Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Регуляция взаимоотношения остеогенной и гемопоэтической тканей костного мозга

" AiiA ученую степе?:

N

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ имени академика И„П.ПАВЛОВА

ИВАСЕНКО Ирина Николаевна

РЕГУЛЯЦИЯ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ОСТЕОГЕННОЙ И ГЕМОПОЭТИЧЕСКОЙ ТКАНЕЙ КОСТНОГО МОЗГА.

14.00.29 - гематология и

переливание крови

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант -академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.А.Алмазов

Санкт-Петербург 1998

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Проблема регуляции межклеточных, и межтканевых взаимоотношений относится к числу общебиологических фундаментальных проблем. Существование взаимообусловленных и тесных взаимоотношений между остеогенезом и гемопоэзом в костном мозге ни у кого не вызывает сомнений. О них свидетельствует не только единство происхождения этих тканей внутренней среды, о котором писал еще в начале столетия А.А.Максимов [63, 64], но и отношения между этими тканями, складывающиеся еще в эмбриогенезе, когда с 20 недели гестации у человека впервые оформляется анатомо-функциональная связь между остеогенной и гемопоэтической тканями костного мозга [14].

Нахождение костного мозга в полостях костной ткани связано не только с необходимостью защиты столь жизненно важного источника кроветворных элементов, но и с обеспечением оптимальных условий для самоподдержания, пролиферации и дифференцировки родоначальных трансплантабельных костномозговых клеток, которые . условно называются полипотентными стволовыми клетками /ПСК/ и полипотентными клетками-предшественниками /ПКП/. Эти процессы регулируются различными гуморальными факторами, которые экспрессируются и депонируются не только стромальными и гемопоэтическими клетками, но и костными элементами. Причем, усиление освобождения этих рост регулирующих факторов /РРФ/ клетками-продуцентами в костном мозге отмечается при нестабильном кроветворении, когда в экстремальных условиях возникает необходимость уси-

ленной регенерации не только костного мозга, но и скелетной ткани [56, 92]. Однако, изучение этих взаимоотношений сопряжено со значительными методическими трудностями.

Определенный вклад в формирование концепции взаимосвязи остеогенной и гемопоэтической тканей костного мозга внесли результаты экспериментов по изучению регуляции регенерации поврежденной костной ткани гуморальными индукторами, появляющимися в крови после травмы, и стимулирующими как остеогенез, так и гемопоэз [107].

В настоящее время межтканевые взаимоотношения в костном мозге изучают, преимущественно, при длительном культивировании костного мозга, когда формируется стромальная подложка, выполняющая роль основного регулятора пролиферации и дифференцировки ПСК и ПКП - гемопоэз индуцирующего микроокружения /ГИМО/ [240, 241, 277, 291]. Однако, изучение остеогенных потенций стромальных элементов подложки возможно лишь после гетеротопной трансплантации ее под капсулу почки мыши, когда формируется очаг эктопического кроветворения с костной капсулой. К сожалению, подобная трансплантация исключена при изучении костного мозга больных.

Трудности в изучении вопросов межпопуляционных взаимоотношений в значительной мере связаны с отсутствием адекватных моделей. Поэтому создание моделей, позволяющих оценивать взаимоотношение остеогенной и гемопоэтической тканей путем избирательного гуморального воздействия на родона-чальные костномозговые элементы, изменяющего направление их последующей дифференцировки в сторону преобладания одной из

них, является одной из актуальных задач современной гематологии. Взаимообусловленность функционирования остеогенеза и гемопоэза в настоящее время признается, практически, всеми исследователями [68,76, 102, 116, 119]. Поиск РРФ, позволяющих обеспечить самоподдержание, пролиферацию и дифферен-цировку полипотентных родоначальных костномозговых элементов , отвечающих за гистогенез остеогенной и гемопоэтической тканей и изменяющих взаимоотношение этих тканей в сторону преобладания одной из них, ведется не одно десятилетие.

