Роль гликопротеидов, регулирующих апоптоз, в дифференцировке гемопоэтических клеток человека

Заботина, Татьяна Николаевна

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Роль гликопротеидов, регулирующих апоптоз, в дифференцировке гемопоэтических клеток человека

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Заботина, Татьяна Николаевна Москва 2005 г.

Ученая степень: доктора биологических наук

ВАК РФ: 14.00.14

Автореферат диссертации по медицине на тему Роль гликопротеидов, регулирующих апоптоз, в дифференцировке гемопоэтических клеток человека

На правах рукописи

ЗАБОТИНА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

РОЛЬ ГЛИКОПРОТЕИДОВ, РЕГУЛИРУЮЩИХ АПОПТОЗ, В ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

14.00.14 - Онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2005 г.

Работа выполнена в лаборатории клинической иммунологии опухолей (руководитель - профессор З.Г. Кадагидзе) ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН (директор - академик РАН и РАМН М.И. Давыдов).

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор З.Г.Кадагидзе доктор медицинских наук, профессор А.Ю. Барышников

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Б.П. Копнин

Доктор медицинских наук, профессор A.A. Ярилин

Доктор медицинских наук, профессор, чл.-корр. РАМН A.B. Караулов

Ведущее учреждение:

ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена Росздрава

Защита состоится: « 27 » апреля 2006г. в 1000 на заседании Диссертационного совета Д.001.17.01 ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, д.24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан « 24 » марта 20061

Ученый секретарь Диссертационного сов д.м.н., профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы диссертации Гемопоэтические клетки развиваются из заложенных в онтогенезе стволовых кроветворных клеток и в процессе созревания проходят длинный путь дифференцировки. Процесс этот не хаотичен. В норме созревает ровно столько клеток, сколько их необходимо для поддержания гомеостаза. Поддержание гомеостаза в многоклеточном организме контролируется не только клеточной пролиферацией и дифференцировкой, но также клеточной смертью. Воспринимая различные сигналы, клетка или продолжает дифференцировку, или останавливается на некоторое время в процессе дифференцировки, или погибает (Ярилин A.A., 2004; Grossi С.Е. et.al., 2000; Opferman J.T. et.al., 2003). Программированная клеточная смерть (апоптоз) является важным механизмом поддержания корректного числа клеток в многоклеточном организме, обеспечивая его гомеостаз, а так же элиминацию клеток с генетическими повреждениями и клеток в терминальной стадии дифференцировки (Кгашшег Р.Н., 2000).

Нормальная дифференцировка гемопоэтических клеток представляет собой перманентный процесс, в ходе которого отдельные этапы протекают очень быстро, и, соответствующие типы клеток представлены в ничтожно малых количествах. При гемобластозах клеточная дифференцировка может быть «заморожена» на отдельных этапах и количество клеток, находящихся на определенном этапе созревания, непропорционально велико в результате дисбаланса между пролиферацией клеток и апоптозом.

В норме клетки миелоидного ряда проходят полное созревание в костном мозге, затем попадают в периферическую кровь в виде гранулоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, моноцитов. Клетки лимфоидного направления дифференцировки в незрелом состоянии покидают костный мозг и мигрируют в лимфатические узлы, селезенку (B-клетки), тимус (Т-клетки), где осуществляется их дальнейшая селекция и дифференцировка и, лишь, затем начинают циркуляцию в периферической крови. Известно, что в периферических лимфоидных органах на антигензависимой стадии дифференцировки B-лимфоцитов большинство клонов погибают по механизму апоптоза. В процессе созревания кортикальных и медуллярных тимоцитов селекция Т-клеток так же осуществляется с помощью апоптоза.

Опухоли гемопоэтической системы представляют собой уникальный пример сохранения клетками нормального дифференцировочного статуса в сочетании с опухолевой трансформацией, для которой характерны блокирование специфической дифференцировки, стимуляция пролиферации, подавление апоптоза (Абелев Г.И., 2000). То есть, одной из причин возникновения лимфопролиферативных заболеваний, является нарушение реализации программы апоптотической гибели, начиная от клеток-предшественников в костном мозге до зрелых клеток периферической крови. Поскольку злокачественные новообразования кроветворной и лимфоидной тканей представляют собой накопление или пролиферацию клеток на определенной стадии дифференцировки, мы использовали эти заболевания в качестве модельной системы для выяснения механизмов индукции апоптоза на различных этапах дифференцировки гемопоэтических клеток.

Молекулярные механизмы регуляции апоптотический гибели клеток исследуются весьма активно уже на протяжении двух десятилетий. Однако интерес к данной проблеме не ослабевает. В настоящее время изучение феномена апоптоза проводится на уровне «единственной клетки» в пределах многоклеточного организма. Различают два основных пути активации апоптотической программы в клетке, это внешний путь и внутренний путь. Внешний или рецепторно-опосредованный путь реализуется через «рецепторы смерти» поверхностной мембраны клетки, в частности, через СЭ95 рецепторно-лигандную систему. Внутренний или рецепторно-независимый (митохондриальный) путь контролируется семейством Бесподобных белков. Эти пути могут быть как независимыми друг от друга, так и взаимосвязанные Баланс проапоптотических и антиапоптотических белков-регуляторов апоптоза, таких как, СЭ95, С0243, Вс1-2, Вах, Р53, Кл-67, решает судьбу клетки в различных тканях, включая костный мозг, тимус и периферические лимфоидные ткани. Исследования апоптоза послужили толчком к развитию принципиально новых направлений в противоопухолевой биотерапии и разработке препаратов, действие которых направлено на конкретные мишени - гены, белки, рецепторы. Выяснение роли этих белков важно с практической позиции, поскольку белки, регулирующие реализацию программы апоптоза, сегодня рассматриваются как возможные мишени противоопухолевых препаратов. «Таргетная

терапия» открывает новые возможности в лечении злокачественных новообразований.

Таким образом, изучение молекулярных механизмов поддержания клеточного гомеосгаза и регуляции программы апоптотической гибели нормальных и опухолевых гемопоэтических клеток является актуальной задачей и служит основой для определения роли белков-маркеров апоптоза в дифференцировке клеток на различных этапах гемопоэза и создания новых подходов в биотерапии злокачественных заболеваний системы крови.

Цель работы

Исследовать и оценить прогностическое значение экспрессии белков, регулирующих апоптоз, на различных этапах дифференцировки нормальных и злокачественных гемопоэтических клеток человека.

Задачи исследования

1. Исследовать экспрессию мембранных белков СП95, СЭ243 на лимфоидных и миелоидных клетках различных этапов созревания.

2. Исследовать экспрессию внутриклеточных белков Вс1-2, Р53, Кд-67 на лимфоидных и миелоидных клетках различных этапов созревания.

3. Изучить коэкспрессию онкобелков и дифференцировочных антигенов лейкоцитов человека на лейкозных клетках и в норме.

4. Изучить уровень спонтанной и индуцированной фрагментации ДНК клеток, находящихся на различных этапах лимфоидной и миелоидной дифференцировки.

5. Определить клинико-диагностическую значимость экспрессии гликопротеидов, регулирующих апоптоз.

Научная новизна

Впервые проведена субпопуляционная оценка экспрессии белков-регуляторов апоптоза на различных этапах созревания нормальных и опухолевых клеток лимфоидного и миелоидного направлений дифференцировки с применением модельной системы злокачественных заболеваний гемопоэтической природы.

Получены данные, указывающие на то, что экспрессия С095 является маркером определенного этапа дифференцировки гемопоэтических клеток. Выявлены различия экспрессии антигена С095 в процессе дифференцировки

В-клеток: на ранних этапах созревания (OJ1JI) белок экспрессируется, при XJIJ1 он отсутствует. CD95 коэкспресирован с антигеном CD34 и антигенами ранних этапов миелоидной дифференцировки.

Дана оценка роли CD243 в процессе развития XMJ1 и при созревании лимфоидных клеток.

Выявлены различия в экспрессии Вс1-2 на этапах лимфоидной дифференцировки. Белок Вс1-2 отсутствовал при заболеваниях, соответствующим стадиям ранних В-клеток, и на стадии плазматических клеток. Высокая экспрессия Вс1-2 обнаружена в лейкозных клетках периферической крови больных B-XJU1 независимо от стадии развития заболевания.

Определены количественные показатели фрагментации ДНК лейкозных клеток периферической крови и костного мозга in vivo до лечения и в процессе терапии.

Сформулировано представление о значении и месте различных механизмов апоптоза в процессе дифференцировки кроветворных клеток человека.

Научно-практическая значимость работы

В ходе работы показано прогностическое значение экспрессии поверхностных и внутриклеточных онкомаркеров при ряде гемобластозов человека, что свидетельствует о целесообразности их определения при проведении иммунофенотипирования в комплексе с существующими параметрами. Разработанные подходы определения су б п опул я ц и он н ой экспрессии маркеров апоптоза могут быть использованы в клинической практике при выборе тактики лечения и назначения адекватных схем терапии. Предлагаемые проточно-цитофлуориметрические методы идентификации апоптоза клеток крови и костного мозга больных онкогематологическими заболеваниями могут быть рекомендованы для мониторинга качественной и количественной оценки эффективности назначаемой терапии. Исследование открывает перспективы изучения регуляции апоптоза при различных заболеваниях гемопоэтической природы в научных учреждениях системы РАМН и МЗ РФ.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на: 12-й конференции Международного гематологического общества (Вена, 1994), 13-й конференции Европейской ассоциации по исследованию рака (Берлин, 1994), 3-й, 4-й и 11-й международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 1995, 1996, 2003), конференции «Регуляция клеточного роста, дифференцировка и генетика опухоли» (Порто Каррас, Греция, 1995), конференции AACR «Программированная клеточная смерть» (Лейк-Джордж, США, 1996), 1-ом и 2-ом Съездах онкологов стран СНГ (Москва, 1996, и Киев, 2000), 28-ой и 29-ой конференциях Международного общества детских онкологов (Вена, 1996 и Стамбул, 1997), 7-ом, 8-ом, 15-ом Международных конгрессах по противоопухолевой терапии (Париж, 1997, 1998, 2004), 4-ом Международном симпозиуме по лекарственной резистентности (Берлин, 1997), 10-ом симпозиуме NCI-EORTC по новым препаратам в терапии рака (Амстердам, 1998), 14-ом международном конгрессе общества гематологов (Стокгольм, 1997), симпозиуме «Морфологические, иммунологические и молекулярно-биологические аспекты идентификации гемобластозов и родственных заболеваний» (Адлер, 1999), 92-ой ежегодной конференции AACR (Новый Орлеан, 2001), 3-ей, 5-ой, 6-ой , 8-ой и 9-оЙ конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург 1999, 2001, 2002, 2004, 2005), 8-ом международном симпозиуме по молекулярным аспектам химиотерапии (Гданьск, 2001), на симпозиумах «Биологические основы терапии он ко гематологических заболеваний» (Москва 1999, 2001, 2003), 1-ой, 2-ой, 3-ей конференциях «BD FACS Users Meeting» (Санкт-Петербург, 2001, 2002, 2004), конференции «Проточная цитометрия в онкологии» (Казань, 2003), конгрессе «Иммунологические заболевания: от теории к практике» (Москва, 2005).

Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции лаборатории клинической иммунологии опухолей, лаборатории иммунологии гемопоэза, клинико-диагностической лаборатории, лаборатории клинической цитологии, отделения химиотерапии гемобластозов, отделения биотерапии опухолей НИИ КО, отделения химиотерапии гемобластозов НИИ детской онкологии и гематологии, лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей,

лаборатории фар м акоцито ки нети ки, лаборатории медицинской биотехнологии НИИ ЭДиТО, лаборатории генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН 28 декабря 2005 года.

Материалы, изложенные в диссертации, представлены в 51 печатной публикации, в том числе получен патент на изобретение.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 276 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов, 6 глав собственных наблюдений, обсуждения и выводов. Библиографический указатель включает 482 источника (22 отечественных и 460 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 49 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МА ТЕРИЛЛЫ И МЕТОДЫ Моноклональные антитела (МКА). Для иммунофенотипирования (CD) клеток периферической крови и костного мозга здоровых доноров и больных гемобластозами, клеток тимуса и лимфатических узлов применяли МКА, полученные в ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН и коммерческие аналоги производства. Внутриклеточные биологические маркеры оценивали только при помощи коммерческих наборов.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ). В работе использовано одно-, двух- и трехцветное окрашивание поверхностных антигенов клеток с помощью МКА к дифференцировочным антигенам человека; комбинированное окрашивание поверхностных рецепторов МКА с одновременным окрашиванием внутриклеточных структур или только окрашивание внутриклеточных маркеров. Однопараметровое окрашивание проводили в непрямой или прямой РИФ, в остальных случаях применяли только вариант прямой РИФ.

Определение апоптотических клеток по окрашиванию ДНК пропидий иодидом (PÍ). Апоптозные клетки определяли по методу I.Nicoletti (1991).

Определение апоптоза методом TUNEL (terminal dUTP nick-end labeling) проводили с использованием коммерческого набора "In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein" (Boerhringer-Mannheim, Германия) no

описанной в руководстве методике для анализа методом проточной цитофлуориметрии.

Выявление апоптотических клеток методом двойого окрашивания с использованием Аннексина V-FITC и PI. Анализ клеточных популяций апоптотических клеток проводили с помощью метода прижизненного двойного окрашивания Аннексина V-FITC в комбинации с PI по методике, приведенной в руководстве (Caltag Lab., США).

Определение функциональной активности Р-гликопротеина. Активность белка оценивали по выбросу флуоресцентного красителя -субстрата Р-гликопротеина родамина Rhl23 с применением модуляторов функциональной активности (верапамил).

Проточно-цитофлуориметрический анализ. Использовали проточные цитофлуориметры FACSCalibur и FACScan ("Becton Dickinson", США). Выделение «гейтов» клеток для анализа осуществляли по параметрам прямого и углового светорассеяния (FSCvsSSC), в смешанных линейно-логарифмических режимах (SSCvsFLl,FL2,FL3) или только с применением параметров флуоресценции с логарифмическим усилением сигнала (log/log). В зависимости от цели анализа, в каждом образце проводили сбор от 10 ООО до 500 ООО клеток. Использовали гистограммный и DotPIot анализ, учитывали относительное число позитивных клеток (%) и интенсивность среднего канала флуоресценции (MFI).

Общая характеристика использованного материала. В работе были использованы образцы периферической крови и костного мозга 407 больных: ОЛЛ (п=54), ХЛЛ (п=116), ММ (п=14), НХЗЛ(лекемизация) (п=11), ОМЛ (п=30), ХМЛ (п=121), МДС (п=61), находившихся на лечении в отделении химиотерапии гемобластозов НИИ КО (зав. д.м.н. Османов Е.А.) и отделении химиотерапии гемобластозов НИИ детской онкологии и гематологии ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН (зав. - д.м.н. Попа А.В.), отделении химиотерапии лейкозов и патологии эритрона (зав. — проф., д.м.н. Н.Д.Хорошко) и клинике высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга (руководитель - проф., д.м.н. Савченко В.Г.) ГНЦ РАМН, отделении гематологии МОНИКИ им.М.Ф.Владимирского (зав. -проф., д.м.н. А.К.Голенков). В контрольной группе изучено 53 образца нормальной гемопоэтической ткани. Образцы периферической крови новорожденных детей (п=7) получены из отделения экстренной кардио-

хирургии недоношенных детей и детей первого года жизни Научного Центра Сердечно-Сосудистой Хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН. Образцы периферической крови здоровых доноров (п=30) получены из отделения переливания крови с банком костного мозга ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН (руководитель д.м.н. Огородникова Е.В.). Тимоциты были выделены из тимуса детей (п=8) в возрасте от 1 года до 14 лет, подвергшихся открытым операциям на сердце в отделении врожденных пороков сердца Научного Центра сердечно-сосудистой хирургии им.А.Н.Бакулева РАМН. Лимфоидные клетки получали из лимфатических узлов (п=5), удаленных с профилактической целью у больных с солидными опухолями во время выполнения хирургических операций.

Статистическая обработка результатов. Статистический анализ проводили с использованием программ "В IО STAT" (Version 3.2). Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента. Различия считали статистически достоверными при р<0,05 (Гланц С.А., 1998). Анализ данных, полученных с помощью проточных цитофлуориметров, проводился с использованием программного обеспечения BD CellQuest™Pro software, BD Ра1п1-а-Са1ешРЯО software, LYSYS II software. Сравнительный анализ гистограмм окрашенных клеток проводили попарно с применением статистики Kolmogorov-Smirnov (K-S) (Young I.Т., 1977).

РЕЗУЛЬТА ТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспрессия мембранных белков, регулирующих апоптоз

Экспрессия CD95

Наиболее изученным механизмом физиологической гибели клеток является рецепторно-лигандный путь передачи сигнала апоптоза с участием рецепторов суперсемейства TNF, в состав которого входит CD95. Взаимодействие CD95 с его лигандом (CD95L/FasL/APO-IL) или с моноклональными антителами против CD95 является триггерным моментом для активации процесса апо птоза. Кроме того, установлено, что большинство химиопрепаратов, применяемых в терапии гемобластозов, оказывают свое воздействие на опухолевую популяцию клеток путем индукции апоптоза (Krammer Р.Н., 2000; Барышников А.Ю., 2001; Askenasy N., et.aL 2005). CD95

является дифференцировочным антигеном, следовательно, его экспрессия связана с определенными этапами созревания гемопоэтических клеток.

Нами была изучена экспрессия дифференцировочного антигена С095(Раз/АР0-1) на лейкозных клетках больных ОЛЛ, ХЛЛ, ХМЛ в ХФ, ФА и в стадии БК, ММ, МДС и на нормальных клетках периферической крови доноров и тимуса.

Острый лгшфобяастный лейкоз.

Нами проведено исследование экспрессии С095 антигена на бластных клетках детей, больных ОЛЛ. Сравнение частоты встречаемости экспрессии С095 на клетках костного мозга при различных иммунологических подвариантах ОЛЛ выявило, что наиболее часто (63,6%) его экспрессия определялась при клинически наиболее благоприятном пре-пре-В подварианте заболевания. Проведенный корреляционный анализ выявил зависимость между экспрессией СОЮ и экспрессией С095 антигенов в группе больных с пре-пре-В ОЛЛ (г=0,54, р<0,05). Анализ 10-летней выживаемости больных показал, что медиану продолжительности жизни в С095+ группе больных на момент проведения сопоставлений определить не удалось в связи с тем, что общая выживаемость в этой группе была выше 50%, в то время как в С095" группе медиана общей выживаемости составила 24 месяца. Медиана безрецидивной выживаемости у больных в С095+ группе составила 115 месяцев, в СЭ95* группе - 13,2 месяцев. С помощью двухцветного окрашивания мы провели проточно-цитофлуори метрический анализ коэкспрессии дифференцировочных антигенов на бластных клетках больных ОЛЛ. Нами обнаружено, что С019+В-бласты экспрессируют на своей поверхности антиген С095 (рисунок 1).

1-ый квадрант - клетки, окрашенные только МКА СО 19, конъюгированными фикоэритрином (РЕ);

2-ой квадрант - клетки, одновременно окрашенные МКА С019РЕ, и МКА С095, конъюгированными Р1ТС;

3-й квадрант - клетки окрашенные только МКА С095Б1ТС;

I I ми«! | пищ "тип»!

4-й квадрант - интактные (неокрашенные) клетки

интактные

СБ95 ПТС

Рисунок К DotPlot цитограмма двухцветного анализа коэкспрессии дифференцироючных антигенов CD19 и CD95 на мембране бластных клеток больного ОЛЛ.

Наши данные, а также анализ литературных источников, позволили предположить что, наличие экспрессии поверхностного антигена CD95 на ранних этапах дифференцировки В-клеток достоверно влияло на увеличение общей и безрецвдивной выживаемости детей, больных ОЛЛ, и является самостоятельным параметром благоприятного прогноза при данной форме лимфопролиферативного заболевания.

Хронический римфолейкоз.

Исследовали экспрессию CD95 антигена на клетках периферической крови больных хроническим лимфолейкозом. При анализе лимфоидного пула клеток экспрессия антигена выявлена в 50,5% случаев, уровень антиген-позитивных клеток сильно варьировал от 10 до 67%. Анализ экспрессии CD95 антигена в группах больных до начала лечения, резистентных к терапии больных, и больных после лечения не выявил каких-либо различий. Эти результаты, а также противоречивые данные литературы послужили поводом для проведения детального субпопуляционного анализа коэкспрессии дифференцировочных антигенов на лейкемических клетках больных, не подвергавшихся терапии.

В исследуемую группу вошли первичные больные с различными клинико-гематологическими показателями. При одноцветном анализе лимфоцитарного «гейта» уровень клеток, экспрессирующих антиген CD95 колебался в пределах от фоновых значений на уровне изотипического контроля до 50%. Нами была обнаружена отрицательная корреляция содержания клеток, экспрессирующих антиген CD95, с уровнем лейкоцитов и абсолютным и относительным (процентным) содержанием лимфоцитов в периферической крови больных В-ХЛЛ, Больные с низким лейкоцитозом (лимфоцитозом) имели показатели выше по сравнению с пациентами, лейкоцитоз которых превышал 50 х 109 /л. Независимо от содержания CD95+ клеток, в сравнении с донорской группой, антиген представлен на мембране СШ5+-лимфоидных клеток больных В-ХЛЛ крайне слабо, что отражает интенсивность флюоресценции или MFI. MFI у больных ХЛЛ не превышает 30, в то время как у доноров этот показатель в 2,5 раза выше (р<0,001).

Поскольку в периферической крови онкогематологических больных всегда присутствуют нормальные клетки, мы провели многопараметровый трехцветный проточно-цнтофлуориметрический анализ коэкспрессии дифференцировочных антигенов налимфоидных С1)45+ клетках больных В-ХЛЛ. Было обнаружено, что у больных в начальных стадиях заболевания антиген СГ)95 локализован на мембране СЭЗ^Т- лимфоцитов. Аналогичное исследование экспрессии молекулы С095 проведено на СЕ>45+В-клетках. Оказалось, что В-клетки периферической крови с фенотипами СВ45+Л1Ю19+, С045+/НЬА-0г+ не экспрессируют на своей поверхности антиген СЭ95 (рисунок 2). ь_

СОЗ+/ СВ95-. 2 СЮЗ+/СОЭ5+ Л

""Ю* 10' 101 10* 10'

СЮЯНТС

Рисунок 2. Коэкспрессия дифференцировочного антигена С095 на С045+/СЭЗ+Т-лимфоцитах и его отсутствие на С045+/С019+ и С045+/НЬА-Эг+ В-клетках периферической крови первичного больного В-ХЛЛ в начальной стадии заболевания (трехцветное окрашивание).

Изучены образцы периферической крови первичных больных В-ХЛЛ в развернутых стадиях заболевания. Для этой категории пациентов характерно нарастание лейкозных лимфоцитов вследствие нарушения процесса гибели опухолевых клеток (лейкоцитоз, лимфоцитоз, пролимфоцитоз). Так, среди С045+лимфоцитов экспрессия С095 на клетках не превышала 5%, т.е. была

практически на уровне фонового контроля. Субпопуляционный анализ показал, что антиген С095 также отсутствовал на В-лимфоцитах, являющихся субстратом лейкозного пула клеток (рисунок 3). А Б В

to'

-щШ, "i'-Йг*

•iH

¡шш,

Рисунок 3. DotPIot цитограмма клеток периферической крови первичного больного B-XJLJI в III стадии заболевания (трехцветное окрашивание). Отсутствие экспрессии антигена CD95 на:

А - CD457CD5* клетках; Б - CD45+/CD19+ клетках; В - CD45+/HLA-Dr+ клетках.

Таким образом, на более поздних стадиях созревания лимфоидных клеток на примере первичных больных B-XJIJ1 мы обнаружили, что антиген. CD95 отсутствует на поверхности B-лимфоцитов независимо от стадии развития заболевания, а его наличие на ранних стадиях развития заболевания обусловлено коэкспрессией на циркулирующих в периферической крови нормальных CD3+ Т-клетках.

Хронический миеяоидный лейкоз.

