Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Проточная ДНК-цитометрия костного мозга у больных острыми лейкозами



КУЧМА ЮРИЙ МИРОСЛАВОВИЧ

ПРОТОЧНАЯ ДНК-ЦИТОМЕТРИЯ КОСТНОГО МОЗГА У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ

14.00.29 - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2002

Работа выполнена в Главном военном клиническом госпитале имени академика Н.Н.Бурденко и Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор В. Г. Савченко, доктор медицинских наук Д. А. Шмаров

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор М.А.Волкова доктор медицинских наук Е.В.Домрачева

Ведущее научное учреждение:

Научно-исследовательский институт детской гематологии

Защита состоится "_"_2002 г. в_час.

на заседании диссертационного совета Д 001.042.01 в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук.

(Москва, 125167, Новозыковский пр., 4А)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН.

2002 г.

В.Д.Реук

Автореферат разослан " /У"

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

/° ^ 0*2 г?- 4 Г О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современные программы противоопухолевой химиотерапии (ХТ) базируются в основном на эмпирическом анализе результатов лечения в многоцентровых исследованиях. Несмотря на постоянное совершенствование протоколов ХТ острых лейкозов на основе эмпирического подхода, в значительном числе случаев ремиссии достигнуть не удается, особенно при рецидивах заболеваний. Изыскание новых подходов к применению цитостатических средств, увеличение избирательности и эффективности их действия связано с углубленным изучением процессов клеточной кинетики при лейкозах. Различия в чувствительности клеток к действию цитостатиков обусловлены особенностями их пролиферации. Вместе с тем, такое классическое понятие онкологии, как величина ростовой фракции опухоли до настоящего времени не получило должного распространения в лейкозологии. По-видимому, это связано с трудностями применения методов исследования клеточного цикла в клинической практике. В период ремиссии заболевания в организме остается около 100 миллионов лейкозных клеток. Однако реальная возможность контроля опухолевого клона весьма ограничена. Для мониторинга минимальной остаточной болезни необходимы дополнительные методы исследования. С появлением метода проточной ДНК-цитометрии представилась возможность быстрого и информативного анализа распределения клеток по содержанию ядерной ДНК с высокой разрешающей способностью. Это позволяет определять параметры клеточного цикла и , выявлять анеуплоидные клеточные клоны. Исходя из этого, внедрение проточной ДНК-цитометрии костного мозга в клиническую практику представляется актуальной задачей.

Цель работы: оценка пролиферации и плоидности клеток костного мозга у больных острыми лейкозами до и после ХТ методом проточной ДНК-цитометрии, использование полученных данных в гематологической практике. Основные задачи исследования

1. Методом проточной ДНК-цитометрии у больных с острыми миелоидными лейкозами исследовать распределение миелокариоцитов по фазам клеточного цикла до и после ХТ и установить его влияние на показатели миелограммы и крови.

2. Изучить влияние стандартной ХТ на пролиферацию миелокариоцитов больных острыми миелоидными лейкозами.

3. Установить различия в пролиферации клеток костного мозга больных, достигших и не достигших ремиссии заболевания.

4. Исследовать ДНК-плоидность клеток костного мозга при острых лейкозах в динамике заболевания и возможность использования её для контроля минимальной остаточной болезни.

Научная новизна. Показано, что метод проточной ДНК-цитометрии позволяет достоверно оценивать пролиферативную активность миелокариоцитов и выявлять анеуплоидные клеточные клоны у больных острыми лейкозами. Установлено, что фракция покоя костного мозга прямо коррелирует с величиной опухолевой массы, а пролиферирующая фракция зависит от сохранности нормальных ростков кроветворения. Острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) в активной фазе характеризуются снижением фракции роста костного мозга по сравнению с нормой. При выходе заболевания в ремиссию после курса ХТ наблюдается значительное повышение пролиферативной активности кроветворных клеток, связанное с регенерацией нормального кроветворения. ДНК-анеуплоидия выявляется у 21% пациентов с острыми лейкозами и может быть использована для мониторинга минимальной остаточной болезни в фазе ремиссии заболевания.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют современные представления о пролиферации клеток костного мозга при острых лейкозах. Метод проточной ДНК-цитометрии можно применять для оценки гемопоэза до и в процессе ХТ острых лейкозов, разработки новых программ ХТ.

Апробация диссертации. Материалы работы докладывались и обсуждались на: научно-практической конференции ГВКГ им. Н.Н.Бурденко "Возможности и перспективы диагностики и лечения в клинической практике" (Москва, 1992); международном симпозиуме "Новые направления в развитии гематологии" (Санкт-Петербург, 1992, 1994); V Российском съезде специалистов по лабораторной диагностике (Москва, 1995); гематологической секции Московского научного общества терапевтов (Москва, 1996); научно-практической конференции "Клиническая лабораторная диагностика -состояние и перспективы" (Санкт-Петербург, 1996); конференции "Анализ изображения клеток системы крови: настоящее и будущее" (Москва, 1996); симпозиуме "Национальные дни лабораторной медицины России" (Москва, 1997).

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы, включающего 54 отечественных и 147 зарубежных источников. Изложена на 118 страницах, содержит 7 таблиц и 43 рисунка.

Положения, выносимые на защиту.

1. Проточная ДНК-цитометрия костного мозга даёт возможность исследовать распределение миелокариоцитов по фазам клеточного цикла и использовать эти данные в повседневной клинической практике.

2. С увеличением опухолевой массы при ОМЛ происходит снижение доли миелокариоцитов, вступающих в клеточный цикл.

3. Восстановление нормального кроветворения после курса ХТ сопровождается выраженным увеличением пролиферативной активности миелокариоцитов, что является признаком выхода острого лейкоза в ремиссию.

