Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль индукторов дифференцировки в комбинированной терапии злокачественных новообразований

На правах рукописи УДК 615.277.3.015.2:616-006-092.4/.9

КАРШИЕВА САЙДА ШАМИЛЬЕВНА

РОЛЬ ИНДУКТОРОВ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ В КОМБИНИРОВАННОЙ ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

14.00.14 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□□3471955

Москва - 2009 г.

003471955

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

Трещалина Елена Михайловна

доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН

Барышников Анатолий Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук ГУН НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН

Переверзева Элеонора Рафаиловна

доктор медицинских наук, ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН

Доненко Федор Витальевич

Ведущая организация: ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Росздрава

Защита диссертации состоится «"¿Л. » c-CtCLP 2009 г. на заседании диссертационного совета (Д.001.017.02) ГУ Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан «_»_200 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Ю.А. Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Самостоятельное применение цитодифференцирукмцих агентов (ЦЦА) в онкологии связано с доказанным феноменом программированной гибели некоторых злокачественных клеток путем запуска терминальной дифференцировки. В последнее время активно изучается возможность повышения эффективности лечения некоторых распространенных форм злокачественных новообразований путем комбинированного применения их друг с другом и с химиотерапией [Абелев Г.И., 2001 г.; Волкова М.А., 2002 г.;]. Особую актуальность приобретает совершенствование схем комбинированного лечения с использованием ЦДА, отличающихся сравнительно низкой токсичностью [Уоррел Р.П., 2002 г.; Переводчикова Н.И., 2005 г.]. Механизм антипролиферативного действия одного из них был изучен на примере полностью трансретиноевой кислоты (ПТРК) - натурального метаболита витамина группы А. Противоопухолевый эффект ПТРК осуществляется за счет прямой стимуляции дифференцировки и индукции апоптоза в клетках больных острым промиелоцитарным лейкозом (ОПЛ). Данные доклинического изучения продемонстрировали также перспективность поиска новых ЦДА в ряду производных ПТРК, например 13-цис-ретиноевой кислоты. Определенные надежды связывают с включением производных ретиноевой кислоты в схемы лечения рака почки [Волкова М.А. и др. 2001 г.; Савченко В.Г. и др. 2004 г.; Bartolini G. et al., 2004]. Другим известным примером использования дифференцирующего подхода в терапии иммунозависимых злокачественных опухолей является терминальная дифференцировка клеток под влиянием цитокинов. Дифференцировка, индуцированная интерфероном (ИФН), хорошо изучена в культуре клеток волосатоклеточного лейкоза человека. Этот эффект рассматривается как результат активации внутриклеточных ферментов, обуславливающих функции клеток [Рукавицин О.А. и др., 2004 г., Кадагидзе З.Г., 2003 г.; Caraglia М. et al., 2005]. Улучшение результатов лечения больных с диссеминированной меланомой и раком почки за счет использования а2-ИФН позволило добиться длительных ремиссий и рекомендовать этот препарат в качестве «золотого» стандарта лечения [Носов Д.А., 2005 г.].

Среди новых ЦДА наиболее интересны и перспективны низкомолекулярные соединения, в числе которых трихостатин, депудецин, трапоксины, апицидины и производные гидроксамовой кислоты [Monneret С., 2005]. В настоящем исследовании углубленно изучено одно из соединений этого типа - новый отечественный оригинальный псевдопептид дикарбамин (Dcr), представляющий собой 2-(имидазол-4-ил)-этанамид пентандио-вой-1,5 кислоты. Анализ консервативного лечения некоторых форм рака, в числе которых меланома, рак почки и ОПЛ, показывает, что, несмотря на увеличение числа лекарственных средств (ЛС) различных групп, результаты остаются неудовлетворительными.

Отдельные схемы химиотерапии (XT), иммунотерапия или цитодифференцирующая терапия не приводят пока к полным клиническим эффектам. Поэтому в настоящее время особую актуальность приобретает вопрос совершенствования комбинированного лечения за счет сочетания XT и иммунотерапии с индукторами дифференцировки. Однако использование ЦДА может привести к таким нежелательным эффектам, как снижение эффективности лечения за счет уменьшения пролиферативного пула опухолевых клеток или блокирования общей с иммунокорректором мишени.

В связи с этим, чрезвычайно актуально обоснование в эксперименте рациональных схем применения комбинаций с использованием противоопухолевых цитостатиков и средств иммунотерапии с ЦДА. Цель исследования

Выявить роль индукторов дифференцировки различного механизма действия в эффективности противоопухолевой терапии на моделях опухолей животных и человека. Задачи исследования:

1. Выявить in vitro и in vivo на моделях гемобластоза и меланомы степень модификации эффективности комбинированного лечения индукторами дифференцировки при различных схемах применения.

2. Определить in vivo влияние цитодифференцирующих агентов ПТРК, а2-ИФН и Der на опухолевый рост я эффективность некоторых схем комбинированной химиотерапии на моделях экспериментальных гемобластозов и меланом.

3. Исследовать in vitro и in vivo возможный механизм антипролиферетивного и противоопухолевого действия индукторов дифференцировки на клеточном и тканевом уровнях.

Научная новизна

Впервые разработана модель перевиваемого дифференцирующегося гемобластоза на мышах линии DBA2 и гибридах BDF¡ с использованием культуры клеток DS19 эрит-робластоза Френд (ЭБФ), адекватная для доклинического изучения цитодифференцирующих агентов in vivo.

Впервые в экспериментах на перевиваемом ЭБФ и меланомах мышей и человека in vitro и in vivo изучены свойства известных индукторов дифференцировки (ПТРК, а2-ИФН) и нового препарата Der в монорежиме, в сочетании друг с другом и с противоопухолевыми цитостатиками (дакарбазином (DTIC), цисплатином (ЦП).

Впервые определены терапевтические дозы Der на различных моделях опухолевого роста животных и человека в монорежиме и в сочетании с цитостатиками. Для мышиных опухолей установлен диапазон разовых терапевтических доз 0,5-4,5 мг/кг при 5-30-

кратном введении per os, для опухолей человека диапазон разовых терапевтических доз 1,5-4,5 мг/кг при 5-10-кратном р/о введении.

Впервые найдены эффективные комбинации и подобраны режимы введения различных индукторов дифференцировки (Der, а2-ИФН и ПТРК) и противоопухолевых ци-тостатиков (ЦП и DTIC). Установлен синергизм Der и а2-ИФН при последовательном введении в отношении ЭБФ и при одновременном введении в отношение ксенографтов меланомы человека Meló. Найдено аддитивное усиление эффективности ЦП и DTIC при сочетании с Der и Der с ПТРК при последовательном введении.

Впервые найдены концентрации ПТРК, а2-ИФН и Der для проявления антипро-лиферативного и цитодифференцирующего действия на культурах клеток меланомы человека MS и Ме15, а также эффективные дозы in vivo на ЭБФ в монорежиме и в комбинациях.

Впервые установлено, что антипролиферативное и противоопухолевое действие ПТРК, 02-ИФН, ДМСО и Der сопряжено со следующими проявлениями цитодифферен-цировки: изменение фенотипического профиля клеток (промиелоцитарный лейкоз человека NB4, HL60) интенсификацией меланиногенеза (культуры клеток меланомы человека AÍS и Ме15, и п/к ксенографты Ме16); увеличение активности апоптоза, снижение активности митоза и возрастание зоны некроза в опухолях мышей и человека (гемобластоз ЭБФ, меланома В¡6, Meló, Ме17); перераспределение клеток по фазам клеточного цикла -задержка клеток в стационарной фазе G(/G¡ и накопление в фазе S без выхода в митоз (гемобластозы NB4, HL60, меланомы В16, Meló, MelT). Научно-практическая значимость

В результате исследований получены новые данные о свойствах различных цито-дифференцирующих агентов на моделях опухолевого роста, имеющие фундаментальное значение. Установлены новые феномены аятипролиферативной активности ПТРК, 02-ИФН и Der на культурах клеток меланомы человека и животных MS, Ме15, В16, а также антипролиферативной и противоопухолевой активности Der на культурах клеток ОПЛ, перевиваемых гемобластозе и меланомах животных и человека.

Перспективными для клинического изучения являются экспериментальные данные, полученные:

• по способности Der ингибировать пролиферацию клеток и опухолевый рост меланомы животных и человека с увеличением выживаемости.

• о синергизме между а2-ИФН и Der

• об аддитивном усилении эффективности комбинаций с включением цитостатиков ЦП или DTIC и цитодифференцирующих препаратов ПТРК или Der.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на заседании Ученого Совета НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН, 2006 г.; на VI и VII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», (М/о, с-з «Московский», 2007, 2008 гг.); на Российской конференции по меланоме с международным участием, проводимой совместно с Европейской школой онкологии и Всемирной рабочей группой по меланоме (Москва, 2008 г.); 7 июня 2008 г. на межлабораторной конференции в НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН с участием лаб. клеточного иммунитета, лаб. фармакокенетики, лаб комбинированной терапии опухолей, лаб. фармакологии и токсикологии, лаб. экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаб. синтетических противоопухолевых веществ, а также лаборатории фармакологии и химиотерапии ГУ НИИНА им. Гаузе РАМН. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 4 научные статьи в рецензируемых журналах и 2 тезиса. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 1.52 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы «обзор литературы», главы «материалы и методы», 4 глав собственных результатов, выводов, списка литературы, списка сокращений. Список литературы включает 133 публикаций, из них 40 отечественных и 93 иностранных источников. Работа иллюстрирована 62 рисунками и 34 таблицами.

Материалы и методы исследования Использованные в работе ЦЦА. 1) Дикарбамин {Der, ООО «Фарминтерпрайсез») представляет собой 2-(имидазол-4-ил)-этанамид пентандиовой-1,5 кислоты (М.м. 225) в разовых дозах 1,0-4,5 мг/кг р/о ежедневно в течение 5-13 дней. 2)Политрансретиноевая кислота (ПТРК, Sigma) вводили мышам п/к ежедневно в течение 5 дней в разовой дозе 0,3 мг/кг. 3)РФН (а2а-ИФН) вводили мышам п/к в разовой дозе 10 тыс. ME/кг ежедневно в течение 5-ти дней; 4)Интрон-А (ИН-А (а2Ь-ИНФ), Шеринг-Плау) использовали в концентрациях 7-70-700 ME/мл инкубировали в культуре клеток в течение 72 часов. Противоопухолевые средства. 1)Цисплатин (ЦП, Teva) вводили в разовой дозе 3 мг/кг в/б 3-кратно с интервалом в 48 часов ; 2)Дакарбазин (DTIC, Lachema) вводили мышам в разовой дозе 200 мг/кг в/б ежедневно в течение 3-х дней (суммарная доза 600 мг/кг). Лабораторные животные

Эксперименты выполнены на изогенных мьппах-самках DBA2, C57BI6 и BDFi разведения ГУ РОНЦ и из питомника РАМН «Столбовая», которых содержали в виварии ГУ РОНЦ на брикетированных кормах. Для трансплантации опухолей человека использова-

ны иммунодефицитные мыши-самки Balb/c nude разведения ГУ РОНЦ, которых содержали в специализированном кондиционированном отсеке с соблюдением требований, предъявляемым к конвенциональным животным.

