 3%, гранулоцитов - на 17% и лимфоцитов - на 14%.

4. Сравнительная оценка длительного хранения (до 41 суток) концентрата эритроцитов в стабилизирующем растворе SAGM свидетельствует о достоверном снижении количества эритроцитов (на 1112%) к 21-41 суткам.

5. Электронно-микроскопическое изучение эритроцитов, хранящихся в растворах SAGM, Адсол и CPD показало однотипное изменение морфологии этих клеток при трансформации по пути диск-эхиноциг-сфера. Отличие заключалось в количественном соотношении различных форм эритроцитов в одни и те же сроки хранения, в растворах SAGM, Адсол и CPD. Более эффективное восстановление эхиноцитов в дискоциты при помещении эритроцитов в свежую плазму отмечено в растворе Адсол.

6. Количественный и качественный состав концентрата тромбоцитов зависит от способа его заготовки, как показали исследования на счётчике «Cobas Micros 18 ОТ». Концентрат тромбоцитов, полученный на сепараторах крови от одного донора, является оптимальным, при

котором выход тромбоцитов составляет 540±14х109, примесь лейкоцитов -0,01 ±0,0015х 109/л.

7. При исследование компонента крови - свежей плазмы на проточном счётчике не отмечено наличия каких-либо клеточных примесей.

Список работ опубликованных по теме диссертации.

1. Васильев С.А., Джукаев A.A., Ерёменко Л.Л., Калинин H.H., Левина Т.Н., Куликов С.М. Показатели функциональной активности тромбоцитов в крови доноров тромбоцитной массы // Клиническая лабораторная диагностика, №5, 1997, С.60.

2. Ершова Л.И., Лиховецкая З.М., Курбатова Г.Н., Шишканова З.Г., Витвицкий В.М., Левина Т.Н., Горбунова H.A., Козинец Г.И., Никитин И.К. Оценка качества концентратов эритроцитов при длительном хранении в дополнительном растворе «адсол» // Тез.конференции «Трансфузиология и служба крови», Москва, 1998.

3. Калинин H.H., Петров М.М., Варламова C.B., Левина Т.Н., Козинец Г.И. Оценка режимов фракционирования крови на центрифуге ЦР 3-6 // IV конференция Московского общества гемафереза, Москва, 1996.

4. Козинец Г.И., Погорелов В.М., Шишканова З.Г., Дягилева O.A., Сарычева Т.Г., Попова О.В., Новодержкина Ю.К., Левина Т.Н. Структура, внутриклеточный обмен и кинетика бластных клеток при острых лейкозах: компьютерный анализ практической значимости гематологических параметров // Тез.докл. V съезда специалистов по лабораторной диагностике, Москва, 1995, С. 153-154.

5. Козинец Г.И., Луговская С.А., Левина Т.Н., Никитин И.К., Новодержкина Ю.К., Сарычева Т.Г., Балабуткин В.А., Фёдорова И.М., Князева Е.С., Дягилева O.A., Калинин H.H. Проточные счётчики в практике лабораторного обследования, гематологии и трансфузиологии // Тез.докл. конференции «Клиническая лабораторная диагностика: состояние и перспективы», Санкт-Петербург, 1996, С.273-274.

6. Козинец Г.И., Сарычева Т.Г., Левина Т.Н., Дягилева O.A., Наумова И.Н., Фёдорова И.М., Князева Е.С., Луговская С.А., Балабуткин

B.А. Роль проточных счётчиков в лабораторных исследованиях II Новое в трансфузиологии, вып.15, 1996, С.42-47.

7. Козинец Г.И., Сарычева Т.Г., Дягилева O.A., Попова О.В., Левина Т.Н., Наумова И.Н., Соколинский Б.З., Стрелецкая Е.А. Особенности клеточного состава и исследование крови пожилых людей // Лабораторная медицина, №1, 1998, С.34-42.

8. Козинец Г.И., Левина Т.Н., Сарычева Т.Г., Никитин И.К., Стрелецкая Е.А. Использование счётчика Cobas Micros в службе крови // Тез.конференции «Трансфузиология и служба крови», Москва, 1998,

C.195.

9. Козинец Г.И., Сарычева Т.Г., Левина Т.Н., Дягилева O.A., Наумова И.Н., Попова О.В., Стрелецкая Е.А., Никитин И.К. Верхняя возрастная граница доноров крови // Тез.конференции «Трансфузиология и служба крови», Москва, 1998, С. 121.