Считается, что функционирование «сливного» белка р210, продукта гена Ьсг/аЬи играет роль в ингибиции «апоптотической машины» при ХМЛ и ведет к росту числа миелоидных клеток (Calabretta В. and Perrotti D., 2004). Имеются сведения, что некоторые виды апоптоза, в частности, апоптоз, индуцированный NK-клетками и макрофагами, не блокируются р210. Возможно, что одним из механизмов увеличения популяции лейкозных клеток при ХМЛ является нарушение функционирования СD95-рецепторно-лИгандгной системы. С этой целью нами проведено исследование экспрессии CD95 антигена на клетках больных ХМЛ в ХФ (п=46), ФА (п=13) и в стадии БК (п=43). ГранулоцитарныЙ и бластно-лимфоидный «гейты» клеток для анализа выделяли по светорассеянию в линейных параметрах FSC vs SSC.

Основной пул клеток периферической крови в хронической фазе ХМЛ представлен незрелыми миелоидными элементами и ни в одном из исследованных образцов гранулоцитарные клетки не экспрессировали антиген С095. В тоже время, бластно-лимфоидные клетки имели на своей поверхности СБ95 антиген у 22 из 46 больных (48%).

Иммунологический фенотип бластных клеток 9 больных в ХФ ХМЛ соответствовал иммунофенотипу бластов, типированных в стадии БК. Кроме того, частота выявления СЭ95 антигена на клетках в группе больных в ХФ (48%) практически не отличалась от частоты выявления антигена на клетках в группе больных в ФА — у 7 из 13 (53,8%). С помощью метода двойного окрашивания клеток периферической крови больных в ХФ обнаружено, что МКА ап^-С095 окрашивали клетки, экспрессирующие антигены С034, СОЮ, СШЗ, СОВ, характерные для ранних этапов миелоидной и лимфоидной дифференцировки (рисунок 4).

а - коэкспрессия антигенов СЭ95 и СЭЗЗ на бластных клетках больного ХМЛ вХФ

б- коэкспрессия антигенов СЭ95 и СОЮ на бластных клетках больного ХМЛ в ХФ

СОЗЗ+/СОЗЗ+

•лЙ/-.;.'

ь^;-.:' -

. - ГЛ'--,-:.,.

"13:'.;" ' 1

Но1 10-сом ргтс

Рисунок 4. Двойное окрашивание бл астно-л и м фон д н ы х клеток периферической крови больных ХМЛ в ХФ.

В стадии БК ХМЛ исследование экспрессии антигена С095 на бластных клетках было проведено у 43 больных. Относительное содержание бластных клеток в периферической крови составило от 20 до 84,3%. Экспрессия антигена С095 была выявлена у 42% больных, а содержание клеток, позитивных по С095, не коррелировало с процентным содержанием

бластных клеток (г=0,26; р>0,05). Анализ экспрессии 0095 антигена на клетках больных в зависимости от иммунологических вариантов БК ХМЛ показал, что антиген наиболее часто встречается при смешанном варианте властного криза ХМЛ (62%), затем при миелоидном варианте БК ХМЛ (59%) и несколько реже при лимфоидном (20%).

С помощью метода двойного окрашивания мы показали, что большинство бластных С034+клеток в стадии БК ХМЛ экспрессируют на своей поверхности молекулу С095, опосредующую апоптоз. При этом значительная доля бластных клеток оказалась отрицательной по связыванию с МКА ап1(-С095 (рисунок 5).

я е.

Рисунок 5. Е>о1Р1о1 цитограмма коэкспрессии антигена СБ95 на СР34+ клетках больных ХМЛ в стадии БК.

Таким образом, наши результаты говорят в пользу того, что антиген СЭ95 экспрессирован на бластных клетках 48% больных в ХФ ХМЛ, где показана его коэкспрессия на бластных клетках с ранними миелоидными антигенами. В ФА частота выявления молекулы С095 составила 53,8%. В стадии БК ХМЛ антиген представлен на клетках больных в 42% случаев. Коэкспрессия на бластных клетках С095 антигена с антигеном стволовой клетки СБ34 и рядом миелоидных антигенов (С013, СЭЗЗ) свидетельствует о том, что он является маркером ранних этапов дифференцировки.

Множественная миелома.

Множественная миелома (ММ) - системное заболевание лнмфоидной ткани. В основе ММ лежит злокачественная трансформация плазматических клеток, при этом клетки стромы, молекулы внеклеточного матрикса и растворимые факторы определяют выживание и прогрессирование опухоли. Только небольшая часть клеток ММ активно синтезирует ДНК, так что

С 034 ззЗяИИ , Ср34*/С005+

Ш \ - «Ч V* * Т

10" 10' 101 1 " 10* 10*

СО 94 Р1ТС

прогрессировать опухоли определяет скорее устойчивость к апоптозу, чем способность к пролиферации (Spets et.al., 2002).

Исследуя экспрессию CD95 на 14 образцах костного мозга больных ММ, экспрессию маркера мы наблюдали в 57% (8 из14) случаев. Количество положительных по маркеру клеток колебалось от 3,7 до 79,9%, и, в среднем по группе, составило 24,4±22,1% положительных клеток. I Коэкспрессию CD95 и Вс1-2 мы исследовали в 8 случаях и, хотя статистически достоверных корреляций между экспрессией этих двух маркеров не наблюдалось, 62,5% (5 из 8) больных имели негативную экспрессию Вс1-2 и позитивную экспрессию CD95, что указывает на проапоптотический фенотип клеток CD95+/BcI-2\ Коэкспрессию CD95 и мутантного р53 мы исследовали всего в 5 случаях, и, несмотря на отсутствие корреляций, 60% больных (3 из 5) имели положительную экспрессию обоих маркеров.

Однако по литературным сообщениям исследования роли рецептора CD95 при ММ следует считать мало перспективными. В пользу этого свидетельствуют результаты по изучению селективной индукции апоптоза в клетках больных ММ с вовлечением других рецепторов смерти - DR4 и DR5 (TRAIL-Rl/Apo2). При этом TRAL-/Apo2L вызывает апоптоз исключительно в клетках ММ (даже в. резистентных к дексаметазону), но не в нормальных В-клетках или гемопоэтических предшественниках (Mitsiades C.S. et. al., 2001).

Мне под испласт ический синдром.

В изученной нами литературе имеются работы по изучению процесса программированной клеточной смерти при миелодисплазиях, однако исследований экспрессии антигена CD95 выполнено мало. Возможность трансформации МДС в лейкоз делает изучение данного вопроса важным не только с теоретических, но и с практических позиций.

Анализ экспрессии антигена CD95 больных МДС мы проводили только на клетках костного мозга. При однопараметровом (одноцветном) анализе бластно-лимфоидного «гейта» клеток было обнаружено, что антиген CD95 экспрессирован в 27 из 61 случаев (44,2%) и представлен на 34,2% ± 14,3% клеток костного мозга. Анализ различий иммунологического фенотипа между РА и РАИБ показал, что для РА характерна достоверно высокая экспрессия антигенов более поздних этапов дифференцировки (CD15, CD4,

CD20 и Др.). Напротив, экспрессия маркеров ранних гемопоэтических клеток CD13, CD38, HLA-Dr была более свойственна РАИБ.

Изучение коэкспрессии дифференцировочных антигенов на клетках бластно-лимфоидного и гранулоцитарного «гейтов» с применением двухцветного проточно-цитофлюориметрического анализа показало, что при РА и РАИБ антиген CD95 экспонируется только на клетках бластно-лимфоидного гейта. Клетки гранулоцитарного «гейта» были негативны по CD95 у всех больных. В связи с этим, в дальнейшем анализу подвергались только клетки бластно-лимфоидного происхождения.

У больных РА иммунологический профиль б л астн о-лимфоидных клеток практически не отличался от показателей здоровых доноров. Отсутствие миелоидных предшественников в костном мозге больных РА косвенно указывает на апоптоз в коммутированных миелоидных клетках. Экспрессия CD95 незначительно снижена по сравнению с контрольными образцами, как по уровню антиген-позитивных клеток (31,3±2,7%), так и по степени экспрессии антигена (интенсивность флуоресценции или MFI=40,2).

Блаегно-лимфоидные клетки костного мозга больных РАИБ также экспрессировали антиген CD95, однако, количество антиген-положительных клеток было достоверно ниже, чем в группе больных РА (23,6±4,2%, р<0,05). Результаты двухцветного иммунофлуоресцентного окрашивания клеток МКА antí-CD13, MICA anti-CD33 и МКА anti-CD95 позволило сделать заключение о том, что выявляемые дифференцировочные антигены миелоидной направленности и антиген CD95 локализованы на разных клетках, поскольку отсутствует двойная позитивная популяция клеток, коэкспрессирующая оба маркера. Вместе с тем, высокая корреляционная связь экспрессии антигена CD95 с антигеном CD34 в С095-положительной группе больных РАИБ указывает на взаимосвязь этих маркеров именно при бластноЙ морфологии стволовых гемопоэтических клеток (г=0.81, р<0,02). Кроме того, с помощью метода двухцветного окрашивания клеток костного мозга больных РАИБ моноклональными антителами к данным антигенам была обнаружена популяция бластных клеток, коэкспрессирующая на своей поверхности оба маркера. При этом часть клеток оставалась положительной по связыванию с MICA anti-CD34 и негативной по связыванию с МКА anti-CD95, а часть клеток была отрицательной по экспрессии антигена CD34 при наличии на мембране антигена CD95 (рисунок 6).

2С013* Р1в

* С034* С034*/ССЭ5

;р;р|>вз Р1ТС*

СЙМГГГС

со мрггс

Рисунок 6. Б^РЫ цитограмма двухцветного окрашивания клеток костного мозга больного РАИБ: а - МКА С013-СБ95 (отсутствие двойной позитивной популяции клеток; б - С034-С095 (коэкспрессия антигенов).

Анализ трехлетней выживаемости больных РА и РАИБ в зависимости от экспрессии СЭ95 показал, что среди больных РА никто не умер, тогда, как среди больных РАИБ погибло 11 (45,8%) пациентов. Надо заметить, что у погибших больных РАИБ клетки костного мозга не экспрессировали антиген С095. Именно для больных РАИБ показана благоприятная прогностическая роль экспрессии на клетках С095, что нашло отражение в значительно большем числе неблагоприятных исходов в случае отсутствия антигена. Вместе с тем, проведенный корреляционный анализ и сравнение СЭ95+ и СБ95" групп пациентов позволяет говорить о независимом характере экспрессии С095 антигена от других дифференцировочных антигенов на клетках костного мозга больных МДС.

Нормальные гемопоэтические ткани.

Современная идеология апоптоза гемопоэтических клеток в основном обязана исследованиям лимфоидных клеток, а изучение биологии лимфопролиферативных заболеваний самым тесным образом связано с прогрессом в понимании механизмов нормальной дифференцировки лимфоцитов (Злуегс11о\у АЛ., 2003; Ярилин А.А., 2004).

Субпопуляционные исследования экспрессии в нормальных тканях показали, что мембранный антиген СВ95, опосредующий апоптоз, в периферической крови взрослых доноров выявляется на 35-75% лимфоидных клеток, из них на 40-60% СОЗ+Т~клеток и на всех С019+В-клетках (рисунок 7). Антиген СБ95 отсутствовал на моноцитах и

гранул о цитах во всех образцах периферической крови здоровых доноров независимо от возраста.

о"

1' 1 f~2 43,5% Ж . ' 'is

18,1% ' Л* ;,...' ' -Ш&Ь1

ш ч "J*.?-

' 3 * i'/'. *.

CD 0,7% i * ■ - i \ • Ш 6,91% 1 ,

• •¿■з&йёЬ ^Щр!« 53,9% ^ЩйЕР-. - 1 г - -

С095ПТС

C095F(TC

Рисунок 7. Экспрессия CD95 на CD37CD45 и CD19+/CD45+ субпопуляциях лимфоцитов (трехцветное окрашивание).

Уровень экспрессии CD95 антигена на лимфоцитах зависит от возраста. У новорожденных детей он отсутствует, однако к 4-5 годам показатели соответствуют уровню здоровых взрослых людей.

Экспрессия CD95 на тимоцитах (п=8) сильно варьировала от фонового уровня 8,7% до 35,2%, среднее значение составило 24,7±10,3% антиген-положительных клеток. При этом гистограмма распределения окрашенных клеток имела гомогенный характер экспрессии. Сравнительный анализ гистограмм распределения тимоцитов, окрашенных МКА CD95, с изотопическим контролем проведен также попарно с применением статистики Kolmogorov-Smirnov (K-S). Этот метод позволяет производить количественный анализ различий интенсивности флюоресценции каждой из клеток, составляющих гистограмму (кривую). С этой целью используется режим наложения (overlaid) двух гистограмм в одной системе координат. Анализ показал, что различия являются статистически достоверными при сравнении гистограмм измерений экспрессии CD95 с контрольным образцом (р<=0.001). Индекс сравнения двух гистограмм, обозначаемый D, составил 0.56. Важно подчеркнуть, что гистограммы считаются идентичными при индексе D^O, чем значения D ближе к единице, тем существеннее отличия сравниваемых кривых (Young I.T., 1977). Слабая по интенсивности

экспрессия CD95 антигена на тимической стадии развития Т-клеток указывает на его низко регуляторную роль на данном этапе созревания, хотя известно, что в основном формирование антигенного репертуара Т-лимфоцитов завершается именно в тимусе, а не прошедшие селекцию клетки погибают путем апоптоза (Santori F.R. and Vukmanovic S., 2004; Sprent J., 2005).

На основании полученных результатов можно сказать, что антиген CD95, опосредующий апоптотическую гибель клеток, присутствует на различных этапах созревания, как миелоидных клеток, так и на клетках лимфопоэза и играет важную роль в регуляции дифференцировки гемопоэтических клеток человека.

Экспрессия CD243

Одной из основных причин недостаточной эффективности терапии в лечении гемобластозов является устойчивость опухолевых клеток, опосредованная функционированием трансмембранных белков, к которым принадлежат Р-гликопротеин, а также белки-транспортеры семейства MRP. Экспрессия Р-гликопротеина обеспечивает устойчивость клеток к негативному действию разнообразных цитотоксических веществ и условно является рецепторно-опосредованным механизмом супрессии

апоптотической гибели клеток. На VII Международном рабочем совещании по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека мембранный белок Р-гликопротеин или Pgpl70 был отнесен к кластеру дифференцировки CD243, и, таким образом было зафиксировано, что он является маркером определенных этапов клеточной дифференцировки.

Исследования экспрессии и функциональной активности мембранного белка CD243 проводилось на клетках больных XMJI и OMJI, а также на клетках здоровых доноров и тимоцитах.

Хронический мпелоидный лейкоз.

Исследовали уровень клеток, экспрессирующих мембранный белок CD243 и его функциональную активность по выбросу клетками флуоресцентного красителя родамина 123 (Rhl23) в образцах периферической крови и/или костного мозга, полученных от 121 больного ХМЛ. У 48 больных экспрессия CD243 исследована с одновременным

изучением функциональной активности белка. Повторный анализ экспрессии мембранного белка С0243 на разных стадиях ХМЛ проведен 14 пациентам.

Положительные С0243+-клетки выявлялись у больных во всех стадиях заболевания, при этом число С0243+случаев в хронической фазе (ХФ) было ниже, чем в фазе акселерации (ФА) и при властном кризе (БК). У 32% больных в стадии БК обнаружены позитивные СЭ243-клетки с уровнем экспрессии >20%. У 11% больных в БК были обнаружены клетки с высоким уровнем экспрессии - более 50% С0243+-клеток, Кроме того, установлено, что число С0243+ случаев, содержащих более 20% С0243+ клеток, при БК ХМЛ оказалось статистически достоверно выше, чем в ХФ (р<0»02). Из 13 обследованных больных в ФА С0243+-клетки с высоким уровнем экспрессии белка (>20%) были обнаружены только в двух случаях. В то же время, популяции клеток, позитивных по экспрессии С0243 с низкими уровнями (10-19%), обнаружены во всех стадиях заболевания - в ХФ 13% пациентов, в ФА - 15% и при БК - 18% (рисунок 8), А-хроническая фаза Б-фаза акселерации В- бластный криз

е=5 С0243++ - экспрессия белка > 50%; СИЗ С0243* - экспрессия белка 19 - 49% ™ С0243*'* - экспрессия белка 10-18% 523 С0243* - экспрессия белка < 10% Рисунок 8. Экспрессия С0243 при различных стадиях ХМЛ

Изучено функциональное состояние мембранного белка С0243 периферической крови больных ХМЛ в различных стадиях развития заболевания. Тестирование функциональной активности С0243 необходимый элемент исследования лекарственной устойчивости, обусловленной С0243.

В хронической фазе и фазе акселерации, клетки больных с положительной экспрессией белка С0243, независимо от числа позитивных

клеток, не изменяли свое распределение по интенсивности флюоресценции под действием верапамила, что расценивалось как отсутствие функциональной активности СБ243 и позволило сделать предположение, что в случаях ХФ и ФА клетки вообще слабо накапливают препарат. Однако, в стадии БК у всех пациентов, клетки которых оказались СО243отмечается положительная реакция в тесте по оценке функциональной состоятельности белка С0243 (рисунок 9).

А - хроническая фаза ХМЛ Б - бластный криз ХМЛ

Рисунок 9, Изучение функциональной активности белка С0243 у больных ХМЛ: А - в хронической фазе; Б - при бластном кризе.

При сравнении показателей средних каналов интенсивности флюоресценции (МИ) клеток больных в ХФ и видно, что результаты практически не отличаются в случае обработки клеток верапамилом и без него - 59,8 и 51,7. Кроме того, показатели МБ1 клеток, не обработанных модулятором функциональной активности у больных в стадии БК, имеют сходный характер - 47,4. При сравнении с МИ1 клеток больных БК, обработанных КЫ23 и верапамилом различия составляют более чем в 4 раза. Эти данные позволяют предположить о том, что в случаях ХФ и ФА клетки вообще слабо накапливают препарат.

Поскольку СБ243 является дифференцировочным антигеном, был проведен корреляционный анализ экспрессии на клетках СЭ243 и других исследуемых дифференцировочных антигенов — С034, СЭЗЗ, С013, СО 14, НАЕ-3, НАЕ-9, СБ11Ь, СБ I О, СБ 19, СЭ22. Выявлена достоверная корреляция антигенов СБ243 - СЭ34 (г=0.36) и СЭ243 - СЭ13 (г=0.31). С помощью метода двойного окрашивания было показано, что у больных в

периферической крови циркулируют бластные клетки, коэкспрессирующие на своей поверхности СО243 и СЭ34 антигены (рисунок 10).

С С24334*

С034+

сомпгс

Рисунок 10. Бо1Р1о1 цитограмма бластных клеток больного в стадии БК ХМЛ, коэкспрессирующих антигены С0243 и С034.

Мы исследовали характер экспрессии СЭ243 антигена на клетках костного мозга больных в стадии БК в зависимости от иммунофенотипа бластных клеток. Оказалось, что у больных в БК с фенотипом бласгов С034*С033\ СЭ34+С033+, СОЭ4*СОЗЗ+ наблюдается постепенная утрата клетками экспрессии С0243 (рисунок 11).

СТШ'/СОЭЗ"

С&М'/СВИ*

С1И47С1Ш*

С0243

СР243

€0243

И контроль; — гистограмма распределения клеток, окрашенных МКА С0243 Рисунок 11. Изменение экспрессии С0243 на бластных клетках больных БК ХМЛ в зависимости от иммунофенотипа.

При исследовании динамики лекарственной устойчивости бластных клеток через определенные интервалы времени выявлено, что у некоторых больных в течение бластного криза наблюдалось изменение в процентном содержании бластных клеток, экспрессирующих С0243, как в сторону уменьшения, так и увеличения. Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что при БК ХМЛ терапия препаратами круга МЛУ не является ведущим селективным фактором. По-видимому, при БК ХМЛ резистентность к проводимой терапии не связана в большинстве случаев с гиперэкспрессией

белка С0243, а его наличие следует рассматривать не как причину устойчивости к терапии, а как маркер определенного этапа дифференцировки бластов либо по нормальному типу, либо по абберантному.

Острый миелоидный лейкоз.

Частота выявления экспрессии на властных клетках костного мозга 30 первичных больных ОМЛ белка СЭ243 составила 54%, а уровень клеток, экспрессирующих антиген СЭ243 не превышал по группе 24,6±12,3%. У 3-х больных определялся уровень экспрессии белка на клетках более 50%, И, лишь у одного из этих больных обнаружен высокий уровень экспрессии антигена С034 на бластных клетках.

Нормальные гемопоэтические ткани.

Вопрос о роли транспортного белка С0243 на поздних (периферических) этапах формирования лимфоидной ткани является малоизученным. Однако проведенный нами субпопуляционный анализ показал, что в периферической крови здоровых доноров С03+/С045+/СВ14" Т-клетки являются негативными, то время как все СО 19+/СО45+/С014" В-лимфоциты экспрессируют на своей поверхности функционально неактивный белок СВ2АЗ (рисунок 12).

И ш

шик^

[И ч С019+/СВ243+ ¡Л» .

и«,.- ______ 3

СБ 243 Р1ТС

СО 243 ИТС

Рисунок 12. Экспрессия белка С0243 на СВЗ+/С045+ и С019+/С045+ субпопуляциях лимфоцитов периферической крови здоровых доноров.

В отличие от периферической крови 10-30% клеток тимуса несут на своей поверхности Р-гликопротеин, однако обладают крайне слабой экспрессией. В тоже время в литературе имеется лишь одно сообщение по исследованию значения этого белка на данном этапе дифференцировки Т-лимфоцитов, но на мышиной модели. Было показано, что С0243 не выявлялся на незрелых С04*С08' и СЕ>4+С08+ тимоцитах, также

отсутствовал на зрелой С D4+CD 8'су б п опул я ц и и, при этом слабо экспрессировался на большей части зрелых CD4~CD8+ клетках. Появление Р-гликопротеина на поздних этапах развития лимфоидных клеток в тимусе свидетельствует о его линейно-специфической роли в дифференцировке Т-клеток (MacDonald H.R. et.al., 1995).

Таким образом, можно заключить о том, что мембранный белок CD243 выявляется на CD34* клетках-предшественниках, а также на CD33, CD13 клетках миелоидного направления дифференцировки на примере больных ХМ Л. На лимфоидных клетках периферической крови здоровых доноров антиген отсутствует на мембране CD3+ Т-лимфоцитов, однако, все В-лимфоциты его экспрессируют, но в функционально неактивном состоянии. Невысокий уровень экспрессии CD243 обнаружен на тимоцитах.

Экспрессия внутриклеточных белков

Экспрессия белков семейства Вс1-2

Процесс апоптоза в клетке контролируется целым рядом внутриклеточных белков, в частности, белками семейства Вс1-2. Одни из них индуцируют программированную клеточную гибель, другие - ингибируют ее. Предполагается, что программа апоптотической гибели клетки, регулируется соотношением анти- и про-апоптотических белков, а именно, соотношением гомо- и гетеродимеров (Thomas A. etal., 1996).

Нормальные гемопоэтические ткани

Экспрессия белков семейства Bcl-2 на лимфоцитах периферической крови и костного мозга здоровых доноров

Изучение экспрессии белка Вс1-2 в лимфоидных клетках периферической крови здоровых доноров (п=18) показало, что он представлен на мембранах митохондрий лимфоцитов практически в 100% случаев, при этом, интенсивность экспрессии крайне слабая и имеет гомогенный характер. Уровень положительных клеток составил 13,5±5,8%. Анализ среднего канала интенсивности флюоресценции окрашенных образцов (MFI) практически не отличался от изотипического внутриклеточного контроля - 33 и 28 соответственно. Однако сравнительный анализ гистограмм с применением коммерческого пакета статистической обработки данных (Kolmogorov-Smirnov Statistics (K-S) «Becton Dickinson»)

указал на достоверные различия анализируемых образцов. Индекс различия гистограмм (И) составил 0.21, р<0,001.

Экспрессию белка Вах на лимфоидных клетках периферической крови здоровых доноров наблюдали в 15 из 18 образцов (83,3%). Как и в случае исследований Вс1-2, положительная реакция отмечалась в виде сдвига «пика» окрашенных клеток вправо по шкале интенсивности флюоресценции. Уровень клеток, его экспрессирующих, варьировал от 1,2% до 14,1%, а среднее значение по группе составило 6,4±5,7%. Соотношение экспрессии белков семейства Вс1-2/Вах на лимфоидных клетках периферической крови доноров (п=15) составило 1.5-2.6.