Модели опухолевого роста. Использованы культуры клеток опухолей человека и перевиваемые опухоли мышей и человека из Банка опухолевых штаммов ГУ РОНЦ. Культуры клеток: 2 линии клеток ОПЛ человека HL60 и NB4 с транслокацией 1(15;] 7), способных к дифференцировке под действием ЦДА в гранулоциты, моноциты и макрофаги; 1 линия меланомы мышей В16 и 2 линии клеток меланомы человека MS и Ме15 с различной способностью к меланиногенезу. Клетки перевиваемых клеточных линий культивировали в соответствующих питательных средах, после чего рассевапи в пластиковые флаконы фирмы Costar (25см2), добавляли тестируемые агенты, с которыми инкубировали клетки. Штаммы перевиваемых опухолей животных и человека (2-17-й пассажи): эритролейкоз Френд (ЭБФ), полученный из клеточной линии DS19, солидная пигментированная мышиная меланома В16, 2 штамма меланомы человека - слабо пигментированная дифференцирующаяся Meló и беспигментная Ме17. Опухоли трансплантировали мышам подкожно (п/к) по стандартным методикам.

Основные критерии оценки эффективности. Об эффективности индукторов дифферен-цировки in vitro судили по стандартным показателям дифференцировки: по динамике специфических маркеров CDllb, CD38, CD15, CD18, CD54, CD14, CD71, CD33, CDI3, Ki67, по функциональной активности клеток, по уровню их пролиферативной активности, а также по распределению клеток по фазам клеточного цикла. О противоопухолевой эффективности препаратов in viva судили по кинетическим показателям (V/V,-¡) и по торможению (ТРО%, Т/С%) роста опухолей в опытных и контрольных группах, а также по увеличению продолжительности жизни (УПЖ%) мышей, которые определяли стандартными способами [Барышников А.Ю, 2003 г.; Софьина З.П. и соавт., 1979 г.; Треща-лина Е.М. и соавт., 2005 г.; В. Taicher et al., 2004].

Методы электронной и световой микроскопии. Использованы стандартные методы с окраской гистологических срезов гематоксилин-эозином и фиксацией материала для электронной микроскопии (ЭМИ) в глутаральдегиде. Для количественной оценки степени дифференцировки опухолевых клеток при ЭМИ подсчитывали общее количество клеток в нескольких ультратонких срезах с разных блоков (5 блоков, количество клеток до 500), количество содержащих меланосомы клеток и среднее число меланосом на одну такую клетку. Индекс интенсивности меланинообразования (ИИМ) определяли по формуле: ИИМ=КМхМК/500, где КМ - количество клеток, содержащих меланосомы, а МК - среднее количество меланосом на клетку [Райхлин Н.Т., 1979].

Иммунофлуоресцентный метод. Для проведения непрямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции клетки сначала инкубировали с МКА, а затем с FITC-меченной антисывороткой. Для проведения прямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции использовали МКА, напрямую меченные флуорохромами флуоресцеином (FITC) или фикоэритрином (РЕ). Реакцию анализировали на проточном цитофлуоримет-ре FACScan (Becton Dickinson, USA) [Docik G. et ed., 1980].

ДНК-цитометрический анализ. ДНК-цитометрический анализ проводили в импульсном проточном цитофлуориметре ICP-22 (фирма «Фиве», ФРГ) с использованием флуоресцентных красителей этидиум-бромида и митрамицина. Уровень люминесценции окрашенных клеток (ядер) был пропорционален содержанию ДНК, стандарт - нормальные лимфоциты человека или спленоциты мыши. Расчет распределения клеток по фазам клеточного цикла (Gi/Gi, S, GJM) выполняли по коэффициенту вариации индекса ДНК (ИДНК). При анализе структуры популяции значения плоидности пиков на ДНК-гистограммах выражали ИДНК, который вычисляли как отношение номера канала анеу-плоидного пика к номеру канала пика нормальных диплоидных клеток (стандарту). Значимыми считали пики >5% от числа 20-100 и более тыс проанализированных клеток. Данные в автоматическом режиме вводились в ЭВМ РС-286 и обрабатывались с помощью специальных алгоритмов и программ.

Статистическая обработка данных. Конечные результаты всех опытов обрабатывали статистически, вычисляли средние значения с учетом «а» или доверительного интервала средних сравниваемых величин. Достоверность оценивали по методу Стьюдента с 95% вероятностью [Гланц С, 1999 г.].

Результаты исследований и их обсуждение Изучение дифференцирующих свойств индукторов на клетках ОПЛ человека

Показано (рис. 1, табл. 1, 4) уменьшение экспрессии маркера миелоидных предшественников CD33 в 2 раза относительно контроля под действием ПТРК с одновременным увеличением экспрессии маркеров зрелых клеток - CD15 в 2 раз и CDllb в 6 раз. Повышение адгезивных свойств, фагоцитарной активности и люминесценции клеток говорят о дифференцировке клеток NB4 в сторону гранулоцитарного ростка до зрелых терминально дифференцированных нейтрофилов, что согласуется с [Breitman T.R., ¡980]. ПТРК оказывает значимый антипролиферативный эффект, как по уменьшению экспрессии маркера митотической активности Ki67 в 30 раз, так и по увеличению доли покоящихся (Gf/Gi^A0%) и уменьшению доли синтезирующих (S=44%) клеток.

ДМСО также вызывал уменьшение экспрессии CD33 в 2 раза и повышение CDllb в 3 раза относительно контроля, но уменьшал экспрессию CD15 в 1,5 раз, CD38 в 6 раз и

молекул адгезии CD54 в 2,5 раза. Это показывает, что на уровне монобластов-промоноцитов утрачивается экспрессия маркера CD1S. Таким образом, ДМСО, скорее всего, стимулирует как гранулоцитарную, так и макрофагальную дифференцировку клеток, причем эти процессы терминально не завершенные. Этим объясняется повышение фагоцитарной активности клеток в 2-3 раза и люминесценции 1,5-2 раза относительно контроля, которое не достигает уровня нормальных зрелых фагоцитов.

t 701 *

» I

I «!

сою CDU сонь аш CDU CDU cdm a>7i до

СЛШ CDU (DI Ik CDX CD1S CDU ОЯ CD7I

Рис. 1. Изменение экспрессии дифференцировоч- Рис. 2. Изменение экспрессии дифференцировоч-ных антигенов на клетках линии NB4 под влияни- ных антигенов на клетках линии NB4 под влияем Der, ПТРК и ДМСО. нием Der в различных концентрациях.

Таблица 1.

Фагоцитарная активность и хемилюминесценция клеток линии NB4 после приме-

Агент Концентрация, мкг/мл Фагоцитирующие клетки, % Люминесценция

Без сыворотки С сывороткой Без стимуляции Зимозаи

- - 18,1+11,5 12,2+0,2 0,653+0,1 1,019+0,3

ПТРК 0,3 29,6+12,1 58,1+6,7 27,0+13,3 500,0+229,4

ДМСО 13000 31,6+7,6 38,4+17,4 0,73+0,05 2,26+0,3

Der оа 10,3 12,5 0,565 1,142

2,1 17,3 26,5 0,598 1,203

21,0 12,1+3,8 31,3+7,7 0,71+0,1 0,87+0,07

142,8 13,4 26,5 0,787 1,354

1420,0 14,4 28,3 0,780 1,140

Тем не менее, ДМСО оказывает выраженный антипролиферативный эффект, что проявляется в уменьшении экспрессии Ki67 в 22 раза, а также в уменьшении доли 5=28% и повышении доли Gi/Gi-68%.

Действие Der на фенотипический профиль клеток отличается уменьшением экспрессии маркеров CD33 в 1,3-2,0 раза и CD38 в 2,0-5,5 раз относительно контроля. Экспрессия CDllb и CD15 в зависимости от концентрации либо колеблется на уровне контрольных значений, либо уменьшается в 2,5-2,0 раза, а экспрессия адгезивной молекулы CD54 остается на уровне контроля. Возможно, такое влияние на антигенный профиль клеток NB4 связано со сдвигом дифференцировки более ранних предшественников лим-фоидного (CD38) и миелоидного (CD38, CD33) ростков без запуска терминальной диф-

ференцировки. Уменьшение CDI5 и CDllb при некоторых концентрациях Der, скорее всего, связано с гибелью клеток, что проявляется в резком уменьшении экспрессии CD71 (в 78 раз) и Ю67 (в 43 раз), а также в положительной тенденции распределения клеток по фазам клеточного цикла: небольшим накоплением покоящихся клеток в фазе G</Gi~43% и обеднением пролиферирующихся клеток в ¿'-фазе до 55%.

Исследование ИДА на клетках HL60 по различным параметрам дифференцировки показало (рис. 2, табл. 2-4), что каждый из индукторов имеет своеобразный профиль активности. Так, ПТРК вызывает незначительное снижение маркера-предшественника мие-лоидного ряда CD33 и не влияет на экспрессию CD13, одновременно с этим повышая экспрессию CD38 в 5,5 раз относительно контроля. Это может быть связано с индукцией дифференцировки CD38 на более ранних этапах дифференцировки и пополнением популяции CD33 клеток.

Таблица 2.

Влияние ПТРК, ДМСО и Der на экспрессию дифференцировочных антигенов в клетках линии HL60

Антигены Среднее значение экспрессии в процентах (М+ш)

Контроль ПТРК 0,3 мкг/мл ДМСО 1,3 мг/мл Der 2,1 мкг/мл

CD33 96,7+3,6 90,1+0,5 90,3+0,4 92,0+0,9

CD13 98,4+0,9 94,0+4,9 95,6+6,0 97,6+1,8

CDllb 0,8±0,5 37,6+10,0* 32,5+4,3* 1,2+0,1

CD38 11,3+13,3 60,9±0,3* 35,4+10,4* 1,1+0,9

CD15 85,6+4,5 44,6±28,3* 45,2+21,5* 49,3+13,1*

CD18 7,5+8,9 16,6+10,2 37,7+45,6 17,6+23,6

CD54 2,8+0,1 70,0+8,6* 78,1+4,4* 8,7±7,6

CD14 0,4+0,4 9,5±2,7 71,2+1,3* 3,6+2,0

CD71 20,1+16,1 6,2+3,1 3,9+1,4 12,1+11,3

Примечание: *р<0,05

ПТРК также вызывает увеличение экспрессии адгезивной молекулы С054 в 25 раз, миелоидного антигена СОНЬ в 47 раз, специфического маркера промоноцитов и моноцитов СВ14 в 24 раза с одновременным уменьшением гранулоцитарного маркера СВ15 в 2 раза. Замещение популяции С075 клеток популяцией СВ14 клеток можно расценить как коммутирование миелоидных предшественников в сторону гранулоцитарного и мо-ноцитарно/макрофагального рядов. Это отражается в повышении, как фагоцитарной активности, так и люминесценции, значения которых, однако, не позволяют говорить о терминальной дифференцировке до зрелых фагоцитов (табл. 3). Кроме того, ПТРК вызывает снижение С£>7/ в 3,2 раза, значительное увеличение фракции покоящихся клеток С(/0/-74,1 % и обеднение фракции делящихся и синтезирующих клеток 5 - 18,0% и О/Л/ -7,9%.

Под действием ДМСО фенотипический профиль клеток НЬбО меняется аналогично ПТРК. Экспрессия СОЗЗ и С013 колеблется в пределах контроля, зато увеличивается

в 3 раза экспрессия СВ38, в 41 раз - СОНЬ и в 178 раз - С014. Одновременно с этим происходит в 2 раза уменьшение экспрессии СО] 5. Все это говорит о сходстве экспрессии дифференцировочных антигенов на клетках НЬбО под действием ДМСО и ПТРК. Результатом может быть неполная гранулоцитарная и/или относительно более выраженная мо-ноцитарная дифференцировка, о чем свидетельствует соотношение популяций СО 14 и СОНЬ клеток. Процент фагоцитирующих клеток того же порядка, что и при действии ПТРК, хотя свечение при стимуляции зимозаном в случае ПТРК выше.

