Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Современные особенности этиологической структуры, клинического течения, диагностики показателей местного иммунитета и терапии больных кандидозным вульвовагинитом

На правах рукописи

ООЗ 17 { ГЛ. *

Просовецкая Анна Леонидовна

Современные особенности этиологической структуры, клинического течения, диагностики, показателей местного иммунитета и терапии больных кандидозным вульвовагинитом

14 00 11 - Кожные и венерические болезни

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

17 янв

Москва 2007 г

003177721

Работа выполнена в отделении урогснитальных инфекционных заболеваний Федерального Государственного учреждения «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Росмедтехнологий»

Научные руководители кандидат медицинских наук, доцент

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Рахматулина Маргарита Рафиковна

Степанова Жанна Васильевна

доктор медицинских наук, профессор Липова Елена

Валерьевна

Ведущее научное учреждение Российский Университет Дружбы Народов

Защита диссертации состоится « ¡13 » на

заседании Диссертационного совета (Д 208 115 01) при ФГУ «ЦНИКВИ Росмедтехнологий» по адресу 107076, Москва, ул Короленко, д 3, стр 6

Автореферат разослан « » декабря 2007 года.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ЦНИКВИ Росмедтехнологий»

Ученый секретарь Диссертационного совета, Иванова Наталья

Кандидат медицинских наук Константиновна

Актуальность проблемы

Частота ршистрации кандидозного вульвовагинита (КВВ) за последние 10 лет почти удвоилась и составляет от 30 до 45% в структуре инфекционных поражений вульвы и влагалища Установлено, что 70-75% женщин имеют в течение жизни хотя бы один эпизод кандидозного вульвовагинита, при этом в 510% случаев заболевание становится рецидивирующим (Sobel J D ,199В) Особенностью данной инфекции является длительное течение, возможность распространения на друше органы и системы с развитием в 20-30% случаев генерализованных форм кандидоза у иммунокомпроментированных больных (Сергеев А Ю , Сергеев Ю В , 2000, Серова В Н , 2002, Касабулатов Н М , 2003)

По данным отечественных авторов, в России до недавнего времени обнаружение Candida albicans отмечалось не менее чем в 80% наблюдений КВВ (Ахрарова JIM, 1993, Сергеев АЮ, Сергеев ЮВ, 2000) Среди остальных представителей рода Candida клиническое значение в развитии кандидозного вульвовагинита имеют Cglabrata (-10%), С parapsdosis (-7%), С tropicalis (-4%), реже С krusei, С pseudotropicahs, Saccharomyccs cerevisiae (Кисина В И, Степанова Ж В, 2002) Видовая неоднородность возбудителей кандидозного вульвовагинита проявляется различиями в клинической картине, а также развитием устойчивости некоторых видов к противогрибковым средствам

Гуморальный иммунный ответ в лимфоидной ткани, связанной со слизистыми оболочками, имеет особенности, заключающиеся в формировании преимущественно ТЬ2-типа с высоким уровнем трансформирующего фактора роста ß Активированные ТЬ2-типа наряду с другими цитокинами продуцируют интерлейкин - 5 (ИЛ-5), поддерживающий пролиферацию и дифференцировку преимущественно Ig А позитивных клеток и считается цитокином, обеспечивающим защиту слизистых оболочек (Ярилин А А, 1999, Карсонова МИ, Пинегин БВ, 2003, Granger S Е, 1992, Fiedel Р, 1996) Результаты исследования в вагинальном экссудате трансформирующего фактора ß и ИЛ-5 позволяют судить о способности лимфоидных клеток, связанных со слизистыми оболочками влагалища, развивать иммунный ответ на кандидозную инфекцию и обеспечить защиту от нее

В настоящее время диагноз кандидозного вульвовагинита устанавливается на основании данных клинических проявлений, бактериоскопического и культурального методов исследований Развитие современных генотехнологий в выявлении различных возбудителей диктует необходимость применения новых методик В частности, метод количественного определения ДНК инфекционного агента в процессе лечения позволяет прогнозировать периоды обострения хронического заболевания, а также дает возможность получить информацию об эффективности проводимой антикандидозной терапии

Этиологическая неоднородность возбудителя влечет за собой не только различия в клинических проявлениях заболевания, но и различия в чувствительности к применяемым антимикотическим препаратам По данным проводимых в России исследований чувствительность к флуконазолу С albicans составляет 97,4%,

Сglabrata — 58,6% (Страчунский J1 С , 2004) Данные о резистентности к наиболее широко используемому антимикотическому препарату в России определяют необходимость поиска новых антимикотических средств и проведения исследований в данном направлении

Цель исследования: изучить современные особенности видового спектра возбудителя, клинического течения заболевания, показателей местного иммунитета и оптимизировать диагностику и терапию больных кандидозным вульвовагинитом

Задачи исследования

1 Изучить этиологические особенности кандидозного вульвовагинита и особенности клинического течения в зависимости от видового состава возбудителя

2 Изучить чувствительность грибов рода Candida к антимикотическим препаратам в зависимости от видового состава возбудителя

3 Оценить значимость метода Real-time PCR в диагностике кандидозного вульвовагинита

4 Изучить особенности местного иммунитета больных кандидозным вульвовагинитом путем определения уровня интерлейкина-5 и трансформирующего фактора роста ß во влагалищном экссудате и установить взаимосвязь между содержанием цитокинов, клиническими проявлениями заболевания и длительностью течения заболевания

5 Разработать оптимальный режим дозирования Итраконазола вагинальные таблетки для лечения больных кандидозным вульвовагинитом путем оценки эффективности, безопасности и переносимости препарата

Научная новизна

Показано, что Real-time PCR является высоко чувствительным и высоко специфичным методом для определения вида возбудителя кандидозного вульвовагинита

Впервые у женщин с кандидозным вульвовагинитом для оценки антиинфекционных факторов защиты влагалища было проведено исследование содержания цитокинов, участвующих в синтезе секреторного иммуноглобулина, интерлейкина 5 и трансформирующего фактора роста ß Установлено, что интерлейкин 5 и трансформирующий фактор роста ß у больных кандидозным вульвовагинитом определяется в низких концентрациях и их дефицит нарастает при выраженных признаках воспаления, обильном росте Candida и увеличении продолжительности заболевания

Впервые изучена эффективность, безопасность и переносимость Итраконазола для местного применения в лечении больных кандидозным вульвовагинитом при различных режимах дозирования препарата Установлено, что оптимальной дозировкой препарата для местного применения является Итраконазол вагинальные таблетки 200 мг

Практическая значимость работы

Установлено, что основным возбудителем кандидозного вульвовагинита является Candida albicans с характерными клиническими проявлениями в виде зуда и жжения в аногенитальной области, творожистых выделений из половых путей, а также гиперемии слизистых оболочек вульвы и влагалища и творожистого отделяемого в заднем своде влагалища, чувствительный в 100% наблюдений к исследуемым препаратам Для клинических проявлений, вызванных Candida glabrata, характерно отсутствие выраженных воспалительных явлений

Впервые установлена роль интерлейкина 5 и трансформирующего

фактора роста ß, определяемых в содержимом влагалища у женщин с

кандидозным вульвовагинитом, в оценке противоинфекционной защиты слизистой оболочки влагалища

Показано, что метод Real-time PCR является высокочувствительным и высокоспецифичным методом определения С albicans в патологическом материале от больных кандидозным вульвовагинитом

Определен оптимальный режим дозирования (200 мг) препарата Итраконазол вагинальные таблетки для терапии рецидивирующего кандидозного вульвовагинита

Основные положения, выносимые на защиту

Клинические проявления и чувствительность к антимикотическим препаратам зависят от видового состава возбудителя На современном этапе основным возбудителем кандидозного вульвовагинита остается Candida albicans с характерными проявлениями в виде зуда и жжения в аногенитальной области, творожистых выделений из половых путей, гиперемии слизистых оболочек вульвы и влагалища Продемонстрировано, что для кандидозного вульвовагинита, вызванного Candida glabrata характерно отсутствие выраженных воспалительных явлении даже при обильном росте возбудителя Для сочетания С albicans и С glabrata характерны выраженные воспалительные явления в клинической картине в сочетании с преобладающим ростом Candida glabrata при культуральном исследовании

Метод полимеразной цепной реакции с гибридизационно флуоресцентной детекцией в реальном времени является высокочувствительным и высокоспецифичным при определении вида возбудителя кандидозного вульвовагинита и количественной оценки его содержания