4. У больных острыми лейкозами проточная Д НК-цитометрия костного мозга

позволяет выявлять анеуплоидные клоны клеток и в отдельных случаях

контролировать минимальную остаточную болезнь.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В основу настоящей работы были включены результаты 304 исследований клеточного цикла миелокариоцитов у 122 больных острыми лейкозами. 172 исследования проведено у 62 больных ОМЛ и 132 исследования у 60 больных острым лимфобластным лейкозом (OJIJI). В группу больных OMJI вошли 51 мужчина и 11 женщин в возрасте от 18 до 82 лет на момент развития заболевания, средний возраст - 33 года. Для индукции и консолидации ремиссии у больных OMJI использовались цитозин-арабинозид, даунорубицин и 6-меркапгопурин по программам ХТ "7+3" и "TAD-9". Поддерживающая ХТ проводилась ежемесячными ротирующими 5-дневными курсами, в которых цитозин-арабинозид последовательно комбинировался с рубомицином, 6-меркаптопурином, винкристином и циклофосфаном в течение 3 лет. Среди больных OJIJI было 52 мужчин и 8 женщин в возрасте от 17 до 63 лет, средний возраст - 29 лет. Больные ОЛЛ получали ХТ по протоколу немецкой группы исследования острых лейкозов 04/89. Протокол предусматривал 8-недельную индукцию ремиссии, включавшую винкристин, рубомицин, L-аспарагиназу, преднизолон, циклофосфан, 6-меркаптопурин, цитозар. Далее проводились две 5-дневные консолидации цитозаром и вепезидом, 6-недельная реиндукция и поддерживающая ХТ 6-меркаптопурином и метотрексатом в течение 3 лет.

Анализ показателей прслиферативной активности костного мозга проводился только в группе ОМЛ. Это связано с тем, что основная масса исследований была выполнена у больных в процессе проведения ХТ, и с самого начала существовал вопрос, как отделить изменения пролиферации, обусловленные заболеванием, от изменений, обусловленных цитостатическим воздействием. Часть больных получили цитостатики или преднизолон до поступления в госпиталь. Поэтому после сбора анамнеза и анализа всей медицинской документации в группу больных, достоверно не получивших лекарственных препаратов до первичного исследования пролиферации, вошло только 20 человек. Длительность заболевания от первых клинических проявлений до первой ДНК-цитометрии костного мозга составляла от 6 до 66 дней. На основании данных, полученных от этих больных, были сделаны выводы о влиянии заболевания на пролиферацию клеток костного мозга.

152 исследования у 53 больных ОМЛ было проведено в различные сроки после окончания курсов ХТ. Поскольку лечение больных с ОМЛ проводилось прерывистыми курсами, период восстановления кроветворения, прошедший от окончания цитостатического воздействия до момента исследования, имел

решающее влияние на показатели пролиферации. Поэтому все исследования, проведенные после ХТ, были сгруппированы по недельным интервалам от + 1 до + 50 дня (от 0 до 7 недель соответственно) таким образом, чтобы отклонения по срокам не превышали 3 дней. Была определена динамика изменений пролиферации костного мозга в зависимости от срока, прошедшего с момента окончания курса ХТ. Основная часть исследований после курсов ХТ выполнена через 3-4 недели после их завершения, перед началом очередного курса. Однако по различным причинам, как правило, связанным с осложнениями химиотерапии, перерывы между очередными курсами лечения были значительно увеличены и пункции костного мозга выполнялись через 5, 6 и 7 недель после завершения курса. Часть исследований были выполнены непосредственно в момент окончания ХТ, а также через 1 и 2 недели после окончания курса. Таким образом, были получены данные о зависимости пролиферативной активности миелокариоцитов от времени, прошедшего с момента цитостатического воздействия. Корреляционный анализ между показателями ДНК-гистограммы и миелограммы проводился в точках, стандартизированных по недельным интервалам после воздействия стандартных по интенсивности курсов ХТ. Период наблюдения за больными с проведением ДНК-цитометрии костного мозга составлял от 1 до 43 месяцев. Учитывалось также общее число проведенных курсов ХТ, которое составляло у разных больных от 1 до 29. Исследование пролиферативной активности костного мозга в динамике при ОЛЛ требовало принципиально иного подхода в связи с другим характером химиотерапии и в данном исследовании не проводилось. Изучение частоты ДНК-анеуплоидии проведено в группах ОМЛ и ОЛЛ. Клеточный состав костного мозга (миелограмму) и периферической крови анализировали в препаратах, окрашенных по Романовскому.

Распределение миелокариоцитов по фазам клеточного цикла (0ол, Б, С2М) производили методом проточной ДНК-цитометрии. Для окраски клеточной ДНК использовали одновременно два красителя - бромистый этидий и хромомицин А3. Клетки костного мозга получали пункцией грудины или подвздошной кости. После того как игла со шприцем вынута из кости и содержимое помещено на предметное стекло, в опорожненный шприц набирали 0,5 мл раствора, содержащего цитрат натрия в концентрации 1 г/л и флуоресцентный краситель бромистый этидий (0,05 г/л). Получившийся смыв клеток со стенок иглы и шприца помещали в пробирку. Раствор цитрата натрия вызывал лизис эритроцитов и способствовал хорошему связыванию флуоресцентных зондов с ядерной ДНК. Концентрация клеток получалась оптимальной для последующих проточно-цитометрических измерений. К полученной взвеси добавляли равный объём раствора хромомицина А3. При совместном использовании двух флуоресцентных зондов значительно возрастает интенсивность реакции и повышается точность измерений. Непосредственно перед измерением полученную взвесь инкубировали с рибонуклеазой.

Работа выполнена на проточном цитофлуориметре - анализаторе и сортировщике клеток EPICS-C (Coulter Electronics, США). Для возбуждения флуоресценции применяли длину волны 457,9 нм от аргонового лазера "Argon-Innova 90-6" ("Coherent", США) с выходной мощностью 6 Вт. Эмиссионным объективом световые сигналы углового светорассеяния и флуоресценции фокусировались на соответствующих детекторах, которые преобразовывали их в электрические импульсы и регистрировались компьютером прибора. В процессе прохождения образца прибор обеспечивал одновременное измерение до 6 параметров клетки с представлением результатов в виде четырех одно- и двухпараметровых гистограмм. Установка оборудована компьютером для обработки данных, сопряженным с процессором самого прибора. В одном образце анализировали, как правило, 30 тысяч клеток. Комплексное тестирование аппаратуры проводили при помощи стандартных калибровочных частиц, которые применяли как для оценки точности работы приборов, так и для их ежедневной настройки. Для анализа ДНК-гистограмм использовалась специальная компьютерная программа распределения клеток по содержанию ДНК. В отношении клеток костного мозга больных острыми лейкозами метод флуоресцентной окраски и проточной ДНК-цитометрии обладал достаточно высокой точностью и воспроизводимостью результатов. При измерении отдельных образцов отношение пиков G,M/G0/| составляло 1,95-2,04, что свидетельствовало о хорошей линейности измерений. Основным параметром, характеризующим разрешающую способность метода, является коэффициент вариации, который рассчитывали по ширине пика Gn/1. Этот показатель в большинстве случаев не превышал 3,5%. Значения коэффициентов вариации использовали в качестве критерия для определения принадлежности популяции определенному клеточному клону. Обнаружение ДНК-анеуплоидного клона подтверждалось его регистрацией в двух разных образцах костного мозга при условии совпадения индексов ДНК. Статистическая обработка результатов исследований выполнена с помощью пакета компьютерных программ Statistica и Stat View. Диаграммы получены при помощи программ Statistica и Microsoft Excel.