Однако, до настоящего времени отсутствуют экспериментальные модели, позволяющие оценивать участие взаимодействия этих тканей и его регуляцию в развитии патологии кроветворения. Получение таких моделей, предоставляющих возможность оценки взаимоотношения остеогенеза и гемопоэза путем избирательного гуморального воздействия на родоначальные трансплантабельные костномозговые элементы, изменяющего направление их дифференцировки в сторону остеогенеза или гемопоэза, определило актуальность данного исследования.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования явилось изучение регуляции взаимоотношения остеогенной и гемопоэтической тканей костного мозга на экспериментальных моделях гипер- и гипопродукции гемопоэтических клеток .

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать экспериментальную модель гемопоэз индуцирующего микроокружения для оценки трансплантабельности

его стромальных элементов при воздействии различных гуморальных факторов на костный мозг доноров и реципиентов после его гетеротопной трансплантации.

2. Разработать экспериментальные модели гипер- и гипо-продукции гемопоэтических клеток с использованием гетеротопной трансплантации костного мозга сингенным реципиентам.

3. Определить возможные механизмы регуляции пролиферации и дифференцировки полипотентных стволовых клеток костного мозга, приводящие к изменению взаимоотношения остео-генной и гемопоэтической тканей в эксперименте.

4. Оценить роль кроветворного компонента ГИМО, моноцитов -макрофагов и лимфоцитов, в регуляции взаимоотношения остеогенной и гемопоэтической тканей костного мозга доноров и реципиентов при экспериментальном моделировании.

5. Оценить возможность использования костного мозга в качестве субстрата репаративного остеогенеза и стимуляции остеогенных клеток-предшественников при устранении дефекта костной ткани.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. На модели гетеротопной трансплантации костного мозга сингенным реципиентам в экспериментальных условиях выявлена ее адекватность для оценки взаимодействия остеогенной и гемопоэтической тканей костного мозга при формировании нового эктопического кроветворного органа.

Длительное введение курантила - препарата, нарушающего функциональную активность тромбоцитов, приводит к преимущественному образованию гемопоэтической ткани в костном мозге

- б -

и торможению формирования остеогенной.

Использование эстрогенов сопровождается дозозависимым формированием гипоплазии костного мозга с усилением образования остеогенной ткани в трансплантате костного мозга реципиента

В костном мозге выявлены 2 типа фибробластов, отличающихся чувствительностью к эстрону: 1 тип -высокочувствительный, отвечающий за фибробластогенез и приводящий после 4-кратных еженедельных инъекций эстрона к формированию мие-лофиброза, 2 тип - низкочувствительный, отвечающий за ос-теогенез в костном мозге. Увеличение длительности введения эстрона приводит к заполнению костномозговых полостей остеогенной тканью.

Длительное введение курантила приводит в костном мозге

»

к увеличению числа патологически измененных мегакариоцитов, усилению их разрушения из-за накопления в цитоплазме этих клеток гигантских липидных капель. Установлена способность тромбоцитарных факторов стимулировать синтез липидов в ме-гакариоцитах и описан механизм локального поступления содержимого цитоплазмы этих клеток во внеклеточный матрикс под влиянием курантила.

Введение курантила и эстрона вызывает в костном мозге экспериментальных животных /мыши/ нарушение взаимоотношения остеогенеза и гемопоэза за счет изменения дифференцировоч-ной направленности ПСК при опосредованном /курантил/ или прямом /эстрон/ влиянии этих препаратов.

Установлено, что кроветворные элементы гемопоэз инду-

цирующего микроокружения, моноциты-макрофаги и лимфоциты, имеют существенное значение в регуляции направленности пролиферации и дифференцировки родоначальных костномозговых элементов. Так, недостаток моноцитов-макрофагов в костном мозге мышей-реципиентов выравнивает стимулирующий или инги-бирующий эффект полисахарида при формировании нового эктопического кроветворного органа. Дефицит В- и Т-лимфоцитов влияет, преимущественно, на прохождение клеточного цикла миелокариоцитами костного мозга.