Среди общего пула С045+-лимфоидных клеток костного мозга здоровых доноров (п=4) экспрессия Вс1-2 не выявлена ни в одном из тестируемых образцов, экспрессия белка составила от 0,44 до 4,35% (среднее 2,2±1,7%) положительных клеток. Экспрессию белка Вах на клетках нормального костного мозга изучали только в двух случаях, при этом один образец был отрицательным - 0,91%, а в другом - 63% положительных клеток. Соотношение экспрессии белков группы Вс1-2/Вах в донорском костном мозге составило 2.6 и 0.002 соответственно.

Экспрессия белка Вс1-2 на субпопуляциях тимоцитов

Исследование экспрессии Вс1-2 в тимоцитах проводилось с применением трехцветного окрашивания. Субпопуляции тимоцитов выделяли в зависимости от экспрессии поверхностных антигенов. На основании коэкспрессии на мембранах тимоцитов дифференцировочных антигенов были выделены 4 гейта клеток: 1-ый - зрелые С04+ тимоциты, 2 -ой - незрелые С04+С08+ тимоциты, 3-ий - зрелые С08+ тимоциты, 4-ый -негативные тимоциты по экспрессии обоих маркеров. В дальнейшем был использован гистограммный анализ для изучения содержания внутриклеточного митохондриального Вс1-2 белка в каждой из субпопуляций тимоцитов (рисунок 13).

Вс1-2 экспрессировался в С04~С08~ дубль-негативных тимоцитах, а также в зрелых С1)4+(1,2 квандранты) и С08+(2,3 квандранты) популяциях тимоцитов. Абсолютное большинство СЕ>4+С08+ дубль-позитивных тимоцитов также экспрессировали Вс1-2, однако, его экспрессия (МР1) была значительно ниже, чем в других субпопуляциях. Средний капал интенсивности флюоресценции (МИ) клеток, окрашенных И1ТС-

конъюгированными ап11-Вс1-2 МКА, составил от 68 до 74 для субпопуляций С04~С08~, С04+СВ8~, СЕ>4~С08+ тимоцитов и 46 для СШ+С08+ тимоцитов. Надо заметить, что среди тимоцитов с фенотипом СП4+С08+ часть клеток оказалась отрицательной по связыванию с апи-Вс1-2 МКА.

СБ4+/СВ8-

94,7%

■е

10° 10' 10- 10* Вс1-2 РГТС

10°

10*

выделение гейта

СВ4+/С08+

74,6%

ю"

-Л

4' **

ю"

8, СВ4-/Ст-

91,2%

10' юг ю*

СМРегСР

10*

10' 10^ 10* 6с 1-2 РГТС

10'

10' ю- 10* Вск2 Р1ТС

С04-/СБ8+

94,8%

10°

10*

101 10* 10» еы-2 втс

10*

Рисунок 13. Анализ субпопуляций тимоцитов, выделенных по связыванию с МКА анти-СЭ4РЕ, анти-С08РегСР

Экспрессия белка Вс1-2, Кг-67 на субпопуляциях лимфоцитов периферических лимфатических узлов

Проведено исследование распределения Вс1-2 в Т- и В-лимфоцитах, полученных из лимфатических узлов (п=5). Выделение популяций клеток для последующего анализа проводилось в Оо1РЫ цитограмме по экспрессии поверхностного антигена СВ19 (для В-лимфоцитов) или СЭЗ (для Т-лимфоцитов) и маркера ядерной пролиферации К1-67, характеризующего активность клеточного деления (цикла).

Положительная экспрессия маркера К1-67 наблюдалась во всех 5 случаях (100%) на Т-, и В-клетках. Количество К1-67 позитивных лимфоцитов варьировало от 1,7 до 8,9% (в среднем по группе 6,2±4,8%)

среди В-клеток и было значительно ниже от 0,5 до 2,3% (в среднем в группе 1,4±1%) в Т-клетках.

Экспрессия Вс1-2 также наблюдалась во всех 5-ти (100%) изученных образцах клеток. Вс1-2 положительные клетки были обнаружены и в С019, и в СБЗ популяциях лимфоцитов лимфатических узлов. Уровень экспрессии Вс1-2 в Кл-67+ В-клетках составил от 12 до 28,3% и имел бимодальный характер гистограммы распределения окрашенных клеток, который встречается крайне редко при исследовании экспрессии белка Вс1-2. Исключительно среди делящихся (К1-67+) В-лимфоцитов лимфатических узлов были обнаружены Вс1-2-отрицательные клетки. При этом митохондрии большинства К.1-67 С019+ В-клеток экспрессировали Вс1-2 белок, а уровень его экспрессии составил 75,4-93,6%, в среднем по группе 86,0±8,4% положительных клеток.

В отличие от В-лимфоцитов, в Т-клетках лимфатических узлов распределение белка Вс1-2 имеет независимый от клеточного цикла характер экспрессии (рисунки 14 и 15).

Рисунок 14. Экспрессия Вс1-2 в СВ19* В-клетках лимфатических узлов.

Рисунок 15. Экспрессия Вс1-2 в СОЗ+ Т-лимфоцитах лимфатических узлов. — контроль IР1ТС

СйЗ гистограмма распределения клеток, экспрессирующих белок Вс1-2

по оси абсцисс - количество клеток

по оси ординат - интенсивность флюоресценции

Острый лимфобластный лейкоз

Мы исследовали экспрессию белка Вс1-2 в бластно-лимфоидной фракции костного мозга 24 больных ОЛЛ, из них 18 детей и 6 взрослых. При исследовании образцов костного мозга детей выявлено, что в 89% случаев (у 16 из 18 больных) наблюдалась отрицательная экспрессия Вс!-2. Уровень экспрессии составил от 0,1 до 3,61% (в среднем 2,5±1,1%) положительных клеток. В двух случаях была обнаружена положительная экспрессия белка 55,45 и 81,7% соответственно. В подгруппе взрослых больных ОЛЛ экспрессия белка Вс1-2 варьировала от 0,4 до 11,85% (в среднем 6,3±5,5%) положительных клеток.

В нашем исследовании экспрессию Вах мы изучали на 7 образцах костного мозга детей с диагнозом ОЛЛ. Положительная экспрессия белка наблюдалась в 43% случаев (3 из 7), а уровень экспрессии маркера колебался от 0,1 до 61,7% (в среднем 23,4±25,2%) положительных клеток.

У взрослых больных ОЛЛ экспрессию Вах в костном мозге исследовали только в 2-х случаях, в каждом из образцов наблюдалась отрицательная (менее 1% положительных клеток) экспрессия белка.

Таким образом, уровень клеток, экспрессирующих белок Вс1-2, в костном мозге больных ОЛЛ, не зависит от возраста пациентов и статистически не превышает показателей экспрессии в нормальном костном мозге. Однако наличие экспрессии проапоптотического белка Вах позволяет нам говорить о гетеродимерной структуре белков семейства Вс1-2 на клетках костного мозга детей, больных ОЛЛ, и, возможно, как следствие, более благоприятное течение заболевания и ответ на проводимое лечение. Даже небольшое число исследований экспрессии Вах у взрослых больных ОЛЛ, свидетельствует в пользу неблагоприятного соотношения Вс1-2/Вах и указывает на гомодимерную структуру белков семейства В с 1-2 при данной форме лейкоза у взрослых. Полученные даннью подтверждают теорию отсутствия экспрессии маркеров, ингибирующих гибель и о наличии индукторов апоптоза на ранних этапах созревания В-клеток.

Хронически й лгтфолейкоз

В подавляющем большинстве случаев у больных ХЛЛ в опухолевых клетках выявляется повышенное содержание белка Вс1-2, хотя характерной транслокации 1(14;18ХЧз2;Чи), приводящей к нарушению экспрессии гена, не наблюдается. Установлено, что экспрессия Вс1-2 в лейкемических клетках в

большинстве случаев В-ХЛЛ в 6-25 раз выше, чем в нормальных клетках. Оказалось, что гиперэкспрессия белка Вс1-2 при ХЛЛ обусловлена не транслокацией гена bcl-2, а гипометилированием 5-конца гена bcl-2 (Hanada M. et.al., 1993). Показано, что повышение уровня экспрессии белка Вс1-2 нарастает по мере прогрессировання заболевания и сопровождается лекарственной устойчивостью к различным химиотерапевтическим препаратам (Rabizadeh Е. et.al., 1997; Dive С., 1997; Byrd J.C. et.al., 1998).

Нами проведено исследование образцов периферической крови больных ХЛЛ (п=116). Уровень экспрессии Вс1-2 в лимфоидном «гейте» у больных ХЛЛ по группе варьировал в широких пределах от 0,1 до 100% (в среднем 5 7,1 ±37,6%) положительных клеток. В зависимости от количества экспрессирующих белок Вс1-2 клеток, больные разделены на три подгруппы: 1-ая подгруппа включала больных с высоким содержанием клеток, экспрессирующих белок Вс1-2 - от 74,2% до 100% (п=51); 2-ая подгруппа-с уровнем клеток, положительных по экспрессии белка в диапазоне от 36% до 68,3% (п=38) и, в третьей подгруппе оказались больные, клетки которых имели низкие уровни белка Вс1-2 - от 0,1 до 18,6% (п=27).

При анализе группы больных ХЛЛ с высоким содержанием Вс1-2+-клеток выявлена положительная корреляционная связь с уровнем лимфоцитов и пролимфоцитов в крови (г=0.708, р<0,003 и г=0.647, р<0,002 соответственно). Кроме того, оказалось, что, в данную подгруппу вошли больные с развернутыми клиническими стадиями заболевания.

Двухцветный проточно-цитометрический анализ экспрессии белка Bcl-2 в клетках, в сочетании с анализом ДНК-плоидности, показал, что все Bcl-2+-клетки являются покоящимися (Go), отсутствуют клетки со спонтанной межнуклеосомной фрагментацией ДНК (рисунок 16).

I «m

PI*

?- »• 10= ........

| •м

....... Jpt Bcl-r -(3--

I »1*

Bcl-2*/PI1"

Рисунок 16. Двухцветный анализ клеток больного XJ1JI (III стадия) на внутриклеточное содержание белка Вс1-2 и ДНК-плоидности.

Проведенные исследования экспрессии белков семейства Вс1-2 на лейкемических клетках больных В-ХЛЛ показали, что независимо от стадии развития заболевания, лейкоцитоза и абсолютного лимфоцитоза, митохондрии CDI9+, CD5+, CD20+, HLA-Dr+ опухолевых B-клеток сильно экспрессируют на своей мембране антиапоптотический белок Вс1-2 (рисунок 17).

ал* mm t% luv

1 »I»

HlA-DHVBcl-b-

Sïi*

»ä »i«

CDi»WBtM+ #

Г !

Рисунок 17. Экспрессия Bcl-2 на клетках периферической крови больных ХЛЛ

Проапоптотический белок Вах также выявлялся в тотальной CD45+ популяции лимфоидных клеток в 100% случаев на 83,3±14,1% клеток.

Поскольку решающее значение в реализации программы апоптоза имеет соотношение белков семейства Bcl-2, а не их абсолютное количество в клетке, мы провели оценку соотношения BcI-2/Bax в клетках больных В-ХЛЛ (%;MFI). Соотношение BcI-2/Bax у первичных больных варьировало от 0.1 до 1.6, при этом среднее значение составило 0.7±0.9 при анализе MFI и от 0.03 до 1.3, а в среднем 0.5±0.7 при анализе процентного числа клеток, экспрессирующих вцутритриклеточные белки-регуляторы апоптоза из группы Вс1-2. Значение соотношения было равным 1.8 (MFI) и 1.3 (%) в случае гиперэкспрессии Вс1-2. Если же экспрессия Вс1-2 была невысокой, то соотношение составило 0.4±0.2 и 0.12±0.2 (MFI и % соответственно). В качестве примера на рисунке 18 приведены гистограммы флуоресценции клеток первичных больных ХЛЛ с гетеро- и гомодимерной формой белков семейства Вс1-2.

а - гетеродимерная структура белков семейства Вс1-2

гомодимерная структура белков семейства Вс1-2

Bcl-2/Bax -1.06

Bcl-2/Bax — 2.2

10' 10* 1Q1 10* BCL-2FITC

й 1

10' 10s 10' 10 ва-гггтс

О клетки, окрашенные МКА anti-Bcl-2 □ клетки, окрашенные МКА anti-Bax Рисунок 18. Гистофаммы распределения клеток первичных больных B-XJIJ1 Множественная миелома (ММ)

Экспрессию Вс1-2 мы исследовали на 12 образцах костного мозга больных ММ, в 10 из 12 (83%) экспрессии Вс1-2 не наблюдалось. Количество клеток, экспрессирующих Вс1-2, в костном мозге больных ММ в по группе варьировало от 0,3 до 50,4 %, и составило 9,4±15,5% положительных клеток. Наши результаты согласуются с данными, полученными в других лабораториях (Robillard N. et.al., 2005). Существует мнение, что в патогенезе ММ задействован другой антиапоптотический белок ВП-1/А1 и, именно он обеспечивает выживание B-клеткам при дифференцировке в плазматические клетки (Robillard N. et.al., 2005).

Неходжкгшская лгшфома <НХЛ) с лейкемюаиией Своим названием группа белков Вс1-2 («В»-В-линейность, «с»-сеП-клегочная, «1»-лимфома) обязана именно этой форме заболевания. С транслокацией гена bcl-2 связана устойчивость клеток к проводимой терапии (Yang Е. and Korsmeyer S.J., 1996). Мы провели изучение экспрессии белка Вс1-2 в костном мозге (п=4) и периферической крови (п=7) больных фолликулярной лимфомой при лейкемизации процесса. Различий по экспрессии белка в КМ и ПК не наблюдалось. Положительная экспрессия выявлялась в 72,7% случаев. Уровень экспрессии BcI-2 у больных НХЛ в целом по группе колебался от 0,7 до 96,1% (в среднем 53,8±36,1%) положительных клеток.

Острый миелоидный лейкоз

У 2 из 9 (22,2%) больных ОМЛ в костном мозге обнаружена положительная экспрессия белка Вс1-2 - 24,3 и 51,3%. При этом, максимальный уровень Вс1-2+ - клеток (51,3%) выявлен у больного ОМЛ с трансформацией из МДС. Образцы костного мозга остальных больных были отрицательны по экспрессии этого белка: у них выявлялось от 0,4 до 5,7% (в среднем 2,3±2,1%) положительных клеток.

Экспрессию внутриклеточного белка Вах мы изучали в образцах костного мозга 5 больных ОМЛ. Во всех случаях наблюдалась отрицательная экспрессия белка - 2,1±1,7%.

Хронический миелоидный лейкоз

Результаты исследования представлены в таблице 1.

Нозологические формы ХМЛ

ХФ ФА БК

Кол-во больных 7 4 7

% положительных случаев 28,5 75 0

Уровень положительных клеток 9,б±8,3 31,08±9,6 2,1 ±0,7

В свете полученных данных можно сделать предположение, что при ХМЛ положительная экспрессия белка Вс1-2 выявляется только в клетках костного мозга больных в ФА. Отсутствует белок в хронической стадии заболевания и в терминальной фазе при бластном кризе.

Миелодиспластический синдром

Проведено исследование 30 образцов костного мозга больных МДС. Положительная реакция была обнаружена в 6 случаях (20%), количество Вс1-2+клеток по группе составило 38,4±17,9%. Максимальные значения - 66,96% и 59,6% Вс1-2*клеток были выявлены у больных РАИБЧ. Кроме того, при иммунофенотипировании у этих больных выявлялось значительное число С034+ бластных клеток (45,6% и 27,3% соответственно). Эти результаты согласуются с данными других исследователей и свидетельствуют о более агрессивном течении заболевания и короткой продолжительности жизни.

Экспрессию белка Вах изучали в 10 образцах костного мозга. При этом положительной экспрессии маркера не выявлялось ни в одном из исследованных образцов костного мозга (3,9±1,1% положительных клеток). Соответственно, соотношение белков семейства Вс1-2 оказалось равным в

целом по группе 2.6±0.9, а у Вс1-2+-больных 9.8±2.9, то есть в положительных случаях определялась гомодимерная структура белков группы Вс1-2» что является фактором неблагоприятного прогноза.

Р53

Гемобластозы отличаются от большинства солидных опухолей тем, что частота новообразований, характеризующихся нарушением функции р53, снижена. Наличие или отсутствие мутаций р53 при лимфопролиферативных заболеваниях, может говорить скорее об участии подобных изменений в злокачественной трансформации, и будет давать мало информации об участии этого маркера в ходе нормальной дифференцировки.

Контрольная группа.

Уровень экспрессии мутантной формы белка р53 среди общего пула лимфоцитов ПК доноров (п=12) практически не отличались от контрольных образцов. Ни СОЗ* Т-клетки, ни С019* В-клетки при двухцветном иммунофлюоресцентном анализе не экспрессировали мутантный белок р53.

Мутантную форму белка р53 мы изучали в СЭ45+ лимфоидном гейте клеток 3-х образцов нормального костного мозга, при этом в одном случае экспрессия составила 28,7%, однако МР1 составила 18.1 по сравнению с контролем 17.2, в двух других случаях - 3,03% и 0,27% соответственно, что расценено как негативная реакция.

Экспрессия белка Р53 при заболеваниях лгшфоидного направления дифферениирювки

Экспрессию мутантного р53 исследовали в клетках костного мозга 12 детей, больных ОЛЛ. Количество положительных клеток по группе варьировало от 0,3% до 33,5% и, в среднем составило 14,6±12,8% положительных клеток. Эти результаты согласуются с литературными данными, где отмечено, что, несмотря на невысокое количество нарушений р53 при ОЛЛ даже при продвинутых стадиях заболевания, больные хорошо отвечают на проводимую терапию (КешсотЬ 1995).

В нашей работе мутации р53 наблюдались у 5 из 18 (27,7%) больных ХЛЛ, и у 3 из 11 (27,2%) больных ММ, а уровень клеток, позитивных по экспрессии этого белка при ХЛЛ статистически достоверно выше -35,4±25,5% против 14,5±14,4% при ММ (р<0,05).

Экспрессия белка Р53 при заболеваниях миелоидного направления дифференцировки

Экспрессию мутантной формы белка р53 мы оценивали в костном мозге 12 больных ОМЛ. Уровень экспрессии маркера составил 5,5±4,1% положительных клеток. В исследуемой нами группе не оказалось больных с р53-положительным фенотипом.

Среди больных ХМЛ лишь в ФА у 75% больных выявляется статистически достоверная повышенная частота и уровень экспрессии p53mut по сравнению с больными в ХФ (р<0,02 и р<0,03 соотв.). В стадии БК положительную экспрессию p53mut мы выявили только у 1 из 9 больных (11,1%)- Число позитивных клеток варьировало от 0,1 до 32,5%, в среднем по группе - 8,9±8,8%.

В исследуемую группу МДС вошли 6 (37,5%) больных РА, 8 (50%) больных РАИБ и 2 больных (12,5%) РАИБ-t. Экспрессия белка p53mut в этих подгруппах составила: РА - 3,7±6,3%, РАИБ - 6,6%±7%, РАИБ-t -12,35±7,9%. Статистически достоверной разницы между экспрессией мутантного р53 при различных формах МДС получено не было, хотя определяется тенденция нарастания данного маркера по мере прогрессирования заболевания.

Оценивая характер экспрессии белка p53mut при различных формах заболеваний миелоидной направленности можно сделать предположение, что за исключением ФА ХМЛ, белок не выявляется в клетках костного мозга в случае ОМЛ, ХФ ХМЛ, БК ХМЛ и МДС. Возможно, при проведении подобного анализа необходимо проводить коррекцию учета порогового уровня положительной экспрессии маркера. Однако чаще всего в литературе вообще не упоминается о количестве положительных клеток, экспрессирующих тот или иной внутриклеточный маркер, а говорится только о качественных показателях - «плюс» или «минус» (Wojcik I., 2005). Кроме того, для гемобластозов (при постановке диагноза) вообще характерно низкое выявление мутантной формы р53. Этот показатель колеблется от 3 до 13%. Объясняется это тем, что по сравнению с солидными новообразованиями, для которых в 50-80% случаев характерны точечные мутации, при гемобластозах чаще наблюдается утрата (делеция) р53. Особенно это относится к гемобластозам, характеризующимся изменениями хромосомы 17, в которой локализован ген р53 (Ставровская A.A., 2000,2001).

Кь67

Антиген ядерной пролиферации Кл-67 арпоп не является дифференцировочным маркером, скорее он отражает активность биологических процессов в клетках. В диагностике гемобластозов пролиферативную активность оценивают по экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток (РСЫА), но чаще всего по экспрессии антигена ядерной пролиферации Кд-67, а также по включению бромдеоксиуридина.

В таблице 2 представлены результаты изучения характера экспрессии маркера К>67 в клетках больных гемобластозами.

Дифференцировка клеток лимфоидная миелоидная

Нозологические формы ОЛЛ ХЛЛ ММ ОМЛ ХМЛ МДС

ХФ ФА БК РА РАИБ

Кол-во больных 12 32 13 6 9 3 II 9 8

% положительных случаев 25 0 15,3 50 0 0 36 0 0

Уровень положительных клеток 23,2 1,8 46,5 11,2 1,3 4,8 16,7 2,2 6,6

На основании полученных результатов можно сказать, что при миелоидных заболеваниях (ОМЛ, БК ХМЛ) значительно чаще встречается экспрессия Ki-67, чем при лимфоидных (ОЛЛ, ММ). Однако уровень клеток, экспрессирующих ядерный белок Ki-67, в случае лимфоидных заболеваний (ММ, ОЛЛ) превышает показатели экспрессии маркера при миелоидных формах гемобластозов (БК ХМЛ, ОМЛ). Белок отсутствует в случае МДС (РА, РАИБ) и ХМЛ (ХФ, ФА) и, естественно, при ХЛЛ.

Фрагментация ДНК

Межнуклеосомальная фрагментация ДНК является конечным этапом реализации программы апоптотической гибели клеток как в условиях in vitro, так и в пределах многоклеточного организма in vivo. Деградация ДНК до олигонуклеосомальных фрагментов, связанная с активацией эндонуклеаз, используется как один из биологических маркеров апоптоза. В литературе описано не менее 6-ти методов оценки апоптоза, однако самыми точными и

высокочувствительными оказались способы количественной детекции фрагментации ДНК с помощью проточной цитофлуориметри и, а полученные результаты статистически сходны (Liming P. etal., 1999). С целью углубления представлений о биологических свойствах лейкозных клеток мы исследовали уровень спонтанной и индуцированной фрагментации ДНК клеток периферической крови и/или костного мозга больных лимфопролиферативными заболеваниями до начала лечения и в процессе проведения специфической терапии.

В настоящей работе применено три различных метода идентификации апоптотических клеток периферической крови и/или костного мозга больных с использованием проточной цитофлуориметрии.

1. Изучение фрагментации ДНК клеток периферической крови и костного мозга по выявлению клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК (окрашивание пропидий иодидом) Были исследованы образцы периферической крови и/или костного мозга 105 больных онкогематологическими заболеваниями. При этом 91 больной был обследован до лечения и 48 больных в процессе проведения специфической терапии. Уровень апоптоза в популяции лейкозных клеток оценивали по выявлению клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК (окрашивание PI).

В исследуемую группу вошли 19 больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), 5 больных острым миелоидным лейкозом (ОМЛ), 36 больных хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), 45 больных миелодиспластическим синдромом (МДС).

Уровень спонтанной фрагментации ДНК в властных клетках в группе больных ОЛЛ достоверно возрастал до 24,6±7,2% на 3-ий день лечения и достигал 64,6±17,3% к 21-му дню терапии (р=0,001). Максимальные показатели - 87% и 94,5% выявлены у пациентов с С D95 - пол ожител ьн ым фенотипом бластных клеток при пре-пре-В-варианте ОЛЛ. В качестве примера на цитограмме представлены результаты анализа спонтанного апоптоза клеток костного мозга больной ОЛЛ до лечения, а также индуцированной фрагментации ДНК бластных клеток костного мозга на третий и 21-й дни проведения специфической терапии (рисунок 19).

по оси абсцисс - интенсивность флюоресценции по оси ординат - количество клеток Рисунок 19. Фрагментация ДНК клеток костного мозга больной ОЛЛ до лечения и в процессе терапии (окрашивание PI).