Таблица 3.

Фагоцитарная активность и хемилюминесценция клеток линии НЬбО после применения различных индукторов дифференцировки__

Агент Концентрация, мкг/мл Фагоцитирующие клетки, % Люминесценция, %

Без сыворотки С сывороткой Без стимуляции Зимозан

- - 1,6+0,7 4,2+0,8 0,741+0,2 0,883+0,2

ПТРК 0,3 17,8 68,5 1,802 80,0

ДМСО 13000 14,6+7,7 61,9+8,9 1,103+0,3 19,03+3,1

Der 2,1 2,9 8,5 0,750 5,478

0,2 2,3 12,5 0,665 3,740

21,0 2,3 10,7 0,681 3,694

142,8 3,0 14,4 1,022 2,918

Действие Der на фенотип клеток HL60 отличается от ПТРК и ДМСО по отсутствию влияния на экспрессию гранулоцитарного маркера CDllb при подавлении экспрессии CD38 в 10 раз. Der также вызывает уменьшение экспрессии CD 15 в 2 раза и увеличение экспрессии CD14 в 9 раз, a CD54 в 4 раза. Сдвиг дифференцировки ранних предшественников миелоидного и лимфоидного ростка CD38 клеток на несколько ступеней под действием Der способствует дифференцировке CD15 клеток, коммитированных в сторону моноцитарного/макрофагального ростка до промоноцитов, что сопровождается слабым повышением фагоцитарной активности клеток (табл. 4). Кроме того, Der снижает экспрессию маркера CD71 в 2 раза и приводит к накоплению Gi/Gi-клеток со снижением доли S-клеток и G2/M до 6,9 и 40,7%, соответственно.

Исследование фенотипического профиля и функциональную активность клеток ОПЛ человека линии NB4 и HL60 под влиянием индукторов дифференцировки позволяет заключить, что все агенты запускают дифференцировку клеток, причем терминальную -только ПТРК. Как и следовало ожидать, клетки NB4, в которых присутствует аберрантная форма рецептора ретиноевой кислоты RAR-a, оказались наиболее чувствительными к действию ПТРК. Это объясняется механизмом действия ПТРК, который подробно описан в обзоре литературы, ДМСО в отличие от ПТРК только существенно сдвигает дифференцировку NB4 в сторону гранулоцитов и/или моноцитов. Der в широком диапазоне концентраций способен запускать дифференцировку на дискретном этапе ранних миелоид-ных предшественников. При этом модуляция экспрессии антигена CD33 в клетках лейко-

за ИВ4 свидетельствует о том, что, скорее всего, происходит сдвиг блока дифференци-ровки на несколько ступеней.

Таблица 4.

Влияние ПТРК, ДМСО, Der на распределение клеток NB4 и HL60 по фазам клеточного цикла_

Агент Концентрация, мкг/мл Фазы клеточного цикла

NB4 HL60

С,/С, g¡/m S G,/G, GJM S

Без индуктора - 40,06% 1,35% 58,59% 47,13% 10,78% 42,09%

ПТРК 0,3 47,88% 8,44% 43,68% 74,1% 7,85% 18,0%

ДМСО 13000 68,37% 3,56% 28,04% 92,79% 2,32% 4,89%

Der 2,1 43,2% 0,97% 55,83% 52,41% 6,92% 40,68%

Отсутствие этого эффекта в клетках лейкоза HL60, в которых нет специфической хромосомной транслокации t(15;17), подтверждает, что Der способен ингибировать пролиферацию только тех клеток, в которых присутствует аберрантная форма рецептора. С другой стороны, эта неполная дифференцировка не сопряжена с модуляцией антигенов зрелых гранулоцитов, таких как CDI5 и CDIJb, и с изменением адгезионного профиля клеток CD54. В результате она является функционально незавершенной, так как не сопровождается изменением фагоцитарной активности и способности клеток к хемолюми-несценции. Таким образом, дифференцировка гемопоэтических клеток, которая запускается препаратом Der, отличается от процессов, индуцируемых как ПТРК, так и ДМСО. Изучение цитодифференцирующих свойств различных индукторов на экспериментальных гемобластозах in vivo

Изучение ЦДА и их комбинаций на модели дифференцирующегося развившегося п/к ЭБФ (рис. 3) показало (табл. 5), что в монорежиме ПТРК, Der и РФН кратковременно ин-гибируют рост лейкоза. Достоверный максимальный эффект наблюдается сразу после окончания лечения и затем в течение 6 с. ПТРК вызывает плохо воспроизводимый эффект, ТРО=50-71% (р<0,05 только в одном опыте), а РФН и Der - воспроизводимый эффект, ТРО=64-66% (р<0,05) и 73-78% (р<0,05), соответственно. Эти данные подтверждают, что ПТРК и РФН в монотерапии не способны ингибировать опухоли больших размеров, что согласуется с данными литературы [Уоррел Р.П., 2002]. Der по характеру действия близок как обоим индукторам, но также как РФН оказывает хорошо воспроизводимое ингибирующее действие. При гистологическом изучении результатов цитодифференци-рующей терапии Der, ПТРК и РФН в п/к ЭБФ показано (табл. 6), что при применении ЦДА в монорежиме наибольшие изменения по зоне некроза вызывал РФН, менее активным был Der, самым слабым - ПТРК. По степени ингибирования митоза в клетках ЭБФ, более выраженное действие оказали РФН и Der. По индукции апоптоза все ЦДА оказались практически одинаковыми. Показано, что все агенты вызывали дифференцировку

клеток ЭБФ (табл. 6), при чем Der и РФН индуцировали лимфоидную и миелоидную дифференцировку клеток, а ПТРК - только лимфоидную.

Таблица 5.

Эффективность монотерапии ПТРК, Der или РФН п/к трансплантированного ЭБФ в

серии опытов

Препарат Разовая доза** Суммарная доза ТРО% на сутки после лечения

Контроль (физ. р-р) 0,2 мл/мышь 1,0 мл/мышь 1-4 6-7 9-11

ПТРК 0,3 мг/кг 1,5 мг/кг 50-71* 57 15-50

Der 4,5 мг/кг 22,5 мг/кг 61-78* 73* 40-53

РФН 10 тыс. МЕ/кг 50 тыс. МЕ/кг 58-66* 64* 39-68

Примечания: *различия с контролем достоверны, р<0,05; **введение на 2-6 сутки после трансплантации

Таблица 6.

Влияние монотерапии ПТРК, РФН и Der на морфологические показатели ЭБФ через сутки после лечения __

Показатели, % Контроль Der ПТРК РФН

Властные 95,0 85,0 90,0 85,0

Лимфокдые 3,0 10,0 8,0 10,0

Гранулоциты 2,0 5,0 2,0 5,0

Клетки с фигурами митзов 1,5-2,0 0,5-1,0 1,5-2,0 0,5-1,0

Клетки с признаками апоптоза 0,5 1-1,5 1-1,5 1-1,5

Площадь некрозов 5-10 10-20 10-15 20-30

Примечание: *препараты вводили на 2-6 сутки после трансплантации гемобластоза.

Комбинированное лечение п/к ЭБФ проводили по 2-м схемам с одновременным или последовательным введением препаратов. Дозы препаратов и режим их введения при этом не менялись (2-6 сутки). Результаты опытов с одновременным введением ПТРК, РФН и Der показали (табл. 7А), что самой эффективной комбинацией оказалась РФН+öcr, причем эффект был устойчивым и стабильным в течение 9-18 суток после окончания терапии ТРО=77-85%. При сочетании Dcr+ПТРК ингибирующий эффект не превышал 69-71% и был менее длительным - 9 дней после отмены лечения. Увеличение суммарной дозы РФН+ПТРК при пролонгировании лечения было неэффективным. Отсутствие терапевтического выигрыша при одновременном введении Der и ПТРК было расценено как следствие возможной конкуренции 2-х миелоидных индукторов диффе-ренцировки за мишень.

При введении Der первым (табл. 7Б) эффективность ßcr+ПТРК реализуется на уровне ТРО%=48-63% (р>0,05). Отсутствие эффекта при введении ПТРК первой может быть следствием общей мишени на клетках. Эффективность комбинации реализуется за счет Der, РФН ничего не добавляет. При начале терапии с РФН введение Der пролонгирует эффект и удерживает его на достоверном уровне (ТРО%=б1-67%, р<0,05). Эффект гистологически верифицирован (табл. 8) и показано, что при сочетании Der с ПТРК или с РФН индуцируется выраженная лимфоидная и миелоидная дифференцировка с существенным перераспределением властных клеток в сторону лимфоидного ростка.

12

Таблица 7.

Эффективность комбинированной терапии с использованием ПТРК, РФН и Der на ЭБФ

{^.Одновременное введение препаратов в серии Б. Последовательное введение препаратов опытов

Группа Разовая доза** Суммарная доза ТРО% на сутки после лечения Группа Разовая доза** Суммарная доза ТРО% на сутки после лечения

2-4 6-7 11-13 1 6

Der + ПТРК 4,5 мг/кг + 0,3 мг/кг 22,5 мг/кг + 4471* 69* 68 Der + ПТРК 4,5 мг/кг + 0,3 мг/кг 22,5 мг/кг + 1,5 мг/кг 48 63

РФН + Der 100 тыс. МЕ/кг + 4,5 мг/кг 500 тыс. МЕ/кг + 22,5 мг/кг 6082* 77*80* 84*85* ПТРК + Der 0,3 мг/кг + 4,5 мг/кг 1,5 мг/кг + 22,5 мг/кг 14 12

Der + РФН 4,5 мг/кг + 100 тыс. МЕ/кг 22,5 мг/кг + 500 тыс. МЕ/кг 26 41

РФН + ПТРК 100 тыс. МЕ/кг + 0,3 мг/кг 500 тыс. МЕ/кг + 1,5 мг/кг 13 +18 +20

РФН + DCR 100 тыс. МЕ/кг + 4,5 мг/кг 500 тыс. МЕ/кг + 22,5 мг/кг 61 67*

Примечания: *р<0,05, **введение на 2-6 сутки после

трансплантации. Примечание: *р<0,05; **/ курс терапии на 2-6 сутки,

Пкурс-на 7-11 сутки после перевивки опухоли.

Из всех изученных сочетаний наиболее эффективной была комбинация РФН+Исг

(ТРО=67% с длительной стабилизацией роста опухоли). Гистологические изменения в опухоли полностью подтверждают терапевтическую эффективность указанных агентов и их сочетаний по основным показателям дифференцировки клеток, которые проявляются во взаимоусилении направления дифференцировки с перераспределением бластных клеток, а также в увеличении процессов некротической и апоптотической гибели клеток, например, увеличение зоны некроза до 40-50% и числа клеток с признаками апоптоза в 2-3 раза.

Таблица 8.

Влитие двойных комбинаций ПТРК, РФН и Der на морфологические показатели ЭБФ в зависимости от последовательности их введения (1 и б сутки после окончания лечения)

Вид клеток, % Контроль Осг+ПТРК ПТРК+Dcr Dcr+РФН РФН+Dcr

1 1 6 1 1 6 1 1 6 1 1 6 1 1 6

Властные 95,0 80,0 90,0 80,0 80,0

Лимфоидые 3,0 15,0 8,0 15,0 15,0

Гранулоциты 2,0 5,0 2,0 5,0 5,0

Клетки с фигурами митозов 1,5-2,5 0,5-1,0 2,0-2,5 0,5-1,5 0,5-1,5

Клетки с признаками апоптоза 0,5 1,5-2,0 0,5-1,0 1-1,5 1-1,5

Площадь некрозов 15-20 20-25 15-20 20-30 5-10 20-30 30-40 30-40 40-50

Примечание: "препараты вводили на 2-6 сутки после трансплантации гемобластоза.