У женщин с кандидозным вульвовагинитом в содержимом заднего свода влагалища наблюдается дефицит интерлейкина 5 и трансформирующего фактора роста ß - у 46 (76,7±5,5%) и у 31 (51,7± 6,5 %) соответственно Дефицит интерлейкина 5 и трансформирующего фактора роста ß достоверно

часто определяется у женщин с кандидозным вульвовагинитом с обильными вагинальными выделениями при обильном росте Candida albicans и длительно болеющих, что свидетельствует о снижении локального иммунитета слизистых оболочек влагалища

Максимальная эффективность и наилучшая переносимость при использовании препарата для местного применения Итраконазол установлена для дозировки 200 мг

Внедрение в практику. Полученные результаты внедрены в практику работы консультативно-диагностического отделения ФГУ «ЦНИКВИ Росмедтехнологий»

По теме диссертационной работы опубликовано 13 работ

Апробация диссертационного материала. Результаты проведенных исследований представлены в докладах на научно-практической конференции в ФГУ «ЦНИКВИ Росмедтехнологий» 24 02 200бг и на IX Всероссийской конференции дерматовенерологов 1-2 июня 2006г г Екатеринбург

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов исследования, 7 глав, содержащих результаты собственных исследования, заключения, выводов, списка литературы, включающего 121 отечественных и зарубежных источников

Работа изложена на 125 страницах машинописного текста,

иллюстрирована 19 таблицами и 3 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Клинический раздел работы проводился на базе ФГУ «ЦНИКВИ Росмедтехнологий» в период с 2004 по 2007 год Было обследовано 145 женщин в возрасте от 19 до 45 лет, которые были разделены на следующие группы I группа была представлена 125 (86,2%) пациентками с признаками урогенитального кандидоза, обратившимися в консультативно-диагностическое отделение ФГУ «ЦНИКВИ Росмедтехнологий» В контрольную группу (II группа) вошли 20 практически здоровых женщин в возрасте от 19 до 46 лет, обследованных в ЦНИКВИ на наличие урогенитапьных инфекций I группа была условно разделена на две подгруппы 1а - 65 (52%) пациенток, получавших в качестве терапии Итраконазол, lb - 60 (48%) пациенток, получавших другие препараты для лечения кандидозного вульвовагинита

На этапе клинического обследования проводили анализ анамнеза жизни и болезни, общий и гинекологический осмотр пациенток Диагноз кандидоза гениталий устанавливали на основании клинических и лабораторных признаков Клинические признаки включали жалобы (выделения из половых путей различного характера и интенсивности, зуд, жжение наружных половых органов, болезненность мочеиспускания и полового акта) и объективные

признаки заболевания (выделения из половых путей различного характера, отечность и гиперемия слизистых оболочек вульвы, влагалища, эндоцервикса, кожи перианальной области)

При микробиологаческом исследовании клинического материала уретры, влагалища и шейки матки осуществляли идентификацию патогенных возбудителей, передаваемых половым путем {Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis), Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, а также условно-патогенных аэробных и анаэробных микроорганизмов с их количественным определением

Диагноз кандидоза считали подтвержденным при наличии вегетирующих форм Candida spp (почкующихся дрожжевых клеток, псевдомицелия и/или мицелия) в окрашенных по Граму мазках со слизистых оболочек вульвы, влагалища и эндоцервикса, а также при росте культуры на селективной среде >103 КОЕ/мл

Микологическое исследование включало выделение культуры Candida spp из исследуемого материала, определение вида и чувствительности возбудителей к антимикотическим препаратам in vitro С этой целью использовалась селективная среда Кандиселект (BIO-RAD)

Идентифицированная культура возбудителя исследовалась для определения чувствительности к антифунгальным препаратам (5-флюороцитозин, амфотерицин В, миконазол, кетоконазол, флуконазол, итраконазол) с использованием микропанели 60780 Фунгитест

Исследование влагалищного отделяемого для определения уровня ИЛ-5 и ТФР р - 1 проводилось методом ИФА с использованием наборов BIOSOURCE EUROPE SAh Bender MedSystems

Амплификация участка ДНК (метод ПЦР) и измерение флуоресцентного сигнала в реальном времени проводилась с использованием комплекта «АмплиСенс» (производство ЦНИИ Эпидемиологии) вариант FRT

Статистическую обработку данных выполняли с помощью параметрических и непараметрических методов в пакете прикладных программ STATISTICA for Windows 6 0 Для сравнения частотных характеристик качественных признаков использовали комплекс критериев (критерий уД критерий Фишера) Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05

Результаты исследования и их обсуждение.

Результаты изучения анамнеза и клинического анамнеза пациенток I и II групп На момент обращения в I группе пациентки предъявляли следующие жалобы на зуд в области половых органов — в 95 (76%), на жжение в аногенитальной области - в 77 (61,6%), на творожистые выделения из половых путей - в 88 (70,4%), на сливкообразные выделения - в 4 (3,2%), на пенистые выделения - в 2 (1,6%), на сухость во влагалище - в 4 (3,2%), на болезненность полового акта - в 8 (6,4%), на боли при мочеиспускании — в 8 (6,4%), на нарушения менструального цикла — в 2 наблюдениях (1,6%) Пациентки II группы жалоб при обращении не предъявляли

При оценке объективных симптомов заболевания у пациенток из I группы были выявлены следующие характерные клинические проявления свободные выделения из половых путей - у 40 пациенток (32,0%), гиперемия слизистой оболочки вульвы — у 95 (76,0%), гиперемия слизистой оболочки влагалища - у 110 (88,0%) При осмотре с помощью зеркал Куско творожистое отделяемое в заднем своде влагалища было выявлено у 75 (61,0%) пациенток, выделения сливкообразного характера зарегистрированы у 27 (21,6%), пенистого - у 2 (1,6%), слизистого - у 20 (16,0%) пациенток группы I (таблица 1)

Таблица 1

Клинические проявления заболевания у пациенток I группы

Признаки Абс %

Свободные выделения 40 32,0±4,17

Гиперемия слизистой оболочки вульвы 95 76,0+3,82

Гиперемия слизистой оболочки влагалища 110 88,0±2,91

Творожистое отделяемое 75 60,0±4,38

Сливкообразное отделяемое 27 21,6+3,68

Пенистое отделяемое 2 1,6+1,12

Слизистое отделяемое 20 16,0±3,28

При изучении роли различных предрасполагающих факторов в развитии кандидозного вульвовагинита были получены следующие данные Наиболее часто встречаемыми факторами являются отсутствие средств контрацепции (43,2+4,43%), использование КОК (28,0±4,02%) применение антибактериальных препаратов широкого спектра действия (25,6±3,90%), наличие в анамнезе ИППП и заболеваний желудочно-кишечного тракта (16,0±3,28% соответственно) Полученные результаты представлены в таблице 2

Сравнение факторов риска у пациенток основной и контрольной групп

Факторы риска Группа I Контрольная группа

Абс % Абс %

Отсутствие средств 43,2+4,4

контрацепции 54 3 7 35

Применение КОК 35 28±4,02 6 30

Применение

антибактериальных

препаратов широкого 25,6±3,9

спектра действия 32 0 1 5

16,0±3,2

Заболевания ЖКТ 20 8 2 10

Наличие ИППП в 16,0±3,2

анамнезе 20 8 4 20

Наличие

урогенитального кандидоза у 13,6±3,0

сексуального партнера 17 7 0 0

Наличие

гинекологических

заболеваний 12 9,6+2,63 6 30

Заболевания

эндокринной системы 11 8,8±2,53 3 15

""-различия достоверны (р<0,05)

При изучении сексуалыю1 о анамнеза было установлено, что наибольшая частота возникновения кандидозного вульвовагинита отмечалась у женщин с количеством сексуальных партнеров от 1 до 3 человек (52,0+4,47% наблюдений) Рисунок 1

Рисунок 1 .

Количество половых партнеров у пациенток основной группы 16,8%

ЕЭ1-3 человек Н 4-10 человек □ более 10 человек

Наличие урогенитального кандидоза у полового партнера статистически достоверно чаще встречалось у пациенток основной группы в сравнении с контрольной (р<0,05).

Таким образом, статистически значимые различия в факторах риска развития КВВ между пациентками контрольной и основной групп отмечались только в применении антибактериальных препаратов широкого спектра действия (р<0,05). Статистически значимые различия у пациенток I и П групп по другим исследуемым факторам выявлено не было.