Фрагменты работы выполнены в соавторстве с к.б.н. О.Н.Поповой, Е.А.Белоусовым, Н.М.Щербаковым, к..ф.-м..н. С.М.Куликовым.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ПАРАМЕТРЫ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА КОСТНОГО МОЗГА БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ ДО НАЧАЛА ХИМИОТЕРАПИИ.

Использование метода проточной ДНК-цитометрии для исследования клеточного цикла миелокариоцитов позволило получать данные о пролиферации костного мозга одновременно с миелограммой. При сопоставлении ДНК-гистограмм и миелограмм больных острыми лейкозами было обращено внимание, что ростовая фракция костного мозга больных до начала ХТ меньше, чем в норме. Это не соответствовало общим представлениям о повышенной скорости пролиферации опухолевых клеток при остром лейкозе. Тотальная бластная трансформация костного мозга сопровождалась низкими параметрами пролиферации, а после курса ХТ она значительно повышалась, изменяясь во времени. Мы поставили перед собой задачу установить, какие показатели ДНК-гистограммы костного мозга больных до начала ХТ являются наиболее информативными и коррелируют с показателями миелограммы, периферической крови и клиническими данными. Для корреляционного анализа выбрали 8 показателей ДНК-гистограммы, 10 показателей миелограммы, 8 показателей клинического анализа крови, а также возраст больного, вариант лейкоза и длительность заболевания от первых клинических проявлений до момента первого исследования пролиферации костного мозга. Анализируемые показатели представлены в таблицах I, II, III.

Таблица I.

Показатели ДНК-гистограммы костного мозга

№ Показатель

1 % G0G1 - % клеток в фазах GO и G1 (фракция покоя)

2 % G2M - % клеток в фазах G2 и М

3 % S - % клеток в фазе S

4 % S+G2M — сумма % клеток в фазах S, G2 и М (фракция роста)

5 G0G1/S —соотношение фракций G0G1 и S

6 G0G1/G2M - соотношение фракций G0G1 и G2M

7 S/G2M - соотношение фракций S и G2M

8 G0G1/S+G2M- соотношение фракций G0G1 и S+G2M

Таблица И.

Показатели миелограммы

№ Показатель

1 Количество миелокариоцитов (х 10%)

2 Относительное количество бластов (%)

3 Абсолютное количество бластов (х 109/л)

4 Относительное количество лимфоцитов (%)

5 Абсолютное количество лимфоцитов (х 10ч/л)

6 Относительное количество клеток миелоидного ростка (%)

7 Абсолютное количество клеток миелоидного ростка (х 10 /л)

8 Относительное количество клеток эритроидного ростка (%)

9 Абсолютное количество клеток эритроидного ростка (х 109/л)

10 Количество митозов на 500 миелокариоцитов.

Таблица Показатели периферической крови

№ Показатель

1 Гемоглобин (г/л)

2 Эритроциты (х 1012/л)

3 Лейкоциты (х 10ч/л)

4 Тромбоциты (х 10%)

5 Абсолютное количество бластов (х 109/л)

6 Абсолютное количество лимфоцитов (х 109/л)

7 Абсолютное количество гранулоцитов (х 10ч/л)

8 Абсолютное количество моноцитов (х 109/л)

Абсолютные значения показателей миелограммы и крови получали путём умножения соответствующих относительных показателей на количество миелокариоцитов в единице объёма костного мозга или количество лейкоцитов крови. Результаты корреляционного анализа представлены на рисунках.

Оказалось, что между фракцией роста и абсолютным количеством бластов костного мозга имеет место обратная корреляция (рис. 1). В то же время была выявлена прямая зависимость между фракцией роста и эритроидным ростком костного мозга (рис. 2). Наличие прямой зависимости между пролиферирующим пулом миелокариоцитов и эритроидным ростком кроветворения подтвердилось такой же прямой зависимостью количества эритроцитов (рис. 3) и гемоглобина крови от фракции Б-фазных клеток костного мозга. Корреляция между пролиферирующим пулом костного мозга и

Корреляция между фракцией роста и абсолютным количеством бластов костного мозга до ХГ П = 20 Г = • 0,456 р = 0,043

•

•

• •

----* " - - •

• ■— - -

• • • • •

100 200 300 400

Бласты косяного мозга, х 10А9/л

500

Корреляция между фракцией роста и эритроидным ростком костного мозга до ХТ П = 20 Г = 0,613 р = 0,004

Количество эритрокариоцитов, %

Корреляция между фракцией Э костного мозга и количеством эритроцитов крови до ХТ П = 20 г = 0,706 р = 0,001

2,2 2,8 3,4 4,0 4,6

Количество эритроцитов крови, х 10Л12/л

Рис. 4

28 24 20

^ 16

2" см

О 12 +

(Л

Корреляция между фракцией роста костного мозга и количеством гранулоцитов крови до ХТ П = 20 Г = 0,710 р = 0,001

•

- • •

• •

• . ..........

•

•1 •

• • •

■0,2 0,2 0,6 1,0 1,4 1,8 2,2 2,6

Количество гранулоцитов крови, х 10А9/л

3,0

миелоидным ростком кроветворения до начала ХТ не была достоверной. Однако абсолютное количество гранулоцитов крови достоверно коррелировало с ростовой фракцией костного мозга (рис. 4). Прямая корреляция меньшей силы выявлена и с количеством тромбоцитов крови (рис. 5). Соответственно, фракция покоя костного мозга имела обратную корреляцию с эритроидным ростком костного мозга, количеством эритроцитов, гемоглобина, гранулоцитов и

тромбоцитов крови.