Более значительные гистологические изменения получены при монотерапии Der или

ПТРК, а также при различных их сочетаниях независимо от последовательности

введения. На основании данных терапевтических опытов (динамика показателей эффективности ТРО и Т/С) и гистологических исследований п/к ЭБФ после применения Der, ПТРК и РФН в монорежиме и в различных комбинациях следует считать перспективными для дальнейшего изучения комбинации Der и РФН в прямой и обратной последовательности введения, а также Der и ПТРК с введением первым Der. Неудачи при комбинации Der и ПТРК могут быть следствием общих мишеней для их цитодифференцирующего действия.

Изучение дифференцирующих свойств различных индукторов на клетках меланомы человека

Показано, что клетки MS без воздействия (контроль) растут в центре более компактно, чем на периферии. Цитоплазма большинства клеток, особенно на периферии, относительно светлая, ее насыщенность зернистыми гранулами выражена слабо реже умеренно. Видно, что на 100-200 клеток приходится ~50% клеток со слабой насыщенностью цитоплазмы мелкими зернами, 30% - с умеренной и 20% - с высокой.

Таблица 9.

Влияние ПТРК и Der на степень мелкогранулярной зернистости в цитоплазме клеток меланомычеловека линии MS

Группа Концентрация Процент клеток с мелкогранулярной зернистостью различной степени

Высокая Умеренная Слабая

Контроль - 20 30 50

ПТРК 1х10""М 60 30 10

Der lxlO^M- lxlO'^M 60 30 10

При добавлении ПТРК (табл. 9) в центре клетки лежат компактно. На периферии клетки образуют синцитий, соединяясь друг с другом с помощью отростков. Клетки полиморфные, преимущественно, удлиненной формы. Ядра округлые или овальные. Однако насыщенность цитоплазмы 1ранулярной зернистостью увеличивалась, о чем свидетельствует следующее перераспределение клеток: -10% со слабой насыщенностью, 30% -с умеренной и 60% - с высокой. При добавлении Der (табл. 9) независимо от величины концентрации в клетках MS отмечали появления мелкозернистых гранул. В мазках видно, что на периферии клетки растут в виде синцития, в центре более компактно. Они преимущественно удлиненной формы, с отростками, которые соединяются друг с другом. Встречаются крупные клетки иногда с несколькими ядрами. Цитоплазма клеток во многих участках препарата насыщена мелкой зернистостью, при этом доля клеток со слабой насыщенностью зернистости не превышает 10%, с умеренной - 30%, а с высокой 60%. Контроль образования неспецифической зернистости в клетках MS показал, что после УФ-облучения только в чашках с клетками, обработанными ПТРК и Der, появилось потемнение ростовой среды. Таким образом, ПТРК в концентрации lxlO^M и Der в кон-

центрациях lxlO^M и 1х10'5М способны вызвать 3-кратное увеличение фракции клеток меланомы человека MS с высокой степенью мелкогранулярной зернистости, что можно расценивать как запуск дифференцировки клеток по пути пигментообразования.

На клетках меланомы В16 и меланомы Ме15 изучено влияние Der и ИН-А отдельно и в комбинации. Der (табл. 10) в концентрациях 0,01-100,0 мкМ обнаружил дозозависи-мый возрастающий во времени значительный и устойчивый антипролиферативный эффект, который проявлялся замедлением роста клеток В1б в микроколониях в течение 72 ч. Максимальный эффект зарегистрирован при 100,0 мкМ, последовательное уменьшение клеток через 24-48-72 часа инкубации с препаратом снизилось до 33,7-17,7-16,9%, соответственно. После добавления в культуру 7 ME/мл ИН-А (табл. 14) содержание клеток в колониях сначала возросло до 112,1%, а затем по срокам снизилось до 38,6% и 33,1%, соответственно. При 70 ME/мл содержание клеток уменьшалось до 68,8-31,8-28,4%, соответственно, а при 700 ME/мл - до 36,9-24,3-22,6%, соответственно. Выживаемость клеток колебалась в пределах 89-103% и практически не отличалась от контроля. Таким образом, аналогично Der ИН-А в концентрации 7-700 ME/мл вызывал дозозависимый антипролиферативный эффект в клетка меланомы В16. При совместном добавлении в культуру клеток Der и ИН-А (табл. 15) антипролиферативный эффект усиливался. Сочетание 1,0 мкМ Der и 7,0 МЕ/мл ИН-А через 48 ч после инкубации приводило к уменьшению числа клеток до 26,1%, что было почти вдвое меньше, чем при добавлении препаратов

отдельно в тех же концентрациях.

Таблица 10.

Влияние Der и/или ИН-А на пролиферацию клеток мышиной меланомы В16 _

Группа Концентрация в среде Число клеток/микроколонию (% от контроля) на срок после добавления препарата

24 ч 48 ч

Контроль - 100,0 100,0

Der 1,0 мкМ 44,6 43,6

10 мкМ 36,5 31,4

РФН 7,0 МЕ/мл - 50,2

70,0 МЕ/мл - 44,5

700,0 МЕ/мл 35,S 29,0

Dcr+РФН 1,0 мкМ+7,0 МЕ/мл - 26,1

10,0 мкМ+70,0 МЕ/мл - 16,0

1,0 мкМ+700,0 МЕ/мл 21,5 18,3

10,0 мкМ+700,0 МЕ/мл 16,2 13,0

Сочетание 10,0 мкМ Der и 70,0 ME/мл ИН-А уменьшало содержание клеток в ко-

лониях через 48 ч до 16%, что также было вдовое меньше, чем при каждом из препаратов в этих концентрациях в отдельности. Таким образом, сочетание Der и РФН в диапазоне изученных концентраций привело к повышению антипролиферативного эффекта каждого из комбинатов почти в 2,0 раза через 48 ч инкубации.

На клетках меланомы человека Ме!5 показано (табл. 11), что при 0,01 мкМ Der в те же сроки количество клеток в микроколониях уменьшалось до 92,7-68,9-58,4%, соот-

ветственно. Максимальный эффект наблюдался при 100,0 мкМ Der, количество клеток уменьшалось до 43,8-29,7-25,9%, соответственно. Выживаемость микроколоний при всех использованных концентрациях Der оставалась на уровне контрольных значений 91100% (табл. 16). При добавлении 7,0 ME/мл ИН-А в течение 72 ч после количество клеток снижалось от 86,2% до 49,3%. При добавлении 70,0 ME/мл число клеток уменьшалось до 54,5-40,1-37,4%, соответственно. После 700,0 ME/мл число клеток уменьшалось до 43,1-29,7-27,7%, соответственно срокам. Выживаемость колоний клеток Ме15 была на уровне интактных клеток 96-100% (табл. 16).

На клетках Ме15 комбинация 0,01 мкМ Der и 7,0 ME/мл ИН-А при одновременном добавлении в среду дала низкий эффект. При этом число клеток варьировало в пределах 47-50% в течение 72 ч. Улучшить эффект удавалось путем увеличения концентрации одного из препаратов. Максимальное ингибирование до 23,9-30,7% было только при высоких концентрациях обоих препаратов (табл. 11).

Таблица 11.

Влияние Der и/или ИН-А на пролиферацию клеток меланомы человека MelS_

Группа Концентрация препаратов в среде Число клеток/микроколонию (% от контроля) на срок после добавления препарата

24 ч. 48 ч. 72 ч.

Контроль - 100 100 100,0

Der 0,01 мкМ 84,2 73,6 70,2

1,0 мкМ 69,0 50,0 49,1

ИН-А 7,0 МЕ/мл 111,3 94,8 73,0

70,0 МЕ/мл 53,7 51,9 48,8

Dcr+Ш-А. 0,01 мкМ+7 МЕ/мл 79,1 49,1 46,9

0,01 мкМ+70 МЕ/мл 40,5 34,9 31,7

1,0 мкМ+7 МЕ/мл 54,7 36,9 33,3

1,0 мкМ+70 МЕ/мл 30,7 24,5 23,9

Примечание: критерий оценки—задержка роста микроколоний.

Таким образом, опыты по изучению дифференцирующего действия Der, ИН-А и ПТРК на клетки различных вариантов меланомы показали, что Der и ИН-А в относительно высоких концентрациях дозозависимо замедляют пролиферацию клеток, не влияя на их выживаемость. Сочетание Der и ИН-А усиливает ингибирующий эффект. ПТРК и Der в относительно низких концентрациях индуцируют образование мелкогранулярной зернистости в клетках меланомы MS. Замедление скорости пролиферации и запуск мела-нинсинтезирующей функции клеток отдельных видов меланомы животных и человека, которые проявляются при достижимых концентрациях всех 3-х указанных агентов, свидетельствуют о неспецифическом цитодифференцирующем действии. Анализ полученных результатов показал, что Der и ИН-А близки по уровню антипролиферативной активности и относительно высоким ингибирующим концентрациям, но, возможно, имеют разные мишени на клетке, т.к. их сочетание приводит к существенному усилению инги-бирования пролиферации. Аналогично для Der и ПТРК получено восстановление мела-

нинсинтезирующей функции в клетках меланомы, но без существенного влияния на интенсивность роста клеток и их морфологию. Результаты опытов in vitro не однозначны, т.к. не всегда действие агентов сопровождается замедлением пролиферации или остановкой роста клеток. Поскольку указанные" эффекты реализуются при достижимых in vivo концентрациях, была проведена серия опытов с изучением эффективности всех 3-х ЦДА на перевиваемых меланомах животных и человека.

Изучение эффективности комбинированной терапии меланомы животных и человека под влиянием цитодифференцирующих агентов

Изучение эффективности комбинаций проведено на перевиваемых меланомах В16, Meli и Meló. Для химиотерапии использованы ЦП и DTIC, входящие с основные схемы лечения диссеминированной меланомы [Носов Д.А., 2001 г.; Переводчикова Н.И., 2005 г.]. В качестве ЦДА использованы РФН, который используется в схемах адъювантной химиотерапии меланомы, а также Der в разовых доз от 0,5 до 4,5 мг/кг при разных схемах лечения. Показано (табл. 12), что меланома В16 чувствительна к Der (ТРО=69-93%, р<0,05) при всех изученных дозах. Прослежена зависимость ингибирующего действия от величины разовой дозы при 5-кратном курсе: при увеличении дозы от 1,5 до 4,5 мг/кг ТРО возрастало от 69 до 93%. При 30-кратном введении увеличение разовой дозы также сопровождалось возрастанием ТРО с достоверным УПЖ=41% (р<0,05). Аналогичные результаты получены при 15-кратном введении Der в разовой дозе 4,5 мг/кг.

Таблица 12.

Оптимальные дозы и схемы введения Der на меланоме В16

Разовая доза, число введений Максимальный противоопухолевый эффект

Суммарная доза, мг/кг УПЖ% ТРО% Сохранение эффекта

0,5 мг/кг х 10 5,0 1 29 -

1,5 мг/кг х 5 7,5 - 69* +*

4,5 мг/кг х 5 22,5 - 93* +++

4,5 мг/кг х 13 58,5 - 93* +++

0,5 мг/кг х 30 15,0 19 78* +

1,5 мг/кг х 30 4,5 13 61* +

4,5 мг/кг х 30 13,5 41» 91* +++

Примечания: *р<Р,05; (+) - 7 дней.

В серии экспериментов с различными схемами применения Der установлено (табл.