Результаты микробиологического исследования пациенток I и II групп. В соответствии с поставленными задачами исследования, было проведено микробиологическое исследование пациенток основной и контрольной групп. Результаты микроскопического исследования материала, полученного со слизистой оболочки влагалища, представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Результаты бактериоскопического исследования влагалищного мазка у пациенток основной и контрольной групп

Количество лейкоцитов 1 группа (п=125) Контрольная группа (п=20)

Абс. % Абс. %

Единичные 10 8,0 10 50,0

До 10 в поле зрения 11 8.8 6 30,0

10-20 в поле зрения 34 27,2 1 5,0

20-30 в поле зрения 58 46,4 2 10,0

Более 30 в поле зрения 12 9,6 1 5,0

Почкующиеся дрожжевые клетки 110 88,0 - -

Обнаружение псевдомицелия 110 88,0 -

Приведенные в таблице результаты обследования демонстрируют выраженность лейкоцитарной реакции до 20-30 клеток в поле зрения у 58 (46,4%) пациенток основной группы (р<0,05). В контрольной группе наиболее часто отмечались единичные лейкоциты во влагалищном мазке - у 6 пациенток (50,0%) (р<0,05). Наличие почкующихся дрожжевых клеток и псевдомицелия отмечалось у ПО (88,0%) пациенток основной группы и не было выявлено у пациенток контрольной группы (р<0,05).

Всем пациенткам было проведено культуральное исследование вагинального экссудата для идентификации грибов Candida. Результаты культуралыюго исследования представлены на рисунке 2.

Рисунок 2.

Частота выявления различных возбудителей Candida

|ш С. albicans ■ С. glabrata О С albicans+C.glabrata

Полученные данные свидетельствуют, что при культуральном исследовании С. albicans была выявлена у 115 пациенток (92%), С. glabrata - 7 (5,6%), сочетание С. albicans и С. glabrata - 3 (2,4%), при этом наблюдался скудный рост С. albicans и обильный рост С. glabrata (данные представлены в таблице 4).

Таблица 4.

Результаты культурального исследования Candida spp.

Возбудитель Скудный рост Умеренный рост Обильный рост

С. albicans 5 (4,35 %) 83 (72,18 %) 27 (23,47 %)

С. glabrata 2 (28,57 %) 2 (28,57 %) 3 (42,86 %)

Клинические проявления заболевания демонстрировали зависимость от видового состава возбудителя. Так, клиническая картина кандидозного

вульвовагинита, вызванного С albicans, характеризовалась жалобами на зуд у 76,52% пациенток, жжение в области половых органов - у 60,87%, творожистые выделения из половых путей - у 73,91% пациенток, что отмечалось достоверно чаще, чем при вульвовагинитах, вызванных другими оцениваемыми возбудителями При осмотре свободные выделения отмечались в 32,17% наблюдений, гиперемия слизистой оболочки вульвы и влагалища в 78,26% и 89,57% наблюдений соответственно

Для клинических случаев, связанных с выявлением С glabrata, были характерны следующие проявления жалобы на зуд, жжение в области половых органов — у 4 (57,1%) пациенток Болезненность при половом акте выявлялась у 4 (57,1%), нарушение менструального цикла - у 2 (28,5%), сухость во влагалище - у 4 (57,1%), пенистые выделения из половых путей - у 2 (28,5%), на сливкообразные выделения из половых путей также у 2 (28,5%) пациенток, что отмечалось достоверно чаще, чем при вульвовагинитах, вызванных другими оцениваемыми возбудителями

При физикальном обследовании отмечались следующие проявления свободные выделения из половых путей - у 3 пациенток (42,8%), гиперемия слизистой оболочки вульвы - у 5 (71,4%), гиперемия слизистой оболочки влагалища - у 4 (57,1%) Отсутствие гиперемии слизистых оболочек вульвы и влагалища достоверно чаще отмечалось у 6 (85,7%) При осмотре с помощью зеркал Куско творожистое отделяемое в заднем своде влагалища было выявлено у 3 пациенток (42,8 %), сливкообразное - у 4 (57,1%)

При кандидозном вульвовагините, обусловленном сочетанием С albicans и С glabrata, отмечали следующие особенности клинических проявлений жалобы на зуд и жжение в аногенитальной области были зарегистрированы у 3 пациенток (100%), на творожистые выделения из половых путей - у 3 (100%) пациенток Осмотр пациенток дал следующие результаты гиперемия слизистых оболочек вульвы и влагалища отмечались у 3 (100%) пациенток, творожистое отделяемое в заднем своде влагалища - у 1 (33,3%), сливкообразное - у 2 (66,6%) пациенток

Проведенные исследования для определения чувствительности возбудителей кандидозного вульвовагинита показали, что все штаммы С albicans обладали 100% чувствительностью к изучаемым препаратам

Candida glabrata была чувствительна к 5 -флюороцитозину и амфотерицину В в 10 случаях (100 0%), к миконазолу - в 4 случаях (40,0%), к флюконазолу и кетоконазолу - в 3 случаях (30,0%) В 2 случаях (20,0%) Candida glabrata обладала промежуточной чувствительностью к данным препаратам К итраконазолу возбудитель в 6 наблюдениях (60,0%) оказался чувствителен, в 2 наблюдениях (20,0%) - резистентен и обладал промежуточной чувствительностью также в 2 наблюдениях (20,0%) Полученные данные отображены в таблицах 5 и 6

Антимикотические препараты С albicans С glabiata

Абс % Абс %

5-флюороцитозин 115 100 I 10 100

Амфотерицин В 115 100 10 100

Миконазол 115 100 4 40

Кетоконазол 115 100 3 30

Итраконазол 115 100 6 60

Флуконазол 115 100 3 30

Таблица 6

Промежуточная чувствительность Candida к антимикотическим препаратам

Антимикотические С glabrata

препараты

Абс %

5-флюороцитозин - -

Амфотерицин В - -

Миконазол 2 20

Кетоконазол 2 20

Итраконазол 2 20

Флуконазол 2 20

Результаты проведенных исследований демонстрируют различную чувствительность грибов рода Candida к антимикотическим препаратам

Иммунные механизмы защиты при кандидозном вучьвовагините Для установления роли интерлейкина 5 и трансформирующего фактора роста р в обеспечении антиинфекционной защиты влагалища было определено содержание данных цитокинов во влагалищном экссудате у 60 больных женщин и получены следующие результаты у 46 пациенток с диагнозом КВВ (76,7±5,5%) уровень ИЛ-5 по данным ИФА равен нулю, у 14 (23,3+2,86%) -4,13±0,63 пкг/мл Содержание ТФР-Р у 10 пациенток (16,7+2,7%) равно нулю, у 50 (83,3+4,8%) - 0,84±0,08 пкг/мл При изучении материала от 17 здоровых женщин получены следующие данные ИЛ-5 у 10 (58,8±6,4%) определялся на нулевом уровне, у 7 (41,2±6,4%) - 2,41±0,79 пкг/мл У 3 здоровых женщин (17,6±7 2%) содержание ТФР-Р было равно нулю, у 14 (82,3+5,0%) определялся в количестве 1,0+0,25 пкг/мл

Так же для оценки выраженности антиинфекционной защиты влагалища проводилось определение трансформирующего фактора роста р у больных кандидозным вульвовагинитом (таблица 7)

Таблица 7

Содержание ТФР-ß у больных кандидозным вульвовагинитом

N Общая группа больных Число больных Р

п=60 Абсол %

1 Низкое 31 51,7±6,5 1 и 2 <0,05

2 Высокое 16 26,6+ 5,7 1 и 3 < 0,05

3 Нормальное 13 21,7+4,6

При исследовании количественного содержания ТФР-ß у больных кандидозным вульвовагинитом были получены следующие данные у 31 пациентки (51,7±6,5%) низкий уровень содержания данного цитокина, у 13 (21,7±4,6%) - нормальный, у 16 (26,6+5,7) - высокий

Результаты проведенных иммунологических исследований показывают, что у 76,7±5,5% и у 51,7± 6,5 % женщин кандидозным вульвовагинитом в содержимом влагалища определяется дефицит цитокинов интерлейкина 5 и трансформирующего фактора роста ß соответственно При этом у женщин с обильными выделениями дефицит исследованных цитокинов наблюдается достоверно у большего числа женщин, чем у больных с умеренными выделениями (х2=6,7, р<0,05 - для ИЛ5, %2=3,9, р<0,05 -для ТФР ß) Недостаток ИЛ-5 усугубляется у женщин с обильными выделениями и при обильном росте Candida albicans по сравнению с женщинами с умеренными выделениями и скудным ростом грибов (х2=6,7, р<0,05, х2=3,8, р<0,05 соответственно)

Также продемонстрировано, что с увеличением длительности заболевания число женщин кандидозным вульвовагинитом с дефицитом ТФР -ß и ИЛ-5 становится достоверно больше (х2=4,1, р<0,05 и х2=4,4, р<0,05 соответственно)

Применение метода Real- time PCR для диагностики кандидозного вульвовагинита Для определения диагностической значимости метода Realtime PCR было проведено исследование патологического материала со слизистых оболочек урогенитального тракта женщин с подтвержденным диагнозом кандидозного вульвовагинита и в контрольной группе обследуемых без данного заболевания Методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени изучен 61 образец (Таблица 8).