Рис.5

Корреляция между фракцией роста костного мозга и количеством тромбоцитов крови до ХТ п = 19 г = 0,515 р = 0,024

20 60 100 140

Тромбоциты крови, х 10А9/л

4

Далее были вычислены все возможные соотношения между фазами клеточного цикла миелокариоцитов (G0G1/S, G0G1/G2M, G0G1/S+G2M, S/ G2M) и проанализированы их коэффициенты корреляции с показателями крови и миелограммы. Установлено, что наиболее универсальным показателем является отношение фракции покоя к ростовой фракции костного мозга (G0G1/ S+G2M). Он достоверно коррелирует с наибольшим числом показателей миелограммы и крови. Была выявлена достоверная прямая зависимость показателя G0G1/S+G2M от цитоза костного мозга (рис. 6). Однако значимость корреляции была не высокой. Тогда с этим показателем было сопоставлено абсолютное количество бластов в единице объёма костного мозга (рис. 7). Значимость этой зависимости оказалась высокой и достоверной (г = 0,76, р < 0,001). Это говорит о том, что соотношение фракции покоя и фракции роста костного мозга зависит в большей степени от абсолютного количества бластов

г

см

(3 +

сл о

о о

Корреляция между С0И./3+С2М и количеством миелокариоцитов в единице объёма, костного моэга до ХТ п = 20 Г = 0,588 р = 0,006

100 200 300 400

Количество миелокариоцитов, х 10А9/л

Рис. 7

Корреляция между соотношением С0С1/5+С2М и абсолютным количеством бластов костного моэга до ХТ п = 20 г = 0,758 р < 0,001

0 (00 200 300 400

Количество бластов костного моэга, х 10А9/л

в единице объёма или от абсолютной величины опухолевой массы. Величина эритроидного и миелоидного ростков кроветворения, а также количество лимфоцитов костного мозга имеют обратную зависимость от этого показателя. Абсолютное количество бластов в единице объёма крови прямо коррелировало с соотношением вСЮ 1 /8+С2М, так же как и количество бластов костного мозга, однако корреляция была статистически недостоверна (г = 0,3554, р = 0,124). Количество эритроцитов, гемоглобина, гранулоцитов, тромбоцитов и моноцитов крови имеют обратную зависимость от соотношения ООС1/8+С2М. Статистическая достоверность не доказана только для моноцитов.

Раздельный анализ фаз Б и 02М ростовой фракции миелокариоцитов показал, что доля клеток костного мозга в фазах С2М коррелирует с показателями миелограммы в том же направлении, что и доля Б-фазных клеток. Количество клеток в фазах С2М имеет прямую корреляцию с абсолютным количеством лимфоцитов костного мозга(г = 0,51, р = 0,022). Учитывая, что морфологически клетки-предшественники имеют вид лимфоцитов, можно предполагать, что ростовая фракция костного мозга прямо зависит от количества предшественников кроветворения в единице объёма костного мозга. Не выявлено зависимости показателей ДНК-гистограммы от возраста больного, варианта лейкоза и длительности заболевания. Корреляция ростовой фракции костного мозга с миелоидным ростком кроветворения и количеством митозов до ХТ статистически не достоверна из-за недостаточного числа наблюдений.

Таким образом, проточная ДНК-цитометрия костного мозга больных ОМЛ, проведенная до начала ХТ, выявляет прямую зависимость фракции покоя от абсолютной величины опухолевой массы и фракции роста от сохранности нормального кроветворения. В наибольшей степени фракция роста костного

мозга зависит от сохранности эритроидного ростка.

ИЗМЕНЕНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ КОСТНОГО МОЗГА БОЛЬНЫХ ОМЛ В ПОСТЦИТОСТАТИЧЕСКОМ

ПЕРИОДЕ.

Нам представлялось важным изучить изменения пролиферации во времени после цитостатического воздействия. С этой целью было выполнено 152 исследования костного мозга у 53 больных. Все выполненные исследования были сгруппированы по недельным интервалам после окончания курса ХТ таким образом, чтобы отклонения по срокам не превышали 3 дней. В каждой группе исследований были определены средние значения и квадратичные отклонения значений фаз клеточного цикла миелокариоцитов. Анализ динамики количества миелокариоцитов, находящихся в Б-фазе клеточного цикла, показывает, что минимальное количество клеток в этой фазе регистрируется

через 1 неделю (+ 8 день) после окончания курса ХТ (рис. 8). Через 2 недели (+ 15 день) количество Б-фазных клеток резко повышается и достигает максимума через 4 недели (+ 29 день) после окончания курса. В сроки 5-6 недель после курса ХТ наблюдается снижение числа клеток в Б-фазе относительно максимума, однако их значения превышают норму и показатели до начала курса. Пунктаты костного мозга, которые были получены через 7 недель после курса химиотерапии, содержали малое количество клеток в фазе Б. Количество миелокариоцитов в фазах в2М в постцитостатическом периоде имеет динамику, сходную с динамикой клеток в Б-фазе. Минимум наблюдается через 1 неделю, а максимум через 4 недели после окончания курса ХТ. Однако сразу же после окончания курса, на +1 день, отмечается значительное повышение числа миелокариоцитов в фазах 02М, которое, по-видимому, связано с остановкой клеточного цикла в результате цитостатического воздействия. Рисунок 8 демонстрирует волну пролиферации миелокариоцитов после цитостатического воздействия. Значение максимума на +29 день после курса ХТ отличается от минимума на +8 день более чем в два раза. Среднее значение максимума пролиферирующего пула миелокариоцитов через 4 недели после курса ХТ достигает 20%. Остальные 80% составляют покоящиеся клетки в фазах вО/а. На рисунке 9 изображена динамика соотношения пролиферирующей и покоящейся фракций миелокариоцитов до и после курса ХТ. Описываемая волна пролиферации затрагивает в среднем 1/5 часть всех клеток костного мозга.

Рис. 8

Диамка относительного когичесгаа клеток костного моога в Э-фазе до и после ХТ

Дккзмкз соошошэдоя прогиферцэукхцвй и нвпрстферирунщзй

ДоХТ 1 8 15 . 22 29 36 43 День после окожания курса ХТ

Нарастающая часть волны пролиферации охватывает период со 2 до конца 4 недели после окончания курса ХТ.