10. Левина A.A., Шишканова З.Г., Иванова С.М., Левина Т.Н., Цибульская М.М., Лабецкая О.И., Караштин В.В., Козинец Г.И. Исследование показателей обмена железа у человека в условиях антиортастатической гипокинезии // Клиническая лабораторная диагностика, №7, 1998, С.3-5.

11. Левина Т.Н., Сарычева Т.Г., Никитин И.К., Козинец Г.И. Опыт применения проточного счётчика «Cobas Micros 18 ОТ» в гематологии и трансфузиологии // Клиническая лабораторная диагностика, №5, 1997, С.66.

12. Левина Т.Н., Сарычева Т.Г., Князева Е.С. Опыт применения проточного счётчика «Cobas Micros 18 ОТ» в гематологической практике // Клиническая лабораторная диагностика, №10, 1997, С.18-20.

13. Левина Т.Н., Никитин И.К., Орлова Г.К., Козинец Г.И. Гематологические анализаторы и качество компонентов крови // Тез.VI конференции Московского общества гемафереза, Москва, 1998, С. 108.

14. Никитин И.К., Орлова Г.К., Максимов П.И., Козинец Г.И., Левина Т.Н. Фракционирование консервированной крови с использованием полуавтоматических плазмоэкстракторов и контейнеров оптипек // Тез.конференции «Трансфузиология и служба крови», Москва, 1998, С.52.

15. Петров М.М., Варламова C.B., Калинин H.H., Никитин И.К., Левина Т.Н., Орлова Г.К., Семинишина И.Т., Шумилова Л.Л. Качественный состав тромбоцитов: нерешённые вопросы и пути рационального использования // Тез.конференции «Трансфузиология и служба крови», Москва, 1998, С.55.

16. Фёдорова И.М., Бляхер М.С., Левина Т.Н. Исследование периферической крови мышей на автоматическом анализаторе Cobas Micros в эксперименте // Клиническая лабораторная диагностика, №10, 1997, С.23-24.

17. Чебышев Н.В., Левина Т.Н., Лазарева Ю.Б. Комплексное изучение кроветворения мышей при экспериментальном трихоцефалезе и на фоне химиотерапии // Материалы Всероссийской конференции «Актуальные вопросы медицинской паразитологии», Санкт-Петербург, С.37-38.

18. Шмаров Д.А., Магомедова А.У., Сарычева Т.Г., Левина Т.Н., Козинец Г.И. Параметры клеточного цикла клеток костного мозга у больных множественной миеломой и лимфосаркомой И Клиническая лабораторная диагностика, №5, 1997, С.77.

Приношу глубокую благодарность за помощь и совместную работу:

Козинцу Г.И., Сарычевой Т.Г., Шишкановой З.Г., Дягилевой O.A., Никитину И.К., Орловой Г.К., Калинину H.H., Петрову М.М., Цыбе H.H., Горбуновой H.A., Шмарову Д.А., Стрелецкой Е.А., Наумовой И.Н., Поповой О.В., Каталиной B.C., Князевой Е.С., Витвицкому В.М., Ершовой Л.И., Лиховецкой З.М., Курбановой Г.Н., Максимову П.И., сотрудникам лаборатории гемоцитологии и других подразделений ГНЦ РАМН.

Актуальность проблемы. К сожалению, современная цивилизация с высоким уровнем промышленного производства, урбанизации, роста народонаселения, вплотную сталкивается со значительным ухудшением условий окружающей среды, которое неминуемо ведёт за собой неблагоприятные воздействия на организм человека. Это ставит в повестку дня создание минимально инвазивных и максимально информативных методов контроля состояния организма. Этим требованиям отвечают исследования состояния системы крови, которое прямо или косвенно отражает влияние различных факторов среды, позволяет оценить уровень вредных воздействий и реакцию организма на них, в частности, его адаптационные возможности.