12), что хорошо воспроизводимые от опыта к опыту результаты можно получить при применении разовых доз Der 1,5-4,5 мг/кг в режиме 5-30 дневных курсов введения (диапазон курсовых доз 22,5-58,5 мг/кг). При этом следует ожидать наступления максимального ответа опухоли на 10-13 сутки от начала лечения с сохранением достоверного эффекта в случае продолжения лечения. Эти схемы и были использованы в комбинированной терапии. Гистологическое и ДНК-цитометрическое исследования показали (табл. 13), что под влиянием Der в п/к трансплантированной меланомы В16 происходит существен-

ное снижение доли пролиферирующих клеток в срезах в 1,2-2,0 раза и в популяции в 1,8 раз. Гибель клеток путем алоптоза и некроза возросла в 2 раза относительно контроля. Указанные изменения плюс накопление клеток в стационарной Gt/Gi фазе клеточного цикла (90% против 82% в контроле) возрастали при продолжении введения препарата. На эти же сроки наблюдалось снижение доли пролиферирующих клеток в S- и G/Ai-фазах почти в 2 раза. Полученные результаты свидетельствовали о том, что Der реализует лечебный патоморфоз в меланоме В16 путем перераспределения клеток из пролиферирую-щей фракции в стационарную, которое проявляется в снижении их митотической активности, усилении процесса апоптоза и увеличении зоны некроза.

Таблица 13.

Влияние Der на патоморфологические показатели и популяциоппый состав клеток

меланомы В16

Показатели (%) Контроль Der

Сутки после трансплантации опухоли

10 15 20 10(4)* 15(2)* | 20(7)*

Площадь некроза 10,0-15,0 20,0-30,0 25,0-30,0 15,0-20,0 50,0-60,0

Митозы 2,0-3,0 2,0-3,5 1,5-2,0 1,0-1,5

Апоптоз 0,1-0,2 0,2-0,4

G0/G1 86,0±8,0 87,0±7,3 82,0±7,1 88,0±9,0 89,0±9,1 90,0±9,2

S 7,0±1,1 7,0±0,9 9,0±0,8 6,0*0,7 6,0±0,5 5,0±0,7

G2/M 7,0±0,9 6,Ш,0 9,0*1,0 6,0±0,6 5,0±0,6 5,0±0,4

Примечание: *(4) — через 4 суток после 1 курса; (2) и (7) — через 2 и 7 суток после 2 курса лечения, соот-

ветственно.

Изучение комбинации Dcr+ЦП показало (табл. 14) более высокий эффект в сравнении с монохимиотерапией ЦП, как по ингибированию первичного узла меланомы В16 с длительным снижением скорости роста опухоли, ТРО%=85-88% против ТРО%=29-48%, так и по выживаемости мышей, УПЖ%=38% против УПЖ%=15%. Der реализовал в этом эксперименте свойства модификатора эффективности цитостатика. Все эффекты достоверны по отношению к контролю, р<0,05.

На п/к ксенографтах Mel6 Der был изучен в монорежиме в диапазоне разовых доз от 1,0 м/кг до 4,5 мг/кг при длительном (5-10 дней) пероральном введении. Первый вариант меланомы представляет собой гистологически слой полиморфных активно пролиферирующих (частота митозов 3-5%) и слабо пигментированных клеток (1-3-%). В течение 48 ч наблюдается незначительное увеличение пигментации клеток с ИИМ=5,1 и до ИИМ=8,2. Опухоль имеет слабо развитую строму, низкую долю апоптотирующих клеток (0,1-0,2%), площадь некрозов небольшая (1-5%). Показано (рис. 4), что 5-дневный курс Der в разовой дозе 1 мг/кг оказывает слабое кратковременное рост-ингибирующее действие (Т/С%=80-96%). При гистологическом исследовании установлено (табл. 15), что уже через 12 ч после отмены препарата площадь некроза в опухоли увеличивается в 3-6 раз по

сравнению с контролем, и в течение следующих 48 часов гибель клеток от некроза продолжается, и площадь некроза достигает 8-10%. Однако при этом не меняется митотиче-ская активность клеток (частота митозов 3-5%) и лишь незначительно увеличивается доля апоптотических клеток до 2-3% только к концу наблюдения.

Таблица 14.

Эффективность терапии Der, ЦП и их комбинации на мышиной меланоме В16_

Препарат Разовая доза Суммарная доза v,.vh,% на сутки после трансплантации опухоли ТРО, % На сутки после лечения УПЖ%

14 17 21 4 9 12 16

Контроль-физ. р-р ОД мл 1 мл 8,3 1,9 1,9

Do- 1,5 мг/кг 15 мг/кг 6,1 1,9 1,9 3 29 29 26 1

rn 3 мг/кг 9 мг/кг 8,4 2,1 1,7 49* 48 41 48 15*

Der + ЦП 1,5 мг/кг + 3 мг/кг 15 мг/кг + 9 мг/кг 6,8 2,3 2,5 85* 88* 85* 81* 38*

После отмены Der достоверно увеличивается количество опухолевых клеток содержащих ме-ланосомы, по сравнению с контролем (табл. 15): в 1,4 раза -через 12 ч, в 1,3 раза - через 24 ч и в 1,4 раза - через 48 ч препарата. Кроме того, увеличивается и содержание меланосом в клетках: в 1,4 раза - через 12 ч, в 1,6 раз - через 24 и 48 ч. ИИМ=19,0.

Таким образом, Der в течение 48 ч после окончания 5-дневного курса увеличивает в 2,2 раза по показателю ИИМ степень дифференцировки опухолевых клеток меланомы Ме16 ив 1,3 раза количество меланосом в клетках и число содержащих меланосомы клеток.

Цитодифференцирующая активность Der, показателем которой является усиление меланинсинтезирующей функции клеток меланомы человека Meló, была также подтверждена цитологическими исследованиями. Было показано, что Der в дозе 4,5 мг/кг вызывает статистически достоверное увеличение доли меланинсодержахцих клеток в 3 раза по сравнению с контролем при 21-дневном курсе введения. Цитометрический анализ попу-ляционного состава клеток показал (табл. 15), что Der в разовой дозе 1 мг/кг при 5-кратном курсе вызывает достоверное накопление опухолевых клеток в стационарной фазе клеточного цикла G</G¡. После прекращения введения Der задержка клеток в фазе

Cynai после тршюипнтжшш «путли -•-Контроль —Der

Рис. 4. Динамика роста п/к ксенографта меланомы человека Meló под действием Der

Оо'О] прослеживается, по крайней мере, в течение 48 ч. Слабые изменения в пролифери-рующей популяции опухолевых клеток были статистически не достоверны.

Таблица 15.

Влияние Der на патоморфологические показатели, популяционный состав и интенсивность меланиногенеза в клетках меланомы человека Ме1б

Показатели Срок после курса Der

12ч 24 ч 48 ч

Контроль Der Контроль Der Контроль Der

Площадь некроза, % 1-2 6-7 2-3 7-9 3-5 8-10

Митоз, % 3-5 3-5 3-5 3-5 3-5 3-5

Апогггоз, % 0,1-0,2 0,1-ОД 0,1-0,2 0,2-0,3 0,1-0,2 0,2-0,3

Клетки с пигментом, % 1-2 2-3 1-2 2-4 2-3 3-5

со/а 27,3±2,5 35,9*±2,9 30,4±2,2 39*±2,3 27,1±2,8 35,1*±4,5

5+С2/М 15,6±1,6 18,2*±2,3 16,4±2,0 18*±1,9 15,1±3,5 16,4±3,1

Число клеток с мелано-сомами (на 500 клеток) 135,0 175,0 144,0 210,0 159,0 227,0

Среднее число мелано-сом на одну клетку 19,0 28,0 21,0 35,0 26,0 42,0

ИИМ 5,1 9,8 6,0 14,7 8,2 19,0

Примечание: *р<Р,05

Анализ эффективности комбинации 1,5 мг/кг Der + 100 тыс. ME/кг РФН показал (табл. 16), что для достижения воспроизводимого ингибирующего эффекта (Т/С=57-66%) минимально достаточно 5-дневного курса лечения. Продолжение лечения не приводит к усилению эффекта. Терапевтический выигрыш комбинации по сравнению с монотерапией каждым из препаратов отсутствует.

Применение 4,5 мг/кг Der при длительном курсе лечения п/к ксенографтов меланомы человека МеП (рис. 5) дало высокий ингибирующий эффект Т/С=51 % (р<0,05), верифицированный по увеличению некротической (в 1,5-2 раза) и апоптотической (в 2-5 раз) гибели клеток при гистологическом исследовании.

Таблица 16.

Эффективность терапии Der, РФН и их комбинации на меланоме человека Meló

Препарат Разовая доза Суммарная доза У/У,-! на сутки после трансплантации опухоли Т/С%* на сутки после лечения

19(11) 23(1П) 28(IV) 32 (V) I II III IV V

Контроль 0,2 мл 4,2 мл 2,7 2,1 1,6 1,4

Der 1,5 мг/кг 31,5 мг/кг 4,7 2,1 2,1 1,4 57 97 100 133 131

РФН 100 тыс МЕ/кг 500 тыс. МЕ/кг 3,9 1,8 2,4 1,4 - 57 50 74 76

Der + РФН 1,5 мг/кг + 100 тыс. МЕ/кг 31,5 мг/кг + 500 тыс. МЕ/кг 2,7 1,6 1,8 1,5 66 64 49 57 60

Примечание: */- 5 сутки введения Der, II - 8 сутки введения Der и 5 сутки - РФН; III - 12 сутки введения Der и 4 сутки после курса РФН; IV- 17 сутки введения Der и 9 сутки после курса РФН; У- 21 сутки введения Der и 13 сутки после курса РФН.

1000 о

При этом активность митоза достоверно снижалась в 1,52,5 раз во время лечения и в 4-6 раз после его окончания. После 5-ого введения препарата получено накопление клеток в стационарной фазе G0/G1 со снижением доли G/Ai-клеток; ИП также ниже, чем в контроле почти в 2 раза.

Таблица 17.

Влияние Der на патоморфологичеекие показатели и популяционный состав меланомы человека Meli

0 1 2 3 4 5 6 ^ Я 9 10 И 12 15 14 15 16 17 1в 19 20 11 12 23 (ут*н после трянеппякпиии «пуголи ■ Контроль Der

Рис. 5. Влияние Der на динамику роста ксенографтов меланомы человека Meli

Показатели Контроль Der

Сутки после трансплантации опухоли Сутки после лечения*

15(1) 20(11) 22(Щ) 1 11 III

Площадь некроза, % 8-10 15-20 20-25 15-20 20-30 25-35

Митоз, % 1,5-2,0 1,5-2,5 3,0-4,0 1,0-1,5 0,5-1,0 0,5-1,0

Апоптоз, % 0,2-0,3 0,2-0,3 0,2-0,3 0,3-0,5 0,5-1,0 1,0-1,5

G0/G1, % 65,3±4,5 84,0±3,б 84,043,0 81,3±1,1 78,0±4,5 85,3±1,5

S, % 10,б±0,6 11,0±3,6 7,7±1,5 10,3±1,5 11,3±2,1 7,7±1,1

G2/M, % 24,0±4,0 8,3±0,6 8,3±1,5 9,0±0,6 14,0±3,6 7,0±1,0

ИП 35,0±4,5 18,7±3,2 16,0±3,0 18,7±1,1 25,3±1,5 14,7±1,5

Примечание: */ - через 1 суток после 5-кратного введения: II и III - через 1 и 3 сутки после 10-кратного введения, соответственно.