Сходные результаты были получены при исследовании образцов, полученных от пациентов с диагнозом В-ХЛЛ. Однако уровень клеток с гиподиплоидной фракцией ДНК в костном мозге превышал показатели периферической крови. Не было выявлено достоверных отличий в содержании гиподиплоидных клеток в костном мозге больных ОМЛ до лечения и в процессе терапии.

Особый интерес представляют результаты исследований спонтанной фрагментации ДНК клеток костного мозга у пациентов с МДС, поскольку именно для данной категории больных с гемобластозами установлено патогенетическое значение апоптоза (Kurotaki Н., et. al., 2000; Parker J.E., et. al., 2000). В группе больных МДС (РА) на фоне терапии происходило снижение доли апоптотаческих клеток. Аналогичная динамика зафиксирована в группе больных МДС (РАИБ). Однако в клетках костного мозга больных МДС (РАИБ-t), МДС (ОМЛ) отмечается статистически достоверное прогрессивное нарастание межнуклеосомиой фрагмеЕггации ДНК лейкозных клеток.

В таблице 3 представлены результаты анализа спонтанной фрагментации ДНК клеток периферической крови и/или костного мозга до

начала лечения и в процессе терапии in vivo по окрашиванию ДНК специфическим красителем пропидий иодидом.

Таблица 3. Исследование фрагментации ДНК клеток периферической крови и костного мозга больных онкогематологическими заболеваниями.

Диагноз Среднее значение % (М±т) Достоверность (р)

До терапии На фоне терапии

ОЛЛкм* 1,42±0,3 (п=19) 64,6±17,3 (n=I 1) 0,001*

ОМЛ"м' 3,7±1,6 (п=5) 4,4±2,7 (п=3) 0,654

ХЛЛПК' 1,38+0,6 (п=22) 11,1±1,7 (п=6) 0,002*

ХЛЛКМ' 3,7+1,2 (п=7) 50,3±20,1 (п=3) 0.001*

МДС (РА)к м' ,20,1 ±4,3 (п=13) 13,5±4,7 (п=8) 0,004*

М ДС (Р АИБ)км' 19,1 ±2,3 (п=16) 6,6±1,2 (п=8) 0,001*

МД С(Р АИБ-t) *"м' 2,9±2,6 (п=6) 31,2±13,4 (п=6) 0,001*

МДС(ОМЛ)*м' 13,1 ±8,4 (п=3) 46,3+13,7 (п=3) 0,005*

к.м.-исследования костного мозга; п.к.- исследования периферической крови

2. Фрагментация ДНК клеток периферической крови по оценке нитевых разрывов ДНК - Ник-мечен ию 3'-концов молекул ДНК (окрашивание с помощью метода TUNEL)

В процессе ano птоза под действием эндонуклеаз образуются многочисленные разрывы нитей ДНК и, соответственно, большое число свободных З1- и 5-концов. Присутствие свободных 3'-концов можно детектировать с помощью метода TUNEL. Под действием фермента терминальной дезоксинуклеотид-трансферазы (TdT) к З'-концу нити ДНК ковалентно присоединяется дезоксиур ид и нтр и фо сфат (dUTP), меченый флуоресцентным красителем (FITC). Таким образом, количество присоединившейся метки пропорционально количеству свободных 3'-концов, т.е. количеству внутринитевых разрывов ДНК. Для дальнейшего исследования спонтанного и индуцированного ano птоза клеток больных лимфопролиферативными заболеваниями мы использован метод TUNEL, позволяющий выявлять «ранние» апоптогические клетки с фрагментацией

ДНК, у которых еще отсутствуют или слабо выражены морфологические изменения, характерные для апоптоза.

Были изучены образцы периферической крови первичных больных XJIJI (п=6) с помощью TUNEL-метода до лечения и в процессе терапии. Выделение гейта исследуемых клеток проводили по связыванию с МКА в смешанных линейно-логарифмических режимах SSC vs FL2 (lin/log) или только с применением параметров флуоресценции (log/log) по окрашиванию МКА, что позволяет максимально анализировать лейкемический пул клеток (рисунок 20).

А Б

Рисунок 20. Дискриминация гейта исследуемых клеток периферической крови больных ХЛЛ для анализа фрагментации ДНК с применением метода TUNEL: А - в смешанном линейно-логарифмическом режиме SSC vs FL2 (lin/log) по окрашиванию МКА CD5; Б - с применением параметров флюоресценции FL3 vs FL2 (log/log) по окрашиванию МКА HLA-Dr vs CD5.

В дальнейшем применяли гистограммный анализ интенсивности флюоресценции по каналу FL1 с логарифмическим усилением сигнала. Такой методический прием необходимо использовать, поскольку в периферической крови гематологических больных практически всегда циркулируют нормальные здоровые клетки. Кроме того, этот подход дает возможность проводить количественный анализ на уровне «единственной клетки» в стандартных условиях с заданным иммунофенотипом.

Анализ фрагментации ДНК клеток периферической крови больных ХЛЛ показал, что уровень спонтанного апоптоза до лечения составил 1,43±0,4%. В процессе лечения содержания клеток с двуннтевыми и однонитевыми разрывами ДНК возросло до 30,9±13,2% (р<0,001).

В качестве примера на рисунке 21 показаны гистограммы интенсивности флюоресценции клеток периферической крови больного В-ХЛЛ. Накопление клеток с фрагментированной ДНК отражается смещением пика на гистограммах вправо. При этом площадь пика, выходящая за профиль пика клеток до лечения, соответствует доле клеток, содержащих фрагментированную ДНК, а медиана флюоресценции (интенсивность) -степень фрагментации ДНК.

В процессе 35,7%

10*

ю1

FLI

Интенсивность флюоресценции (FITC) Рисунок 21. Гистограммы интенсивности флюоресценции клеток периферической крови больного ХЛЛ (окрашивание TUNEL).

3. Спонтанная фрагментация ДНК клеток костного мозга больных МДС по оценке экстернализации фосфатидилсерина (двойное прижизненное окрашивание)

В апоптотических клетках фосфолипид фосфатидилсерин (FS) перемещается на внешнюю сторону плазматической мембраны. Мы использовали метод прижизненного двойного окрашивания клеток костного мозга первичных больных МДС. С этой целью клетки окрашивали Аннексином V-FITC (экстернализация PS) в комбинации с PI (накопление в ДНК при разрушении ядерной мембраны) и количественно оценивали популяции клеток на разных стадиях апоптоза.

В таблице 4 представлены результаты количественного анализа фрагментации ДНК клеток костного мозга.

Таблица 4. Количественный анализ популяций клеток костного мозга больных МДС на различных этапах апоптоза (двойное окрашивание -Аннексии V-FITC vs PI).

Диагноз Живые интактные клетки (%) (FITCTPr) Ранние апоптотические клетки (%) (FITC+/P1*) Поздние апоптотические или некротические клетки (%) (FITC+/PI+)

РА(п=3) 46,7±8,5 19,5±7,8 30,1 ±3,5

РАИБ(п=3) 62,3±14,3* 18,1±17,3* 11,5±5,2*

PAHB-t(n=l) 75,8* 7,0* 8,4*

* различия между группами больных статистически достоверны (р<0,05)

В качестве примера на рисунке 22 представлены Оо1Р1о1 цитограммы анализа спонтанной фрагментации ДНК клеток, регистрируемой методом прижизненного окрашивания с помощью Аннексина У-Р1ТС в комбинации с Р1. В 1-ом квадранте располагаются неокрашенные интактные клетки -живые клетки, во 2-ом квадранте - клетки, мембраны которых окрашены только антикоагуляционным белком Аннексином V, конъюгированным Р1ТС, в 3-ем квадранте - клетки, с признаками вторичного некроза или поздние апоптотические клетки.

а - РА б - РАИБ в- РАИБ-t

1 - живые 2 - ранние 3 - поздние апоптотические

апоптотические или некротические клетки

клетки

Рисунок 22. Двухцветное прижизненное окрашивание клеток костного мозга больных МДС с помощью Аннексина V-FITC в комбинации с PI.

Таким образом, анализ результатов спонтанного и лекарственно-индуцированного апоптоза in vivo, полученные методом проточной ц итоф л у ор и м етр ни, и, выявляемые как путем окрашивания клеток пропидиий иодидом, методом TUNEL, так и Аннексином V-FITC в сочетании с пропидий иодидом не имели между собой принципиальных

количественных различий. Методы идентификации апоптоза могут быть использованы для качественной и количественной оценки эффективности назначаемой терапии у больных онкогематологическими заболеваниями.

ВЫВОДЫ

1. CD95 является дифференцировочным антигеном лейкоцитов человека, следовательно, его экспрессия связана с определенными этапами созревания лимфоидных и миелоидных гемопоэтических клеток.

2. Среди CD45+/CD14* лимфоцитов периферической крови взрослых доноров антиген CD95 определяется на 35-75% клеток, из них 40-60% составляют СОЗ+Т-клетки, а также на всех С019+В-клетках. На тимоцитах рецептор CD95 представлен на 8,7±35Д% клеток.

3. Антиген CD95 отсутствует на моноцитах и гранулоцитах во всех образцах периферической крови здоровых доноров независимо от возраста. В то же время, экспрессия антигена CD95 на CD45+/CD14* лимфоидных клетках зависит от возраста и отсутствует на лимфоцитах периферической крови только новорожденных детей.

4. На ранних этапах дифференцировки В-клеток (пре-пре-В ОЛЛ) антиген CD95 коэкспрессирован на С019+клетках. На поздних этапах дифференцировки CD19\ HLA-Dr+, CD5+ В-клетках (В-ХЛЛ) антиген CD95 отсутствует при всех стадиях развития заболевания.

5. Коэкспрессия на бластных клетках больных ХМЛ молекулы CD95 и дифференцировочных антигенов CD13, CD33 свидетельствует о том, что он является маркером ранних этапов миелоидной дифференцировки. На полиморфноядерных клетках миелоидного ряда антиген CD95 отсутствует на всех стадиях ХМЛ.

6. В стадии бластного криза ХМЛ у 32% больных выявляется функционально активный белок CD243, экспрессирующийся на CD34+, CD33+, CD13+ клетках.

7. На С D4 5 +-л им фонд ны х клетках периферической крови здоровых доноров антиген CD243 отсутствует на мембране CD3+ Т-лимфоцитов, однако, все CDI9+ В-лимфоциты его экспрессируют в функционально

неактивном состоянии. Белок CD243 обнаружен также на 10-30% тимоцитов.

8. Экспрессия Вс1-2 меняется на этапах дифференцировки В-клеток. Вс1-2 экспрессируется на стадии зрелых периферических В-клеток и отсутствует в ранних В-клетках и плазматических клетках,

9. Тимоциты с фенотипом CD4+/CD8\ CD47CD8\ CD47CD8* , а также CD3VKÍ-6T", CD3+/KÍ-67" Т-клегки и CD19+/Ki-67 В-клетки лимфатических узлов обладают высокой экспрессией Вс1-2. Белок Bcl-2 отсутствует на части тимоцитов с фенотипом CD4+/CD8+ и в CD 19+/Ki-67+ В-клетках лимфатических узлов,

Ю.Высокая экспрессия белка Bcl-2 наблюдается в митохондриях лейкозных CD5+, CD19+, HLA-Dr+ В-клеток периферической крови больных В-ХЛЛ как на ранних, так и в развернутых стадиях развития заболевания.

11 .Отсутствие CD95 на В-клетках больных ХЛЛ и, выявленная двумя методами (пропидий иодид и TUNEL) специфическая фрагментация ДНК клеток в процессе терапии, свидетельствует о С095-рецепторно-независимом , механизме апоптоза при данной форме лимфопролиферативного заболевания.

12.Судьба гемопоэтической клетки в процессе дифференцировки зависит от соотношения антиапоптотических и проапоптотических белков. Перспектива развития заболевания и прогностическая ценность использованных маркеров может быть оценена только при их комплексном анализе.

1. Барышников А.Ю., Заботина Т.Н., Седяхина Н.П., Хорошко Н.Д., Туркина А.Г., Палкина Т.Н., Шишкин Ю.В., Лобанова В.В., Кадагидзе З.Г. Коэкспрессия антигена СЭ34 ранних гемопоэтических предшественников и антигена Раз/АРО-1, опосредующего апоптоз. Экспрериментальная онкология, 1994, т,16, № 4-6, с.343-347.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

2. Kadagidze Z.G., Sedyakhina N.P., Zabotina T.N., Shishkin Yu.V., Turkina A.G., Baryshnikov A.Yu. Coexpression of antigens CD34 specific for early hemopoietic precursors and CD95(FAS/APO-l) mediating apoptosis. Berlin, 1994.

3. Baryshnikov A.Yu., Zabotina T.N., Sedyakhina N.P., Shishkin Yu.V., Frenkel M.A., Turkina A.G., Polosukhina E.R., Golenkov A.K., Kadagidze Z.G. Expression of antigen CD95 mediating apoptosis on leukemic cells. International Journal for Cancer Research and Treatment, 1994, vol.17, (suppl.2), p.7

4. Baryshnikov A.Yu., Zabotina T.N., Sedyakhina N.P., Turkina A. G. Instability of blast cell immunological phenotype in patients with chronic myeloid leukemia. Proc. XVI International Cancer Congress, C>ct.30-Nov.5,1994, New Delhi, India.

5. Sedyakhina N.P., Zabotina T.N., Shishkin Yu.V., Kuznetsov S.V., Turkina A.G., Baryshnikov A.Yu. Investigation of FAS/APO-1/CD95 antigen expression on human leukemic cells. 3rd International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems", St.Peretsburg, Russia, May 22-26, 1995, p.39. • •

6. Шишкин Ю.В., Седяхина Н.П., Заботина Т.Н., Кузнецов С.В., Туркина А.Г., Палкина Т.Н., Полосухина Е.Р., Ширин А.Д., Волкова М.А., Френкель М.А., Хорошко Н.Д., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. Экспрессия антигена Fas/APO-l/CD95, опосредующего апоптоз на лейкозных клетках человека. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1996, т.122, №11, с. 544-547.

7. Барышников А.Ю., Шелепов В.П., Кузнецов С.В., Шишкин Ю.В., Седяхина Н.П., Донская О.Н., Заботина Т.Н., Полосухина Е.Р., Туркина А.Г., Хорошко Н.Д. Экспрессия и проявление функциональной активности Fas/APO-I/CD95 антигена, опосредующего апоптоз при гемобластозах у человека. Гематология и трансфузиология, 1996, № 5, с.42-44.

8. Заботина Т.Н., Лазарева Н.И., Чинарева И.В., Лукашина М.И., Седяхина Н.П., Полосухина Е.Р., Метелица И.С., Шишкин Ю.В., Барышников А.Ю. FAS-антиген - новый активационный маркер для оценки иммунного статуса. Материалы 1-го съезда онкологов стран СНГ, 1996, с. 173.

9. Zabotina T.N., Lazareva N.I., Lukashina M.I., Polosukhina E.R., Shishkin Yu.V. APO-l/(Fas/CD95)-antigen expression on the peripheral blood lymphocytes. AACR Special Conference "Programmed Cell Death". The Sagamore, Bolton Landing, Lake George, NY. October 19-23, 1996, P-C66.

10. Baryshnikov A.Yu., Polosukhina E.R., Zabotina T.N., Lazareva N.I., Lukashina M.I., Shishkin Yu.V., Chinaijova I.V., Tenuta M.R., Metelitsa I.S., Kadagidze Z.G. Fas(APO-l/CD95) Antigen: New Activation Marker for Evaluation of the Immune Status. Russian Journal of Immunology, 1997, vol.2, №2, p. 115-120.

П.Полосухина E.P., Заботина Т.Н., Шишкин Ю.В., Логачева Н.П., Чинарева И.В., Кузнецов С.В., Блохин Д.Ю., Тенута М.Р., Шелепов В.П., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. Исследование экспрессии антигена Fas(APO-

1/CD95) с помощью проточной цитометрии и моноклональных антител IPO-4. Экспериментальная онкология, 1997, т. 19, ХаЗ, с.206-211.

12.Ivanov Р.К., Polosukhina E.R., Zabotina T.N., Blokhin D.Yu., Shishkin Yu.V., Volkova M.A., Mayakova S.A., Tenuta M.R., Baryshnikov A.Yu. Apoptosis during treatment of leukemias. In: 7lh International Congress on Anti-Cancer Treatment, Paris, 1997, p.l62.

13.Барышников А.Ю., Сыркин А.Б., Полосухина Е.Р., Шишкин Ю.В., Гаврикова Н.В., Тупицын Н.Н., Андреева Л.Ю., Заботина Т.Н., Маякова С.А., Курмашев В.И., Кадагидзе З.Г, Прогностическое значение экспрессии CD95(FAS/APO-l) антигена при остром лимфобластном лейкозе у детей. Российский онкологический журнал, 1998, №4, с.31-35.

14.Stromskaya Т.P., Rybalkina E.Y., Shtil А.А., Zabotina T.N., Filippova N.A., Stavrovskaya A.A. Influence of exogenous RARa gene on MDR1 expression and Pglycoprotein function in human and rodent cells. British Journal of Cancer, 1998, vol.77, № 11, p.1718-1725.

15.Полосухина E.P., Заботина Т.Н., Шишкин Ю.В., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. Получение и характеристика моноклональных антител ICO-160 против айтигена CD95(FAS/APO-1), опосредующего апоптоз. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1998, Т.125, №6, с.670-673.

16.Гужаева Е.Л., Кобляков В.А., Заботина Т.Н., Рыбалкина Е.Ю., Ставровская А.А. Координированная регуляция активности Р-гликопротеина и индукции цитохрома Р-4501А в сублиниях гепатомы МсА RH 7777 с различной степенью устойчивости к колхицину. Биологические мембраны, 1998, т.15, №4, с.388-394.

17.Барышников А.Ю., Полосухина Е.Р., Шишкин Ю.В., Тупицын Н.Н., Сыркин А.Б., Гаврикова Н.В., Андреева Л.Ю., Заботина Т.Н., Маякова С.А., Курмашев В .И., Кадагидзе З.Г. Новый прогностический маркер острого лимфобластного лейкоза - антиген CD95(Fas/APO-l). Гематология и трансфузиология, 1998, т.43,№2, с.8-11.

18.Полосухина Е.Р., Кузнецов С.В., Логачева Н.П., Заботина Т.Н., Тенута М.Р., Ширин А.Д., Калетин Г.И., Туркина А.Г., Цветаева Н.В., Шишкин Ю.В., Кадагидзе З.Г., Хорошко Н.Д., Волкова М.А., Барышников A.IO, Оценка прогностической значимости экспрессии антигена CD95(Fas/APO-l) на клетках больных миелодиспластическим синдромом, острым миелоидным лейкозом и хроническим миелолейкозом. Терапевтический архив, 1998, №7, с. 21-35.

19.Zabotina T.N., Kadagidze Z.G., Martinova Е.А. Modulation of T-lymphocyte antigen expression by tumor necrosis factor alpha (TNF-a). 15th meeting EACR, 1998, p. 155.

20.Stavrovskaya A., Turkina A., Sedyakina N., Stromskaya Т., Zabotina Т., Khoroshko N,, Baryshnikov A. Prognostic Value of P-glycoprotein and Leukocyte Differentiation Antigens in Chronic Myeloid Leukemia. Leukemia and Lymphoma, 1998, Vol.28, p.469-482.

21 .Полосухина E.P., Заботина Т.Н., Иванов П.К., Барышников А.Ю, Получение и характеристика моноклональных антител (МКА) ИКО-160, направленных к молекуле CD95(FAS/APO-l), опосредующей апоптоз. Russian Journal of Immunology, 1999, vol. 4, suppl.l, p.67.

22.Соколовская A.A., Заботина Т.Н., Блохин Д.Ю., Барышников А.Ю. Идентификация лекарственно-индуцированного апоптоза в лейкозных клетках. Медицинская иммунология, 1999, т.1, №3-4., с. 109-110.

23.Соколовская А.А., Заботина Т.Н., Блохин Д.Ю., Барышников А.Ю. Лекарственно-индуцированный апоптоз. Симпозиум "Биологические основы терапии он ко гематологических заболеваний у детей", Москва, 1999, с.43.

24.BIokhin A.V., Zabotina T.N., Kuznetsov D.V. Cell proliferation: Experimental confirmation of the thermodynamic model of signal transduction. Molecular Biology of the Cell, 2000, vol. 11, p.457.

25.3аботина Т.Н., Кадагидзе З.Г. Возможности проточной цитофлуориметрии в диагностике гемобластозов. Материалы 5 Всероссийского съезда онкологов «Высокие технологии в онкологии», Казань, 4-7 октября 2000, т.1, с.299-300.

26. Соколовская А.А., Заботина Т.Н., Блохин Д.Ю., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю, Противоопухолевые препараты в лекарственно-индуцированном апоптозе. Материалы 5 Всероссийского съезда онкологов «Высокие технологии в онкологии», Казань, 4-7 октября 2000, т.1, с.220-221.

27.3аботина Т.Н., Иншаков А.Н., Лысюк Е.Ю., Михайлова И.Н., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. Изучение экспрессии гликопротеидов, регулирующих апоптоз, на клетках больных хроническим лимфоидным лейкозом (ХЛЛ). «Онкология 2000» Тез. докл. 2-го съезда онкологов стран СНГ с участием ученых Европы, Америки и Азии, Май 23-26,2000, Киев.

28.3аботина Т.Н., Кадагидзе З.Г., Сай Е.В., Бухаркин Б.В. Экспрессия CD95 (Fas/APO-1) антигена у больных раком предстательной железы. Вестник РОНЦ им.Н.Н. Блохина РАМН, 2001, №1, с.54-57.

29.Zabotina T.N., Kadagidze Z.G., Baryshnikov A.Yu. Oncoprotein Expression and Apoptosis in Myelodysplastic Syndromes. 92nd Annual Meeting, March 24-28, 2001, New Orleans, LA.

ЗО.Заботина Т.Н., Соколовская A.A. Оценка спонтанного и индуцированного апоптоза у больных с гемобластозами. Медицинская иммунология, 2001, т.З, №2, С.113-356, с 267.

31.Соколовская А. А., Забота на Т.Н., Блохин Д.Ю., Панкина Т.Н., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. CD95(APO- I/Fas) рецептор-лигандная система и лекарственно-индуцированный апоптоз в клетках JURKAT. Медицинская иммунология, 2001, томЗ, №2. С.113-356, с 278.

32.Sokolovskaya А.А., Zabotina Т.Ы., Blokhin D.Yu., Kadagidze Z.G., Baryshnikov A.Yu. Comparative analysis of apoptosis induced by various anticancer drugs in Jurkat cells. Experimental Oncology, 2001, vol.23, p.46-50.

33.Соколовская A.A., Заботина Т.Н., Блохин Д.Ю., Иншаков А.Н., Михайлов А.Д., Кадагидзе З.Г., Барышников A.I0, CD95-дефицнтные клетки сублинии Jurkat/А4, устойчивые к лекарственно-индуцированному апоптозу. Экспериментальная онкология, 2001, т.23, №.3, с.174-180.

34.Стромская Т.П., Рыбалкина Е.Ю., Теркина А.Г., Заботина Т.Н., Логачева Н.П., Захарова Е.С., Мечетнер Е.Б., Барышников А.Ю., Хорошко Н.Д., Ставровская А.А. Функциональная активность и экспрессия Р-гликопротеина при хроническом миелолейкозе. Терапевтический архив,

2001, т. 73, №7, с.20-25.

35.Рыбалкина Е.Ю., Стромская Т.П., Заботина Т.Н., Ставровская А.А. Регуляция белка множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) Р-гликопротеина (PGP) в опухолевых клетках при активации сигнального пути, контролируемого ретиноидами. "Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний" Москва, 5-6 февраля 2001г., с. 2930.

36. Заботина Т.Н., Буркова А.А., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. Субпопуляционная характеристика маркеров апоптоза в норме и при гемобластозах. Медицинская иммунология, 2002, т.4, №2, С. 109-400, с.294-295.

37.Kadagidze Z.G., Zabotina T.N., Baryshnikov A,Yu. Spontaneous and inducing apoptosis during therapy in patients with lymphoprollferative disease. Oslo,

2002, P820, p.393.