Клинический анализ крови является одним из наиболее распространённых клинико-лабораторных исследований в медицинской практике. Многие десятилетия при изучении гематологических показателей пользовались ручными методами. За последние годы созданы высокотехнологические системы анализа крови, которые вытесняют ручные и полуавтоматические методы исследования. Преимуществами автоматического анализа крови являются: высокая производительность (до 100 и более проб в час), небольшой объём крови (12-50мкл), оценка более 20 показателей, вместо 10-12 при обычном анализе крови, графическое представление распределения клеток (гистограммы, скетограммы), высокая точность исследования, так как подсчёту подвергаются несколько тысяч клеток из одной пробы. В настоящее время выпускается большое количество гематологических анализаторов, различных по степени сложности - один из них счётчик среднего класса «Cobas Micros 18 ОТ» фирмы «Hoffmann-La Roche", Швейцария. Он является полностью автоматизированным гематологическим анализатором и используется для диагностического тестирования цельной крови in vitro.

К сожалению, проточные счётчики используются при обследовании доноров (зарубежный опыт) и практически нет данных об их применении для оценки и стандартизации получаемых компонентов крови, что крайне необходимо для проведения современной компонентной терапии.

Цель настоящей работы оценить возможность использования современного проточного счётчика среднего класса «Cobas Micros 18 ОТ», в обследовании доноров и дать количественно-качественную характеристику цельной крови и получаемых из неё компонентов.

Основные задачи исследования.

1. Сравнительный анализ параметров крови доноров, полученных на гематологическом анализаторе «Cobas Micros 18 ОТ» и при световой микроскопии.

2. Количественно - качественная характеристика полученных клеточных компонентов крови с применением счётчика среднего класса «Cobas Micros 18 ОТ» и последующим анализом эритроцитов на сканирующем электронном микроскопе.

3. Оценка чистоты полученных компонентов крови (характеристика клеточных примесей) с использованием счётчика среднего класса «Cobas Micros 18 ОТ".

Научная новизна работы. Оценены результаты использования гематологического анализатора в службе крови. Получены данные: обследования доноров крови, количественная и качественная характеристика цельной крови в мешке, чистоты фракций плазмы, концентрата эритроцитов, концентрата тромбоцитов. Дана морфофункциональная оценка эритроцитов при длительном хранении концентрата эритроцитов в растворах SAGM, Адсол и CPD.

Теоретическое и практическое значение. На основании проделанной работы даны практические рекомендации по использованию гематологического анализатора «Cobas Micros 18 ОТ" для обследования доноров крови, подсчёта гранулоцитов, эритроцитов, тромбоцитов при проведении современной компонентной терапии.

Реализация результатов исследования. Внедрение полученных результатов в практику осуществляется следующими путями:

1. Результаты исследований опубликованы в 18-и печатных изданиях, докладывались научных и научно-практических конференциях.

2. Проведено внедрение гематологического анализатора «Cobas Micros» на станциях переливания крови (7 ГКБ г.Москвы, ГНЦ РАМН).

3. Разработана «Инструкция по фракционированию консервированной крови с использованием контейнеров Оптипэк, полуавтоматических плазмоэкстракторов Оптипресс и аппаратов для стерильного соединения трубок», утверждённая Министерством здравоохранения РФ, от 29.06.1999г.

Положения выносимые на защиту.

1. Проведена апробация и разработаны рекомендации использования гематологического анализатора среднего класса для обследования доноров, а также для эффективного контроля за чистотой и качеством получаемых компонентов крови.

2. Получены данные, характеризующие эритроциты при длительном хранении концентрата эритроцитов в растворах SAGM, Адсол и CPD, свидетельствующие о достоверном снижении количества эритроцитов на 10-11% к 21-41 суткам хранения в растворе SAGM. Электронно-микроскопическое изучение эритроцитов, хранящихся в 7 растворах БАвМ, Адсол и СРБ, показало однотипное изменение морфологии этих клеток - трансформация осуществлялась по пути диск-эхиноцит-сфера. Отличие заключалось в количественном соотношении различных форм эритроцитов в одни и те же сроки хранения и времени уменьшения дискоцитов. После помещения эритроцитов (на 28-42 сутки хранения) в свежую плазму, наблюдалось некоторое восстановление эхиноцитов в дискоциты, более эффективное в случае хранения клеток в растворе Адсол.

3. Количественная и качественная характеристика концентратов тромбоцитов зависит от метода их получения. Наилучшим является концентрат тромбоцитов, полученный на сепараторе крови, при котором средний выход тромбоцитов составляет 540±14х109, а примесь лейкоцитов 0,01 ±0,0015x10%.