Таблица 8

Результаты исследования соскобов со слизистых урогенитального тракта пациенток с кандидозным вульвовагинитом методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени Тест-система «АмплиСенс®

Candida albicans- Flu»

Оцениваемые признаки Число пациентов Обнаружено Не обнаружено

Абс % Абс %

Наличие клинических проявлений 61 41 67,2+4,3 20 32,8±4,3

Микроскопическое и культуральное исследование 61 41 67,2±4,3 20 32,8±4,3

ПЦР в реальном времени 61 42 68,9±4,2 19 31,1±4,2

Из 61 изученной пробы при исследовании методом ПЦР в реальном времени позитивный ответ получен в 42 случаях (68,85%), негативный - в 19 (31,15) 39 (63,9%) положительных тестов по результатам ПЦР были подтверждены при культуральном исследовании, скудный рост отмечался в 3 наблюдениях (7,69%), умеренный - в 20 (51,29%). обильный - в 16 (41,02%) Из 3-х неподтвержденных в одном случае наблюдали выраженные клинические проявления заболевания

Из 61 пробы кандидозный вульвовагинит был культурально подтвержден в 41 (67,2%) случае Из них лишь 39 образцов дали положительный ПЦР результат Таким образом, по сравнению с посевом клиническая чувствительность молекулярного метода составила 95% В одном из случаев несовпадения результатов Ct по каналу FAM показал следовые количества ДНК возбудителя и составил 31,9, несколько не дойдя не порогового значения позитивного результата (30-й цикл)

В то же время, из 20 случаев, когда культуральное исследование не выявило наличия в образце Candida albicans, в 3-х ПЦР в реальном времени дал положительный результат на ДНК возбудителя кандидозного вульвовагинита Это свидетельствует о специфичности теста в 85% Кроме того, в одном случае из 3-х несовпадений результатов двух видов исследования клинические признаки заболевания подтверждали достоверность ПЦР теста (Таблица 9)

Сравнение методов идентификации возбудителя

Абс %

Обнаружение микроскопическим и культуральным методами исследования из них подтверждение результатом ПЦР 41 39

Чувствительность ПЦР метода по сравнению с культуральным 95,12

Отсутствие результата при микроскопическом и культуральном методах исследования из них не обнаружен методом ПЦР 20 17

Специфичность ПЦР метода по сравнению с культуральным 85

Проведенные исследования показали, что метод полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени является высокочувствительным и специфичным способом видового определения Candida albicans в клиническом материале, позволяя не только оперативно и достоверно подтверждать диагноз кандидозного вульвовагинита, но и дать сравнительную оценку количественных показателей инфекции

Оптимизация терапии рецидивирующего кандидозного вульвовагинита С целью оценки эффективности, безопасности и переносимости различных четырех доз препарата Итраконазол вагинальные таблетки, применяемого в течение 10 дней у больных рецидивирующей формой кандидозного вульвовагинита, на базе ФГУ «ЦНИКВИ Росмедтехнологий» было проведено рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое клиническое исследование в параллельных группах

В исследование были включены 65 пациентов женского пола из группы I, которые были условно разделены на 5 подгрупп

Подгруппа 1 13 пациенток, которым проводилась терапия препаратом

Итраконазол вагинальные таблетки в дозе 100 мг 1 раз в сутки

Подгруппа 2 13 пациенток, которым проводилась терапия препаратом

Итраконазол вагинальные таблетки в дозе 150 мг 1 раз в сутки

Подгруппа 3 13 пациенток, которым проводилась терапия препаратом

Итраконазол вагинальные таблетки в дозе 200 мг 1 раз в сутки

Подгруппа 4 13 пациенток, которым проводилась терапия препаратом

Итраконазол вагинальные таблеткив дозе 250 мг 1 раз в сутки

Подгруппа 5 13 пациенток, которые получали плацебо 1 раз в сутки

Курс терапии у пациенток всех групп составил 10 дней Динамика

клинических и лабораторных показателей отображена в таблицах 10, 11

Таблица 10

Динамика клинических симптомов после проведенной терапии препаратом Итраконазол (вагинальные табпетки)

Подгр\ппп 1 11одгр\ппа 2 П 01гру ппа 3 Подгруппа 4 Подгр\ ПП1 5

Точный

Оцениваемые критер ИИ

признаки Фишер

Вшит 0 Вишт 2 Ихич Вшит 0 Визит 2 Ишч Визит 0 Вшит 2 #311 ч Вшит 0 Визит 2 Илпч Визит 0 Виз|гг 2 а

1б аб аб аб аб

абс % абс с К абс % абс % вбе У абс % абс абс У, с п™ с абс У с % с %

3\ 1 жжение 10 76 9 0 (1 10 10« 13 ЦК) 0 0 13 НЮ 13 100 0 0 13 КК1 1! 61 5 2 15 4 6 75 0 5 38 5 4 30 8 0 71

Свободные

вагинальные 76

выделения 6 46 1 (1 0 6 11111 7 0 0 7 100 ю 0 II 0 10 /00 К 61 5 II 0 X НЮ 7 53 8 6 46 1 0 72

Гиперемия

слизистой

оботочки III 76,9 3*4 5 50 13 II» 3 23 1 III 7*5 У 13 100 0 0 13 11X1 1(1 76 9 2 8 кОО 13 100 12 <)2 3 0 99

Характер

отделяемого в

заднем своде

влтгаанща 13 100 5 Ч«4 К 61 5 13 к» 3 23 1 10 76 9 13 ню II 0 п 100 13 100 0 II 13 НЮ 13 100 12 92 3 0 99

Примечание Визит 0 - получение клинико-анамнестических данных, верификация диагноза Проводился за 7 дней до назначения терапии

Визит 2 - оценка эффективности и безопасности препарата (динамика клинико-лабораторных показателей) Проводился через 2 недели после окончания терапии

Динамика лабораторных показателей после проведенной терапии препаратом Итраконазол (вагинальные таблетки)

ПОШОУППП 1 Подгруппа 2 Подгруппа 3 Подгруппа 4 Подгр\п|та 5

Точи

ыи

Оцениваемы крит

с признаки ерий Фиш

Визит 0 Вшит 2 Иляс'1 Визит 0 Визит 2 Итч Визит 0 Визит 2 Ншч Визит 0 Влзит2 Ишч Визит 0 Визит 2 ера

аб аб

с % обе % абс X абс % абс % обе % обе % обе % абс % абс % с % абс % абс % абс %

Обнаружь

ние при

микроско

пни дрож

жсвыч кле

ток или

псгвдомн цслия 12 92,3 5 38 5 7 ЖЗ 11 84,6 3 23 1 8 72? 13 100 1 7,7 12 921 П 100 I 77 б 923 12 92 3 13 100 0 50

РостСал

(Ма более

100 КОЕ/мл

при

культуральн

ом

исследоваии и 13 11X1 7 53,8 6 461 13 100 3 23 1 10 169 13 100 0 0 13 100 13 100 0 0 8 ¡00 П 100 12 92 3 0 99

Чисто

выздоровев

шн\ по

оцениваемы м признаком 6 461 0 691 12 92} 12 923

После проведенного курса лечения у 61,5% пациенток I группы отмечалось клиническое излечение, лабораторное - у 46,1%, у пациенток II группы, получавших Итраконазол вагинальные таблетки в дозе 150 мг, клиническая эффективность лечения составила 76,9%, лабораторная - 69,2%, у пациенток III и IV групп, получавших препарат в дозе 200 и 250 мг соответственно, исчезновение клинических симптомов заболевания, подтвержденных лабораторно, наблюдалось в 100% и 84,6% случаев В контрольной группе, получавшей плацебо, клинические и лабораторные признаки кандидозного вульвовагинита не зарегистрированы у 1 (7,6%) пациентки Все полученные различия статистически значимы В группе, применявшей Итраконазол вагинальные таблетки 250 мг, у всех пациенток отмечалось отсутствие клинических проявлений кандидозного вульвовагинита, подтвержденное лабораторно, однако у 15,4% пациенток отмечались нежелательные явления на фоне применения данного препарата в виде выраженного жжения во влагалище При физикальном исследовании пациенток с такими жалобами были обнаружены гиперемия-слизистой оболочки влагалища и единичные петехиальные элементы, не отмечавшиеся до проведения лечения Пациентки, применявшие Итраконазол вагинальные таблетки 200 мг, отмечали хорошую переносимость, отсутствие нежелательных явлений во время применения препарата Исчезновение клинических симптомов вульвовагинита и отрицательные результаты культурального исследования на Candida отмечались у 100% пациенток данной группы