Дальнейшая задача состояла в том, чтобы выяснить, имеются ли отличия постцитостатической волны пролиферации в случаях выхода острого лейкоза в ремиссию от случаев резистентности. Для этого было проведено сопоставление нарастающей её части в тех и других случаях. Проанализировано относительное и абсолютное количество пролиферирующих миелокариоцитов на 15-29 дни после курса химиотерапии. Анализ проводился отдельно после 1 и 2 курсов лечения. После 1 курса ХТ проанализировано 20 больных. Их них у 15 была достигнута ремиссия заболевания и 5 оказались резистентными. Количество пролиферирующих миелокариоцитов больных, достигших ремиссии после 1 курса ХТ, превышало аналогичные показатели резистентных больных более чем в два раза (рис. 10). Предположение о прямой зависимости пролиферирующего пула миелокариоцитов от сохранности нормальных ростков кроветворения до начала ХТ косвенно подтверждается динамикой пролиферации после ХТ. Высокие показатели пролиферации костного мозга у больных, достигших ремиссии, обусловлены восстановлением нормального кроветворения. Корреляция ростовой фракции костного мозга наиболее высокая с эритроидным ростком кроветворения (рис. 11). В постцитостатическом периоде, благодаря большему числу проведенных исследований, выявляется достоверная прямая зависимость фракции роста костного мозга с миелоидным

ростком (рис. 12) и количеством митозов (рис. 13). Были произведены вычисления всех возможных соотношений между различными фазами клеточного цикла (6001/8, ООС1Л32М, ООС1/8-н32М, 8Л32М) у больных, достигших и не достигших ремиссии после первого курса ХТ. Результаты представлены в таблице IV.

Таблица IV.

Соотношения между различными фазами клеточного цикла при выходе больных в ремиссию и в случаях резистентности

Показатель Ремиссия Резистентность Отношение

п=15 п=5 средних значений (резистентность / ремиссия)

воа/Б J 6,7 ± 1,4 28,0 ±17,4 4,2

ОООШ2М 31,4 ±7,7 67,4 ±15,3 2,1

8/02М 4,4 ± 0,6 5,8 ± 1,8 1,3

ООС1/8+С2М 5,4 ± 1,2 15,4 ± 6,4 2,9

Рис. 10

Огноситсгьное когичестао грсит^ре^хруюи*« ^vlGлa<ap^кx^froo

Корреляция между фракцией роста и эритроидным ростком костного мозга после ХТ п = 152 г = 0,624 р < 0,001

10 30 50

Количество эритрокариоцитов, %

Рис. 12

Корреляция между фракцией роста и миелоидкым ростком костного мозга после ХТ п = 152 ' г = 0,332 р < 0,001

TtJi'O О О О

о0оо<? О О

5„® О о ! Ó?

Гбо • V ОЬ о

•20

40 100 . 160 220

Ниелоидный росток, х 10А9/л

280

Корреляция между фракцией роста костного мозга и количеством митозов на 500 миелокариоцитов после ХТ п = 152 г = 0,203 р = 0,012

2 6 10 14 18

Количество митозов на 500 миелокариоцитов, абс.

Рис. 14

Соотношения мюеду количеством ыиелокариоцпов, находвдчхся в различных фазах клеточного цикла на 15 - 29 день после 1 курса ХТ"

Из четырёх возможных соотношений фаз клеточного цикла наиболее информативны показатели ССЮШ и ООС1/5+С2М (рис. 14). Соотношение между фракцией покоя и фракцией роста костного мозга (0(Ю1/8+02М) в случае резистентности в 2,9 раза превышает аналогичное соотношение при выходе больного в ремиссию. А среднее значение показателя 0001/8 при отсутствии ремиссии после первого курса ХТ превышает аналогичные в случаях выхода в ремиссию в 4,2 раза. Доверительные интервалы средних значений не пересекаются. Можно с уверенностью говорить, что если в пунктате костного мозга, выполненного через 2 - 4 недели после окончания курса ХТ, соотношение 0001/8 равно 8,1 и более и/или соотношение 0001/8+02М равно 6,6 и более - ремиссии нет и она не наступит после данного курса ХТ. Это важно, когда в пунктате костного мозга после первого курса ХТ остаётся 10 - 20% властных клеток, а в крови сохраняется панцитопения. Такая ситуация может разрешиться в двух направлениях: 1) выходом в полную ремиссию с течением времени без дополнительного цитостатического воздействия, учитывая механизм репродуктивной клеточной гибели; 2) возвратом в активную фазу заболевания. В первом случае начало очередного курса ХТ на фоне сохраняющейся цитопении в периферической крови и неразрешившихся очагах инфекции резко

увеличивает риск летального исхода. Отсрочка второго курса ХТ до выхода из цитопении и разрешения очагов инфекции не будет иметь негативных последствий, позволит избежать высокого риска смертельных осложнений после второго курса. Во втором случае отсрочка ХТ будет сопровождаться накоплением опухолевой массы и уменьшением вероятности достижения ремиссии. Данные о распределении миелокариоцитов по фазам клеточного цикла в этот момент помогут врачу принять правильное решение.

Таким образом, в первые 4 недели после цитостатического воздействия проточная ДНК-цитометрия костного мозга показывает ход восстановления нормального гемопоэза, по которому можно судить о выходе больного в ремиссию или резистентности его заболевания к проводимой ХТ.

Справедливость полученных представлений о зависимости пролиферации костного мозга больных с острыми миелоидными лейкозами от величины опухолевой массы, её динамике до и после ХТ демонстрирует 43-х месячное наблюдение больной О. с ОМЛ. В исходной миелограмме содержалось 100% бластов, доля клеток в Б-фазе составляла 4,4%, в фазах 02М - 1%. После первого курса ХТ по программе ТАД-9 была достигнута ремиссия заболевания, которая поддерживалась ежемесячными 5-дневными курсами. Количество бластных клеток в костном мозге не превышало 3,6%. Пролиферативная активность миелокариоцитов при этом значительно возросла, достоверно превышая нормативные показатели. В момент наступления рецидива при увеличении содержания бластов до 26,8% было зарегистрировано снижение показателей пролиферации. Была установлена достоверная положительная корреляция между количеством бластов в пунктате костного мозга и долей непролиферирующих миелокариоцитов в фазах 0001 (г = 0,661, р = 0,001).

Более высокий уровень корреляции отмечался между пролиферирующим пулом клеток (8+02М) и суммой всех клеток эритроидного и миелоидного ростков (г = 0,734, р < 0,001). Был вычислен показатель отношения между фракцией покоя и фракцией роста костного мозга (С001/8+02М) и сопоставлен с количеством бластов и нормальными ростками кроветворения во всех точках исследования. Корреляция этого показателя с количеством бластов была положительная (г = 0,910, р < 0,001), а с нормальными ростками кроветворения - отрицательная (г = - 0,897, р < 0,001). Эти данные отчётливо демонстрируют прямую зависимость фракции покоя костного мозга от величины опухолевой массы, а фракции роста от нормальных ростков кроветворения. Диаграммы представлены в

диссертации.