Апробация диссертации. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: V съезде специалистов по лабораторной диагностике (Москва, 1995г.); Конференции «Анализ изображения клеток системы крови: настоящее и будущее» (Москва, 1996г.); Симпозиуме «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва 1997г.); XVI Научно-практической конференции: "Морфометрия в диагностике болезней" (Москва, 1998г.).

ВЫВОДЫ.

1. Гематологический анализатор среднего класса «Cobas Micros 18 ОТ» может быть использован в службе крови, он существенно оптимизирует процесс обследования доноров и обеспечивает эффективный количественный контроль за чистотой и качеством получаемых компонентов крови.

2. При обследовании крови здоровых людей (доноров) на гематологическом анализаторе «Cobas Micros 18 ОТ» получены гемограммы, не отличающиеся от общепринятых показателей нормы.

3. С помощью счётчика «Cobas Micros 18 ОТ» выявлены различия в показаниях гемограмм из капиллярной крови и мешка-контейнера одного и того же донора, обусловленные разведением крови стабилизирующим раствором. В лейкоцитарной формуле (из мешка) отмечалась тенденция к снижению абсолютных значений моноцитов на 3%, гранулоцитов - на 17% и лимфоцитов - на 14%.

4. Оценка длительного хранения (до 41 суток), концентрата эритроцитов в стабилизирующем растворе SAGM свидетельствует о достоверном снижении количества эритроцитов (на 11-12%) к 21-41 суткам.

5. Электронно-микроскопическое изучение эритроцитов, хранящихся в растворах SAGM, Адсол и CPD показало однотипное изменение морфологии этих клеток: трансформации по пути диск-эхиноцит-сфера. Отличие заключалось в количественном соотношении различных форм эритроцитов в одни и те же сроки хранения, в растворах SAGM, Адсол и CPD. Более эффективное восстановление эхиноцитов в дискоциты при помещении в свежую плазму отмечено в растворе Адсол.

6. Количественный и качественный состав концентрата тромбоцитов, зависит от способа его заготовки, как показали

113 исследования на счётчике «Cobas Micros 18 ОТ». Концентрат тромбоцитов, полученный на сепараторах крови от одного донора, является оптимальным, при котором выход тромбоцитов составляет 540+14x109, примесь лейкоцитов - 0,01±0,0015x10%.

7. При исследование компонента крови - свежей плазмы на проточном счётчике не отмечено наличия каких-либо клеточных примесей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

За последние 15-20 лет произошло существенное развитие технологии и аппаратуры для автоматического исследования клеток крови, основанного на принципе проточной цитометрии. На всех стадиях проведения анализа достигнут достаточно высокий уровень автоматизации - от взятия исследуемой пробы до представления конечных результатов. В развитых странах мира автоматический анализ крови почти полностью вытеснил ручные и полуавтоматические методы. В нашей же стране доля ручного труда при выполнении клинического анализа крови остаётся ещё достаточно высокой. Использование счётчиков значительно облегчает труд работников лабораторий, повышает его производительность, а кроме того улучшает качество и точность анализов.

В работе был использован полностью автоматизированный гематологический анализатор «Cobas Micros 18 ОТ» Roche, Швейцария, позволяющий определять 18 параметров в 12 мкл цельной крови, взятой с антикоагулянтом ЭДТА. Скорость определений 45 образцов в час. Малогабаритный принтер печатает все результаты, включая флаги и графики.

Предварительно в начале работы был проведён сравнительный подсчёт эритроцитов и лейкоцитов из периферической крови от 10 здоровых людей и 20 гематологических больных в камере Горяева и на гематологическом анализаторе. Полученные данные отличались минимально. Однако, время, затрачиваемое на подготовку и подсчёт эритроцитов, лейкоцитов в камере Горяева значительно превышает время, затрачиваемое счётчиком (один анализ: 18 параметров, включая лейкоцитарную формулу, графики) - 2 минуты.

При визуальном анализе лейкоцитарной формулы у 27 доноров крови, 72 негематологических больных и 20 обследованных детей из Брянской области; и при подсчёте на автоматическом анализаторе, были получены сопоставимые данные. Хотя прибор не определяет палочкоядерные нейтрофилы и более молодые клетки этого ряда, эозинофильные и базофильные клетки, он имеет систему флагов. Все аномалии, отмеченные флагами, должны быть проверены морфологическим исследованием специалиста в мазке крови при световой микроскопии для выявления патологических и неопределяемых прибором элементов.