Таким образом, на основании полученных данных сделано заключение об определении оптимальной дозировке препарата Итраконазол 200 мг вагинальные таблетки для лечения рецидивирующего кандидозного вульвовагинита как наиболее эффективной и безопасной

Выводы

1 На современном этапе основным возбудителем кандидозного вульвовагинита остается Candida albicans с характерными проявлениями в виде зуда и жжения в аногенитальной области, творожистых выделений из половых путей, гиперемии слизистых оболочек вульвы и влагалища При изучении клинических проявлений, вызванных Candida glabrata, отмечается отсутствие выраженных воспалительных явлений даже при обильном росте возбудителя

Применение антибактериальных препаратов широкого спектра действия является единственным статистически значимым фактором риска развития кандидозного вульвовагинита (р=0,04)

2. В 100% наблюдений шгаммы Candida albicans обладали чувствительностью к 5-флюороцитозину, амфотерицину В, миконазолу, кетоконазолу, итраконазолу, флюконазолу

Candida glabrata чувствительна к 5 -флюороцитозину и амфогерицину В в 100,0% наблюдений; к миконазолу - в 40,0% (в 20,0% - промежуточная чувствительность), к флюконазолу и кетоконазолу - в 30,0% (в 20,0% наблюдений - промежуточная чувствительность), к итраконазолу - в 60,0% наблюдений (в 20,0% - промежуточная чувствительность)

3 Полимеразная цепная реакция с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени является высокочувствительным (клиническая чувствительность - 95,12%) и специфичным (клиническая специфичность -85,0%) способом видового определения Candida albicans

4 В результате исследования интерлейкина 5 и трансформирующего фактора роста Р в содержимом заднего свода влагалища 60 женщин с кандидозным вульвовагинитом установлено, что дефицит цитокинов наблюдается у 76,7±5,5% и у 51,7± 6,5 % больных соответственно (р<0,05) При этом низкое содержание этих цитокинов достоверно часто регистрируется у женщин с обильными выделениями (р<0,05) и при увеличении длительности заболевания (р<0,05)

5 Итраконазол вагинальные таблетки 200мг является наиболее оптимальной дозой в курсовой 10-дневной терапии больных хроническим кандидозным вульвовагинитом

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Кисина В И Современные представления об этиологии и патогенезе кандидозного вульвовагинита /КисинаВ И , Резайкина А В , Просовецкая АЛ// Успехи медицинской микологии — М Национальная академия микологии, 2004 -Т 4 -С 166-167

2 Кисина В И Факторы локальной антиинфекционной защиты у больных кандидозным вульвовагинитом / Кисина В И , Резайкина А В , Просовецкая АЛ // Тезисы научных работ Всероссийской конференции дерматовенерологов "Современные направления диагностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов" - Нижний Новгород, 2004 - С 67-68

3 Рахматулина М Р Клинико-диагностические аспекты кандидозного вульвовагинита /Рахматулина М Р , Просовецкая АЛ// Тезисы научных работ IX Всероссийского съезда дерматовенерологов - М , 2005 - Т II - С 81

4 Просовецкая А Л Исследование эффективности и безопасности препарата Итраконазол (вагинальные таблетки) для лечения рецидивирующего кандидозного вульвовагинита // Тезисы научных работ IX Всероссийской конференции дерматовенерологов - Екатеринбург, 2006 - С 31

5 Рахматулина М Р Определение оптимальной дозировки препарата Итраконазол (вагинальные таблетки) у пациенток с рецидивирующим кандидозным вульвовагинитом /Рахматулина М Р , Просовецкая АЛ // Тезисы научных работ IX Всероссийской конференции дерматовенерологов -Екатеринбург, 2006 - С 34

6 Просовецкая А Л Кандидозный вульвовагинит этиопатогенез и клиническое течение заболевания / Просовецкая А Л //Венеролог -2006 -№9 -С 14-19

7 Рахматулина М Р Новые подходы к коррекции состояния вагинального микроценоза / Рахматулина М Р , Просовецкая А Л , Плахова К И // Венеролог -2006 -№9 -С 39-45

8 Рахматулина М Р Кандидозный вульвовагинит новые возможности фармакотерапии / Рахматулина М Р , Просовецкая АЛ // Венеролог - 2006 -№10-С 50-54

9 Рахматулина М Р Лекарственные средства для лечения ЗППП / Рахматулина М Р , Просовецкая А Л //Новая аптека -2006 -№7 - С 28-31

10 Просовецкая А Л Новые аспекты в лечении кандидозного вульвовагинита / Просовецкая А Л //Вестник дерматологии и венерологии -2006 - №6 -С 3133

11 Клинические рекомендации Дерматовенерология Урогенитальный кандидоз/под ред А А Кубановой -М ГЭОТАР-Медиа, 2006 - С 219-226

12 Терман OA ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в определении CANDIDA ALBICANS в реальном времени и по конечной точке / Терман О А, Рахматулина М Р , Просовецкая АЛ и др // Тезисы научных работ X Всероссийской конференции дерматовенерологов "Организация оказания дерматовенерологической помощи в современных условиях" — М , 23-24 ноября 2006г - С 77

13 Резайкина А В Исследование показателей местного иммунитета у женщин с кандидозным вульвовагинитом /Резайкина А В, Рахматулина М Р , Просовецкая АЛ // Тезисы научных работ II Всероссийского конгресса дерматовенерологов -С-Пб,2007 —С 144

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИЛ - интерлейкин

ИППП - инфекции, передаваемые половым путем

КВВ — кандидозный вульвовагинит

КОЕ - колониеобразующая единица

КОК - комбинированные оральные контрацептивы

П1ДР - полимеразная цепная реакция

ТФР - трансформирующий фактор роста

ТЬ - Т- хелпер

Подписано в печать 18 12 2007 г Печать трафаретная

Заказ №1061 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Частота регистрации кандидозного вульвовагинита (КВВ) за последние 10 лет почти удвоилась и составляет от 30 до 45% в структуре инфекционных поражений вульвы и влагалища. Установлено, что 7075% женщин имеют в течение жизни хотя бы один эпизод кандидозного вульвовагинита, при этом в 5-10% случаев заболевание становится рецидивирующим (Sobel J.D.,1998). Особенностью данной инфекции является длительное течение, возможность распространения на другие органы и системы с развитием в 20-30% случаев генерализованных форм кандидоза у иммунокомпроментированных больных (Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В., 2000; Серова В.Н., 2002; Касабулатов Н.М., 2003).

По данным отечественных авторов, в России до недавнего времени обнаружение Candida albicans отмечалось не менее чем в 80% наблюдений КВВ (Ахрарова Л.М., 1993; Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В., 2000). Среди остальных представителей рода Candida клиническое значение в развитии кандидозного вульвовагинита имеют C.glabrata (~10%), C.parapsilosis (~7%), C.tropicalis (~4%), реже C.krusei, С. pseudotropicalis, Saccharomyces cerevisiae (Кисина В.И., Степанова Ж.В., 2002). Видовая неоднородность возбудителей кандидозного вульвовагинита проявляется различиями в клинической картине, а также развитием устойчивости некоторых видов к противогрибковым средствам.

Рядом исследователей показано, что одним из факторов вирулентности С.albicans является продукция аспартил протеиназ, которые играют существенную роль в процессах колонизации, инвазии и повреждения эпителия (Cassone А., De Bernardis F., 1987). Данные протеоли-тические ферменты ингибируют механизмы элиминации Candida: расщепляют секретируемые IgG, IgA, факторы комплемента, снижают функциональную активность фагоцитов, что приводит к распространению инфекционного процесса (Kaminishi Н., Miyaguchi Н. et al., 1995).

Гуморальный иммунный ответ в лимфоидной ткани, связанной со слизистыми оболочками, имеет особенности, заключающиеся в формировании преимущественно Th2-Tnna с высоким уровнем трансформирующего фактора роста ß. Активированные ТЪ2-типа наряду с другими цитокинами продуцируют ИЛ-5, поддерживающий пролиферацию и дифференцировку преимущественно Ig А позитивных клеток и считается цитокином, обеспечивающим защиту слизистых оболочек (Ярилин A.A.,1999; Карсонова М.И., Пинегин Б.В.,2003; Granger S.E., 1992; Fiedel P.,1996). Результаты исследования в вагинальном экссудате трансформирующего фактора ß и ИЛ-5 позволяют судить о способности лимфоидных клеток, связанных со слизистыми оболочками влагалища, развивать иммунный ответ на кандидозную инфекцию и обеспечить защиту от нее.