Показана возможность использования остеогенных клеток-предшественников костного мозга в качестве субстрата репа-ративного остеогенеза и стимуляции их пролиферации и дифференцировки при устранении дефекта костной ткани, содержащей костный мозг.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Разработаны 2 модельные системы позволяющие в экспериментальных условиях изучать влияние различных препаратов и биологически активных веществ на пролиферацию и дифференцировку полипотентных стволовых клеток, а также взаимоотношение костной и костномозговой тканей.

Получена модель эстрогенового миелофиброза, на которой были воспроизведены основные феномены миелофиброза человека: гиперваскуляризация и фиброз костного мозга, увеличение числа стволовых кроветворных клеток, колониеобразующих единиц селезенки.

На основании данных, полученных при дозозависимой регуляции пролиферации и дифференцировки стромальных механо-

цитов костного мозга при экспериментальном моделировании с помощью эстрона, разработан способ использования остеоген-ных клеток-предшественников костного мозга при устранении дефекта костной ткани /патент N 2055535, 10 марта 1996г./.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Оптимальной моделью для изучения взаимоотношения между остеогенной и гемопоэтической тканями в процессе регенерации костного мозга является ретрансплантация 7-дневного очага гетеротопного кроветворения вторичному реципиенту .

2. Показана возможность изменять взаимоотношение ос-теогенеза и гемопоэза в сторону преобладания гемопоэтиче-ского компонента в костном мозге при нарушении функциональной активности тромбоцитов курантилом.

3. Эстрон оказывает прямое влияние на трансплантабель-ные стромальные элементы гемопоэз индуцирующего микроокружения. Оно проявляется в усилении дифференцировки полипо-тентных стволовых клеток костного мозга в сторону преобладания их остеогенной направленности.

4. Кроветворные элементы гемопоэз индуцирующего микроокружения имеют существенное значение в регуляции пролиферации и дифференцировки родоначальных клеток костного мозга .

5. Остеогенные клетки-предшественники костного мозга можно использовать в качестве субстрата репаративного ос-теогенеза при устранении дефекта костной ткани, содержащей костный мозг.

АПРОБАЦИЯ И РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всесоюзном симпозиуме "Медиаторы иммунного ответа в эксперименте и клинике", Горький, 1983, 10; Всесоюзной конференции "Новые достижения в изучении нелимфоцитарных лейкозов", Рига, 1983,11; Международном симпозиуме "Стромальная и Т-клеточная регуляция стволовой кроветворной клетки", Москва, 1984,10; Всесоюзной конференции "Иммуномодуляторы природного происхождения", Владивосток, 1990, 10; хирургической секции научного общества стоматологов Ленинграда и области, Ленинград, 1990, 11; 1991, 4; совместном заседании проблемной комиссии "Заболевания сердечно-сосудистой системы", кафедры факультетской терапии, отдела патологии НИЦ СПГМУ им. акад. И.П.Павлова и отдела биотехнологии Центрального научно-исследовательского рентгено-радиологического института, Санкт-Петербург, 18 февраля 1998г..

ВНЕДРЕНИЕ.

Разработанная в экспериментах модель регенерирующего гемопоэз индуцирующего микроокружения при гетеротопной трансплантации костного мозга используется в работе Томского института фармакологии Сибирского отделения Академии Наук для оценки трансплантабельности стромальных элементов гемопоэз индуцирующего микроокружения под влиянием гуморальных регуляторов в экспериментах по регенерации костномозговых структур после цитостатического воздействия.

В ходе выполнения настоящего исследования при экспериментальном моделировании 10 марта 1996г. получен патент на

изобретение "Способ устранения дефекта костной ткани" N 2055535.

С 1991 г. предложенный биоцротез из коллагеновой гемо-статической губки используется с целью стимуляции репаратив-ного остеогенеза в клинике челюстно-лицевой и пластической хирургии СПГМУ им. акад. И.П.Павлова и на ее клинических базах (в городских стоматологических поликлиниках NN 12, 20, 30 и в стоматологическом отделении поликлиники N 38).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ, 16 из них - в центральных журналах. Получен патент N 2055535 от 10.03.96 на изобретение "Способ устранения дефекта костной ткани".