38.Bogush T.A., Konukhova A.V., Zabotina T.N., Bogush E.A., Timofeeva N.V., Ozerelyev A.S., Komov D.V., Barishnikov A.Y. Cisplatin encreases doxorubicin intracellular accumulation and binding to DNA in multidrug resistance (MDR) breast cancer. 5th Milan Breast Cancer Conference, 2003, G-8, p.88-89,

39.Богуш Т.А., Конухова A.B., Равчеева А.Б., Заботина Т.Н., Кадагидзе З.Г., Богуш Е.А., Комов Д.В., Полоцкий Б.Е., Лактионов К.К., Давыдов М.И. Ингибирование функции ABC-транспортеров в клетках немел ко клетчного рака легкого при воздействии препаратов платины. Антибиотики и химиотерапия, 2003, т.48, №10, с.11-15.

40.Богуш Т.А., Заботина Т.Н., Богуш Е.А., Чмутин Е.Ф., Комов Д.В., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. Новый подход к прижизненной оценке функциональной активности ABC-транспортеров (маркеров множественной

лекарственной резистентности) в солидных опухолях методом проточной цитофлюориметрии. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2003, Т.135, №5, с.566-574.

41 .Соколовская A.A., Заботина Т.Н., Московцев A.A., Лукашина М.И., Жданов Р.И., Блохин Д.Ю. Характеристика методов регистрации апоптоза и их использование в экспериментальной и клинической онкологии. Российский биотерапевтический журнал, 2003, т.2, №3, с.53-60.

42.3аботина Т.Н., Соколовская A.A., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. Спонтанный и индуцированный апоптоз у больных лимфопролиферативными заболеваниями. Иммунология, 2003, №1, с.23-26.

43.3аботина Т.Н. Маркеры апоптоза в дифференцировке гемопоэтических клеток человека. Медицинская иммунология, 2004, т.6, №3-5, С.153-480, с.352.

44.Кадагидзе З.Г., Заботина Т.Н. Роль некоторых молекулярно-биологичее ки х маркеров в лекарственной устойчивости. Материалы международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки», Тюмень, 2005.

45.Соколовская A.A., Заботина Т.Н., Панкина Т.Н., Блохин Д.Ю. Возможное участие CD95(APO-l/FAS)/CD95L в лекарственно-индуцированном апоптозе. Российский биотерапевтический журнал, 2004, т.З, №3, с.6-11.

46.Stromskaya Т.Р., Rybalkina E.Y., Zabotina T.N, Shishkin A.A., Stavrovskaya A.A. Influence of RARa gene on MDR1 expression and P-glycoprotetn function in human leukemic cells. Cancer Cell International, 2005, vol.5, №15, p.1-9.

47Лаботина Т.Н. Роль некоторых онкобелков в дифференцировке лимфоцитов человека. Медицинская иммунология, 2005, т,7, №2-3, С.105-340, с.198.

48.3аботина Т.Н., Кадагидзе З.Г. Роль гл и ко протеидов, регулирующих апоптоз, в дифференцировке лимфоцитов человека. Российский биотерапевтический журнал, 2005, т.4, №3, с.5-11.

49.Zabotina T.N. The expression of CD95, CD243, BcI-2, Ki-67 in human lymphocytes. Journal of the Association of Pediatric Allergists and Immunologists of Russia (JAPAIR), 2005, vol.6, supplement 1, p.97-98.

50.Вайман A.B., Стромская Т.П., Рыбалкина Н.Ю., Сорокин A.B., Гурьянов С.Г., Заботина Т.Н., Мечетнер Е.Б., Овчинников Л.П., Ставровская A.A. Содержание и локализация белка YB-1 в опухолевых клетках с множественной лекарственной устойчивостью. БИОХИМИЯ, 2006, т.71, вып.2, с. 190-200.

51 .Соколовская A.A., Заботина Т.Н., Михайлов А.Д., Блохин Д.Ю., Барышников А.Ю. Клеточная линия5 A4 Т-лимфобластного лейкоза человека, используемая для скрининга противоопухолевых препаратов. ПАТЕНТ на изобретение RU№ 2267532,2006.

Подписано в печать 22.03.06 г. Формат 60x84/16. Тираж 100 эга. Заказ 169

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина РАМН

115478, Москва, Каширское ш., 24

Оглавление диссертации Заботина, Татьяна Николаевна :: 2005 :: Москва

Содержание.

Список сокращений.

Введение диссертации по теме "Онкология", Заботина, Татьяна Николаевна, автореферат

Актуальность темы.6

Цель работы.9

Задачи исследования.10

Научная новизна.10

Научно-практическая значимость.11

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.12

Заключение диссертационного исследования на тему "Роль гликопротеидов, регулирующих апоптоз, в дифференцировке гемопоэтических клеток человека"

228 ВЫВОДЫ

2. Среди CD45+/CD14" лимфоцитов периферической крови взрослых доноров антиген CD95 определяется на 35-75% клеток, из них 40-60% составляют СОЗ+Т-клетки, а также на всех CD 19+В-клетках. На тимоцитах рецептор CD95 представлен на 8,7±35,2% клеток.

3. Антиген CD95 отсутствует на моноцитах и гранулоцитах во всех образцах периферической крови здоровых доноров независимо от возраста. В то же время, экспрессия антигена CD95 на CD45+/CD14" лимфоидных клетках зависит от возраста и отсутствует на лимфоцитах периферической крови только новорожденных детей.

4. На ранних этапах дифференцировки В-клеток (пре-пре-В ОЛЛ) антиген CD95 коэкспрессирован на СБ19+клетках. На поздних этапах дифференцировки CD19+, HLA-Dr+, CD5+ В-клетках (В-ХЛЛ) антиген CD95 отсутствует при всех стадиях развития заболевания.

7. На CD45+-лимфоидных клетках периферической крови здоровых доноров антиген CD243 отсутствует на мембране CD3+ Т-лимфоцитов, однако, все CD19+ В-лимфоциты его экспрессируют в функционально неактивном состоянии. Белок CD243 обнаружен также на 10-30% тимоцитов.

8. Экспрессия Bcl-2 меняется на этапах дифференцировки В-клеток. Bcl-2 экспрессируется на стадии зрелых периферических В-клеток и отсутствует в ранних В-клетках и плазматических клетках.

9. Тимоциты с фенотипом CD4+/CD8", CD4"/CD8+, CD47CD8" , а также CD3+/Ki-67+, CD3+/Ki-67" Т-клетки и CD19+/Ki-67" В-клетки лимфатических узлов обладают высокой экспрессией Bcl-2. Белок Bcl-2 отсутствует на части тимоцитов с фенотипом CD4+/CD8+ и в CD 19+/Ki-67+ В-клетках лимфатических узлов.

Ю.Высокая экспрессия белка Bcl-2 наблюдается в митохондриях лейкозных CD5+, CD19+, HLA-Dr+ В-клеток периферической крови больных B-XJIJI как на ранних, так и в развернутых стадиях развития заболевания.

11.Отсутствие CD95 на В-клетках больных ХЛЛ и, выявленная двумя методами (пропидий иодид и TUNEL) специфическая фрагментация ДНК клеток в процессе терапии, свидетельствует о С095-рецепторно-независимом механизме апоптоза при данной форме лимфопролиферативного заболевания.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2005 года, Заботина, Татьяна Николаевна

1. Аббасова С.Г., Липкин В.М., Трапезников Н.Н., Кушлинский Н.Е. Система Fas-FasL в норме и патологии // Вопр. биолог, мед. и фарм. химии. 1998. -№ 4. - С. 15-23.

2. Абелев Г.И. Механизмы дифференцировки и опухолевый рост // Биохимия. 2000. - Т. 65. - Вып. 1. - С. 127-138.

3. Барышников А.Ю. Программированная клеточная смерть (апоптоз) // В кн.: Клиническая онкогематология / Под ред. М.А.Волковой. М.: Медицина. - 2001. - С.36-42.

4. Барышников А.Ю., Сыркин А.Б., Полосухина Е.Р. и др. Прогностическое значение экспрессии CD95(Fas/APO-l) антигена при остром лимфобластном лейкозе у детей // Российский онкологический журнал. -1998. №.4. - С.31-35.

5. Барышников А.Ю., Шелепов В.П., Кузнецов С.В. и др. Экспрессия и проявление функциональной активности Fas/APO-l/CD95-антигена, опосредующего апоптоз, при гемобластозах у человека // Гематол. и трансфузиол. 1996. - Т. 41. - № 5. - С.42-44.

6. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. FAS/APO-1-антиген молекула, опосредующая апоптоз // Гематол. и трансфузиол. - 1995. - Т. 40. - №. 6. -С.35-38.

7. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза- М.: Эдиторал УРСС. 2002. - 320 с.

8. Волкова М.А. Хронический лимфолейкоз // В кн.: Клиническая онкогематология / Под ред. М.А.Волковой. Москва. - Медицина. - 2001.- С.376-392.

9. Вотякова О.М., Демина Е.А. Множественная миелома // В кн.: Клиническая онкогематология / Под ред. М.А.Волковой. Москва. -Медицина. - 2001. - С.423-448.

10. Ю.Глузман Д.Ф, Абраменко И.В, Скляренко JI.M, Надгорная В.А. Лабораторная диагностика онкогематологических заболеваний. К.: Морион. - 1998.-С.

11. Заботина Т.Н., Кадагидзе З.Г, Сай Е.В, Бухаркин Б.В. Экспрессия CD95 (Fas/APO-1) антигена у больных раком предстательной железы // Вестник РОНЦ им.Н.Н. Блохина РАМН. 2001. - №1. - С.54-57.

12. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. -2000.-Т. 65.-Вып. 1.-С.34-37.

13. Луговская С.А, Почтарь М.Е, Тупицын Н.Н. Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов // М. Тверь: ООО «Издательство «Триада». -2005.

14. Н.Новиков В.В, Алясова А.В., Уткин О.В. и др. Растворимые антигены CD38 и CD95 при раке молочной железы // Рос. Биотерап. Журн. 2005. -Т.4. - № 3. - С. 46-51.

15. Погорелов В.М., Козинец Г.И. Морфология апоптоза при нормальном и патологическом гемопоэзе // Гематол. и трансфузиол. 1995. - Том 40.-№5.-С. 17-25.

16. Ройт А, Бросторфф Дж, Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. // М.: Мир. -2000. 592 с, ил.

17. Ставровская А.А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток // Биохимия. 2000b. - Т.65. - Вып. 1. -С.112-126.

18. Ставровская А.А. Механизмы лекарственной устойчивости опухолевых клеток // Канцерогенез. М.: Научный мир. - 2000а. - С. 407-418.

19. Фильченков А.А., Стойка Р.С. Апоптоз и рак. К.: Морион. - 1999. -184 с.

20. Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью // Биохимия. 2000. - Т.65. - Вып. 1. - С.34-37.

21. Шишкин Ю.В., Седяхина Н.П., Заботина Т.Н. и др. Экспрессия антигена Fas/APO-l/CD95, опосредующего апоптоз, на лейкозных клетках человека // Бюлл. экспер. биол. мед. 1997. - Т.122. - №. 11. - С.544-546.

22. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология. 1996. -№. 6.-С. 10-23.

23. Ярилин А.А. Гомеостатические процессы в иммунной системе. Контроль численности лимфоцитов // Иммунология. 2004. - №5. - С.312-320.

24. Adams J.M. and Cory S. The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival // Science. 1998. - Vol. 281. -N.5381. - P. 1322-1326.

25. Adkins В., Charyulu V., Sun Q.L. et. al. Early block in maturation is associated with thymic involution in mammary tumor-bearing mice // J Immunol. 2000. -Vol.-164.-No. 11.-P. 5635-5640.

26. Alimonti J.B., Shi L., Baijal P.K., Greenberg A.H. Granzyme В induces BID-mediated cytochrome с release and mitochondrial permeability transition // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 6974-6982.

27. Antonsson В., Conti F., Ciavatta A. et.al. Inhibition of Bax channel-forming activity by Bcl-2 // Science. 1997. - Vol. 277. - P. 370-372.

28. Ashhab Y., Alian A., Polliack A. et.al. Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern // FEBS Lett. 2001. - Vol. 495. - P. 56-60.

29. Ashkenazi A. and Dixit V.M. Death receptors: Signaling and modulation // Science. 1998. - Vol. 281. - P. 1305-1308.

30. Askenasy N., Yolcu E.S., Yaniv I., et.al. Induction of tolerance using Fas ligand: a double-edged immunomodulator // Blood. 2005. - Vol. 105. - N. 4. -P. 1396-1404.

31. Bairey О., Zimra Y., Shaklai M. et.al. Bcl-2, Bcl-XL, Bax, and Bak expression in short- and long-lived patients with diffuse large B-cell lymphomas // Clin Cancer Res. 1999. - Vol. 5. - P. 2860-2866.

32. Bakhshi A., Jensen J.P., Goldman P. et.al. Cloning the chromosomal breakpoint of t(14;l 8) human lymphomas: Clastering around JH on chromosome 14 and near a transcriptional unit on 18 // Cell. 1985. - Vol.41. - P. 889-897.

33. Belaud-Rotureau M.A., Durrieu F., Labriolle G. et.al. Study of apoptosis-related responses of leukemic blast cells to in vitro anthracycline treatment // Leukemia.-2000.-Vol. 14.-N. 7.-P. 1266-1275.

34. Bellgrau D., Gold D., Selawry H. et al. A role for CD95 ligand in preventing graft rejection // Nature. 1995. - Vol.377. - P.630-632.

35. Bellosillo В., Villamor N., Lopez-Guillermo A. et.al. Spontaneous and drug-induced apoptosis is mediated by conformational changes of Bax and Bak in B-cell chronic lymphocytic leukemia // Blood. 2002. - Vol. 100. - N. 5. - P. 1810-1816.

36. Bennet M.W., O'Connell J., O'Sullivan G.C., et al. Expression of Fas ligand by human gastric adenocarcinomas: a potential mechanism of immune escape in stomach cancer // GUT. 1999. - Vol. 44. - P.156-162.

37. Benveniste P., Cohen A. p53 expression is required for thymocyte apoptosis induced by adenosine deaminase deficiency // Proc Natl Acad Sci USA. 1995.- Vol.92. No. 18. - P. 8373-8377.

38. Bhardwaj A. and Aggarwal B.B. Receptor-mediated choreography of life and death // J. Clin. Immunol. 2003. - Vol. 23. - P. 317-332.

39. Blume-Jensen P., Janknecht R. and Hunter T. The kit receptor promotes cell survival via activation of PI 3-kinase and subsequent Akt-mediated phosphorylation of Bad on Serl36 // Curr. Biol. 1998. - Vol. 8. - P. 779-782.

40. Boatright K.M. et al. A unified model for apical caspase activation // Mol. Cell.- 2003.-Vol. 11.-P. 529-541.

41. Borner C. Diminished cell proliferation associated with the death-protective activity of Bcl-2 // J Biol Chem. 1996. - Vol. 271. -N.22. -P.12695-12698.

42. Borner С. The Bcl-2 protein family: sensors and checkpoints for lifeor-death decisions // Mol. Immunol. 2003. - Vol. 39. - P. 615-647.

43. Bouillet P., Metcalf D., Huang D. C. S. et.al. Proapoptotic Bcl-2 relative Bim required for certain apoptotic responses, leukocyte homeostasis, and to preclude autoimmunity // Science. 1999. - Vol. 286. - P. 1735-1738.

44. Boullet Ph. and Strasser A. ВНЗ-only proteins evolutionarily conserved proapoptotic Bcl-2 family members essential for initiating programmed cell death // J Cell Scie. - 2002. - Vol. 115. - P. 1567-1574.

45. Bradley G., Juranka P., Ling V. Mechanism of multidrug resistance // Biochim Biophys Acta. 1988. - Vol. 948. - P. 87-128.

46. Brunet A., Bonni A., Zigmond M.J. et.al. Akt promotes cell survival by phosphorylating and inhibiting a Forkhead transcription factor // Cell. 1999. -Vol. 96.-P. 857-868.

47. Bueso-Ramos C.E., Ferrajoli A., Medeiros L.J. et.al. Aberrant morphology, proliferation, and apoptosis of B-cell chronic lymphocytic leukemia cells // Hematology. 2004. - Vol. 9. - N. 4. - P. 279-286.

48. Bursch W. The autophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death//Cell Death Differ.-2001.-Vol. 8.-P. 569-581.

49. Buzyn A., Petit F., Ostankovitch M., et al. Membrane-bound Fas (Apo-l/CD95) ligand on leukemic cells: a mechanism of tumor immune escape in leukemia patients // Blood. 1999. - Vol. 94. - P.3135-3140.

50. Calabretta B. and Perrotti D. The biology of CML blast crisis // Blood. 2004. -Vol. 103. -N.ll.-P. 4010-4022.

51. Capello D. and Gaidano G. Molecular pathophysiology of indolent lymphoma // Haematologica. 2000. - Vol. 85. -N. 2. - P. 195-201.

52. Cardone M.H, Roy N, Stennicke H.R. et.al. Regulation of cell death protease caspase-9 by phosphorylation // Science. 1998. - Vol. 282. - P. 1318-1321.

53. Carter A, Lin K, Sherrington P.D. and Pettit A.R. Detection of p53 dysfunction by flow cytometry in chronic lymphocytic leukemia // Br J Haematol. 2004. - Vol.127. - P.425-428.

54. Cascino I, Fiucci C, Papoff C. et.al. Three functional soluble forms of the human apoptosis-inducing Fas molecule are produced by alternative splicing // J. Immunol.- 1995.-Vol. 154.-P.

55. Cavalcanti G.B. Jr, da Cunha Vasconcelos F, Pinto de Faria et.al. Coexpression of p53 and MDR functional phenotype in leukemias: the predominant association in chronic myeloid leukemia // Cytometry В Clin Cutom.-2004.-Vol. 61.-N. l.-P. 1-8.

56. Cavalcanti G.B.Jr, da Cunha Vasconcelos F, Pinto de Faria G. et.al. Coexpression of p53 protein and MDR functional phenotype in leukemias: the predominant association in chronic myeloid leukemia // Cytometry В Clin Cytom.-2004.-Vol. 61.-N.l.-P. 1-8.

57. Cervelo C, Escribano L, San Miguel J.F. et.al. Expression of Bcl-2 by Human Bone Marrow Mast Cells and its Overexpression in Mast Cell Leukemia // American J Haem.- 1999.-Vol. 60.-P. 191-195.

58. Chang B.S, Minn A.J, Muchmore S.W. et.al. Identification of a novel regulatory domain in Bcl-X(L) and Bcl-2 // EMBO J. 1997. - Vol. 16. - P. 968-977.

59. Chang D.W, Xing Z, Capacio V.L. et.al. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 2003. - Vol. 22. - P. 4132-4142.

60. Chao D.T. and Korsmeyer S.J. Bcl-2 family: regulators of cell death // Annu. Rev. Immunol. 1998. - Vol. 16. - P.396-419.

61. Chaudhary P, Roninson I. Expression and activity of p-glycoprotein, a multidrug efflux pump, in human hematopoietic stem cells // Cell. 1991. -Vol. 66.-P. 85-94.

62. Chauncey T.R. Drug resistance mechanisms in acute leukemia // Curr. Opin. Oncol.-2001.-Vol. 13.-P. 21-26.

63. Chen Y.C., Tien H.F., Wang C.H. Immunophenotype and genotype of MDS in acute transformation // Leukemia Res. 1994. - Vol. 18. - P. 35.

64. Cheng E.H., Kirsch D.G., Clem R.J. et.al. Conversion of Bcl-2 to a Bax-like death effector by caspases // Science. 1997. - Vol. 278. - P.1966-1968.

65. Chou J.J, Li H., Salvesen G.S. et.al. Solution structure of BID, an intracellular amplifier of apoptotic signaling // Cell. 1999. - Vol. 96. -P. 615-624.

66. Chowdary D.R., Dermody J.J., Jha K.K., Ozer H.L. Accumulation of p53 in a mutant cell line defective in the ubiquitin pathway // Mol Cell Biol. 1994. -Vol.3.-P. 1997-2003.

67. Chylicki K., Ehinger M., Sveberg H. et.al. Characterization of the molecular mechanisms for p53-mediated differentiation // Cell Growth and Diff. 2000. -Vol. 11.-P. 561-571.

68. Clem R.J., Cheng E.H., Karp C.L. et.al. Modulation of cell death by Bcl-XL through caspase interaction // Proc Natl Acad Sci 1998. - Vol. 95. - P. 554559.

69. Cohen G.M. Caspases: the executioners of apoptosis // Biochem J. 1997. -Vol. 326.-P. 1-16.

70. Collins R. J., Verschuer L. A., Harmon В. V. et.al. Spontaneous programmed death (apoptosis) of B-chronic lymphocytic leukaemia cells following their culture in vitro II Br. J. Haematol. 1989. - Vol. 71, N 3. - P. 345-350.

71. Cookson В. T. and Brennan M. A. Pro-inflammatory programmed cell death // Trends Microbiol. 2001. - Vol. 9. - P. 113-114.

72. Cory S., Huang D. C., Adams J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis // Oncogene. 2003. - Vol. 22. - P. 8590-8607.

73. Cossarizza A, Ortolani C, Monti D, Franceschi C. Cytometric analysis of immunosenscence // Cytometry. 1997. - Vol.27. - No.4. - P.297-313.

74. Coustan-Smith E, Kitanaka A, Pui C.H. et.al. Clinical relevance of Bcl-2 overexpression in childhood acute lymphoblastic leukemia // Blood. 1996. -Vol. 87. -N. 3.-P.1140-1146.

75. Currach M.E, Connor T.M, Knudson C.M, et.al. bax- deficiency promotes drug resistance and oncologenic transformation by attenuating p53-dependent apoptosis // Proc Natl Acad Sci USA. 1997. - Vol. 94. - P.2345-2349.

76. Danial N. N. and Korsmeyer S. J. Cell death: critical control points // Cell. -2004.-Vol. 116.-P. 205-219.

77. Datta S.R, Dudek H, Tao X. et.al. Akt phosphorylation of BAD couples survival signals to the cell-intrinsic death machinery // Cell. 1997. - Vol. 91. -P. 231-241.

78. Datta S.R, Katsov A, Hu L. et.al. 14-3-3 proteins and survival kinases cooperate to inactivate BAD by BH3 domain phosphorylation // Mol. Cell. -2000.-Vol. 6.-P. 41-51.

79. Del Poeta G., Maurillo L., Suppo G. et. al. Both high CD38 and soluble APO-1/FAS(CD95) correlate with advanced stages and poor outcome in В chronic lymphoid leukaemia (B-cell) // The Haematol. J. 2000. - VI. SI. - P. 91.

80. Delfino D.V., Agostini M., Spinicelli S., et. al. Decrease of Bcl-xL and augmentation of thymocyte apoptosis in GILZ overexpressing transgenic mice // Blood. 2004. - Vol. 104. - No. 13. - P. 4134-4141.

81. Desagher S., Osen-Sand A., Nichols A. et.al. Bid-induced conformational change of Bax is responsible for mitochondrial cytochrome с release duringapoptosis // J. Cell Biol. 1999. - Vol. 144. - P. 891-901.

82. Deveraux Q.L. and Reed J.C. IAP family proteins: suppressors of apoptosis // Genes Dev. 1999. - Vol.13. - P. 239-252.

83. Ding H.F., Fisher D.E. Mechanisms of p-53mediatied apoptosis // Crit Rev Oncog. 1998. - Vol. 9. - P.83-98.

84. Dingwall C., Robbins J., Dilworth S.M. et.al. The nucleoplasmin nuclear localization sequence is larger and more complex than that of SV-40 large T-antigen // J. Cell Biol. 1988. - Vol. 107. - P.841-849.

85. Dive C., Hickman J.A. Drug-target interactions: only the first step in the commitment to a programmed cell death? // Br. J. Cancer -1991. -Vol.64. -P.192-196.

86. D6hner H., Fisher K., Bentz M. et.al. P53 gene deletion predicts for poor survival and non-response to therapy with purine analogs in chronic B-cell leukemias // Blood. Vol. 85. - P. 1580-1589.

87. Drach D., Zhao S., Mahadevia R., et. al. Subpopulations of normal peripheral blood and bone marrow cells express a functional multidrug resistant phenotype // Blood. 1992. - Vol.80 - No.l 1. -P.2729-2734.

88. Drach J., Zhao S., Drach D., et. al. Expression of MDR1 by normal bone marrow cells and its implication for leukemic hematopoiesis // Leuk Lymphoma. 1995. - Vol. 16. - P.419-424.