Cobas Micros» удобен при подсчёте жидкой крови в условиях поликлиники, стационара, при больших диспансерных обследованиях и особенно при массовом обследовании доноров. Такой гематологический анализатор необходим на современных станциях переливания крови. Он позволяет быстро оценить гематологические параметры (лейкоциты, эритроциты, гемоглобин, тромбоциты и др.) донора перед кроводачей.

С помощью счётчика было обследовано 100 доноров крови (50 мужчин и 50 женщин), полученные показатели не выходили за рамки «стандартных» нормативных параметров, утверждённых Минздравом РФ. С помощью гематологического анализатора "Cobas Micros» можно получить дополнительные параметры исследования крови, что обычными методами сделать невозможно. Для показателей, в качестве стандартных, выбраны нормативные значения предлагаемые фирмой.

У большинства доноров, регулярно сдающих кровь с интервалом не менее 2 мес. (4-5 раз в течение 12 мес.), морфологическая картина крови, костного мозга, биохимический состав крови, показатели свёртывающей системы и гемодинамические данные не отличаются от таковых у здоровых лиц, никогда не сдававших кровь.

Естественно возникает вопрос о стабильности кроветворения, т.е. в каких пределах варьируют, параметры нормального кроветворения и где начинается патология? Для ответа на эти вопросы в нашем центре с учётом собственных многолетних работ, были проанализированы данные литературы за 1890-1998 годы. Согласно этим данным, количество лейкоцитов, эритроцитов, гемоглобина и величина гематокрита как у мужчин, так и у женщин характеризуется минимальной вариабельностью и за обозримый промежуток времени не претерпело каких-либо изменений. Факторами, влияющими на кроветворение и обеспечивающими его стабильность, являются постоянная концентрация кислорода в окружающей среде, земная гравитация и минимальная «естественная радиация». Важно, что все эти факторы присутствовали в течение всего процесса эволюции на Земле, при этом величина гравитационного поля была постоянной.

Донорами, в нашей стране, по законодательству могут быть здоровые люди в возрасте от 18 до 60 лет. Однако, современная демографическая ситуация характеризуется общим постарением населения и ростом доли людей старше 65 лет. Наступление старости -индивидуально и далеко не всегда совпадает её «календарное» и «физиологическое» время.

Наблюдаются ли в крови здоровых людей пожилого возраста изменения, связанные исключительно с возрастом? Отвечая на этот вопрос, было проведено обследование 40 пожилых людей (20 мужчин и 20 женщин) в возрасте от 60 до 83 лет (средний возраст составлял 67 лет). Все они вели активный образ жизни (работали). Контрольную группу составили 40 человек (20 мужчин и 20 женщин) в возрасте от 25 до 50 лет. Материалом исследования служила периферическая кровь. Подсчёт показателей жидкой крови производили на гематологическом анализаторе. Подсчёт лейкоцитарной формулы осуществляли параллельно на приборе и визуально в световом микроскопе. При исследовании клеток крови этими методами статистической разницы не выявлено.

При анализе данных, полученных при подсчёте элементов жидкой крови, была выявлена тенденция к уменьшению тромбоцитов у лиц старше 60 лет, но изменения находились в пределах нормы. При подсчёте лейкоцитарной формулы особых изменений не выявлено, хотя у отдельных лиц (женщин) была тенденция к увеличению лимфоцитов и палочкоядерных нейтрофилов, у женщин старше 60 лет было также более высокое СОЭ (до 18 мм/ в час), но эти изменения также были в пределах верхней границы нормы.

Таким образом, проведённое исследование показывает, что нет видимых возрастных изменений в кроветворении. Это позволяет думать о расширении границ донорства и в определённых ситуациях использовать кровь пожилых людей.

Ведущим направлением современной трансфузиологии является гемокомпонентная терапия, под которой подразумевается целенаправленное восполнение дефицита клеточных и плазменных факторов у больных людей. Постоянно растущие требования к качеству компонентов крови и стремление максимально уменьшить примесь лейкоцитов, являющихся одной из причин посттрансфузионных реакций и осложнений. Неудовлетворённость методом получения тромбоцитов из обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП), обусловленная высокой контаминацией лейкоцитами концентратов тромбоцитов (КТ), способствовала разработке и внедрению в практику службы крови новых технологий выделения лейкотромбоцитарного слоя (ЛТС). В этих технологиях используются полуавтоматические плазмоэкстракторы и контейнеры (с верхним и нижним выходом), дополнительные растворы консерванта для длительного хранения эритроцитов (ресуспензирующий раствор), а также аппараты для стерильного соединения трубок. Всё это позволяет осуществить получение качественно новых компонентов крови. Основными преимуществами технологии фракционирования крови, получившей название «Оптисистем», являются комплексность, безотходность и возможность получения компонентов крови со стабильными характеристиками и низкой контаминацией лейкоцитами в условиях «закрытой системы» на протяжении всего цикла (процесса) фракционирования крови.