В настоящее время диагноз кандидозного вульвовагинита устанавливается на основании данных клинических проявлений, бактериоско-пического и культурального методов исследований.

Развитие современных генотехнологий в выявлении различных возбудителей диктует необходимость применения новых методик. В частности, метод количественного определения ДНК инфекционного агента в процессе лечения позволяет прогнозировать периоды обострения хронического заболевания, а также возможность получить информацию об эффективности проводимой антикандидозной терапии.

Этиологическая неоднородность возбудителя влечет за собой не только различия в клинических проявлениях заболевания, но и различия в чувствительности к применяемым антимикотическим препаратам. По данным проводимых в России исследований чувствительность к флуконазолу С.albicans составляет 97,4%, C.glabrata - 58,6% (Стра-чунский JI. С., 2004). Данные о резистентности к наиболее широко используемому антимикотическому препарату в России определяют необходимость поиска новых антимикотических средств и проведения исследований в данном направлении.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучить современные особенности видового спектра возбудителя, клинического течения заболевания, показателей местного иммунитета и оптимизировать диагностику и терапию больных канди-дозным вульвовагинитом.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить этиологические особенности кандидозного вульво-вагинита и особенности клинического течения в зависимости от видового состава возбудителя.

2. Изучить чувствительность грибов рода Candida к антимико-тическим препаратам в зависимости от видового состава возбудителя.

3. Оценить значимость метода Real-time PCR в диагностике кандидозного вульвовагинита.

4. Изучить особенности местного иммунитета больных канди-дозным вульвовагинитом путем определения уровня интерлейкина-5 и трансформирующего фактора роста ß во влагалищном экссудате и установить взаимосвязь между содержанием цитокинов, клиническими проявлениями заболевания и длительностью течения заболевания.

5. Разработать оптимальный режим дозирования Итраконазола вагинальные таблетки для лечения больных кандидозным вульвова-гинитом путем оценки эффективности, безопасности и переносимости препарата.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые изучена значимость метода Real-time PCR в диагностике кандидозного вульвовагинита. Показано, что Real-time PCR является высоко чувствительным и высоко специфичным методом для определения вида возбудителя кандидозного вульвовагинита.

Впервые у женщин с кандидозным вульвовагинитом для оценки антиинфекционных факторов защиты влагалища было проведено исследование содержания цитокинов, участвующих в синтезе секреторного иммуноглобулина, интерлейкина 5 и трансформирующего фактора роста ß. Установлено, что интерлейкин 5 и трансформирующий фактор роста бета у больных кандидозным вульвовагинитом определяется в низких концентрациях и их дефицит нарастает при выраженных признаках воспаления, обильном росте Candida и увеличении продолжительности заболевания.

Впервые изучена эффективность, безопасность и переносимость Итраконазола для местного применения в лечении кандидозного вульвовагинита при различных режимах дозирования препарата. Установлено, что оптимальной дозировкой препарата для местного применения является Итраконазол вагинальные таблетки 200 мг.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Установлено, что основным возбудителем кандидозного вульвова-гинита является Candida albicans с характерными клиническими проявлениями в виде зуда и жжения в аногенитальной области, творожистых выделений из половых путей, а также гиперемии слизистых оболочек вульвы и влагалища и творожистого отделяемого в заднем своде влагалища, чувствительный в 100% наблюдений к исследуемым препаратам. Для клинических проявлений, вызванных Candida glabrata, характерно отсутствие выраженных воспалительных явлений. Для сочетания С. albicans и С. glabrata (5,6 % наблюдений) характерны выраженные воспалительные явления в клинической картине в сочетании с преобладающим ростом Candida glabrata при культуральном исследовании.

Впервые установлена роль интерлейкина 5 и трансформирующего фактора роста ß, определяемых в содержимом влагалища у женщин с кандидозным вульвовагинитом, в оценке противоинфекци-онной защиты слизистой оболочки влагалища.

Показано, что метод Real-time PCR является высокочувствительным и специфичным методом определения С. albicans в клиническом материале.

Определен оптимальный режим дозирования (200 мг) препарата Итраконазол вагинальные таблетки для терапии рецидивирующего кандидозного вульвовагинита.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ

Полученные результаты внедрены в практику в консультативно-диагностическом отделении ФГУ «ЦНИКВИ Росмедтехно-логий».

Результаты проведенных исследований использованы в составлении Клинических рекомендаций в разделе "Урогенитальный кандидоз".

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

Основными клиническими проявлениями вульвовагинита при ассоциации с Candida albicans являются зуд и жжение в аногени-тальной области, творожистые выделений из половых путей, гиперемия слизистых оболочек вульвы и влагалища, для Candida glabrata характерно отсутствие выраженных воспалительных явлений. Для сочетания С. albicans и С. glabrata характерны выраженные воспалительные явления в клинической картине в сочетании с преобладающим ростом Candida glabrata при культуральном исследовании. Клинические проявления и чувствительность к анти-микотическим препаратам зависят от видового состава возбудителя.

Метод полимеразной цепной реакции с гибридизационно флуоресцентной детекцией в реальном времени является высокочувствительным и высокоспецифичным при определении вида возбудителя кандидозного вульвовагинита и количественной оценки его содержания.

Установлено, что у большинства из 60 обследованных женщин с кандидозным вульвовагинитом в содержимом заднего свода влагалища наблюдается дефицит интерлейкина 5 и трансформирующего фактора роста Р - у 46 (76,7±5,5%) и у 31 (51,7± 6,5 %) соответственно. Дефицит интерлейкина 5 и трансформирующего фактора роста р достоверно часто определяется у женщин с канди-дозным вульвовагинитом с обильными вагинальными выделениями при обильном росте Candida albicans и длительно болеющих. Что свидетельствует о снижении локального иммунитета слизистых оболочек влагалища.

Максимальная эффективность и наилучшая переносимость при использовании препарата для местного применения Итракона-зол установлена для дозировки 200 мг.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты проведенных исследований представлены в докладах на научно-практической конференции в ФГУ «ЦНИКВИ Росмедтехнологий» 24.02.2006г. и на IX Всероссийской конференции дерматовенерологов 1-2 июня 2006г. г. Екатеринбург.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертационной работы опубликовано 13 работ. ь *

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов исследования, 7 глав, содержащих результаты собственных исследования, заключения, выводов, списка литературы, включающего 121 отечественных и зарубежных источников. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 таблицами и 3 рисунками.

выводы

1. На современном этапе основным возбудителем кандидоз-ного вульвовагинита остается Candida albicans с характерными проявлениями в виде зуда и жжения в аногенитальной области, творожистых выделений из половых путей, гиперемии слизистых оболочек вульвы и влагалища. При изучении клинических проявлений, вызванных Candida glabrata, отмечается отсутствие выраженных воспалительных явлений даже при обильном росте возбудителя.

Применение антибактериальных препаратов широкого спектра действия является единственным статистически значимым фактором риска развития кандидозного вульвовагинита (р=0,04).

2. В 100% наблюдений штаммы Candida albicans обладали чувствительностью к 5-флюороцитозину, амфотерицину В, микона-золу, кетоконазолу, итраконазолу, флюконазолу.

Candida glabrata чувствительна к 5 -флюороцитозину и амфотерицину В в 100,0% наблюдений; к миконазолу - в 40,0% (в 20,0% - промежуточная чувствительность); к флюконазолу и кетоконазолу - в 30,0% (в 20,0% наблюдений - промежуточная чувствительность); к итраконазолу - в 60,0% наблюдений (в 20,0% - промежуточная чувствительность).

3. Полимеразная цепная реакция с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени является высокочувствительным (клиническая чувствительность — 95,12%) и специфичным (клиническая специфичность - 85,0%) способом видового определения Candida albicans.

4. В результате исследования интерлейкина 5 и трансформирующего фактора роста р в содержимом заднего свода влагалища

60 женщин с кандидозным вульвовагинитом установлено, что дефицит цитокинов наблюдается у 76,7±5,5% и у 51,7± 6,5 % больных соответственно (р<0,05). При этом низкое содержание этих цитокинов достоверно часто регистрируется у женщин с обильными выделениями (р<0,05) и при увеличении длительности заболевания (р<0,05).