89. Dupere-Minier G., Hamelin C., Desharnais P., Bernier J. Apoptotic volume decrease, pH acidification and chloride channel activation during apoptosis requires CD45 expression in HPB-ALL T cells // Apoptosis. 2004. - Vol. 9. -N.5. -P.543-551.

90. Earnshaw W.C. Nuclear changes in apoptosis. // Curr. Opin. Cell Biol. -1995. -Vol. 7. P. 337-343.

91. Enari M., Sakahira H., Okawa K., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor 1С AD // Nature. 1998. -Vol. 391. - P.43-50.

92. Enari N., Hug H., and Nagata S. Involvement of an ICE-like protease in Fas-mediated apoptosis//Nature. 1995. - Vol. 375. - P. 78-81.

93. Eskes R., Antonsson В., Osen-Sand A. et.al. Bax-induced cytochrome С release from mitochondria is independent of the permeability transition pore but highly dependent on Mg2+ions // J. Cell Biol. 1998. - Vol.143. - P. 217-224.

94. Evan G. and Littlewood T. A matter of life and cell death // Science. 1998. -Vol.281.-P.1317-1322.

95. Fadok V.A., Voelker P.A., Campbell J.J. et al. Exposure of phosphatidylethanol-amine on the surface of apoptotic cells // Exp. Cell. Res. -1992,-Vol. 232.-P. 430-434.

96. Fenaux P., Jonveaux P., Quiquandon I. et.al. p53 gene mutations in acute myeloid leukaemia with 17p monosomy // Blood. 1991. - Vol. 78. - P. 16521659.

97. Finucane D.M., Bossy-Wetzel E., Waterhouse N.J. et.al. Bax-induced caspase activation and apoptosis via cytochrome с release from mitochondria is inhibitable by Bcl-XL // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 2225-2233.

98. Fisher D.E. Apoptosis in cancer therapy: crossing the threshold // Cell. 1994. -Vol. 78.-P. 539-542.

99. French L. E. and Tschopp J. Proteinbased therapeutic approaches targeting death receptors // Cell Death Differ. 2003. - Vol. 10. - P. 117-123.

100. Friend S.H., Bernards R., Rogelj S., et.al. A human DNA segment with properties of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma // Nature. 1986. - Vol. 323. -N.6089. -P.643-646.

101. Friesen C., Fulda S., Debatin K.M. Deficient activation of the CD95 (APO-1/Fas) system in drug-resistant cells // Blood. 1997. - Vol.90. - P.3118-3129.

102. Fukuhara S., Rowley J.D., Variakojis D. et.al. Chromosome abnormablities in poorly differentiated lymphocytic lymphoma // Cancer Res. 1979. - Vol. 39. -P. 3119-3127.

103. Fulda S., Friesen C., Debatin K.M. Molecular determinants of apoptosis induced by cytotoxic drugs // Klin. Padiatr. 1998b. - Vol.210. - P. 148-52.

104. Fulda S., Los M., Friesen C. et al. Chemosensitivity of solid tumor cells in vitro is related to activation of the CD95 system // Int J Cancer. 1998a. - Vol. 76. -P.105-114.

105. Fulda S., Strauss G., Meyer E., Debatin K.M. Functional CD95 ligand and CD95 death-inducing signaling complex in activation-induced cell death and doxorubicin-induced apoptosis in leukemic T cell // Blood. 2000. - Vol. 95. -P. 301-308.

106. Gascoyne R.D, Adomat S/.A, Krajewski S. et.al. Prognostic significance of Bcl-2 protein expression and Bcl-2 gene rearrangement in diffuse aggressive non-Hodgkin's lymphoma // Blood. 1997. - Vol. 90. - N. 1. - P. 244-251.

107. Gerdes J, Li L, Schluter C. et.al. Immunobiochemical and molecular antigen that is defined by monoclonal antibody Ki-67 // Am J Pathol. 1991. - Vol. 138. -N.4. - P.867-873.

108. Ghayur T, Hugunin R.V, Talanian S. et al. Proteolytic activation of protein kinase С delta by an ICE/CED 3-like protease induces characteristics of apoptosis // J. Exp. Med. 1996. - Vol. 184. - P. 2399-2404.

109. Ghobrial I.M, Witzig Т.Е. and Adjei A.A. Targeting Apoptosis Pathways in Cancer Therapy // Cancer J Clin. 2005. - Vol. 55. - P. 178-194.

110. Glasova M, Konikova E, Kuzenda J, Babushikova O. Flow cytometric detection of some activation and prolifaration markers in human hematopoietic cell lines //Neoplasma. 1996. - Vol. 43. -N.6. -P.381-388.

111. Golks A, Brenner D., Fritsch C. et.al. C-FLIPR: a new regulator of death receptor-induced apoptosis // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280. - P. 1450714513.

112. Goping I.S, Gross A, Lavoie J.N. et.al. Regulated targeting of BAX to mitochondria // J. Cell Biol. 1998. - Vol. 143. - P. 207-215.

113. Gottlieb T.M, Oren M. p53 and apoptosis // Semin Cancer Biol. 1998. - Vol. 8. -N.5. -P.359-368.

114. Gottlieb T.M, Oren M. p53 in growth control and neoplasia // Biochim Biophys Acta. 1996. - Vol. 1287. N.2-3. - P.77-102.

115. Gozuacik D. and Kimchi A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism // Oncogene. 2004. - Vol. 23. - P. 2891-2906.

116. Grandgirard D, Studer E, Monney L. et.al. Alphaviruses induce apoptosis in Bcl-2-overexpressing cells: evidence for a caspasemediated, proteolytic inactivation of Bcl-2 // EMBO J. 1998.- Vol. 17. - P. 1268-1278.

117. Granville D.J, Jiang H, An M.T, et. al. Overexpression of Bcl-xl prevents caspase-3-mediated activation of DNA fragmentation factor (DFF) produced byф treatment with the photochemotherapeutic agent BPD-MA // FEBS Lett. 1998.-Vol. 422.-P.151-154.

118. Green D. and Kroemer G. The central executioners of apoptosis: caspases or mitochondria? // Trends Cell Biol. 1998. - Vol. 8. - P. 267-271.

119. Greenblatt M.S., Bennet W.P., Holstein M., Harris C.C. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis // Cancer Res. 1994. - Vol. 54. -N.18. - P.4855-4878.

120. Griffith Т., Brunner Т., Fletcher D.R. et al. Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege // Science. 1995. - Vol.270. - P. 1189-1192.

121. Griffiths G.J., Dubrez L., Morgan C.P. et.al. Cell damage-induced conformational changes of the pro-apoptotic protein Bak in vivo precede the onset of apoptosis // J.Cell Biol. 1999. - Vol. 144. - P. 903-914.

122. Griffiths S.D., Goodhead D.T., Marsden S.J., et.al. Interleukin 7-dependent В Lymphocyte Precursor Cells Are Ultrasensitive to Apoptosis // J. Exp. Med. -1994.-Vol.179.-P.1789-1797.

123. Grogan T.M., Lippman S.M., Spier C.M. et.al. Independent prognostic significance of a nuclear proliferation antigen in diffuse large cell lymphomas as determined by the monoclonal antibody Ki-67 // Blood. 1988. - Vol. 71. -P.l 157-1160.

124. Gronbaek K., Straten P.T., Ralfkiaer E. et.al. Somatic Fas mutations in non-Hodgkins lymphoma: association with extranodal disease and autoimmunity // Blood. 1998. - Vol. 92. - N.9. - P. 3018-3024.

125. Gross A., Jockel J., Wei M.C., Korsmeyer S.J. Enforced dimerization of BAX results in its translocation, mitochondrial dysfunction and apoptosis // EMBO J. 1998.-Vol. 17.-P. 3878-3885.

126. Gross A., McDonnell J.M. and Korsmeyer S.J. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis // Genes & Development. 1999b. - Vol.13. - P. 1899-1911.

127. Gross A., Yin X.M., Wang K. et.al. Caspase cleaved BID targets mitochondria # and is required for cytochrome с release, while BCL-XL prevents this releaseф but not tumor necrosis factor-Rl/Fas death // J. Biol. Chem. 1999a. - Vol.274.-P. 1156-1163.

128. Grossi C.E, Cicconi E, Tacchetti C, et. al. Anatomy of the immune system: fact and problems // Ital J Anat Embriol. 2000. - Vol. 105. - No.4. - P.97-124.

129. Gzader M, Porwit A, Tani E. et.al. DNA image cytometry and the expression of proliferative markers (Proliferating cell nuclear antigen and Ki67) in non-Hodgkins lymphomas // Mod Pathol. 1995. - Vol. 8. - N. 1. - P.51-58.

130. Hachem A. and Gartenhaus R B. Oncogenes as molecular targets in lymphoma // Blood. 2005. - Vol. 106. - N.6. - P. 1911-1923.

131. Hahn H.P, Pang M, He J. et.al. Galectin-1 induces nucler translocation of endonuclease G in caspase- and cytochrome c-independent T cell death // Cell Death Differ.-2004.-Vol. 11.-N. 12.-P. 1277-1286.

132. Haldar S., Jena N. and Croce C.M. Inactivation of Bcl-2 by phosphorylation // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. - Vol. 92. - P. 4507^1511.

133. Hall P.A, Richards M.A, Gregory W.M. et.al. The prognostic value of Ki67 immunostaining in non-Ho Hodgkins lymphoma // J Pathol. 1988. - Vol. 154. -P.223-235.

134. Hamada H, Tsuruo T. Functional role for the 170-180 kDa glycoprotein specific to drug-resistant tumor cells as revealed by monoclonal antibodies // Proc Natl Acad Sci USA. 1986. - Vol. 83. - P. 7785-7789.

135. Han Z, Bhalla K, Pantazis P. et.al. Cif (Cytochrome с efflux-inducing factor) activity is regulated by Bcl-2 and caspases and correlates with the activation of Bid//Mol. Cell. Biol. 1999.-Vol. 19.-P. 1381-1389.

136. Harada H., Becknell В., Wilm M. et.al. Phosphorylation and inactivation of BAD by mitochondria-anchored protein kinase A // Mol. Cell. 1999. - Vol. 3. -P. 413-422.

137. Heibein J.A., Goping I.S., Barry M. et.al. Granzyme B-mediated cytochrome с release is regulated by the Bcl-2 family members bid and Bax // J. Exp. Med. -2000.-Vol. 192.-P. 1391-1402.

138. Hellemans P., van Dam P.A., Weyler J. et.al. Prognostic value of bcl-2 expression in invasive breast cancer // Br J Cancer. 1995. - Vol. 72. - P. 354360.

139. Higgins C.F. The ABC of channel regulation // Cell. 1995. - Vol. 82. - N. 5. -P. 693-696.

140. Hildeman D.A. Regulation of T-cell apoptosis by reactive oxygen species // Free Radic Biol Med. 2004. - Vol. 36. - No. 12. - P. 1496-1504.

141. Hirata H., Takahashi A., Kobayashi S.Y. at el. Caspases are activated in branched proteases cascade and control downstream processes in Fas-induced apoptosis // J. Exp. Med. 1998. - Vol. 187. - P. 587-600.

142. Hirose M., Hosoi E., Hamano S., Jalili A. Multidrug resistance in hematological malignancy // J Med Invest. 2003. - Vol. 50. - N. 3-4. - P. 126-135.

143. Hockenbery D., Nunez G., Milliman C. et.al. Bcl-2 is an inner mitohondrial membrane protein that blocks programmed cell death // Nature. 1990. -Vol.348.-P. 334-336.

144. Hogarth L. A. and Hall A.G. Increased BAX expression is associated with an increased risk of relapse in childhood acute leukemia // Blood. 1999. - Vol. 93.-N.8.-P. 2671-2678.

145. Hsu Y.T. and Youle R.J. Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. - P. 1382913834.

146. Hsu Y.T., Wolter K.G., Youle R.J. Cytosol-to-membrane redistribution of Bax and Bcl-xL during apoptosis // Proc Natle Acad Sci USA. 1997. - Vol. 94. -P.3668-3672.

147. Huang D.C.S. and Strasser A. ВНЗ-only proteins essential initiators of apoptotic cell death // Cell. - 2000. - Vol. 103. - P.839-842.

148. Huang D.C.S., Adams J.M., Cory S. The conserved N-terminal BH4 domain of Bcl-2 homologous is essential for inhibition of apoptosis and interaction with CED-4 // EMBO. 1998. - Vol. 17. - N.4. - P. 1029-1039.

149. Huang P., Robertson L.E., Wright S., Plunkett W. High molecular weight DNA fragmentation: a critical event in nucleoside analogue-induced apoptosis in leukaemia cells // Clin. Cancer Res. 1995. - Vol. 1. - P.1005-1013.

150. Ichijo H., Nishida E., Irie K. et al. Induction of apoptosis by ASK1, a mammalian MAPKKK that activates SAPK/JNK and p38 signaling pathways // Science. 1997. - Vol. 275. - P.90-94.

151. Ikeda S., Seki Y., Ozaki K. Mitochondrial factor modulate the activity of endonuclease G, the major nuclease of Mammalian mitochondria // J Biochem Mol Biol Biophys. 2002. - Vol. 6. - N. 1. - P. 17-21.

152. Illera V.A., Perandones C.E., Stunz L.L. et. al. // J.Immunol. 1993. - Vol. 151,N6.-P. 2965-2973.168.1naba H., Komada Y., Li Q.-S. et.al. mRNA Expression of Variant Fas Molecules in Acute Leukemia Cell // Am J Hematol. 1999. - Vol. 62. - P. 150-158.

153. Ink В., Zornig M., Baum B. etal. Human Bak induces cell death in Schizosaccharomyces pombe with morphological changes similar to those withapoptosis in mammalian cells // Mol. Cell. Biol. 1997. - Vol.17. - P. 24682474.

154. Ito Т., Deng X., Carr B. and May W.S. Bcl-2 phosphorylation required for anti-apoptosis function // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. - P. 11671-11673.

155. Itoh N. and Nagata S. A novel protein domain required for apoptosis. Mutational analysis of Fas antigen // J. Biol. Chem. 1993. - Vol.268. - P. 10932-10937.

156. Jamroziak K., Smolewski P., Cebula В et.al. Ralation of P-glycoprotein expression with spontaneous in vitro apoptosis in B-cell chronic lymphocytic leukemia // Neoplasma. 2004. - Vol. 51. - N. 3. - P. 181 -187.

157. Jamroziak K., Smolewski P., Cebula B. et.al. Relation of P-glycoprotein expression with spontaneous in vitro apoptosis in B-cell chronic lymphocytic leukemia//Neoplasma. -2004. Vol. 51. -N. 3. - P. 181-187.

158. Janicke R.U., Sprengart M.L., Wati M.R., Porter A.G. Caspase-3 required for DNA fragmentation and morphological changes associated with apoptosis // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. - P.9357-9360.

159. Jazirehi A.R., Vega M.I., Chatterjee D. et.al. Inhibition of the Raf-MEKl/2-ERK1/2 signaling pathway, Bcl-xL down-regulation, and chemosensitization of non-Hodgkin's lymphoma В cells by rituximab // Cancer Res. 2004. - Vol. 64. -P.7117-7126.

160. Jiang Z.F., Zhao Y., Hong X., Zhai Z.H. Nuclear apoptosis induced by isolated mitochondria // Cell Research. 2000. - Vol. 10. - P. 221-232.

161. Joza N., Susin S.A., Daugas E. et al. Essential role of the mitochondrial apoptosis-inducing factor in programmed cell death // Nature. 2001. - Vol. 410.-P. 549-554.

162. Jurgensmeier J.M., Xie Z., Deveraux Q. et.al. Bax directly induces release of cytochrome с from isolated mitochondria // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. -Vol. 95.-P. 4997-5002.

163. Kaiser H.E., Bodey B. The role of apoptosis in normal ontogenesis and solid human neoplasms // In Vivo. 2000. - Vol. 14. - No. 6. - P. 789-803.

164. Kalinowska M., Garncarz W., Pietrowska M. et.al. Regulation of the apoptotic DNase/RNase Endonuclease G: involvement of Hsp70 and ATP // Apoptosis. -2005.-Vol. 10.-N. 4.-P. 821-830.Щ

165. Karawajew L., Wuchter C., Rupper V. et.al. Differential CD95 expression and function in T and В lineage acute lymphoblastic leukemia cells // Leukemia. -1997.-Vol. 11. -P.1245-1252.

166. Karin M. and Lin A. NF-kappaB at the crossroads of life and death // Nat. Immun. 2002. - Vol. 3. - P. 221-227.

167. Kartner N., Evernden-Porelle D., Bradley G., Ling V. Detection of p-glycoprotein in multidrug-resistant cell lines by monoclonal antibodies // Nature. 1985. - Vol. 316. - P. 820-823.

168. Kastan M.B, Stone K.D, and Civin C.I. Nuclear Oncoprotein Expression as a Function of Lineage, Differentiation Stage, and Proliferative Status of Normal Human Hematopoietic Cells // Blood. 1989. - Vol. 74. -No.5. - P. 1517-1524.

169. Kaufmann S.H. Induction of endonucleolytic DNA cleavage in human acute myelogenous leukemia cells by etoposide, camptothecin, and other cytotoxic anticancer drugs: a cautionary note // Cancer Res. 1989. - Vol.49. - P. 58705878.

170. Kaufmann S.H, Desnoyers S, Ottaviano Y. et al. Specific proteolytic cleavage of Poly (ADP-ribose) polymerase: an early marker of chemotherapy-induced apoptosis // Cancer Res. 1993. - Vol. 53. - P. 3976-3985.

171. Kayagaki N.A, Kawasaki A, Ebata T. et al. Metalloproteinase-mediated release of human Fas ligand // J. Exp. Med. 1995. - Vol.182. - P. 1777-11783.

172. Kelekar A. and Thompson C.B. Bcl-2-family proteins: the role of the BH3 domain in apoptosis // Trends Cell Biol. 1998. - Vol. 8. - P. 324-330.

173. Kerr J. F, Wyllie A. H. and Currie A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics // Br. J. Cancer. -1972.-Vol. 26.-P. 239-257.

174. Kessel D, Beck W.T, Kukuruga D, Schulz V. Characterisation of multidrug resistance by fluorescent dyes // Cancer Res. 1991. - Vol. 51. - P. 4665-4670.

175. Khodarev N.M, Sokolova I.A, Vaughan A.T. Mechanisms of induction of apoptotic DNA fragmentation // Int. J. Radiat. Biol. 1998. - Vol. 73. - P. 455467.

176. Kischkel F.C., et al. Death receptor recruitment of endogenous caspase-10 and apoptosis initiation in the absence of caspase-8 // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276.-P. 46639-46646.

177. Knipping E., Debatin K.M., Strieker K. et.al. Identification of soluble APO-1 in supernatants of human B- and T-cell lines and increased serum levels in B- and T-cell leukemias//Blood. 1995. - Vol. 85. - N. 6. -P.1562-1569.

178. Knorr C., Amrehn C., Seeberger H. et.al. Expression of costimulatory molecules in low-grade mucosa-associated lymphoid tissue-type lymphomas in vitro II Am J Pathol. 1999. - Vol. 155. -N. 6. - P. 2019-2027.

179. Knudson C.M. and Korsmeyer S.J. Bcl-2 and Bax function independently to regulate cell death//Nat. Genet. 1997. - Vol. 16. - P. 358-363.

180. Knudson C.M., Johnson G.M., Lin Y., Korsmeyer S.J. Bax Accelerates

181. Tumorogenesis in p53-deficient Mice // Cancer Res. 2001. - Vol. 61. - P. 659-665.

182. Ко L.J., Prives C. p53: puzzle and paradigm // Genes Dev. 1996. - Vol. 10. -N.9. -P.1054-1072.

183. Komarov P.G., Shtil A.A., Holian O. et.al. Activation of the LRP (lung resistance-related protein) gene by short-term exposure of human leukemia cells to phorbol ester and cytarabine // Oncol Res. 1998. - Vol. 10. - N. 4. - P. 185-192.

184. Konikova E., Kusenda J. P53 protein expression in human leukemia and lymphoma cells // Neoplasma. 2001. - Vol. 48. - N.4. - P. 290-298.

185. Konikova E., Kusenda J., Babusikova O. Flow cytometry of p53 protein expression in some haematological malignancies // Neoplasma. 1999. - Vol. 46. - N.6. - P.368-376.

186. Korsmeyer S.J., Wei M.C., Saito M. et.al. Proapoptotic cascade activates BID, which oligomerizes ВАК or BAX into pores that result in the release of cytochrome с // Cell Death Differ. 2000. - Vol. 7. - P. 1166-1173.

187. Krammer P.H. CD 95's deadly mission in the immune system // Nature. 2000. - Vol. 407. - No. 6805. - P. 789-795.

188. Krammer P-H. CD95 (APO-l/Fas)-mediated apoptosis: live and let die. // Adv. Immunol. -1999. 71,163-210.

189. Krause J.R., Shahidi-Asl M. Molecular pathology in the diagnosis and treatment of non-Hodgkin's lymphomas // J Cell Mol Med. 2003. - Vol. 7. -P. 494-512.

190. Krebs J.F., Armstrong R.C., Srinivasan A. et.al. Activation of membrane-associated procaspase-3 is regulated by Bcl-2 // J. Cell Biol. 1999. - Vol. 144. -P. 915-926.

191. Kroemer G. The proto-oncogene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis // Nature Med. 1997. - Vol. 3. -N.6. -P.614-620.

192. Kumar V., Varma N., Varma S. et.al. Flow Cytometric Analysis of DNA Indices, Expression of p53 and Multidrug Resistance Genes in Multiple Myeloma Patients // Analyt Quant Cytol Histol. 2004. - Vol. 26. - P. 271-277.

193. Kuribara R., Honda H., Matsui H. et.al. Roles of Bim in Apoptosis of Normal and Bcr-Abl-Expressing Hematopoietic Progenitors // Mol Cell Biol. 2004. -Vol. 24.-P. 6172-6183.

194. Kussie P.H, Gorina S, Marechal V. et.al. Structure of the MDM2 oncoprotein bound to the p53 tumor suppressor transactivation domain // Science. 1996. -Vol. 274. -N.5289. - P.948-953.

195. Kuwana T, Mackey M.R, Perkins G. et.al. Bid, Bax, and lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane // Cell. -2002.-Vol. 111.-P. 331-342.

196. Lambertenghi D.G, Soligo D, Oriani A. Increased expression of bcl-2 protein in the bone marrow biopsies of patient with primary MDS // Leukemia Res. -1994.-Vol. 18.-P.50.

197. Landowski Т.Н., Qu N, Buyuksal I. et.al. Mutations in the Fas antigen in patients with multiple myeloma // Blood. 1997. - Vol. 90. - N.l 1. - P. 42664270.

198. Laouar Y, Vasseur F, Moreau G. et.al. Selective involvement of the Fas (CD95)/Fas ligand pathway in bone marrow В cell progenitors // Eur J Immunol. 2000. - Vol. -30. -No.5. - P. 1402-1409.

199. Larsen J.K. Washless double staining of a nuclear antigen (Ki-67 or bromodeoxyuridine) and DNA in unfixed nuclei // Methods in Cell Biology. -1990.-Vol. 33.-P.227-234.

200. Lavrik I.N, Golks A, Krammer P.H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death // J. Clin. Invest. 2005. - Vol. 115. - N. 10. - P. 2665-2672.

201. Laytragoon-Lewin N, Rossmann E.D, Castro J. et.al. Significance of phosphotyrosin proteins, Bcl-2 and p53 for apoptosis in resting B-chronic lymphocytic leukemia (CLL) cells // Int J Cancer. 2002. - Vol. 97. - N. 3. -p. 344-348.

202. Lazebnik Y.A, Kaufmann S.H, Desnoyers S. et al. Cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE // Nature. 1994. -Vol. 371.-P. 346-347.

203. Lebedeva I., Rando R., Ojwang J. et.al. Bcl-xL in prostate cancer cells: effects of overexpression and down-regulation on chemosensitivity // Cancer Res. -2000. Vol. 60. - P. 6052-6060.

204. Lechardeur D., Dougaparsad S., Nemes C., Lukacs G.L. Oligomerization state of the DNA fragmentation factor (DFF) in normal and apoptotic cells // J Biol Chem. 2005. - Oct 3 (supplied by publisher).