Одним из важных путей дальнейшего совершенствования гемокомпонентной терапии является обеспечение высокого качества заготавливаемых компонентов крови. Одновременно с этим необходима максимальная информация о составе компонентов крови, что позволит чётко сформулировать определённые требования, предъявляемые к гемокомпонентам при их заготовке, хранении, транспортировке и переливании.

В связи с отсутствием в научной литературе данных, суммирующих использование проточных анализаторов для вышеуказанных целей, нами и было предпринято исследование компонентов крови. Все исследуемые компоненты крови получены методом «Оптисистем».

Для характеристики клеточного состава (гемограммы) крови доноров и цельной крови в мешке было проведено исследование с помощью гематологического анализатора "Cobas Micros 18 ОТ». Материалом служили образцы капиллярной крови, взятой с антикоагулянтом ЭДТА до кроводачи и цельной крови, забранной у того же донора в пластиковый контейнер "Оптипек" (Baxter). Контейнер содержал 63 мл раствора CPD; в него забирали 450 мл венозной крови. Всего обследовано 10 доноров. Результаты исследований показали, что параметры цельной крови были снижены по сравнению с капиллярной за счёт разведения стабилизирующим раствором СРБ. Степень снижения при подсчёте количества эритроцитов (12,3%), лейкоцитов (на 14,1%), гемоглобина (на 13,5%), гематокрита (на 12,8) хорошо соответствовала разведению (на 14%).

Параметры эритроцитов: средний корпускулярный объём эритроцитов (МСУ), среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН), средняя концентрация гемоглобина (МСНС) и ширина распределения эритроцитов по объёму (КО\¥) практически не изменялись (средние значения отличались на 0,5-1,5%). Число тромбоцитов было снижено на 25%, а тромбокрит на 28,8%. Отмечалась также тенденция к снижению среднего объёма тромбоцитов(МРУ на 6,5%) и ширины распределения тромбоцитов по объёму (PDW на 9,1%). Со стороны лейкоцитарной формулы отмечалась тенденция к снижению абсолютных значений моноцитов на 3%, гранулоцитов на 17% и лимфоцитов на 14%.

Таким образом, основные показатели клеточного состава крови доноров и свежезаготовленной цельной крови в пластиковых контейнерах хорошо соответствовали друг другу. Снижение показателей тромбоцитов в цельной крови на величины, превышающие ожидаемые значения (связанные с разбавлением), обусловлено, вероятно, специфическими свойствами этих клеток. Полученные данные можно использовать при разработке стандартов для исследования крови доноров и компонентов крови.

При исследовании 100 доз плазмы отмечено отсутствие клеточных примесей, что характеризует её чистоту.

Помимо выше изложенного, нами были также исследованы донорские эритроциты при длительном хранении в растворе 8АОМ (до 41 суток).

Результаты исследований свидетельствуют о достоверном снижении (на 11-12 %) количества эритроцитов соответственно к 21-41 суткам хранения у доноров (мужчин и женщин). Достоверных изменений содержания гемоглобина у доноров не отмечено в сравнении с "0" временем. Снижение лейкоцитов у доноров (мужчин и женщин) наблюдается на 21 сутки хранения (9,9%, 11,9%) соответственно. К 35 суткам хранения число лейкоцитов уменьшается у мужчин (на 27,1%), у женщин (на 23,2%), однако достоверности в различии по сравнению с «0» сутками нет. На 41 сутки хранения количество лейкоцитов у женщин практически не меняется по сравнению с «35» сутками (0,8%), у мужчин к 41 суткам по сравнению с «0» падение числа лейкоцитов достигает 30,4% и является достоверным (Р<0,05).

Известно, что по мере хранения консервированной крови при 4°С происходит снижение жизнеспособности и функциональной полноценности эритроцитов в связи с истощением их внутри клеточных систем, и в первую очередь АТФ. Морфологические изменения служат одним из первых признаков деструкции эритроцитов консервированной крови.