Результаты лечения п/к ксенографтов Ме17 с использованием DTIC 200 мг/кг с 10 по 12 сутки и Der 4,5 мг/кг с 10 по 14 сутки после трансплантации показали (табл. 18) достоверно более высокое ингибирование опухоли, чем монохимиотерапия, (Т/С=3% против 5%, р<0,05) с достижением регрессии опухоли и увеличением продолжительности жизни мышей (УПЖ=29%). Важно, что Meli отвечала на монотерапию каждым комбинатом, но была высоко чувствительной к одному из наиболее высокоэффективных про-тивомеланомных средств DTIC. Однако его применение без Der было достоверно менее эффективно по всем использованным показателям, т.к. привело к достоверно более слабому ТРО, более низкому УПЖ=21% и не вызвало регрессии опухоли.

Таким образом, на различных моделях меланомы животных и человека выявлена эффективность индукторов дифференцировки: известного препарата РФН и нового - Der и установлены оптимальные дозы и режимы применения. Показано, что терапевтический эффект РФН в отношении пигментированной меланомы человека Ме16 реализуется при

разовой дозе 100 тыс. ME/кг при 5-дневном курсе лечения и проявляется в незначительном и кратковременном ингибировании роста опухоли.

Таблица 18.

Эффективность DTIC и/или Der при лечении мышей Balb/c nude с п/к ксенографтами меланомы человека Meli

Группа Разовая доза, мг/кг Суммар ная доза, мг/кг Т/С% | У/У 1-1 УПЖ, %

на сутки после окончания лечения

1 II 111 IV I И 111 IV

Контроль - - - - - - 9,8 4,1 5,1 2,0

DT1C 200 600 33* 23* 13* 5* з а 2,7 2,8 0,8 21

Der 4,5 22,5 66* 60* 62* 79 6,4 3,7 5,2 2,6 5

DTIC+Dcr 200+4,5 600+22,5 37* 13" 9* 3** 3,6 1,5 3,4 0,6 29*

Примечание: DTIC вводит ежедневно на 10-12 сутки после трансплантации опухоли; Der - ежедневно на 10-14 сутки отдельно или в комбинации с DT1C на 13-17 сутки после трансплантации опухоли;

1~ 1 сутки после окончания лечения DT1C, 11-1 сутки после окончания лечения Der, 111-1 сутки после окончания лечения DTIC+Dcr, IV-4 сутки после окончания лечения DTIC+Dcr; 4отличие достоверно относительно контроля, р<0,05; • 4отличие достоверно относительно группы DT1C, р<0,05.

Терапевтический эффект Der реализуется при пероральном применении в разовых дозах 1,5-4,5 мг/кг в режиме 5-30 дневного курса и характеризуется ингибированием роста подкожных узлов на 51-93%, в ряде случаев с увеличением продолжительности жизни мышей на 29-41%. Для мышей с меланомой В16 оптимальной является схема применения Der в разовых дозах 1,5-4,5 мг/кг с введением в течение 15-30 дней. Эффективные суммарные дозы должны быть более 22,5 мг/кг. Для мышей с ксенографтами меланомы человека оптимальной схемой является длительное (не менее 5-10 дней) введение в разовой дозе 4,5 мг/кг. Более высокую чувствительность мышиной меланомы В16 к действию Der можно объяснить отсутствием иммунологического компонента эффекта препарата у им-мунодефицитны мышей. Во всех экспериментах с моделями меланомы терапия РФН или Der не вызывала каких-либо побочных или токсических эффектов. Механизм ингиби-рующего противомеланомного действия изучен только для нового препарата Der. Его действие иллюстрирует распределение клеток по фазам клеточного цикла и их функциональное состояние (способность к меланиногенезу, активность митозов и апоптоза). Для всех 3-х использованных моделей меланомы показано, что Der реализует своей ингиби-рующий эффект путем усиления в 1,5-6,0 раз некротической гибели опухолевых клеток и в 1,5-5,0 раз активности апоптоза. Комбинированная химиотерапия ЦП в сочетании с последующим введением цитодифференцирующего препарата Der в разовой дозе 1,5 мг/кг при лечении пигментированной метастазирующей мышиной меланомы В16 оказалась достоверно более эффективной в сравнении с монохимиотерапией как по торможению роста опухоли на 63-76%, так и в 2 раза по выживаемости мышей. Примененный в субтерапевтической разовой дозе Der реализовал в этом эксперименте свойства модификатора эффективности цитостатика. При комбинированном лечении пигментированной мелано-

мы человека Meló одновременное использование 2-х цитодифференцирующих агентов Der в разовой дозе 1,5 мг/кг и РФН в сравнении с монотерапией каждым из препаратов, хотя и не позволило добиться высокого противоопухолевого эффекта, но способствовало уменьшению прогрессии опухоли за счет длительной стабилизации роста в течение по меньшей мере 2-х недель после окончания терапии. Der и РФН проявили синергизм при лечении меланомы. Комбинированная химиотерапия DTIC беспигментной метастази-рующей меланомы человека Ме17 в сочетании с последующим введением Der в разовой дозе 4,5 мг/кг достоверно более эффективна, чем монохимиотерапия. Это выражалось в усилении ингибирования роста опухоли в 1,5 раза, частичной регрессии опухоли и увеличении продолжительности жизни мышей на 29%.

Эти данные свидетельствуют о том, что цитодифференцирующая терапия меланомы с использованием РФН или Der эффективна в отношение РФН моделей животных и/или человека. РФН проявляет синергизм с Der при лечении меланомы. Der оказывает противомеланомное действие в широком диапазоне доз при длительном пероральном применении путем перераспределения клеток из пролиферирующей фракции в стационарную, снижения их митотической активности, усиления процесса апоптоза и увеличения зоны некроза а также увеличения степени дифференцировки клеток путем интенсификации меланиногенеза. Поскольку Der прошел клинические испытания по 1 фазе, выявленная его противомеланомная активность дает основания для клинического испытания препарата в монорежиме по 2 фазе в качестве средства поддержания ремиссии у пациентов исчерпанными возможностями лечения. Для повышения эффективности интер-феронотерашш может быть рекомендована комбинация с одновременным применением РФН и Der. Эффективность комбинированной химиотерапии ЦП или DTIC в сочетании с Der (применение между курсами химиотерапии) может служить основанием для клинических испытаний в качестве средства повышения эффективности лечения у пациентов с диссеминированной меланомой.

Выводы

1. Цитодифференцирующие агенты дикарбамин и диметилсульфоксид в отличие от полностью транеретиноевой кислоты модифицируют фенотип клеток линий NB4 и HL60 острого промиелоцитарного лейкоза человека на промежуточных этапах дифференцировки, сдвигая её в сторону гранулоцитов и/или моноцитов, статистически значимо уменьшая экспрессию маркеров CD33, CD38, и CD54 и увеличивая экспрессию маркеров CD1 Ib, CD15 и CD18 без запуска терминальной миелоидной дифференцировки.

2. Антипролиферативное действие дяфференцировочных агентов на клетки линий NB4 и HL60 проявляется снижением их митотической активности с уменьшением экспрессии пролиферативного антигена KÍ67, а также 2-3-кратным перераспределением кле-

ток из пролиферативной S-фазы в стационарную Go/Gi-фазу клеточного цикла. Антипро-лиферативная активность препаратов убывает в ряду: полностью трансретиноевая кисло-та>диметилсульфоксид>дикарбамин.

3. В монорежиме дифференцировочные агенты статистически значимо ингибируют рост эритробластоза Френд при 2-3-кратном уменьшении активности митоза и увеличении активности апоптоза и зоны некроза; воспроизводимость и уровень эффекта убывают в ряду реаферон>дикарбамин>полностью трансретиноевая кислота.

4. Комбинированная терапия эритробластоза Френд при одновременном введении реаферона и полностью трансретиноевой кислоты неэффективна, но эффективна при последовательным введении реаферона и дикарбамина (цитокин - первый) или двух индукторов дикарбамин и полностью трансретиноевая кислота (терминальный индуктор - последний). Терапевтический выигрыш проявляется синергическим усилением торможения роста опухоли с длительной стабилизацией процесса при 1,5-2-кратном уменьшении числа клеток с митозами и 2-4-кратном увеличении числа клеток с признаками апоптоза и зоны некроза.

5. Инитрон-А и дикарбамин статистически значимо и дозозависимо уменьшают про-лиферативную фракцию клеток меланом В16 и Ме15 в 2-2,7 раза; Интрон-А проявляет синергизм с Der при 3-5-кратном усилении антипролиферативного действия.

6. Дикарбамин в диапазоне доз 1,5-4,5 мг/кг статистически значимо ингибирует рост меланомы мышей В16 и меланом человека Ме1б и Ме17 на 51-93% с увеличением продолжительности жизни мышей на 29-41%; эффективность реализуется путем перераспределения клеток из пролиферирующей фракции в стационарную, снижения митотической активности в 1,2-2,5 раза, с 1,5-5-кратным увеличением клеток с признаками апоптоза и зоны некроза, а также интенсификации меланиногенеза в меланинсинтезирующих клетках (ИИМ=19,0).

7. Одновременное комбинированное применение цисплатина с цитодифференци-рующим агентом Der приводит к достоверному повышению эффективности лечения мышей с меланомой В16; терапевтический выигрыш проявляется увеличением торможения роста опухоли и продолжительности жизни.

8. Последовательное комбинированное применение DTIC с цитодифференцирую-щим агентом Der (1-2 курса) приводит к достоверному повышению эффективности лечения ксенографтов беспигментной метастазирующей в легкие меланомы человека Ме17; терапевтический выигрыш проявляется усилением ингибирующего действия на рост опухоли с частичной регрессией опухоли и увеличением продолжительности жизни мышей.

9. Одновременная комбинированная длительная терапия ксенографтов пигментированной меланомы человека Meló РФН на фоне Der приводит к синергическому усилению эффективности и длительным ингибированием роста опухоли.

10. Схемы комбинированного лечения с использованием цитодифференцирующих агентов ПТРК, РФН или Der не сопровождаются лимитирующими побочными эффектами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Гаджиева С.Ш., Полосухина Е.Р., Седакова JI.A., Трещалина Е.М., Барышников

A.Ю., Небольсин В.Е. Сравнительная эффективность комбинированной терапии с использованием дикарбамина и других индукторов дифференцировки//РБЖ.-т.4.-№3.-2005 г,-с.106-111.

2. Гаджиева С.Ш., Полосухина Е.Р., Николаева Т.Г., Барышников А.Ю., Небольсин

B.Е., Антонов В.Г. Цитодифференцирующие агенты в онкологии//Вопросы онкологии.-2006 г.-т. 52.-№ 3.-С.267-274.

3. Райхлин Н.Т., Андронова Н.В., Седакова JI.A., Гаджиева С.Ш., Смирнова Е.А., Трещалина Е.М., Небольсин В.Е. Действие препарата дикарбамин на дифференцировку опухолевых гемопоэтических клеток эритробластоза Френд (гистологическое и электронно-микроскопическое исследование)//Вопросы онкологии.-2004 г.-т.50.-№2.-с.228-233.

4. Райхлин Н.Т., Андронова Н.В., Седакова JI.A., Гаджиева С.Ш., Смирнова Е.А., Вла-сенкова Н.К., Трещалина Е.М., Небольсин В.Е. Препарат дикарбамин вызывает дифференцировку опухолевых клеток эритробластоза Френд с образованием элементов лимфоидного миелоидного и эритроидного ряда//РБЖ.-т.4.-№3.-2005 г.-с.80-86.

5. Райхлин Н.Т., Букаева И.А, Каршиева С.Щ., Небольсин В.Е.Влияние дикарбамина на экспрессию Ag-белков, регулирующих скорость клеточной пролиферации.// VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» Москва, 17-19 марта 2008 г./ РБЖ.-т.7.-№1.-2008 г.-с. 50-51.