ИЗУЧЕНИЕ ДНК-АНЕУПЛОИДИИ У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ

ЛЕЙКОЗАМИ.

С целью выявления анеуплоидных клонов исследовано распределение клеток костного мозга по содержанию ДНК у 133 больных с различными формами острого лейкоза. Из них 62 больных было с острым лимфобластным лейкозом и 71 больной с о стрым миелоидным лейкозом. В качестве внутреннего стандарта использовали суспензию лимфоцитов человека, фиксированных 20% этиловым спиртом. При обработке гистограмм распределения миелокариоцитов по содержанию ДНК, наряду с данными о фазах клеточного цикла получали информацию о наличии анеуплоидных субпопуляций в образце. Для каждой субпопуляции (анеуплоидного клона) определяли индекс ДНК (иДНК), который рассчитывали как отношение содержания ДНК в фазе С0/) лейкозных клеток к значению соответствующего показателя для нормальных клеток, у которых иДНК=1. ДНК- анеуплоидия была выявлена у 21% (28 из 133) больных острыми лейкозами. При ОЛЛ этот показатель составил 19% (12 из 62), а при ОМЛ 23% (16 из 71). Среди выявленных аномальных по содержанию ДНК популяций лейкозных клеток преобладали гипердиплоидные клоны с околодиплоидными значениями иДНК (рис. 15). Степень анеуплоидии была несколько ниже при ОМЛ (иДНК составлял 1,17+0,06), чем при ОЛЛ (иДНК=1,21±0,05). В одном случае ОМЛ в костном мозге и крови обнаружен тетраплоидный клон опухолевых клеток, (рис. 16), который в процессе развития заболевания вытеснил всю диплоидную популяцию. У 18 из 28 больных с ДНК-анеуплоидией костный мозг исследовали в динамике на протяжении от 2 до 36 месяцев. В одних случаях наблюдали полное исчезновение анеуплоидного клона при достижении гематологической ремиссии заболевания, в других -анеуплоидные клетки оставались в костном мозге в период ремиссии. Проточная ДНК-цитометрия кроветворных клеток давала возможность наряду с оценкой клеточного цикла выявлять анеуплоидные клеточные клоны при острых

лейкозах, что в отдельных случаях позволяло следить за динамикой опухолевого клона в период ремиссии заболевания. При этом содержание анеуплоидных клеток в костном мозге может не соответствовать количеству бластов.

Клиническая значимость использования проточной ДНК-цитометрии костного мозга с целью мониторинга минимальной остаточной болезни в диссертации демонстрируется на конкретном примере.

i

|

I 4

GOG Aneu G2M

Рис. 15. Гистограмма распределения клеток костного мозга по содержанию ДНК больного М. (OJIJI) с гипердиплоидным клоном клеток. По оси абсцисс — содержание ДНК в каждой отдельной клетке, по оси ординат - число клеток с данным содержанием ДНК. Вертикальными линиями отмечен участок гистограммы, соответствующий S-фазе клеточного цикла (6,2%). G0G1 - диплоидные клетки (78,05%), G2M -тетраплоидные клетки (3,92%), Aneu - анеуплоидные клетки (2,79%). Индекс ДНК анеуплоидного клона = 1,33. G2/G1 = 1,94.

ООО Б С2М + Апеи

Рис. 16. Гистограмма распределения клеток костного мозга по содержанию ДНК больного П (ОМЛ) с тетраплоидным клоном клеток. По оси абсцисс - содержание ДНК в каждой отдельной клетке, по оси ординат - число клеток с данным содержанием ДНК. Вертикальными линиями отмечен участок гистограммы, соответствующий Б-фазе клеточного цикла (15,3%). 0001 - диплоидные клетки (50,23%), в2М + Апеи -тетраплоидные + анеуплоидные клетки (34,48%). Индекс ДНК

анеуплоиднош клона = 2,00. Ю1 = 2,00.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Острые лейкозы являются опухолями, которые без лечения в течение нескольких месяцев приводят заболевшего к летальному исходу. По скорости развития недостаточности костномозгового кроветворения и соответствующей клинической симптоматики, несовместимой с жизнью, это самые быстротекущие злокачественные опухоли. В большинстве случаев от первых клинических проявлений до развёрнутой клинической картины заболевания проходит не более 1 месяца. Встречаются случаи, когда этот период занимает 1

неделю. В нашей практике это неоднократно подтверждалось анализами крови, выполненными за 3 — 4 недели до первых клинических симптомов в порядке диспансеризации или медицинского освидетельствования военнослужащих. Они не имели изменений, позволяющих заподозрить острый лейкоз. Характерной особенностью этих заболеваний является быстрый рост опухолевой массы. Это проявляется резкой гиперплазией костного мозга и гиперлейкоцитозом за счёт бластов, увеличением селезёнки, лимфатических узлов, печени. Удвоение бластоза в крови нередко происходит в течение 1—2 суток. В крови остаются единичные гранулоциты и тромбоциты, нарастает анемия. Быстрое увеличение опухолевой массы при остром лейкозе обычно ассоциируется в сознании врача с быстрой пролиферацией опухолевых клеток. При этом подразумевается увеличение скорости деления клеток за счёт уменьшения промежутка времени между митозами. Понятие высокой злокачественности связывается с высокой пролиферативной активностью. Однако при этом практикующий врач не имеет данных о распределении клеток костного мозга по фазам клеточного цикла. Методы его исследования занимали длительное время и были доступны только единичным научным центрам. Мы предприняли попытку исследовать клеточный цикл одновременно с миелограммой в процессе диагностики и лечения больного. Для этого был необходим метод, который можно применить в повседневной практике. В качестве такого метода была использована проточная ДНК-цитометрия. В течение нескольких часов после пункции костного мозга она даёт врачу сведения о ростовой фракции кроветворения.