5. Итраконазол вагинальные таблетки 200мг является наиболее оптимальной дозой в курсовой 10-дневной терапии больных хроническим кандидозным вульвовагинитом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Кандидоз является в настоящее время второй после бактериальной инфекции причиной развития вульвовагинитов [58, 71, 73, 81, 82]. Наиболее часто кандидозный вульвовагинит встречается у женщин детородного возраста, однако не исключено возникновение данного заболевания у девочек и женщин в период менопаузы [4, 26, 78, 88, 92]. Нередко грибы рода Candida выделяются из нижних отделов мочеполового тракта при обследовании до 50% женщин без клинических проявлений вульвовагинита [42, 44].

Этиологический спектр кандидозного вульвовагинита разнообразен, около 20 видов грибов способны вызывать заболевание, но наиболее часто выделяют С. albicans (85-90% наблюдений). Среди не-albicans возбудителей с наибольшей частотой встречается С. glabrata (5-10% наблюдений), затем С. tropicalis, С. krusei и другие виды [48, 71, 79]. Неоднородность состава возбудителей кандидоза характеризуется различными клиническими проявлениями, особенностями течения заболевания, различной чувствительностью и, нередко, резистентностью, к проводимой терапии. В зависимости от течения заболевания выделяют острый и хронический (рецидивирующий) кандидозный вульвовагинит [19, 20, 52].

Имеющиеся в настоящее время в данные свидетельствуют о роли предрасполагающих факторов в развитии заболевания: использование различных средств контрацепции, применение антибактериальных препаратов широкого спектра действия, наличие сопутствующих заболеваний [27, 38, 59, 61, 69]. Также существуют данные, подтверждающие роль патологии местного иммунитета в развитии кандидозного вульвовагинита [62, 98].

Ответ лимфоидной ткани влагалища на стимуляцию антигенами Candida проявляется в синтезе антител различных классов. Основным иммуноглобулином слизистых оболочек является секреторный Ig А, способный к прямому фунгицидному действию [17, 47]. Цитокинами, стимулирующими синтез Ig А, являются интер-лейкин 5 и трансформирующий фактор роста р. В работах ряда исследователей продемонстрирована роль некоторых цитокинов в обеспечении антиинфекционной защиты влагалища при различных урогенитальных заболеваниях, однако значение интерлейкина 5 и трансформирующий фактора роста р при урогенитальном кандидо-зе оценено не было [13,23, 56].

Традиционно для диагностики грибковой инфекции используются микроскопическое исследование материала и культуральная идентификация возбудителя. Наряду с данными методами в последние годы достаточно широко стали применяться методы генодиагностики, в том числе - полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR) [16, 35].

Техническая простота выполнения полимеразной цепной реакции (ПЦР), надежность и низкая себестоимость стали основными причинами, определившими широкое внедрение этого диагностического метода в различные области здравоохранения в последние годы. Однако, в настоящее время становится очевидной необходимость дальнейшего развития метода ПЦР в направлении количественного определения ДНК и РНК различных возбудителей.

Метод количественного определения ДНК инфекционных агентов в процессе лечения позволяет получить информацию об эффективности проводимой терапии, а также дает возможность прогнозировать периоды обострения хронически протекающих заболеваний [29, 87].

Существует определенное количество способов получения данных о концентрации нуклеиновых кислот в пробе методом ПЦР, но при каждом из них требуются дополнительные трудоемкие этапы работы, связанные с предварительной раститровкой выделенной из анализируемой пробы ДНК, или полученных в ходе ПЦР ампликонов, что влечет за собой увеличение длительности постановки анализа, а также сложность в интерпретации полученных данных [16]. Появление любых дополнительных этапов работы повышает вероятность ошибки и получения недостоверных данных.

В настоящее время существует метод, лишенный ранее названных недостатков, - это метод ПЦР в реальном времени. Сущность метода определяется исследованием продуктов .амплификации в процессе накопления с помощью специального прибора без последующей стадии электрофореза. Возможность точно оценить исходное количество матрицы определяется зависимостью кинетики накопления продуктов амплификации от ее исходного количества [16].

При лечении кандидозного вульвовагинита основной задачей является устранение этиологических и патогенетических факторов возникновения заболевания. Основными средствами для лечения грибковой инфекции являются препараты из группы азолов. Для лечения первичного эпизода заболевания существует широкий выбор высоко эффективных препаратов местного действия, применяемых однократно или в течение нескольких дней [15, 30, 33].

Наряду с местнодействующими средствами для лечения хронически протекающего кандидозного вульвовагинита широко назначаются препараты системного действия, в том числе и для длительного противорецидивного использования (флуконазол, итрако-назол, кетаконазол). Данный вид супрессивной терапии предполагает использование антимикотических средств в течение 6 месяцев [81]. Особенностью этих средств является удобство в применении, что в значительной мере повышает комплаентность лечения.

Несмотря на широкое распространение и популярность среди врачей и пациентов схем лечения с применением системных антимикотических препаратов, сохраняется вероятность развития различных побочных эффектов, преимущественно со стороны желудочно-кишечного тракта, варьирующих от слабо выраженных диспепсических явлений до развития фульминантных форм токсического гепатита [21]. В связи с этим становится актуальным поиск новых антимикотических средств местного действия, способных создавать высокие концентрации в месте введения и оказывать выраженный терапевтический эффект при отсутствии системного воздействия.

Целью настоящего исследования явилось изучение современных особенностей видового спектра возбудителя, клинического течения заболевания, показателей местного иммунитета и оптимизация диагностики и терапии больных кандидозным вульвовагинитом.

Для достижения установленной цели были обозначены задачи исследования:

1. Изучить этиологические особенности кандидозного вульво-вагинита и особенности клинического течения в зависимости от видового состава возбудителя.

2. Изучить чувствительность грибов рода Candida к антимико-тическим препаратам в зависимости от видового состава возбудителя.

3. Оценить значимость метода Real-time PCR в диагностике кандидозного вульвовагинита.

4. Изучить особенности местного иммунитета больных канди-дозным вульвовагинитом путем определения уровня интерлейкина-5 и трансформирующего фактора роста ß во влагалищном экссудате и установить взаимосвязь между содержанием цитокинов, клиническими проявлениями заболевания и длительностью течения заболевания.

5. Разработать оптимальный режим дозирования Итраконазола вагинальные таблетки для лечения больных кандидозным вульвовагинитом путем оценки эффективности, безопасности и переносимости препарата.

В соответствии с поставленными целью и задачами на базе ФГУ «ЦНИКВИ Росмедтехнологий» было проведено обследование 145 женщин.

Критериями включения в I группу исследования были:

- наличие данных анамнеза о патологии органов мочеполовой системы;

- наличие патологии слизистой оболочки вульвы и влагалища при физикальном обследовании;

- диагноз кандидозного вульвовагинита, подтвержденный лабораторными исследованиями;

Критериями исключения из исследования были:

- ИЛ 11111, подтвержденные лабораторно (сифилис, гонококковая, трихомонадная, хламидийная инфекции, а также вирус простого герпеса и вирус папилломы человека);

- системная и местная антимикотическая терапия в течение месяца до настоящего обследования;

- наличие беременности. Критерии включения в контрольную группу:

- отсутствие жалоб;

- отсутствие в анамнезе эпизодов кандидозного вульвоваги-нита;

- отсутствие системной и местной антимикотической терапии в течение месяца до настоящего обследования;

- отсутствие клинических проявлений кандидозного вульво-вагинита;

- отсутствие беременности.

Лабораторные исследования проводились на базе Лабораторного центра ФГУ «ЦНИКВИ Росмедтехнологий».

Клинико-анамнестическое обследование включало в себя изучение жалоб при обращении за медицинской помощью, времени их возникновения, проводимой терапия в течение последнего месяца. Также уделялось внимание наличию сопутствующих заболеваний внутренних органов (в т.ч. эндокринопатий), патологии со стороны органов репродуктивной системы.

При изучении гинекологического анамнеза оценивалось: начало и длительность менструального цикла, количество беременностей, течение и исход, наличие в прошлом гинекологических заболеваний и урогенитальных инфекций, в т.ч. передаваемых половым путем, применяемые методы контрацепции.

Клиническое обследование включало осмотр кожных покровов и видимых слизистых оболочек, определение размеров, консистенции и болезненности паховых лимфатических узлов, оценку состояния слизистой оболочки вульвы и преддверия на наличие трещин, эрозий и других дефектов.

Идентификация возбудителей инфекций, передаваемых половым путем {Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium), а также условно-патогенных микроорганизмов {Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, грибы рода Candida) проводилась культуральным методом с количественным определением содержания в исследуемом материале. Идентификацию Neisseria gonorrhoeae проводили в соответствии с Приказом МЗ РФ №415 от 20.08.2003 «Об утверждении протокола ведения больных «Гонококковая инфекция».