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Материал диссертации изложен на 275 страницах машинописного текста и содержит 15 таблиц и 48 рисунков. Диссертация состоит из введения, 9-ти глав, включающих обзор литературы, материал и методы исследования, шести глав с изложением собственных результатов исследований, их обсуждения, а также - заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованных сокращений, списка цитированной литературы, включающего 107 отечественных и 189 зарубежных источников, и указателя содержания.

Глава I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ КОСТНОГО МОЗГА.

В самой проблеме взаимоотношений остеогенной и гемопо-этической тканей костного мозга во взрослом организме необходимо, прежде всего, определить своё отношение к существованию единой полипотентной стволовой клетки /ПСК/ для остеогенной и кроветворной тканей взрослого организма. Этот вопрос уже 3 0 лет остается дискутабельным и по настоящее время.

Анализируя данные литературы по этой проблеме, можно выделить 2 группы авторов, хотя и опирающихся в своей работе на одно и то же учение А.А.Максимова [63], но тем не менее придерживающихся диаметрально противоположных точек зрения.

Так, одна группа исследователей, основываясь главным образом, на данных своих экспериментов по восстановлению кроветворения у радиационных химер и культивированию костного мозга, считает, что постнатальный остеогенез и гемопо-эза в костном мозге происходят независимо друг от друга, т. е. для каждой ткани существует своя ПСК [107, 16, 181] . В 1968 г. на модели соединительной ткани при воспалении было доказано родство фибробластов со стволовыми кроветворными клетками /СКК/. В этом же году А.Я.Фриденштейном и сотр. было высказано предположение, что родоначальные элементы крови могут становиться остеогенными клетками-предшественниками [99] .

Анализ литературы и собственные данные позволили другой группе авторов в 1982 г. выдвинуть гипотезу о единстве стромальной и кроветворной тканей костного мозга [192] .

Ко второй, большой группе авторов, поддерживающих эту гипотезу, принадлежит и группа врачей-травматологов и экспериментаторов [54, 30, 11, 15, 291, 260].

В пользу существования единой ПСК для остеогенной и гемопоэтической тканей костного мозга во взрослом организме свидетельствуют не только экспериментальные, но и клинические данные [546, 260, 239].

Действительно, результаты большого числа исследований позволили предположить общность генеза этих тканей. Так, получены данные, что остеонектин, кость-специфический белок синтезируется не только остеогенными, но и гемопоэтическими клетками костного мозга, мегакариоцитами /МГК/, причем, авторы сумели доказать идентичность остеонектина, выделенного из тромбоцитов /Тр/ или разрушенных МКЦ, костному остеонек-тину [273] . В другой работе представлены данные, что эндо-телиальные стромальные клетки гемопоэз индуцирующего микроокружения /ГИМО/, как и Тр костного мозга, экспрессируют тромбоцитарный ростовой фактор /РСОР/, индуцированный трансформирующим фактором роста /ТОР/. Обе цепи РСБР могут индуцировать пролиферацию как гемопоэтических, так и стро-мальных клеток [108] . Кроме того, было показано, что тромбоцит-активирующий фактор /ТАР/ индуцирует трансформацию в человеческих фибробластах [122] .

В пользу единства источников гистогенеза обеих тканей

также свидетельствуют данные, что ранние гемопоэтические стволовые клетки, положительные по СД34+ антигену, экспрес-сируют сиаломуцин, как и эндотелиальные клетки сосудов костного мозга [291].

Однако, даже если мнение авторов о существовании единой стволовой клетки в обеих тканях и не расходятся, то оспаривается принадлежность этой клетки к остеогенной или кроветворной линиям костномозговой популяции клеток.

Подтверждением того, что гемопоэтические клетки явл