Полученные данные изменили наши представления о связи опухолевой массы, высокой злокачественности и скорости пролиферации. Сопоставление ДНК-гистограмм и миелограмм в дебюте заболевания, до начала ХТ, показало, что относительное количество клеток, вступающих в клеточный цикл, при высоком бластозе костного мозга меньше, чем в норме. Напротив, данные, полученные после ХТ, при выходе больного в ремиссию показывали значительное увеличение количества миелокариоцитов в фазах Б и 02М. Это сопровождалось восстановлением нормальных ростков кроветворения. Оказалось, что, исследуя распределение миелокариоцитов по фазам клеточного цикла в различные сроки после курса ХТ, можно объективно зарегистрировать волну пролиферации после окончания курса, которая показывает, что нормальные миелокариоциты пролиферируют быстрее, чем бласты. Был проведен статистический анализ полученных данных, который показал, что корреляция пролиферирующей фракции костного мозга с величиной нормальных ростков гемопоэза - прямая, а с количеством бластов - обратная. С нарастанием клеточности костного мозга при острых миелоидных лейкозах увеличивается соотношение между фракцией покоя и фракцией роста. Поскольку клеточность костного мозга увеличивается за счёт бластов, то нарастание бластоза приводит к изменению указанного соотношения и к уменьшению фракции роста. Корреляции относительных показателей

миелограммы и ДНК-гистограммы не высокие, но статистически достоверные. Степень корреляции и достоверность этой взаимосвязи значительно повышается, если сопоставлять показатели пролиферации с абсолютным количеством бластов в единице объёма костного мозга (абсолютной величиной опухолевой массы). Наибольшая зависимость величины пролиферирующего пула имеется с эритроидным ростком кроветворения. Это отчётливо подтверждено такой же прямой корреляцией с количеством эритроцитов и гемоглобина крови до начала ХТ. Такая же прямая зависимость выявлена между пролиферирующей фракцией костного мозга и количеством гранулоцитов и тромбоцитов крови. Величина общей фракции роста костного мозга прямо отражается на сохранности нормальных ростков кроветворения.

Гемопоэтическая ткань в норме является наиболее быстро пролиферирующей среди всех тканей организма. Продолжительность жизни гранулоцитов в кровотоке составляет в среднем 10 часов, тромбоцитов - 7 дней, эритроцитов - 90 — 120 дней. Замедление скорости пролиферации клеток костного мозга в первую очередь приведёт к недостатку гранулоцитов и тромбоцитов, а затем - эритроцитов. Быстрое развитие клинической симптоматики при остром лейкозе, обусловленной цитопенией, связано с вытеснением нормального кроветворения опухолью, которая имеет более низкую скорость пролиферации. Но опухолевые клетки, вследствие утраты специфических функций, имеют большую продолжительность жизни. Рост опухоли является сложной функцией размножения и продолжительности жизни клеток. Баланс между делением и гибелью клеток, который в норме обеспечивает постоянство состава крови, сдвигается, и опухолевая масса быстро увеличивается. По-видимому, при острых лейкозах, как и при других злокачественных опухолях, имеет место феномен самоограничения роста. Чем больше опухолевая масса, тем меньше её ростовая фракция и больше фракция покоя. Выявленные нами корреляционные зависимости подтверждают справедливость этого закона опухолевого роста для острого лейкоза. По мере увеличения опухолевой массы скорость роста опухоли снижается. Поскольку эритроидный росток кроветворения обладает наибольшей скоростью пролиферации и инертностью, связанной с продолжительностью жизни эритроцитов, то глубокая анемия до начала ХТ, свидетельствует о большой опухолевой массе. Чем больше опухолевая масса, тем более она вытесняет эритроидный росток кроветворения. Больные с глубокой анемией, развившейся без кровопотери, по-видимому, имеют более медленные характеристики пролиферативной активности опухоли и меньшую её фракцию роста. Глубина подавления эритроидного ростка коррелирует с темпом пролиферации опухоли.

Абсолютное количество фракции покоя в единице объёма костного мозга с нарастанием бластоза приближается к абсолютному количеству бластов в единице объёма, а ростовая фракция костного мозга уменьшается. Это представление даёт путь к пониманию резистентности к химиотерапии, как закономерному явлению, зависящему от опухолевой массы. Чем больше

опухолевая масса, тем меньше её фракция роста, тем больше вероятность резистентности к ХТ. Однако выявить ту критическую величину снижения фракции роста лейкоза, за которой следует резистентность, нам не удалось. Это связано с тем, что исследованная общая пролиферативная активность костного мозга является суммой ростовых фракций опухоли и нормальных ростков. Для повышения чувствительности метода необходимо проводить предварительную сортировку клеток. Было предположение, что уменьшение общей пролиферативной активности костного мозга за счёт бластов может иметь прямую корреляцию с длительностью заболевания. Однако такую связь установить также не удалось. По-видимому, сам темп накопления опухолевой массы у разных больных разный, первые клинические проявления зависят от

многих факторов. Но существует эмпирическое правило, что ХТ при остром лейкозе необходимо начинать как можно раньше. Исследование пролиферации костного мозга методом проточной ДНК-цитометрии объективно подтверждает это правило.

Скорость пролиферации становится важным и значащим фактором, когда оценивается действие Б-фазоспецифических лекарств. Чем больше скорость пролиферации на момент начала лечения, тем большее число клеток в Б фазе, и большая окончательная фракция погибших клеток.

Восстановление нормального гемопоэза после курса химиотерапии и выход из цитопении имеет решающее значение в купировании клинических проявлений лейкоза. Однако индивидуальные особенности восстановления кроветворения различны. Сроки между курсами ХТ, выработанные эмпирически, не позволяют учитывать эти индивидуальные особенности. Как показано на диаграммах постцитостатической волны пролиферации, повторные курсы ХТ через 3 недели попадают на пик пролиферации эритроидного ростка, в связи с чем нередко развивается тяжёлая цитостатическая анемия. Показания к применению ростовых факторов выработаны также эмпирически. Объективные сведения о пролиферации клеток костного мозга, получаемые вместе с миелограммой и анализом крови, расширяют диапазон знаний и решений врача.