Диагностика мочеполового трихомониаза проводилась микроскопическим методом при окраске препаратов метиленовым синим и по Граму, а также культуральным методом на модифицированной среде Джонсона-Трассела в соответствии с приказом №173 от 2005 г.

Идентификацию Chlamydia trachomatis осуществляли в соответствии с методическими рекомендациями "Урогенитальный хламидиоз, уреаплазмоз, гарднереллёз (диагностика, лечение, профилактика)", утверждёнными МЗ СССР (1988). Для идентификации Chlamydia trachomatis использовали культуральный метод и ПЦР-анализ с тест-системами "Литех" (Москва).

Выявление и количественную оценку Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis осуществляли культуральным методом на среде «MYCOPLASMA DUO» (Sanofi-Франция).

Для выявления грибов Candida проводили бактериоскопию мазков при окраске метиленовым синим и по способу Грама. При микроскопическом исследовании диагностическим признаком являлось преобладание вегетирующих форм - почкующихся дрожжевых клеток и мицелия. Культуральная видовая идентификация проводилась с использованием селективной среды Кандиселект (BIORAD). Идентифицированная культура возбудителя исследовалась для определения чувствительности к антифунгальным препаратам. С этой целью использовалась микропанель 60780 Фунгитест.

Исследование влагалищного отделяемого для определения уровня ИЛ-5 и ТФР ß - 1 проводилось методом ИФА. С этой целью использовались: иммуноферментный набор для количественного определения человеческого ИЛ-5 в культуральной среде, забуфе-ренных растворах, сыворотке или плазме человека (BIOSOURCE EUROPE S.A.), а также иммуноферментный набор для количественного определения человеческого ТФР ß - 1 в человеческой сыворотке, плазме, моче и супернатанте культур клеток (Bender MedSystems).

Амплификация участка ДНК (метод ПЦР) и измерение флуоресцентного сигнала в реальном времени проводилась с использованием комплекта «АмплиСенс» (производство ЦНИИ Эпидемиологии) вариант FRT.

При проведении клинического осмотра пациенток с канди-дозным вульвовагинитом наиболее часто наблюдались субъективные проявления в виде зуда в области половых органов (76,0±3,82%), творожистых выделений из половых путей (70,4±4,08%) и жжения в аногенитальной области (61,6±4,35%).

Из клинических проявлений пациенток основной группы преобладали свободные выделения из половых путей (32,0±4,17%), гиперемия слизистой оболочки вульвы (76,0±3,82%) и слизистой оболочки влагалища (88,0±2,91%). При осмотре с помощью зеркал Куско чаще выявлялось творожистое отделяемое в заднем своде влагалища - 60,0+4,38% наблюдений.

Полученные при обследовании 125 пациенток с диагнозом кандидозный вульвовагинит данные свидетельствуют, что наиболее часто встречаемым возбудителем данного заболевания являлась Candida albicans (92% наблюдений) с клиническими проявлениями в виде зуда (76%) и жжения (61,6%) в аногенитальной области, творожистых выделений из половых путей (32%), а также гиперемии слизистых оболочек вульвы (76%) и влагалища (88%), творожистого отделяемого в заднем своде влагалища (61%). Данный вид возбудителя обладал 100% чувствительностью к предложенным анти-микотическим препаратам (5-флюороцитозин, амфотерицин В, ми-коназол, кетоконазол, флуконазол).

Среди других возбудителей КВВ наиболее часто встречается Candida glabrata (2,4% случаев). В клинических проявлениях, вызванных данным видом Candida, характерно преобладание жалоб на зуд и жжение в области половых органов (57,1%), отсутствие выраженных воспалительных проявлений, а также различная чувствительность к антимикотическим препаратам. В частности, Candida glabrata чувствительна к 5 -флюороцитозину и амфотерицину В в 100% наблюдений; к миконазолу - в 40% и в 20% обладает промежуточной чувствительностью; к флюконазолу и кетоконазолу чувствительна - в 30% наблюдений, обладает промежуточной чувствительностью - в 20%; к итраконазолу резистентна в 20% наблюдений или обладает промежуточной чувствительностью также в 20%, в 60% наблюдений возбудитель оказался чувствителен. Неоднородность видового состава отражается в различных клинических проявлениях и чувствительности к антимикотическим препаратам, что соответствует данным ряда авторов (Анкирская A.C., Байрамо-ва Г.Р., Spinillo А).

При изучении сексуального анамнеза было установлено, что наибольшая частота возникновения кандидозного вульвовагинита отмечалась у женщин с количеством сексуальных партнеров от 1 до 3 человек (52% наблюдений). При исследовании различных факторов риска у пациенток основной и контрольной групп статистически значимые различия были отмечены в применении антибактериальных препаратов широкого спектра действия и при наличии уро-генитального кандидоза у сексуальных партнеров (р=0,04).

В соответствии с поставленными задачами исследования, у женщин кандидозным вульвовагинитом для оценки антиинфекционных факторов защиты влагалища было проведено исследование содержания цитокинов, участвующих в синтезе секреторного иммуноглобулина интерлейкина 5 и трансформирующего фактора роста ß во влагалищном экссудате.

Установлено, что при обследовании 60 женщин у 46 (76,7±5,5%) наблюдался дефицит интерлейкина 5 и у 31 (51,7± 6,5 %)- трансформирующего фактора роста ß.

Статистически обоснованные данные показали, что дефицит цитокинов, принимающих участие в синтезе секреторного иммуноглобулина А, и следовательно в обеспечении анитиинфекцион-ной защиты, нарастает у женщин при выраженных признаках воспаления, обилии Candida albicans и при увеличении продолжительности заболевания.

Полученные нами результаты не противоречат данным других исследователей, которые наблюдали снижение местной продукции ключевых цитокинов, в частности интерферонов, у женщин хроническим кандидозным вульвовагинитом в сочетании с хлами-диозом (Шабашова Н.В., Мирзабалаева А.К., Фролова Е.В., Учеват-кина А.Е., 1997; Учеваткина А.Е., 1998).

Проведенные исследования показали, что метод полимераз-ной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в реальном времени является высокочувствительным и высокоспецифичным способом видового определения Candida albicans в клиническом материале, позволяя не только оперативно и достоверно подтверждать диагноз кандидозного вульвовагинита, но и дать сравнительную оценку количественных показателей инфекции. При проведении исследований с использованием Real-time PCR были получены следующие результаты: по сравнению с посевом клиническая чувствительность молекулярного метода составила 95%, специфичность теста - 85%.

Антимикотическая терапия проводилась с использованием препарата Итраконазол вагинальные таблетки в течение 10 дней. Пациентки с диагнозом рецидивирующий кандидозный вульвовагинит были поделены на группы по 13 человек в зависимости от дозы получаемого препарата (100, 150, 200 и 250 мг соответственно). После проведенного курса лечения у 61,5% пациенток I группы отмечалось клиническое излечение, лабораторное - у 46,1%; у пациенток II группы, получавших Итраконазол вагинальные таблетки в дозе 150 мг, клиническая эффективность лечения составила 76,9%, лабораторная - 69,2%; у пациенток III и IV групп, получавших препарат в дозе 200 и 250 мг соответственно, исчезновение клинических симптомов заболевания, подтвержденных лабораторно, наблюдалось в 100% и 84,6% случаев. В контрольной группе, получавшей плацебо, клинические и лабораторные признаки кандидозного вульвовагинита не зарегистрированы у 1 (7,6%) пациентки. Все полученные различия статистически значимы. В группе, применявшей Итраконазол вагинальные таблетки 250 мг, у всех пациенток отмечалось отсутствие клинических проявлений кандидозного вульвовагинита, подтвержденное лабораторно, однако у 15,4% пациенток отмечались нежелательные явления на фоне применения данного препарата в виде выраженного жжения во влагалище. При физикальном исследовании пациенток с такими жалобами были обнаружены гиперемия слизистой оболочки влагалища и единичные петехиальные элементы, не отмечавшиеся до проведения лечения. Пациентки, применявшие Итраконазол вагинальные таблетки 200 мг, отмечали хорошую переносимость, отсутствие нежелательных явлений во время применения препарата. Исчезновение клинических симптомов вульвовагинита и отрицательные результаты культурального исследования на Candida отмечались у 100% пациенток данной группы.

Таким образом, на основании полученных данных сделано заключение об определении оптимальной дозировке препарата Итраконазол 200 мг вагинальные таблетки для лечения рецидивирующего кандидозного вульвовагинита как наиболее эффективной и безопасной.