205. Lee W.H., Bookstein R., Hong F. et.al. Human retinoblastoma susceptibility gene: cloning, identification, and sequence // Science. 1987. - Vol 235. -N.4794. -P.1394-1399.

206. Letai A., Bassik M.C., Walensky L.D. et.al. Distinct BH3 domainseither sensitize or activate mitochondrial apoptosis, serving as prototype cancer therapeutics // Cancer Cell. 2002. - Vol. 2. - P. 183-192.

207. Letai A., Sorcinelli M.D., Beard C., Korsmeyer S.J. Antiapoptotic BCL-2 is required for maintenance of a model leukemia // Cancer Cell. 2004. - Vol. 6. -P. - 241-249.

208. Levin S. Apoptosis, necrosis, or oncosis: what is your diagnosis? A report from the Cell Death Nomenclature Committee of the Society of Toxicologic Pathologists // Toxicol. Sci. 1998. - Vol. 41. - P. 155-156.

209. Levine A.J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division // Cell. 1997. -Vol. 88.-N.3.-P.323-331.

210. Levine A.J., Momand J., Finlay C.A. The p53 tumor suppressor gene // Nature. -1991.-Vol.351.-N.6326.-P.453-456.

211. Lewis S, Bethell S.S, Patel S. et.al. Purification and biochemical properties of soluble recombinant human Bax // Protein Exp. Purif. 1998. - Vol. 13. - P. 120-126.

212. Li H, Zhu H, Xu C.J. and Yuan J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis // Cell. 1998. - Vol. 94.-P. 491-501.

213. Li J.H, Rosen D, Ronen D. et. al. The regulation of CD95 ligand expression and function in CTL // J. Immunol. 1998. - Vol. 161. - P. 3943-3947.

214. Li L.Y, Luo X., Wang X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria // Nature. 2001. - Vol. 412. - N. 6842. - P. 2729.

215. Li X, Gong J, Feldman E. et.al. Apoptotic Cell Death During Treatment of Leukemias // Leukemia and Lymphoma. 1994. - Vol. 13. - P. 65-70.

216. Liming P, Bradley C.J, Liu J.J. The correlativity analysis of six methods of detecting apoptosis // Chin Med Sci J. 1999. - Vol. 14. -N. 3. - P. 145-151.

217. Lin K, Sherrington P.D, Dinnis M. et.al. Relationship between p53 dysfunction, CD38 expression, and IgV(H) mutation in chronic lymphocytic leukemia //Blood. -2002. -Vol. 100.-P. 1404-1409.

218. Linette G.P, Li Y, Roth K, Korsmmeyer S.J. Cross talk between cell death and cell cycle progression: Bcl-2 regulated NFAT-mediated activation // Proc Natl Acad Sci USA. 1996. - Vol. 93. - P.9545-9552.

219. List A.F. Role of multidrug resistance and its pharmacological modulation in acute myeloid leukemia // Leukemia. 1996. - Vol. 10. - P. 937-942.

220. Lithgow T, van Driel R, Bertram J.F, Strasser A. The protein product of the oncogen bcl-2 is a component of the nuclear envelope, the endoplasmicreticulum and the outer mitochondrial membrane // Cell Growth Differ. 1994. -Vol. 5.-P.411-417.

221. Liu J.H., Wei S., Lamy T. et.al. Blokade of Fas-dependent apoptosis by soluble Fas in LGL leukemia // Haematology. 2002. - Vol. 100. -P. 1449-1453.

222. Liu X., Li P., Widlak P. et.al. The 40-kDa subunit of DNA fragmentation factor induced DNA fragmentation and chromatin condensation during apoptosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. - P.8461-8466.

223. Liu X., Zou H., Slaughter C., Wang X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis//Cell. 1997.-Vol. 89.-P. 175-184.

224. Liu X., Zou H., Widlak P. et.al. Activation of the apoptotic endonuclease DFF40 (caspase-activated DNase or nuclease) // J Biol Chem. 1999. - Vol. 74. - P.13836-13840.

225. Lorenzo H.K. and Susin S.A. Mitochondrial effectors in caspase-independent cell death//FEBS Lett.-2004.-Vol. 557.-N. 1-3.-P. 14-20.

226. Los M., Herr I., Friesen C., Debatin K.M. Cross-resistance of CD95- and drug-induced apoptosis as a consequence of deficient activation of caspases (ICE/Ced-3 proteases) // Blood. 1997. - Vol. 90. - P.3118-3129.

227. Los M., Neubuser D., Coy J.F. et.al. Functional characterization of DNase X, a novel endonuclease expressed in muscle cells // Biochemistry. 2000. - Vol. 39.-P. 7365-7373.

228. Los ML, van de Craen M., Perming et. al. Requirement of an ICE/Ced-3 protease for Fas/Apo-1 mediated apoptosis // Nature. 1995. - Vol. 375. -P. 8183.

229. Low R.L. Mitochondrial Endonuclease G function in apoptosis and mtDNA metabolism: a historical perspective // Mitochondrion. 2003. - Vol. 4. - P. 225-236.

230. Lowe S.W., Bodis S., McClatchey A. et.al. p53 status and efficacy of cancer of therapy in vivo // Science. 1994. - Vol. 266. - P.807-813.

231. Lozano G., Momtes de Oca Luna R. MDM2 function // Biochim Biophys Acta. 1998. - Vol. 1377. - N.2. - P.55-59.

232. Luo X., Budihardjo I., Zou H. et.al. Bid, a Bcl2 nteracting protein, mediates cytochrome с release from mitochondria in response to activation of cell surface death receptors // Cell. 1998. - Vol. 94. - P. 481^190.

233. MacDonald H.R., Bommhardt U., Cerottini J.C. Developmentally regulated expression of P-glycoprotein (multidrug resistance) activity in mouse thymocytes // Eur J Immunol. 1995. - Vol. 25. - No.5. - P. 1457-1460.

234. Maestro R., Gloghini A., Doglioni C. et.al. Human Non-Hodgkin's lymphomas overexpress a wild-type form of p53 which is a functional transcriptional activator of the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 // Blood. 1997. - Vol. 89.-N. 7. -P.2523-2528.

235. Mahajan N.P., Linder K., Berry G. et.al. Bcl-2 and Bax interactions in mitochondria probed with green fluorescent protein and fluorescence resonance energy transfer // Nat. Biotechnol. 1998. - Vol. 16. - P. 547-552.

236. Makin G., Hicman J.A. Apoptosis and cancer chemotherapy // Cell Tissue Res. -2000. Vol.301. - P. 143-152.

237. Mao P.L., Jiang Y., Wee B.Y., Porter A.G. Activation of caspase-1 in the nucleus requires nuclear translocation of pro-caspase-1 mediated by its prodomain // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. - P. 23621-23624.

238. Marani M., Tenev Т., Hancock D. et.al. Identification of novel isoforms of the BH3 domain protein Bim which directly activate Bax to trigger apoptosis // Mol. Cell. Biol. 2002. - Vol. 22. - P. 3577-3589.

239. Mariani S.M., Matiba В., Krammer PH. Regulation of cell surface APO-l/Fas (CD95) ligand expression by metalloproteinases // Eur J Immunol. 1995. -Vol. 25. - P.2303-2307.

240. Marie J.P. Drug resistance in hematologic malignancies // Curr Opin Oncol. 2001. - Vol. 13. -N. 6. - P. 463-469.

241. Marie J.P. Drug resistance in hematologic malignancies // Curr Opin Oncol. -2001.-Vol. 13.-N.6.-P. 463-469.

242. Marks D.I., Kurz B.W., Link M.P. et.al. High incidence of p53 inactivation in poor outcome childhood acute lymphoblastic leukemia at diagnosis // Blood. -1996. Vol. 87.-N.3.-P. 1155-1161.

243. Martin D.A., Siegel R.M., Zheng L., Lenardo M.J. Membrane oligomerization and cleavage activates the caspase-8 (FLICE/MACHalphal) death signal // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. - P. 4345-4349.

244. Maslak P., Hegewisch-Becker S., Godfrey L., Andreff M. Flow Cytometric Determination of the Multidrug-Resistant Phenotype in Acute Leukemia // Cytometry.-1994.-Vol. 17. -N. 1. -P. 84 93.

245. Matsuyama S. and Reed J.C. Mitochondria-dependent apoptosis and cellular pH regulation // Cell Death Differ. 2000. - Vol. 7. - P. 1155-1165.

246. May P. and May E. Twenty years of p53 research: structural and functional aspects of the p53 protein. //Oncogene. 1999. - Vol.18. - P.7621-7636.

247. Mazel S., Burtrum D., Petrie H.T. Regulation of cell division cycle progression by Bcl-2 expression: a potential mechanism for inhibition of programmed cell death // J Exp Med. 1996. - Vol. 183. -N.5. - P. 2219-2226.

248. McCarthy N.J., Whyte M.K., Gilbert C.S., Evan G.I. Inhibition of Ced-3/ICE-related proteases does not prevent cell death induced by oncogenes, DNA damage, or the Bcl-2 homologue // Bak. J. Cell Biol. 1997. - Vol. 136. -P.215-227.

249. McConkey D.J., Chandra J., Wright S. et.al. Apoptosis sensitivity in chronic lymphocytic leukemia is determined by endogenous endonuclease content andrevative expression of BCL-2 and BAX // J. Immunol. 1996. - Vol. 156. -N.7.-P. 26-24-2630.

250. McDonnell J.M, Fushman D, Milliman C.L. et.al. Solution structure of the proapoptotic molecule BID: A structural basis for apoptotic agonists and antagonists // Cell. 1999. - Vol. 96. - P.625-634.

251. Mcllroy D, Tanaka M, Sakahira H. et.al. An auxiliary mode of apoptotic DNA fragmentation provided by phagocytes // Genes Dev. 2000. - Vol. 14. - P. 549-558.

252. Medema J.P, Borst J. T-cell signalling: a decision of life and death // Hum Immunol. -1999. Vol. 60. - No. 5. -P.403-411.

253. Medema J.P, Scaffidi C, Kischkel F.C. et.al. FLICE is activated by association with the CD95 death-inducing signaling complex (DISC) // EMBO J. 1997. -Vol. 16.-P. 2794-2804.

254. Meijerink J.P, Mensink E.J, Wang K. et.al. Haematopoietic malignancies demonstrate loss-of-function mutations of Bax // Blood. 1998. - Vol.91. -N.8.-P. 2991-2997.

255. Menendez P, Vargas A, Buino C. et.al. Quantitative analysis of bcl-2 expression in normal and leukemic human B-celldifferentiation // Leukemia. -2004.-Vol. 18.-N. 3. -P. 491-498.

256. Merino R, Ding L, Veis D.J. et.al. Developmental regulation of the Bcl-2 proteins and susceptibility to cell death in В lymphocytes // EMBO J. -1994. -Vol. 13.-N.3.-P. 683-691.

257. Meyn R.E, Stephens L.C, Hunter N.R. et al. Apoptosis in murine tumors treated with chemotherapy agents // Anticancer Drugs. 1995. - Vol. 6. - P. 443.

258. Micheau O. and Tschopp J. Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two sequential signaling complexes // Cell. 2003. - Vol. 114. - P. 181-190.

259. Miramar M.D., Costantini P., Ravagnan L. et.al. NADH oxidase activity of mitochondrial apoptosis-inducing factor // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. -P. 16391-16398.

260. Mitamura S., Ikawa H., Mizuno N. et.al. Cytosolic nuclease activated by caspase-3 and inhibited by DFF-45 // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1998. Vol. 243. - P. 480-484.

261. Mitsiades C.S., Treon S.P., Mitsiades N. et.al. TRAIL/Apo2L ligand selectively induces apoptosis and overcomes drug resistance in multiple myeloma: therapeutic applications // Blood. 2001. - Vol. 98. -N. 3. - P. 795-804.

262. Miyawaki Т., Uehara Т., Nibu R. et. al. Differential expression of apoptosis-related Fas antigen on lymphocyte subpopulations in human peripheral blood // J Immunol. 1992. - Vol. - 149. - No. 11. - P. 3753-3758.

263. Molica S., Mannella A., Dattilo A. et.al. Differential expression of Bcl-2 oncoprotein and Fas antigen on normal peripheral blood and leukemic bone marrow cells. A flow cytometric analysis // Haematologica. 1996. - Vol. 81. -P. 302-309.

264. Momand J., Zambetti G.P., Olson D.C.et.al. The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation // Cell. 1992. - Vol. 69. - N.7. - P. 1237-1245.

265. Mongini P.K.-A., Jackson A.E., Tolani S. et.al. Role of Complement-Binding CD21/CD19/CD81 in Enhancing Human В Cell Protection from Fas-Mediated Apoptosis // J. Immunol. 2003. - Vol. 171. - P. 5244-5254.

266. Muchmore S.W., Sattler M., Liang H. et.al. X-ray and NMR structure of human Bcl-xL, an inhibitor of programmed cell death // Nature. 1996. - Vol. 381. -P. 335-341.

267. Mufti G.J., Galton D.A. Myelodysplastic syndromes: natural history and features of prognostic importance // Clin. Haematol. 1986. - Vol. 15. - P.953.971.

268. Mundle S, Iftikhar A, Shetty V. et.al. // Cell Death Different. 1994. - Vol. 1,N1.-P. 117-122.

269. Muschen M, Re D, Jungnickel B. et.al. Somatic mutation of the CD95 gene in Human В cells as a side-effect of the germinal center reaction // J Exp Med. -2000. Vol. 192. -N. 12. - P. 1833-1839.

270. Muzio M, Stockwell B.R, Stennicke H.R. et.al. An induced proximity model for caspase-8 activation // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. - P. 2926-2930.

271. Nagata S. Apoptosis by death factor // Cell. 1997. - Vol. 88. - P. 355-365.

272. Nagata S. Apoptotic DNA fragmentation // Exp Cell Res. 2000. - Vol. 256. -P.12-18.

273. Nagata S, and Golstein P. The Fas death factor // Science. 1995. - Vol. 267. -P. 1449-1456.

274. Nakamura H, Inokuchi K, Yamaguchi H. and Dan K. Abnormalities of p51, p53, FLT3 and N-ras Genes and Their Prognostic Value in Relapsed Acute Myeloid Leukemia // J Nippon Med Sch. 2004. - Vol. 71. - N.4. - P.270-276.

275. Newcomb E.W. p53 gene mutations in lymphoid diseases and their possible relevance to drug resistance // Leuk. Lymphoma. 1995. - Vol.17. - P. 211221.

276. Nguyen J.T. and Wells J. A. Direct activation of the apoptosis machinery as a mechanism to target cancer cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. -Vol. 100. - P.7533-7538.

277. Nguyen M, Millar D.G, Yong V.W. et.al. Targeting of Bcl-2 to the mitochondrial outer membrane by a COOH-terminal signal anchor sequence // J Biol Chem. 1993. - Vol. 286. - P. 25265-25268.

278. Nicholson D.W. Caspase structure, proteolytic substrates, and function during apoptotic cell death // Cell Death Differ. 1999. - Vol. 6. - P. 1028-1042.

279. Nishitoh N., Saitoh M., Mochida Y. et al. ASK1 Is Essential for JNK/SAPK Activation by TRAF2 // Molecular Cell. 1998. - Vol. - 2. - P. 389-395.

280. Nomdedeu J.F., Lete I., Baiget M. et.al. Mutational analysis of p53 in 16 cases of acute lymphoblastic leukaemia and Burkitt's lymphoma // Haematologica. -1997.-Vol. 82.-P.550-554.

281. Nomura M., Shimizu S., Sugiyama T. et.al. 14-3-3 interacts directly with and negatively regulates pro-apoptotic Bax // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. -P. 2058-2065.

282. Norgaard J.M., Hokland P. Biology of multiple drug resistance in acute leukemia // Int J Hematol. 2000. - Vol. 72. - N. 3. - P. 290-297.

283. Nowicki M., Miskowiak В., Kaczmarek-Kanold M. Correlation between early treatment failure and Ki-67 antigen expression in blast cells of children with acute lymphoblastic leukaemia before commencing treatment // Oncology.2002.-Vol. 62.-N. 1.-P. 55-59.

284. Ohta K., Iwai K., Kasahara Y. et.al. Immunoblot analysis of cellular expression of Bcl-2 family proteins, Bcl-2, Bax, Bcl-x and Mcl-1, in human peripheral blood and lymphoid tissue // Int Immunol. 1995. - Vol. 7. - N. 11. - P. 18171825.

285. Park Y.C., Jeong J.H., Park K.J. et.al. Sulindac activates nuclear translocation of AIF, DFF 40 and endonuclease G but not induced oligonucleosomal DNA fragmentation in HT-29 // Life Sci. 2005. - Vol. 77. - N. 16. - P. 2059-2070.

286. Pastorino J.G., Chen S.T., Tafani M. et.al. The overexpression of Bax produces cell death upon induction of the mitochondrial permeability transition // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. -P.7770-7775.

287. Pepper C., Bentley P., Hoy T. Regulation of clinical chemoresistance by bcl-2 and bax oncoproteins in B-cell chronic lymphocytic leukaemia // Br J Haematol. 1996.-Vol. 95.-P. 513-517.

288. Pepper С., Hoy Т., Bentley D.P. Bcl-2/Bax ratios in chronic lymphocytic leukaemia and their correlation with in vitro apoptosis and clinical resistance // Br J Cancer. 1997. - Vol. 76. - N. 7. - P. 935-938.

289. Pepper C., Thomas A., Hoy T. et.al. Flavopiridol circumvents Bcl-2 family mediated inhibition of apoptosis and drug resistance in В cell chronic lymphocytic leukaemia // Br J Haematol. 2001. - Vol. 114. - P. 70-77.

290. Peter M.E and Krammer P-H. Mechanisms of CD95 (APO-l/Fas)-mediated apoptosis // Current Opinion in Immunology. 1998. - Vol. 10. - P. 545-551.

291. Peter M.E. and Krammer P.H. The CD95 (APO-l/Fas) DISC and beyond // Cell Death Differ. 2003. - Vol. 10. - P. 26-35.

292. Pettitt A.R., Sherrington P.D., Stewart G. et.al. Mechanism of action of purine analogues in chronic lymphocytic leukemia // Br J Haematol. 2003. - Vol. 121.-P. 692-702.

293. Pituch-Noworolska A., Hajto В., Balwierz W., Klus K. Induction of apoptosis and bcl-2 expression in acute lymphoblastic leukaemia and non-Hodgkin's lymphoma in children //Haematologia. 2001.-Vol. 31.-N. 3.-P. 191-207.

294. Plas D.R., Rathmell J.C. and Thompson C.B. Homeostatic control of lymphocyte survival: potential origins and implications // Nature Immunology. -2002.-Vol. 3.-No. 6. -P.515-521.

295. Plumas J., Jacob M.C., Chaperot L. et.al. Tumor В cells from Non-Hodgkins lymphoma are resistant to CD95 (Fas/Apo-l)-mediated apoptosis // Blood. -1998.-Vol. 91.-N. 8. -P.2875-2885.

296. Poapolathep A., Nagata Т., Suzuki H., et. al. Development of early apoptosis and changes in lymphocyte subsets in lymphoid organs of mice orally inoculated with nivalenol // Exp Mol Pathol. 2003. - Vol 75. - No. 1. - P. 74-79.

297. Poommipanit P.B., Chen B. and Oltvai Z.N. Interleukin-3 induces the phosphorylation of a distinct fraction of bcl- 2 // J. Biol. Chem. 1999. -Vol. 274.-P. 1033-1039.

298. Powell W.C., Fingleton В., Wilson C.L. et al. The metalloproteinase matrilysin proteolytically generates active soluble Fas ligand and epithelian cell apoptosis // Curr Biol. 1999. - Vol.9. - P.1441-1447.

299. Prives C. Signaling to p53: breaking the MDM2-p53 circuit // Cell. 1998. -Vol. 95. -N.l. -P.5-8.

300. Puthalakath H. and Strasser A. Keeping killers on a tight leash: transcriptional and post-translational control of the pro-apoptotic activity of ВНЗ-only proteins // Cell Death Differ. 2002. - Vol. 9. - P. 505-512.

301. Puthalakath H., Huang D.C., O'Reilly L.A. et.al. The proapoptotic activity of the Bcl-2 family member Bim is regulated by interaction with the dynein motor complex // Mol. Cell. 1999. - Vol. 3. - P. 287-296.

302. Rabizadeh E., Bairy O., Yeshorn M., et.al. In: VII Intern. Workshop on CLL. -Conde-sur-Noireau: Springer-Verlag, Imprimerie Corlet. 1997. - P. 28.

303. Reed J.C. Bcl-2 family proteins // Oncogene. 1998. - Vol.17. - P. 32253236.

304. Regulation of T-cell apoptosis by reactive oxygen species // Free Radic Biol Med. -2004. Vol. 36. - No. 12. - P. 1496-1504.

305. Renner S, Weisz J, Krajewski S. et.al. Expression BAX in plasma cell dyscrasias // Clin Cancer Res. 2000. - Vol. - N. 6. - P. 2371-2380.

306. Robertson J.D, Orrenius S, Zhivotovsky B. Review: nuclear events in apoptosis // J. Struct. Biol. 2000. - Vol. 129. - P. 346-358.

307. Robertson M.J, Manley T.J, Pichert G. et.al. Functional consequences of APO-lFas(CD95) antigen expression by normal and neoplastic haematopoietic cells//Leuk Lymphoma.- 1995.-Vol. 17.-N. 1-2.-P.51-61.

308. Robillard N, Pellat-Deceunynck C, Bataille R. Phenotypic characterization of the human myeloma cell growth fraction // Blood. 2005. - Vol. 105. - N. 12. P. 4845-4848.

309. Rochard P, Galiegue S, Tinel N, et. al. Expression of the peripheral benzodiazepine receptor triggers thymocyte differentiation //Gene Expr. -2004. Vol.12. - No. 1. - P. 13-27.

310. Rodolico V, Martorana A, Gulotta G. et.al. Prognostic Significance of Standartilized AgNOR Analysis and Ki-67 Immunostaning in Gastrointestinal Stromal Tumors // Analit Quant Cytol Histol. 2003. - Vol.25. - N.4. - P. 199209.

311. Romano C, De Fanis U, Sellitto A. et.al. Induction of CD95 upregulated does not render chronic lymphocytic leukemia B-cells susceptible to CD95-mediated apoptosis // Immunol Lett. 2005. - Vol. 97. -N. 1. - P. 131-139.

312. Sahara S, Aoto M, Eguchi Y. et.al. Acinus is a caspase-3-activated protein required for apoptotic chromatin condensation. Nature. - 1999. - Vol. 401.1. P. 168-173.

313. Sakahira H., Enari М., Nagata S. Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis // Nature. 1998. - Vol. 391. - P. 9699.

314. Sakahira H., Enari M., Ohsawa Y. et.al. Apoptotic nuclear morphological change without DNA fragmentation // Current Biology. 1999. - Vol. 9. - P. 543-546.

315. Sanches-Beato M., Saez A.I., Navas I.C., et.al. Overall Survival in Aggressive B-Cell Lymphomas Is Dependent on the Accumulation of Alterations in p53, pi 6, and p27 // American J Pathol. -2001. -Vol. 159.-N. 1.-P. 205-213.

316. Sanchez-Beato M., Sanchez-Aguilera A., Piris MA. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas//Blood. -2003. Vol. 101. - P. 1220-1235.

317. Sankar M., Tanaka K., Kumaravel T.S. et.al. Identification of a commonly deleted region at 17pl3.3 in leukemia and lymphoma associated with 17p abnormality // Leukemia. 1998. - Vol.4. - P.510-516.

318. Santori F.R., Vukmanovic S. Delineations of signals required for thymocyteft,positive selection // J Immunol. 2004. - Vol. 173. - No.9. - P. 5517-5523.

319. Sato Т., Hanada M., Bodrug S. et.al. Interaction among members of the Bcl-2 protein family analyzed with a yeast two-hybrid system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 9238-9242.

320. Sattler M., Liang H., Nettesheim D. et.al. Structure of bcl-XL-Bak peptide complex: Recognition between regulators of apoptosis // Science. 1997. -Vol. 275. -N.5302. - P. 983-986.

321. Scaffidi C., Fulda S., Srinivasan A. et.al. Two CD95 (APO-l/Fas) signaling pathways // EMBO J. 1998. - Vol. 17. - P. 1675-1687.