По данным электронной микроскопии количество дискоцитов на 21 сутки наблюдения значительно снижено в основном за счет увеличения эхиноцитов. Эта тенденция сохранялась в последующие изучаемые сроки хранения эритроцитов: на 41 сутки количество дискоцитов достоверно было сниженным в сравнении с 35 сутками более чем в 2 раза. Известно, что эхиноциты способны к обратной трансформации, восстанавливая свою дисковидную форму, при помещении их в свежую плазму. Количество сфероцитов увеличивалось к 21 суткам наблюдения, в последующие сроки достоверных изменений в их содержании не отмечается. Сфероциты не способны к обратной трансформации, являясь предгемолитическими формами. Разницы в количественном распределении форм эритроцитов не обнаружено у доноров: мужчин и женщин.

Таким образом, проведённые исследования свидетельствуют о том, что по мере хранения концентрата эритроцитов в течение 41 суток в растворе 8АОМ наблюдаются морфологические изменения эритроцитов: снижение количества дискоцитов за счёт увеличения преимущественно числа эхиноцитов и сфероцитов.

С учётом полученных ранее результатов исследований, была проведена сравнительная оценка качества концентрата эритроцитов при длительном хранении (42 суток) в консерванте СРБ с дополнительным раствором Адсол (опытный раствор) и в СРБ (28 суток) без дополнительного раствора (контрольный раствор). Установлено, что при длительном (42 суток) хранении концентрата эритроцитов в растворе Адсол количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, величина гематокрита, а также средний объём эритроцитов, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах и ширина распределения эритроцитов по объёму достоверно не изменялись в течение всего срока наблюдения. В группе исследований (хранение эритроконцентрата в растворе СРБ) также не отмечалось существенных изменений этих показателей в динамике хранения.

Электронно-микроскопическое изучение эритроцитов, хранящихся в растворе Адсол и СРБ, показало однотипное изменение морфологии этих клеток: транформация осуществляется по пути диск-эхиноцит-сфера. Отличие заключалось в количественном соотношении различных форм эритроцитов в одни и те же сроки хранения и времени истощения дискоцитов.

Уменьшение дискоцитов в растворе Адсол отмечено на 7 сутки в основном за счёт увеличения эхиноцитов, находящихся в 1-ой стадии трансформации, то есть с кренацией мембраны эритроцитов, которые способны быстро восстанавливать свою форму. На 14-е сутки количество дискоцитов заметно уменьшилось за счёт увеличения эхиноцитов 1-П -ой стадий трансформации. В этот период увеличивается число сфероцитов с большими отростками. В последующие сроки хранения концентрата эритроцитов изменения касались главным образом морфологии сфероцитов; преобладали гладкие формы. Максимальные морфологические изменения отмечены на 42 сутки хранения.

Известно, что эхиноциты и сфероциты с большими отростками обратно трансформируются и восстанавливают свою дисковидную форму, при помещении их в свежую плазму. В то же время гладкие сфероциты, а также сфероциты с малым количеством истончённых отростков не способны к обратной трансформации, при помещении их в свежую плазму. Они могут лишь гемолизироваться и элиминироваться из кровотока. Результаты проведённого нами исследования по изучению способности эритроцитов к обратной трансформации, свидетельствуют о том, что на 28 сутки хранения в растворе Адсол количество восстановленных дискоцитов достигло 69% (до помещения в плазму -17%). В дальнейшем, способность восстанавливать свою форму была слабее. Результаты, полученные при аналогичном исследовании эритроцитов, хранящихся в растворе СРБ, свидетельствуют о менее выраженном процессе восстановления формы эритроцитов: количество дискоцитов было меньшим в 2,5-3 раза, а сфероцитов - больше на 2025%. Увеличение предгемолитических форм (сфероцитов) согласуется с более выраженным процессом гемолиза по показателям свободного гемоглобина и деформируемости эритроцитов в растворе СРБ.

Таким образом, изучение динамики изменений количественного и качественного состояния эритроцитов свидетельствует о лучшей сохранности эритроцитов хранимых в растворе Адсол. Результаты исследований показывают менее выраженные процессы гемолиза по показателям выхода гемоглобина, деформируемости эритроцитов, содержанию АТФ и сатурации кислорода в сравнении с CPD.