6. Каршиева С.Ш., Николаева Т.Г., Райхлин Н.Т., Трещалина Е.М., Барышников А.Ю., Небольсин B.EV/Особенности роста различных моделей меланомы животных и человека при щггодифференцирующей терапии дикарбамином. VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» Москва, 17-19 марта 2008 гJ - РБЖ.-т.7.-№1.-2008 г.-с. 42.

Подписано в печать 17.0 3.0 9 Формат 60x84/16. Бумага офсетная. _Тираж 100 экз. Заказ № 251____

тпечатано в службе множительной техники ГУ РОЩ им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Актуальность исследования?

Самостоятельное:- применение; цитодифференцирующих агентов (ЦДА)г в онкологии связано с: доказанным феноменом программированной гибели некоторых злокачественных клеток путем запуска терминальной дифференцировки [ 1, 94]. На примере натурального метаболита витамина А --полностью трансретиноевой кислоты (ГП'РК) - показано; что этот агент, запуская;, терминальную дифференцировку в клетках острого промиелоцитарного лейкоза. (Ol IJI), останавливает их пролиферацию и индуцирует апоптоз: Данные доклинического изучения продемонстрировали перспективность, поиска,: новых оригинальных агентов в ряду производных ПТРК, например;-. 13-цис-ретиноевой кислоты. Другим: давно» известным' примером': использования? ЦДА в онкологии?, является запуск дифференцировки; клеток иммунозависимых опухолей: под влиянием иммунобиологических агентов; - цитокинов; Показана; эффективность применения? препаратов a-2-интерферона. (а2-ИФН) при; волосатоклеточном лейкозе, диссеминированной меланоме и раке почки. [2, 22, 23, 27]. Среди новых цитодифференцирующих агентов наиболее интересны, и перспективны низкомолекулярные . соединения: [99,108]. В настоящем исследовании углубленно изучено одно из соединений этого типа - новый отечественный оригинальный псевдопептид дикарбамин (Der), представляющий собой 2-(имидазол-4-ил)-этанамид пентандиовой-Т,5 кислоты.

Анализ эффективности лекарственного лечения- некоторых форм рака, в числе которых меланома, рак почки и ОГ1Л, показывает, что, несмотря на увеличение числа лекарственных средств различных групп, результаты, остаются неудовлетворительными. В последнее время интенсивно изучается возможность включения ЦДА, в схемы, комбинированного лечения с целью повышения эффективности лечения: Особо актуально- использование малотоксичных ЦДА [1011, 47, 60; 123]. При комбинировании ЦДА с химиотерапией существует опасность снижения эффективности лечения за счет уменьшения пролиферативного пула опухолевых клеток. В.-связи с этим, представляется актуальным экспериментальное доклиническое изучение новых схем комбинированной терапии злокачественных опухолей с использованием индукторов дифференцировки. Цель исследования

Выявить роль индукторов дифференцировки в эффективности противоопухолевой терапии на моделях опухолей животных и человека. Задачи исследования:

1. Выявить in vitro и in vivo на моделях гемобластоза и меланомы степень модификации эффективности комбинированного лечения индукторами дифференцировки при различных схемах применения.

2. Определить in vivo влияние цитодифференцирующих агентов ПТРК, РФН и Der на опухолевый рост и эффективность некоторых схем комбинированной химиотерапии на моделях экспериментальных, гемобластозов и меланом.

3. Исследовать in vitro и in vivo возможный механизм антипролиферативного и противоопухолевого действия индукторов дифференцировки на клеточном и тканевом уровнях.

Методы исследования:

Методы культивирования клеток, методы экспериментальной химиотерапии, иммунофлуоресцентные методы, метод проточной цитофлуориметрии, методы световой и электронной микроскопии, биологические методы оценки эффективности препаратов в опытах на экспериментальных моделях опухолевого роста; статистическая обработка результатов.

Научная новизна

Впервые разработана модель перевиваемого дифференцирующегося гемобластоза на мышах с использованием культуры клеток DS19 эритробластоза Френд (ЭБФ), адекватная для доклинического изучения ЦДА in vivo. Впервые на перевиваемом ЭБФ и меланомах мышей и человека in vitro и in vivo изучены свойства известных ЦДА ПТРК, а2-ИФН и нового Der в монорежиме и/или в различных сочетаниях, а также в комбинации с дакарбазином (DTIC') или цисплатином (ЦП). Впервые установлен диапазон разовых терапевтических доз Der 0,5-4,5 мг/кг при 5-30-кратном введении per os для лечения опухолей мышей и 1,5-4,5 мг/кг при 5-10-кратном per os введении для лечения ксенографтов опухолей человека. Впервые найдены эффективные комбинации и подобраны режимы введения изученных ЦДА (Der, а2-ИФН и ПТРК) и противоопухолевых цитостатиков. Установлен синергизм Der и а2-ИФН при последовательном введении на ЭБФ и при одновременном введении на ксенографтах меланомы человека Meló. Найдено аддитивное усиление эффективности ЦП и DTIC при сочетании с Der и Der с ПТРК при последовательном введении. Впервые найдены оптимальные концентрации ПТРК, а2-ИФН и Der для проявления антипролиферативного и цитодифференцирующего действия на культурах клеток меланомы человека MS и Ме15, а также эффективные дозы in vivo на ЭБФ в монорежиме и в комбинациях. Впервые установлено, что антипролиферативное и противоопухолевое действие ПТРК, а2-ИФН, ДМСО и Der сопряжено со следующими проявлениями цитодифференцировки: изменение фенотипического профиля клеток (промиелоцитарный лейкоз человека NB4, HL60) интенсификацией меланиногенеза (культуры клеток меланомы человека MS и Ме15, и п/к ксенографты Meló); увеличение активности апоптоза, снижение активности митоза и возрастание зоны некроза в опухолях мышей и человека (гемобластоз ЭБФ, меланома В J б, Meló, Ме17); перераспределение клеток по фазам клеточного цикла - задержка клеток в стационарной фазе G¿/G; и накопление в фазе S без выхода в. митоз (гемобластозы NB4, HL60, меланомы В16, Meló, MelT). Научно-практическая значимость

В результате исследований' получены новые данные о свойствах различных цитодифференцирующих агентов на моделях опухолевого роста, имеющие фундаментальное значение. Установлены новые феномены антипролиферативной активности ПТРК, препаратов а2-ИФН и Der на культурах клеток меланомы, человека и животных MS, Ме15, В16, а также антипролиферативной и противоопухолевой активности Der на культурах клеток ОПЛ, перевиваемых гемобластозе и меланомах животных и человека.

Полученные новые экспериментальные данные о способности Der ингибировать пролиферацию клеток и опухолевый рост меланомы животных и человека с увеличением выживаемости, о синергизме между препаратами а2-ИФН' и Der и об аддитивном усилении эффективности ЦП, DTIC и ПТРК в сочетании с Der являются перспективными для клинического изучения. Связь темы диссертации с планом научных работ ГУ РОНЦ РАМН

Диссертационная работа полностью соответствует основным научным и практическим направлениям ГУ РОНЦ РАМН. Тема работы утверждена Ученым советом НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ РАМН.

Положения, выносимые на защиту

Индукторы дифференцировки, ПТРК и Der, способны запускать дифференцировку клеток острого промиелоцитарного лейкоза человека NB4 и HL60 и оказывать антипролиферативный эффект, модулируя экспрессию дифференцировочных и пролиферативного антигенов, а также изменяя распределение клеток по фазам клеточного цикла.

Результаты экспериментального изучения противоопухолевой активности ПТРК, а2-ИФН и Der в монорежиме и в комбинации друг с другом и в разных режимах введения на модели опухолевого роста эритробластозе Френд.

Der и а2-ИФН проявляют синрегизм, подавляя in vitro пролиферацию клеток мышиной меланомы В16 и меланомы человека Ме15.

Результаты экспериментального изучения противоопухолевой активности Der в монорежиме и в сочетании с химиотерапией (цисплатин, дакарбазин) и в разных режимах введения на моделях опухолевого роста. Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на- заседании Ученого Совета*НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН, 2006 г.; на VI и VII Всероссийскою научно-практической, конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», (М/о, с-з «Московский», 2007, 2008 гг.); на Российской конференции, по меланоме с международным участием, проводимой совместно с Европейской' школой онкологии и Всемирной рабочей группой по меланоме (Москва, 2008 г.); 7 июня 2008< г. на ' межлабораторной, конференции НИИ ЭДиТО с участием лаб. клеточного иммунитета, лаб. фармакокенетики,, лаб. комбинированной терапии опухолей, лаб. фармакологии и токсикологии, лаб. экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаб. синтетических противоопухолевых веществ, а также лаборатории фармакологии и химиотерапии ГУ НИИНА им. Г.Ф.Гаузе РАМН. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 4 научные статьи в рецензируемых журналах и 2 тезисов. Объем и структура диссертации

Диссертация, изложена на 151 страницах машинописного текста и состоит из введения, «обзора литературы», «материалов и методов», 4-х глав собственных результатов, выводов, списка литературы, списка сокращений. Список литературы включает 138 публикаций, из них 42 отечественных и 96 иностранных. Работа иллюстрирована 62 рисунками и 34 таблицами.

выводы

1. Цито дифференцирующие агенты (ЦДА) дикарбамин и диметилсульфоксид в отличие от полностью трансретиноевой кислоты модифицируют фенотип клеток линий NB4 и HL60 острого промиелоцитарного лейкоза человека (ОПЛ) на промежуточных этапах дифференцировки, сдвигая её в сторону гранулоцитов и/или моноцитов, статистически значимо уменьшая экспрессию маркеров CD33, CD38, и CD54 и увеличивая экспрессию маркеров CDllb, CD15 и CD18 без запуска терминальной миелоидной дифференцировки.

2. Антипролиферативное действие ЦДА на клетки линий NB4 и HL60 проявляется снижением их митотической активности с уменьшением экспрессии пролиферативного антигена Ki67, а также 2-3-кратным перераспределением клеток из пролиферативной S-фазы в стационарную Go/Gi-фазу клеточного цикла. Антипролиферативная активность препаратов убывает в ряду: ПТРК>ДМСО>Осг.

3. В монорежиме ЦДА достоверно ингибируют рост эритробластоза Френд (ЭБФ) при 2-3-кратном уменьшении митотической активности и увеличении клеточного апоптоза и зоны некроза; воспроизводимость и уровень эффекта убывают в ряду РФН>Осг>ПТРК.

4. Комбинированная терапия ЭБФ при одновременном введении РФН и ПТРК неэффективна, но эффективна при последовательным введении РФН и Der (цитокин - первый) или двух индукторов Der и ПТРК (терминальный индуктор — последний). Терапевтический выигрыш проявляется синергическим усилением торможения роста опухоли с длительной стабилизацией процесса при 1,5-2-кратном уменьшении числа клеток с митозами и 2-4-кратном увеличении числа клеток с признаками апоптоза и зоны некроза.

5. ИН-А и Der статистически значимо и дозозависимо уменьшают пролиферативную фракцию клеток меланом В16 и Ме15 в 2-2,7 раза; ИН-А проявляет синергизм с Der при 3-5-кратном усилении антипролиферативного действия.

6. Der в диапазоне доз 1,5-4,5- мг/кг статистически значимо ингибирует рост меланомы мышей В16 и меланом человека Ме16 и Ме17 на 51-93% с увеличением продолжительности жизни мышей на 29-41%; эффективность реализуется путем перераспределения'клеток из пролиферирующей фракции в стационарную, снижения митотической активности в 1,2-2,5 раза, с 1,5-5-кратным увеличением клеток с признаками апоптоза и зоны некроза, а также интенсификации меланиногенеза в меланинсинтезирующих клетках (ИИМ=19,0).