322. Schafer P., Scholz S.R., Gimadutdinow O. et.al. Structural and functional characterization of mitochondrial Endo G, a sugar non-specific nuclease which plays an important role during apoptosis // J Mol Biol. 2004. - Vol. 338. - N. 2.-P. 217-228.

323. Schendel S.L., Montal M., Reed J.C. Bcl-2 family proteins as ion-channels //

324. Cell Death Differ. 1998. - Vol. 5. - P. 372-380.

325. Schendel S.L, Xie Z, Montal M.O. et.al.Charmel formation by antiapoptotic protein Bcl-2//Proc. Natl. Acad. Sci. 1997.-Vol. 94.-P. 5113-5118.

326. Schenka A.A, Muller S, Fournie J.J. et.al. CD4+ T Cells Downregulate Bcl-2 in Germinal Centers // J Clin Immunol. 2005. - Vol. 25. - N. 3. - P. 224-229.

327. Schimmer A.D, Hedley D.W, Penn L.Z, Minden M.D. Receptor- and mitochondrial-mediated apoptosis in acute leukemia: a translation view // Blood. 2001. - Vol. 98. - N. 13. - P. 3541-3553.

328. Schinzel A, Kaufmann T, Borner C. Bcl-2 family members: integrators of survival and death signals in physiology and pathology // Biochim. Biophys. Acta. 2004a. - Vol. 1644. - P.95-105.

329. Schinzel A, Kaufmann T, Schuler M. et.al. Conformational control of Bax localization and apoptotic activity by Pro 168 // J. Cell Biol. 2004b. - Vol. 164.-P. 1021-1032.

330. Schlesinger P.H, Gross A, Yin X.M. et.al. Comparison of the ion channel characteristics of proapoptotic BAX and antiapoptotic BCL-2 // Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. - Vol. 94. - P. 11357-11362.

331. Schulze-Osthoff K, Ferrari D, Los M. et.al. Apoptosis signaling by death receptors // Eur. J. Biochem. 1998. - Vol.254. - P.439-459.

332. Schwarting R, Gerdes J, Niehus J. et.al. Determination of the growth fraction in cell suspensions by flow cytometry using the monoclonal antibody Ki-67 // J Immunol Methods. 1986. - Vol.90. -N.l. - P.65-70.

333. Sedlak T.W, Oltvai Z.N, Yang E. et.al. Multiple Bcl-2 family members demonstrate selective dimerizations with Bax // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. -Vol. 92. -P.7834-7838.

334. Selleri C, Sato T, Anderson S. et.al. Interferon-g and tumor necrosis factor-a suppress both early and palate stages of hematopoiesis and induce programmed cell death // J Cell Physiol. 1995. - Vol. 165. - P. 538,

335. Selleri C, SatoT, Del Vecchio L. Involvement of Fas-Mediated Apoptosis in the nhibitory Effects of Interferon-a in Chronic Myelogenous Leukemia // Blood. 1997. - Vol. 89. -N. 3. - P. 957-964.

336. Sellitto A., De Fanis U., Romano C. et.al. Direct or reverse correlations within the expression of activation, differentiation or T-B cooperation molecules on chronic lymphocytic leukemia В cells //

337. Sheard M.A., Liu C., Takahama Y. Developmental status of CD4-CD8+and CD4+CD8~ thymocytes with medium expression of CD3 // Eur J Immunol. -2004. Vol. 34. -No.l. -P. 25-35.

338. Sheen-Chen S.M., Chen H.S., End H.L. Chen W.J. Circulating soluble Fas in patients with breast cancer // World J. Surg. 2003. - Vol. 27. - P. 10-13.

339. Sherr С.J. The Pezcoller Lecture: Cancer Cell Cycles Revisitied // Cancer Res.- 2000. Vol. 60. - P. 3689-3695.

340. Sherr C.J. Tumor surveillance via the ARF-p53 pathway // Genes Dev. 1998. -Vol. 12. -N.19. -P.2984-2991.

341. Shimazaki K., Ohshima K., Suzumiya J. Evaluation of apoptosis as a prognostic factor in myelodysplastic syndromes // Br J Haematol. 2000. - Vol. 110. - N. 3.-P. 584-590.

342. Shinomiya N., Shinomiya M., Wakiyama H. et al. Enhancement of CDDP cytotoxity byy caffeine is characterized by apoptotic cell death // Exp Cell Res.- 1994.-Vol. 210.-P. 236.

343. Shiokawa D. and Tanuma S. Molecular cloning and expression of a cDNA encoding an apoptotic endonuclease DNase gamma // Biochem. J. 1998. -Vol. 332 (Pt.3).-P. 713-720.

344. Shiraki K., Tsuji N., Shioda T. et. al. Expression of Fas ligand in liver metastases of human colonic adenocarcinomas // PNAS. 1997. - Vol.94. - P. 6420-6425.

345. Simonian P.L., Grillot D.A., Andrews D.W. et.al. Bax homodimerization is not required for bax to accelerate chemotherapy-induced cell death // J Biol Chem.- 1996. Vol. 271. - N. 50. - P. 32073-32077.

346. Singh S.S., QaqishB., Johnson J.L. et.al. Sampling Strategy for Prostate Tissue Microarrays for Ki-67 and Androgen Receptor Biomarkers // Analit Quant Cytol Histol. 2004. - Vol.26. -N.4. - P. 194-200.

347. Sjostrom J., Blomqvist C., von Boguslawski K., et.al. The predictive value of bcl-2, bax, bcl-xL, bag-1, fas, and fasL for chemotherapy response in advanced breast cancer // Clin Cancer Res. 2002. - Vol. 8. - P. 811-816.

348. Slee E.A., O'Connor D.J., Lu X. To die or not to die: how does p53 decide? Oncogene.-2004.-Vol. 23.-P. 2809-2818.

349. Slingerland J.M., Minden M.D., Benchimol S. Mutation of the p53 gene in human acute myelogenous leukaemia // Blood. 1991. - Vol.77. - N.7. -P.500-507.

350. Sonneveld P. Multiple Myeloma and Related Disorders // Eds. F.Dammaco, B.Barlogie. Rome: Ares-Serono Symposia Publications. - 1994. - P. 107-114.

351. Soussi T. p53 antibodies in the sera of patients with various types of cancer: a review // Cancer Res. 2000. - Vol. 60. - P. 1777-1788.

352. Sprent J. Proving negative selection in the thymus // J Immunol. 2005. -Vol. - 174. - No. 7. - P.3841-3842.

353. Stock W., Tsai Т., Golden S. et.al. Cell cycle regulatory gene abnormalities are important determinants of leukemogenesis and disease biology in adult acute lymphoblastic leukemia // Blood. 2000. - Vol. 95. - N.7. - P. 2364-2371.

354. Strasser A., Harris A.W., Huang D.C. et.al. Bcl-2 and Fas/APO-1 regulate distinct pathways to lymphocyte apoptosis // EMBO J. 1995. - Vol.14. -No.24. -P.6136-6147.

355. Straus S.E., Jaffe E.S., Puck J.M. et.al. The development of lymphomas in families with autoimmune lymphoproliferative syndrome with germline Fasmutations and defective lymphocyte apoptosis // Blood. 2001. - Vol. 98. - N. l.-P. 194-200.

356. Sturm I., Bosanquet A.G., Hermann S. et.al. Mutation of p53 and consecutive selective drug resistance in B-CLL occurs as a consequence of prior DNA-damaging chemotherapy // Cell Death and Deffer. 2003. - Vol. 10. - P. 477484.

357. Styczynski J and Wysocki M. Differences in significance of drug resistance mechanisms between adult and childhood acute lymphoblastic leukemia // Haematologia. 2002. - Vol. 32. - N. 4. - P. 313-325.

358. Suda Т., Okazaki Т., Naito Y. et al. Expression of the Fas ligand in the of T cell lineage // J Immunol. 1995. - Vol.154. - P.3806-3813.

359. Suda Т., Takahashi Т., Golstein P. and Nagata S. Molecular cloning and expression of the Fas ligand: a novel member of the tumor necrosis factor family//Cell. 1993. - Vol.75. - P.l 169-1178.

360. Sun E.W., Shi Y.F. Apoptosis: the quiet death silences the immune system //Ы

361. Pharmacol Ther. -2001. Vol. 92. -N. (2-3). -P. 135-145.

362. Susin S.A., Daugas E., Ravagnan L. et.al. Two Distinct Pathways Leading to Nuclear Apoptosis // J. Exp. Med. 2000. - Vol. 192. -P. 571-580.

363. Susin S.A., Lorenzo H.K., Zamzami N. et.al. Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor // Nature. 1999. - Vol. 397. - P. 441446.

364. Sutton V.R., Davis J.E., Cancilla M. et.al. Initiation of apoptosis by granzyme В requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation // J. Exp. Med. 2000. - Vol. 192. -P. 1403-1414.

365. Swerdlow A.J. Epidemiology of Hodgkin's disease and non-Hodgkin's lymphoma // Europ J Nucl Med Mol Imaging. 2003. - Vol. 30. - P. S3-S12.

366. Takahashi A., Alnemli E.S. Lazebnik Y.A. Cleavage of lamin A by Mch2a but not CPP32: Multiple interleukin 1 P-converting enzyme -related proteases with disting substrate recognition properties are active inqapoptosis // Proc. Natl.

367. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93. - P. 8395-8400.

368. Tanaka M, Suda T, Haze К. Fas ligand in human serum // Nat.Med. 1996. -Vol.2.-P.317-322.

369. Tang D. and Kidd V.J. Cleavage of DFF-45/ICAD by multiple caspases is for its function during apoptosis // J. Biol. Chem. 1998. - Vol.273. - P.28549-28552.

370. Tang R, Faussat A.M., Majdak P. et.al. Valproic acid inhibits proliferation and induces apoptosis in acute myeloid leukemia cells expressing P-gp and MRP1 // Leukemia. 2004. - Vol. 18. - N.7. - P. 1246-1251.

371. Tewari M. and Dixit V.M. Fas- and tumor necrosis factor induced apoptosis in inhibited by the poxvirus crmA gene product // J.Biol.Chem. -1995. Vol. 270. - P. 3255-3260.

372. Thomas A, El Rouby S, Reed J.C. et.al. Drug-induced apoptosis in B-cell chronic lymphocytic leukemia: Relationship of p53 gene mutation, bcl-2/bax proteins in drug resistance // Oncogen. 1996. - Vol. 12. - P. 1055-1061.

373. Thomas D, Du C, Xu M. et.al. DFF45/ICAD can be directly process by granzyme В during the induction of apoptosis // Immunity. 2000. - Vol. 12. -P. 621-632.

374. Thompson C.B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease // Science. 1995. - Vol. 267. - P. 1456-1462.

375. Thornberry N.A. and Lazebnik Y. Caspases: enemies within // Science. 1998. -Vol. 281.-P.1312-1316.

376. Trauth B.C., Klas C, Peters A.M., et al. Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis // Science. -1989. -Vol.245.-P.301-305.

377. Tsangaris G.T, Moschovi M, Mikraki V. et al. Study of apoptosis in peripheral blood of patients with acute lumphoblastic leukemia during induction therapy. // Anticancer Research. 1996. - Vol. 16 - P. 3133-3140.

378. Tsujimoto Y., Gorham J., Cossman J. et.al. The t(14;18) chromosome translocations inviolved in B-cell neoplasms result from mistakes in VDJ joining // Science. 1985. - Vol. 229. - P. 1390-1395.

379. Tsurusawa M., Aoyama M., Saeki K., Fujimoto T. Cell cycle kinetics in childhood acute leukaemia studied with in vitro bromodeoxyuridine labelling, Ki-67-reactivity, and flow cytometry // Leukemia. 1995. - Vol.9. - N.l 1. - P. 1921-1925.

380. Tsurusawa M., Fujimoto T. Cell cycle progression and phenotypic modification of Ki67 antigen-negative Gl- and G2-phase cells in Phorbol ester-treated Molt-4 human leukaemia cells // Cytometry. 1995. - Vol. 20. - N.2. -P.146-153.

381. Tsurusawa M., Saeki K., Katano N., Fujimoto T. Bcl-2 expression and prognosis in childhood acute leukemia. Children's Cancer and Leukemia Study Group //Pediatr Hematol Oncol. 1998. - Vol. 15. -N. 2. - P. 143-155.

382. Turkina A.G., Logacheva N.P., Stromskaya T.P. et. al. Studies of some mechanisms of drug resistace in chronic myeloid leukemia (CML) // Adv Exp Med Biol. 1999. - Vol. 457. - P. 477-488.

383. Urbano A., McCaffrey R., Foss F. Isolation and characterisation of NUC70, a cytoplasmic, haematopoietic apoptotic endonuclease // J. Biol. Chem. 1998. -Vol. 273.-P. 34820-34827.

384. Varfolomeev E.E. and Ashkenazi A. Tumor necrosis factor: an apoptosis JuNKie? // Cell. 2004. - Vol. 116. - P. 491-497.

385. Varkey J, Chen P, Jemmerson R, Abrams J.M. Altered cytochrome с display precedes apoptotic cell death in Drosophila // J. Cell Biol. 1999. - Vol. 144. -P. 701-710.

386. Vilpo J, Koski T, Vilpo L. Calcium antagonists potentiate P-glycoprotein-independent anticancer drugs in chronic lymphocytic leukemia cells in vitro // Haematologica. -2000. Vol. 85. -N. 8. - P. 806-813.

387. Vollunger A., Egle A, Marschitz I. et al. Constitutive expression of Fas (Apo-1/CD95) ligand on multiple myeloma cells: a potential mechanism of tumor-induced suppression of immune surveillance // Blood. 1997. - Vol. 90. - P. 1220.

388. Volm M., Zintl F, Sauerbrey A. et.al. Proliferation and apotosis in newly diagnosed and relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia // Anticancer Res. 1999. - Vol. 19. - P. 4327-4332.

389. Wada M, Bartram C.R, Nakamura H. et.al. Analysis of p53 mutations in a large series of lymphoid malignancies of childhood // Blood. 1993. - Vol. 82. -P. 3163-3168.

390. Wajant H. Death receptors // Essays Biochem. 2003. - Vol. 39. - P. 53-71.

391. Walker P.R, Saas P., Diettich P.Y. Tumor expression of Fas ligand (CD95L) and the consequences // Curr Opin Immunol. 1998. - Vol.10. - P.564-572.

392. Walker P.R. and Sikorska M. New aspects of the mechanism of DNA fragmentation in apoptosis // Biochem. Cell Biol. 1997. - Vol. 75. - P. 287299.

393. Walker P.R, Saas P, Dietrich P.Y. Role of Fas ligand (CD95L) in immune escape // J.Immunology. 1997. - Vol. 158. - P.4521-4524.

394. Walker P.R., Smith С., Yoydale Т. et al. Topoisomerase II-reactive chemotherapeutic drugs induce apoptosis in thymocytes // Cancer Res. 1991. -Vol. 51.-P. 1078-1085.

395. Wallach D., Kovalenko A.V., Varfolomeev E.E., Boldin M.P. Death-inducing functions of ligands of the tumor necrosis factor family: a Sanhedrin verdict // Curr. Opin. Immunol. 1998. - Vol. 10. - P. 279-288.

396. Wang K., Gross A., Waksman G., Korsmeyer S.J. Mutagenesis of the BH3 domain of BAX identifies residues critical for dimerization and killing // Mol. Cell Biol. 1998. - Vol. 18. - P. 6083-6089.

397. Wang K., Yin X.M., Chao D.T. et.al. BID: A novel BH3 domain-only death agonist // Genes & Dev. 1996. - Vol. 10. - P. 2859-2869.

398. Wang X. The expanding role of mitochondria in apoptosis agonist // Genes & Dev. 2001. - Vol. 15. - N.22. - P. 2922-2923.

399. Wattel E., Preudhomme C., Hecqet B. et.al. p53 Mutations Are Associated ^ With Resistance to Chemotherapy and Short Survival in Hematologic

400. Malignancies // Blood. 1994. - Vol.84. - N.9. - P.3148-3157.

401. Wickremasinghe R.G. and Hoffbrand A.V. Biochemical and genetic control of apoptosis: relevance to normal hematopoiesis and hematological malignancies //Blood. 1999. -Vol. 93. -N.ll. -P.3587-3600.

402. Widlak P. and Garrard W.T. Discovery, regulation, and action of the major apoptotic nucleases DFF40/CAD and endonuclease G // J Cell Biochem. 2005. - Vol. 94. - N. 6. - P. 1078-1087.

403. Wieder Т., Essmann F., Prokop A. etal. Activation of caspase-8 in drug-induced apoptosis of B-lymphoid cells is independent of CD95/Fas receptor-ligand interaction and occurs downstream of caspase-3 // Blood. 2001. - Vol. 97.-N. 5.-P. 1378-1387.

404. Williams O., Norton Т., Halligey M. et.al. The action of Bax and Bcl-2 on T cell selection // J Exp Med. 1998. - Vol. 188. - N. 6. - P. 1125-1133.

405. Willis S., Day C.L., Hinds M.G., Huang D.C. The Bcl-2-regulated apoptotic * pathway // J. Cell Sci. 2003. - Vol. 116. - P. 4053-4056.

406. Wojcik I., Szybka M., Golanska E. et.al. Abnormalities of the P53, MDM2, BCL2 and BAX gene in acute leukemias // Neoplasma. 2005. - Vol. 52. -N.4.-P.318-324.

407. Wolowiec D., Wozniak Z., Potoczek S. et.al. Bone Marrow Angiogenesis and Proliferation in B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia // Analyt Quant Cytol Histol. 2004. - Vol. 26. - P.263-270.

408. Wolter K.G., Hsu Y.T., Smith C.L. et.al. Movement of Bax from the cytosol to mitochondria during apoptosis // J. Cell Biol. 1997. - Vol. 139. - P. 12811292.

409. Wu G.S. and El-Deiry W.S. Apoptotic death of tumour cells correlates with chemosesitivity, independent of p53 or bcl-2 // Clin. Cancer Res. 1996. - Vol. 2. -P.623-633.

410. Wu M., Bellas R.E., Shen J., Sonenshein G.E. Roles of the tumor suppressor p53 and the cyclin-dependent kinase inhibitor p21 WAF1/CIP1 jn receptor-mediated apoptosis of WEHI231 В Lymphoma cells // J Exp Med. 1998. - Vol. 187. -N. 10.-P. 1671-1679.

411. Wu X., Bayle J.H., Olson D., Levine A.J. The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop // Genes Dev. 1993. - Vol.7. - N.7A. - P. 1126-1132.

412. WyHie A.H. Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation // Nature. 1980. - Vol. 284. - P. 555

413. Xiang J., Chao D.T., Korsmeyer S.J. BAX-induced cell death may not require interleukin 1 beta-converting enzyme-like proteases // Proc. Natl. Acad. Sci. -1996.-Vol. 93.-P. 14559-14563.

414. Yague E. and Raguz S. Drug resistance in cancer // Br J Cancer. 2005. - Vol. 93.-N. 9.-P. 973-976.

415. Yang E. and Korsmeyer S.J. Molecular thanatopsis: a discourse on the Bcl-2 family and cell death // Blood. 1996. - Vol. 88. - N.2. - P. 386-401.

416. Yin X.M., et al. Bid-deficient mice are resistant to Fas-induced hepatocellular apoptosis // Nature. 1999. - Vol.400. - P.886-891.

417. Yin X.M., Oltvai Z.N., Korsmeyer S.J. BH1 and BH2 domains of Bcl-2 are required for inhibition of apoptosis and heterodimerization with Bax // Nature. 1994. - Vol. 369. - P. 321-323.

418. Yokoyama N., Tanahashi M., Kobayashi Y., et. al. The expression of Bcl-2 family proteins (Bcl-2, Bcl-x, Bax, Bak and Bim) in human lymphocytes // Immunol Lett. -2002. Vol. - 81. No. 2. - P. 107-113.

419. Yonehara S., Ishii A., Yonehara M. A cell killing monoclonal antibody (anti-Fas) to cell surface antigen co-down-regulated with the receptor to tumor necrosis factor//J.Exp.Med. -1989. -Vol.169. -P.1747-1756.

420. Yonehara S., Nishimura Y., Kishi S., Ishii A. Expression and function of apoptosis antigen Fas on T cells in thymus and periphery // Tissue antigens. -1993. Vol.42.-N.4-P.253.

421. Yoshida A., Pourquier P., Pommier Y. Purification and characterisation of a Mg2+ dependent endonuclease (AN34) from etoposide-treated human leukaemia HL-60 cells undergoing apoptosis // Cancer Res. - 1998 - Vol. 58. -P. 2576-2582.

422. Yoshida Y. Hypothesis: apoptosis may be the mechanism responsible for the premature intramedullary cell death in the myelodysplastic syndrome // Leukemia. 1993. - Vol. 7. - P. 144-146.

423. Yoshida Y., Kawaabata H., Anzai N. Cell biology and programmed cell death in MDS.-1994.-Vol. 18.-P. 5.

424. Young Ian Т. Use of Kolmogorov-Smirnov Test for Analysis of Histograms from Flow Systems and Other Sources // J Histochem and Cytochem. 1977. -Vol. 25. -No.7. - P. 935-941.

425. Young К J, Kay L.S, Phillips M.J., Zhang L. Antitumor Activity Mediated by Double-Negative T-cells // Cancer Res. 2003. - Vol. 63. - No. 22. - P. 80148021.

426. Yunis J.J, Frizzera G, Oken M.M. et.al. Multiple recurrent genomic defects in follicular lymphoma // N Engl J Med. 1987. - Vol. 316. - P.79-84.

427. Zamzami N, Brenner C, Marzo I. et.al. Subcellular and submitochondrial mode of action of Bcl-2-like oncoproteins // Oncogene. 1998. - Vol. 16. - P. 2265-2282.

428. Zeytunn A, Hassuneh M, Nagarkatti M. et al. Fas-Fas ligand-based interactions between tumor cells and tumor-specific cytotoxic T lymphocytes: a lethal two -way street // Blood. 1997. - Vol.90. - P.1952-1959.

429. Zha H, Aime-Sempre C, Sato T, Reed J.C. Proapototic Protein Bax Heterodimerized with Bcl-2 and Homodimerized with Bax via a Novel Domain (BH3) Distinct from BH1 and BH2 // J Biol Chem. 1996. - Vol. 271. - N. 13.1. P. 7440-7444.

430. Zha J, Harada H, Osipov K. et.al. BH3 domain of BAD is required for heterodimerization with BCL-XL and pro-apoptotic activity // J. Biol. Chem. -1997. Vol. 272. - P. 24101-24104.

431. Zha J, Harada H, Yang E. et.al. Serine phosphorylation of death agonist BAD in response to survival factor results in binding to 14-3-3 not BCL-X(L) // Cell. 1996.-Vol. 87.-P. 619-628.

432. Zhang J, Liu X, Scherer D.C. et.al. Resistance to DNA fragmentation and chromatin condensation in mice lacking the DNA fragmentation factor 45 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. - P. 12480-12485.

433. Zhang J, Wang X, Bove K.E. Xu M. DNA fragmentation factor 45-deficient cells aremore resistant to apoptosis and exhibit different dying morphology than wild-type control cells // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 37450-37454.

434. Zhang J.H., Xu M. DNA fragmentation in apoptosis // Cell Res.-2000.-Vol. 10.-N. 3.-P. 205-211.

435. Zheng T.S., Schlosser S.F., Dao T. et.al. Caspese-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. - P. 13618-13623.

436. Zhivotovsky В., Burgess D.H., Schlegel J. et.al. Proteases in Fas-mediated apoptosis // J Cell Biochem. 1997. - Vol. 64. - P. 43-49.

437. Zhivotovsky В., Gahm A., Orrenius S. Two different proteases are involved in the proreolysis of lamin during apoptosis // Biochemical and biophysical communications. 1997. - Vol. 233. - P. 96-101.

438. Zhu W., Cowie A., Wasfy G.W. et.al. Bcl-2 mutants with restricted subcellular location reveal spatially distinct pathways for apoptosis in different cell types // EMBO. 1996. - Vol. 15. - P.4130-4141.

439. Zinkel S.S., Ong C.C., Ferguson D.O. et.al. Proapototic BID is required for myeloid homeostasis and tumor suppression // Genes Dev. 2003. - Vol. 17. -N. 2.-P. 229-239.