Заместительная терапия тромбоцитами является крайне актуальной. Успех лечения тробоцитопенического геморрагического синдрома зависит от количества перелитых тромбоцитов и их функциональной полноценности.

В настоящее время, для получения концентрата тромбоцитов (КТ) используется 4 основные методики. Первая и вторая - получение концентрата тромбоцитов из отдельных доз цельной крови с последующим её фракционированием на центрифугах и выделением лейкотромбоцитарного слоя (JITC) ручным способом или с использованием метода «Оптисистем». Третья - методом 4-х кратного тромбоцитафереза (ТЦФ) получение концентрата тромбоцитов осуществляется путём поэтапной 4-кратной эксфузии дозы крови у донора и получения из каждой тромбоцитов при помощи рефрижераторных центрифуг и пластикатных контейнеров. Четвёртая -получение концентрата тромбоцитов на сепараторах крови (аппаратный тромбоцитаферез), что позволяет получить требуемое количество тромбоцитов для больного от одного донора. В среднем для получения концентрата тромбоцитов перерабатывается около 5 литров крови.

Проведённое исследование, с помощью счётчика среднего класса «Cobas Micros 18 ОТ» показало, что наибольший выход тромбоцитов от одного донора достигается получением концентрата тромбоцитов методами: сепараторного выделения — 540±14х109/л и 4-х кратного ТЦФ - 244±8х109/л. Примесь лейкоцитов в этих концентратах тромбоцитов, составляет при сепараторном выделении - 0,01±0,0015х109/л, при 4-х кратном ТЦФ выше - 0,5±0,08x10%. Выход тромбоцитов из единичных доз лейкотромбоцитарного слоя: с применением метода «Оптисистем» выше 68±2х109/л, чем при обычном методе выделения 55±2х109/л (пересчёт на вес мешка). Примесь лейкоцитов ниже в концентрате тромбоцитов, полученном методом «Оптисистем» 0,2±0,01х109/л, за счёт автоматического выделения лейкотромбоцитарного слоя, при «ручном» способе - 0,5±0,02х109/л.

Качественный состав, полученных различными методами концентратов тромбоцитов определяет их дифференцированное использование. Многократные переливания концентрата тромбоцитов увеличивают риск сенсибилизации. Получение концентратов тромбоцитов на сепараторах крови в большой дозе и с минимальной примесью лейкоцитов, обеспечивает высокий посттрансфузионный прирост тромбоцитов и хорошую эффективность.

Также, было проведено исследование количественной характеристики концентрата тромбоцитов, полученных из 1,3,4,5 доз лейкотромбоцитарного слоя. Фракционирование крови осуществлялось с использованием метода «Оптисистем», кровь забиралась в счетверённые контейнеры с верхним и нижним выходом и растворами СРБ и Адсол (КХЖ1674, Орйрас, Вах1ег8А). После центрифугирования (5100§-13 минут) с использованием автоматического плазмоэкстрактора выделялась нативная плазма, лейкотромбоцитарный слой сохранялся в первичном контейнере, а эритроциты выделялись в отдельный контейнер с дополнительным раствором Адсол, лейкотромбоцитарный слой хранился при комнатной температуре в течение ночи. Важно отметить то, что формирование пулов или работа с единичной дозой концентрата тромбоцитов начинается после завершения рабочего дня, т.е. после выбраковки всех позитивных или сомнительных доз крови.

Получение концентрата тромбоцитов из единичной дозы лейкотромбоцитарного слоя и из пула 3,4,5 ЛТС показало, что выход

Ill тромбоцитов из пула значительно выше. Примесь лейкоцитов в пулах концентрата тромбоцитов ниже, чем в единичной дозе. Большой разброс выхода тромбоцитов из единичного лейкотромбоцитарного слоя заставил многих отказаться от их получения, что и произошло в банках крови Европы.

Таким образом, гематологический анализатор среднего класса «Cobas Micros 18 ОТ», испытанный нами, характеризуется высокой точностью, производительностью до 45 образцов в час, что очень важно при массовых обследованиях доноров крови. Ценным в аппарате является и распечатка полученных результатов. Использование анализатора в службе крови позволяет определить различного рода примеси при получении тех или иных компонентов крови, т.е. внести определённую стандартизацию в оценку качества получаемых препаратов, включая и анализ распределения клеток по объёму, что важно для получения качественной информации об исследуемых компонентах крови.