7. Одновременное комбинированное применение цисплатина с цитодифференцирующим агентом Der приводит к достоверному повышению эффективности лечения мышей с меланомой»В16; терапевтический выигрыш проявляется увеличением'торможения роста-опухоли и продолжительности жизни.

8. Последовательное комбинированное применение DTIC с цитодифференцирующим агентом1 Der (1-2 курса) приводит к достоверному повышению эффективности лечения ксенографтов беспигментной метастазирующей в легкие меланомы человека Ме17; терапевтический выигрыш проявляется усилением ингибирующего-действия на рост опухоли с частичной регрессией опухоли и увеличением продолжительности жизни мышей.

9. Одновременная комбинированная длительная терапия ксенографтов пигментированной меланомы человека Ме16 РФН на фоне Der приводит к синергическому усилению эффективности и продолжительному ингибированию роста опухоли.,

10. Схемы комбинированного лечения с использованием цитодифференцирующих агентов ПТРК, РФН! или- Der не сопровождаются лимитирующими побочными эффектами.

ОБЩИЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ Комплексное исследование: влияния ПТРК, ДМСО и; Der на фенотииический профиль и функциональную активность клеток ОПЛ человека линии NB4 и HL60 позволяет заключить, что каждый из изученных ЦДА способен запускать дифференцировку клеток, причем; терминальную -только Г1ТРК. Как и следовало ожидать, клетки NB4, в которых присутствует аберрантная форма рецептора ретиноевой кислоты RARLa, оказались наиболее чувствительными к действию ITTPK. Это объясняется механизмом действия ПТРК, который! подробно; описан в обзоре литературы. ДМСО в отличие от ПТРК не вызывает полное созревание нейтрофилов из клеток NB4; но существенно сдвигает дифференцировку в сторону гранулоцитов и/или моноцитов. Der в широком диапазоне концентраций способен запускать дифференцировку на дискретном этапе ранних миелоидных предшественников. При этом модуляция экспрессии антигена CD33 Bt клетках лейкоза NB4 свидетельствует о том, что, скорее всего, происходит сдвиг блока дифференцировки на несколько ступеней. Отсутствие этого эффекта в клетках лейкоза 1TL60, в которых нет специфической хромосомной транслокации t(15;17), подтверждает, что Der способен ингибировать пролиферацию только тех клеток; в которых присутствует аберрантная? форма рецептора. С другой стороны, эта неполная дифференцировка не сопряжена с модуляцией антигенов зрелых гранулоцитов; таких как CD 15 и CDllb, и с изменением адгезионного профиля клеток (CD54). В результате она является функционально незавершенной, так как не сопровождается изменением фагоцитарной активности и способности клеток к хемолюминисценции. Таким образом, дифференцировка гемопоэтических клеток, которая запускается препаратом- Der, отличается от процессов, индуцируемых какПТРК, так и ДМСО; Анализ эффективности ЦДА на ЭБФ в монорежиме и под контролем гистологических изменений в ЭБФ показал, что в РФН не вызывает достоверного противоопухолевого эффекта, а Г1ТРК или Der достоверно кратковременно* ингибируют роет опухоли на 59 и 65%,. соответственно. Комбинации IITPlODcr, DcrHPOH или Dcr-i-ПТРК малоэффективны по воздействию на рост опухолевого' узла. Наиболее эффективною из; всех изученных сочетаний была; комбинация- РФШ-Dcr, что выражалось в достоверном ТРО-67% и длительной стабилизации роста опухоли.

Гистологические изменениям в опухоли? полностью подтверждают терапевтическую' эффективность указанных агентов и их сочетаний по основным показателям дифференцировки клеток ЭБФ- которые проявляются, во взаимоусилении; направления дифференцировки с перераспределением-бластных клеток,, а также в увеличении процессов некротической; и апоптотической гибели клеток, например; увеличение зоны; некроза до 4050% и числа; клеток; с. признаками; апоптоза в 2-3 раза. Более; значительные; гистологические изменения? получены при; монотерапии Der или- ПТРК,, а также при« различных; их сочетаниях независимо' от последовательности введения: На основании данных терапевтических опытов и гистологических исследований п/к ЭБФ после применения Der, ПТРК и РФН в монорежиме и в различных комбинациях следует считать .перспективными для дальнейшего изучения комбинации- Der и РФН в прямой и обратной последовательности введения, а также Der и ПТРК с введением первым Der. Неудачи при? комбинации Der и ПТРК могут быть следствием общих мишеней для их цитодифференцирующего действия^

Опыты по изучению цитодифференцирующего действия Der, ИН-А и ПТРК на клетки мышиной меланомы В16 и меланом человека MS и Ме15, показалщ что Der и ИН-А в относительно высоких концентрациях дозозависимо замедляют пролиферацию клеток в течение 72 часов, не влияя на их выживаемость. При; этом сочетание Der и ИН-А. усиливает ингибирующий эффект препаратов на клетки. ПТРК и Der в относительно низких- концентрациях увеличивают фракцию клеток меланомы, MS с высокой степенью мелкогранулярной зернистости в 3 раза относительно интактных клеток.

Замедление скорости пролиферации и запуск меланинсинтезирующей функции клеток отдельных видов меланомы, животных и человека, которые проявляются* при достижимых концентрациях всех 3-х указанных агентов, свидетельствуют о неспецифическом цитодифференцирующем действии на клетки этой- опухоли. Анализ полученных результатов дает возможность выявить общие и различные стороны цитодифференцирующего эффекта Der, ИН-А и ПТРК на использованные тест-системы. Прежде всего, видно, что Der и ИН-А не только близки, по уровню-антипролиферативной активности и относительно высоким ингибирующим концентрациям, но, возможно, имеют разные мишени на клетке, т.к. их сочетание привело к существенному снижению-пролиферации меланомы. Аналогичные данные получены для'Осг и ПТРК. Оба препарата индуцируют образование мелкогранулированной-зернистости в клетках меланомы, что свидетельствует о восстановлении меланинсинтезирующей- функции и, соответственно, о запуске клеточной дифференцировки; но ■ без существенного влияния, на интенсивность роста клеток и их> морфологию, т.е не проявляют цитотоксичности.

Проведенные исследования показали, что результаты опытов in vitro не однозначны, т.к. не всегда цитодифференцирующее действие изученных агентов сопровождается замедлением пролиферации или, что лучше, остановкой роста меланомы, как, например, на клетках MS. Поскольку указанные эффекты реализуются при* достижимых in vivo концентрациях, была проведена серия опытов с изучением эффективности всех 3-х ЦДА на перевиваемых меланомах животных и человека.

В экспериментах на различных моделях меланомы животных и человека выявлена эффективность индукторов дифференцировки: известного препарата РФН и нового - Der и установлены оптимальные дозы и режимы применения. Показано, что терапевтический эффект РФН в отношении пигментированной' меланомы человека Ме16 реализуется при разовой дозе 100 тыс. ME/кг. при 5-дневном* курсе лечения и проявляется в незначительном и кратковременном ингибировании роста опухоли.

Терапевтический эффект Der реализуется при пероральном применении в разовых дозах 1,5-4,5 мг/кг в режиме 5-30 дневного курса и характеризуется• ингибированием роста опухоли на 51-93%, в ряде случаев с увеличением продолжительности жизни мышей на 29-41%. Для мышей с меланомой В16 оптимальной является схема применения Der в разовых дозах 1,5-4,5 мг/кг с введением в течение 15-30 дней. Эффективные суммарные дозы должны быть более 22,5 мг/кг. Для* мышей с ксенографтами меланомы человека оптимальной схемой является длительное (не менее 5-10 дней) введение в разовой дозе 4,5 мг/кг. Более высокую чувствительность мышиной меланомы В16 к действию Der можно объяснить отсутствием иммунологического компонента эффекта препарата у иммунодефицитных мышей. Предварительные исследования, проведенные в лаборатории клеточного иммунитета (рук. проф. М.В.Киселевский) показали, что Der является эффективным индуктором лимфокинактивированных клеток (JIAK) (неопубликованные данные). Во всех экспериментах с моделями меланомы терапия РФН или Der не вызывала каких-либо^ побочных или токсических эффектов.

Механизм ингибирующего противомеланомного действия изучен только для нового препарата Der. Его действие иллюстрирует распределение клеток по фазам клеточного цикла и их функциональное состояние (способность к меланиногенезу, активность митозов и апоптоза). Для всех 3-х использованных моделей меланомы показано, что Der реализует свой ингибирующий эффект путем усиления в 1,5-6,0 раз некротической гибели опухолевых клеток и в 1,5-5,0 раз активности апоптоза. Такое повреждающее действие Der, возможно, связано, с его способностью снижать доли пролиферирующих клеток и увеличивать долю-клеток в стационарной фазе Go/Gj; индекс пролиферации снижается в 2 раза. Для пигментированной меланомы человека' Ме16 показано, что Der осуществляет свое цитодифференцирующее действие также за счет усиления меланинсинтезирующей функции клеток в 14 раз.

Комбинированная химиотерапия ЦП в сочетании с последующим введением цитодифференцирующего препарата Der в разовой дозе 1,5 мг/кг при лечении пигментированной метастазирующей мышиной меланомы В16 оказалась достоверно более эффективной в сравнении с монохимиотерапией как по торможению роста опухоли на 63-76%, так и в 2 раза по выживаемости мышей. Примененный в субтерапевтической разовой дозе Der реализовал в этом эксперименте свойства модификатора эффективности цитостатика.

При комбинированном лечении пигментированной меланомы человека Ме16 одновременное использование * 2-х цитодифференцирующих агентов i Der в разовой дозе 1,5 мг/кг и РФН в сравнениигс монотерапией каждым из препаратов, хотя и не позволило добиться высокого противоопухолевого эффекта, но-способствовало стабилизации роста в течение по меньшей мере 2-х недель после окончания терапии*. Der и РФН проявили синергизм при лечении меланомы.

Комбинированная химиотерапия. DTIC беспигментной метастазирующей меланомы человека Ме17 в. сочетании с последующим введением Der в разовой дозе 4,5 мг/кг достоверно более эффективна, чем монохимиотерапия. Это выражалось в усилении ингибирования роста опухоли в 1,5 раза, частичной регрессии опухоли и увеличении продолжительности жизни мышей на 29%.

Цитодифференцирующая терапия меланомы с использованием РФН или Der эффективна. РФН проявляет синергизм с Der при лечении меланомы. Der оказывает противомеланомное действие в широком диапазоне доз при длительном пероральном применении путем перераспределения клеток из пролиферирующей фракции в стационарную, снижения их митотической активности, усиления процесса апоптоза и увеличения зоны некроза а также увеличения степени дифференцировки клеток путем интенсификации меланиногенеза. Поскольку Der прошел клинические испытания по 1 фазе, выявленная1- его противомеланомная активность дает основания для клинического испытания препарата в монорежиме по 2 фазе в качестве средства поддержания ремиссии у пациентов с исчерпанными возможностями лечения.

Использование цитодифференцирующих препаратов друг с другом или после химиотерапии при лечении диссеминированной меланомы может привести к существенному повышению эффективности. Для повышения эффективности интерферонотерапии может быть рекомендована комбинация с одновременным применением РФН и Der. Эффективность комбинированной химиотерапии ЦП или DTIC в сочетании с Der (применение между курсами химиотерапии) может служить основанием для клинических испытаний по 2 фазе в качестве средства повышения эффективности лечения у пациентов с диссеминированной меланомой