Наряду с изучением клеточного цикла при лейкозах, проточная ДНК-цитометрия занимает важное место в выявлении анеуплоидных клонов клеток. При остром лимфобластном лейкозе у детей показано, что присутствие гипердиплоидных бластов прогнозирует лучший ответ на ХТ. В ряде случаев наличие анеуплоидии даёт возможность мониторировать заболевание, когда это не доступно при помощи других методов. Существенно, что в отличие от цитогенетического анализа ДНК-цитометрия позволяет выявлять анеуплоидные опухолевые клетки вне зависимости от интенсивности их деления и проводить исследования достаточно быстро. В том случае, если анеуплоидный клон удалось зарегистрировать и определить иДНК, его можно использовать в качестве достаточно надежного маркера для определения минимальной остаточной болезни в период ремиссии заболевания. При этом метод позволяет

получить быстрый опгвет о его величине и динамике. Нами был проанализирован и описан случай наблюдения за опухолевым гипердиплоидным клоном методом проточной ДНК-цитометрии у больного ОЛЛ в первой и второй ремиссиях заболевания. Длительность ремиссий коррелировала с величиной анеуплоидной фракции костного мозга. Такой мониторинг в отдельных случаях возможен и при исследовании периферической крови. Пороговые значения содержания анеуплоидных клеток, при которых опухолевый клон надежно выявляется (при коэффициенте вариации пика О0/1 до 3,5%) составляют 1-1,5%, что может оказаться недостаточным для мониторинга минимальной остаточной болезни. Одним из путей значительного повышения чувствительности является применение ДНК-цитометрии в сочетании с анализом поверхностных антигенов при помощи флуоресцентно меченых моноклональных антител, что может

обеспечить качественно более высокий уровень мониторинга.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена прямая зависимость фракции покоя миелокариоцитов от массы опухоли и пролиферирующей фракции от сохранности нормальных ростков кроветворения у больных острыми миелоидными лейкозами до начала химиотерапии.

2. Наблюдается волнообразное изменение пролиферирующей фракции миелокариоцитов с минимумом через 1 неделю и максимумом через 4 недели после окончания курса химиотерапии. Нарастающая часть волны пролиферации характеризует восстановление нормальных ростков кроветворения.

3. Эритроидный росток кроветворения вносит максимальный вклад в изменения пролиферирующей фракции миелокариоцитов.

4. Выход в ремиссию острого миелоидного лейкоза после первого курса химиотерапии сопровождается многократным увеличением количества миелокариоцитов в фазах 8 и в2М по сравнению с резистентными случаями. Динамика пролиферации миелокариоцитов после первого курса химиотерапии прогнозирует его клинический результат.

5. ДНК-анеуплоидия выявляется методом проточной ДНК-цитометрии у 21 % больных острыми лейкозами

6. У больных с анеуплоидией проточная ДНК-цитометрия даёт возможность контролировать динамику опухолевого клона и мониторировать минимальную остаточную болезнь в ремиссии заболевания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кучма Ю.М., Шмаров Д.А., Попова О.Н., Белоусов Е.А., Щербаков Н.М. Проточная ДНК-цитометрия в диагностике острого лейкоза. В кн. "Возможности и перспективы диагностики и лечения в клинической практике" (Тез. докл. научно-практической конференции ГВКГ им. Н.Н.Бурденко), М., 1992, 300 - 308.

2. Кучма Ю.М., Шмаров Д.А., Щербаков Н.М., Белоусов Е.А., Козинец Г.И. Проточная цитометрия клеток костного мозга больных острыми лейкозами в изучении ДНК-анеуплоидии. I съезд онкологов стран СНГ. Т. 2. М., 1996, 546-547.

3. Кучма Ю.М., Шмаров Д.А., Щербаков Н.М., Белоусов Е.А., Козинец Г.И. Проточная цитометрия клеток костного мозга больных острыми лейкозами в изучении ДНК-анеуплоидии. В кн. "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии" (Тез. докл. Ш-го Всероссийского съезда гематологов и трансфузиологов, Санкт-Петербург, 1996, 11.

4. Кучма Ю.М., Шмаров Д.А., Козинец Г.И. Оценка эффективности цитостатической терапии при острых лейкозах методом проточной ДНК-цитометрии костного мозга. Клиническая лабораторная диагностика, 1998, 8,26.

5. Мазуров В., Георгиев Г., Розанов Ю., Новик А., Райнов Ю., Кучма Ю. Значение на поточната ДНК-цитометрия при проучване динамиката на левкозния процес. Воен.-мед. дело, 1990, XLIV, №3, 13 - 16, Болг.; рез. англ., рус.

6. Шмаров Д.А., Крехнов Б.В., Попова О.Н., Кучма Ю.М., Лепков C.B. Анализ распределения миелокариоцитов по содержанию ДНК и клеточный состав костного мозга. В кн. "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Тез. докл. II Всесоюзного симпозиума), М. 1991, с. 212.

7. Шмаров Д.А., Крехнов Б.Н., Попова О.Н., Кучма Ю.М., Лепков C.B. Пролиферативная активность миелокариоцитов и клеточный состав костного мозга. Гематология и трансфузиология, 1992, №7-8, 6-9.

8. Шмаров Д.А., Кучма Ю.М., Белоусов Е.А., Щербаков Н.М. Проточная цитометрия клеток костного мозга в определении ДНК-анеуплоидии при острых лейкозах. V Российский съезд специалистов по лабораторной диагностике, ч.Н, М, 1995,318 - 319.

9. Шмаров Д.А., Митерев Г.Ю., Кучма Ю.М., Балабуткин В.А., Козинец Г.И. Параметры клеточного цикла клеток костного мозга, как показатель физиологического состояния кроветворения. В кн. "Патофизиология органов и систем. Типовые патологические процессы" (Тез. докл. I Российского конгресса по патофизиологии), М.,1996, с. 101.

10. Шмаров Д.А., Кучма Ю.М., Митерев Г.Ю. Козинец Г.И. Проточная цитометрия в определении ДНК-анеуплоидии у больных острыми лейкозами. Терапевтический архив, 1996, 7, 11 - 14.

11. Шмаров Д.А., Асцатуров И. А., Кучма Ю.М., Митерев Г.Ю., Козинец Г.И. Показатели клеточного цикла гемопоэтических клеток у больных хроническим лимфолейкозом. Клиническая лабораторная диагностика, 1997,5, 17- 18.

12. Шмаров Д.А., Кучма Ю.М., Козинец Г.И. Изменения стабильности параметров цикла клеток костного мозга при гематологических заболеваниях. Терапевтический архив, 1997, 7, 17 - 21.

13. Шмаров Д.А., Кучма Ю.М., Козинец Г.И. Проточная цитометрия клеток костного мозга в норме, при анемиях различной этиологии и при острых лейкозах. Клиническая лабораторная диагностика, 1997, 10, 3-6.

КУЧМА ЮРИЙ МИРОСЛАВОВИЧ

ПРОТОЧНАЯ ДНК-ЦИТОМЕТРИЯ КОСТНОГО МОЗГА У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Издано Научно-методическим центром ГВКГ им. академика H.H. Бурденко (Лицензия серия ЛР, №040846 от 23.09.97 г.) 105229, Москва, Госпитальная пл., 3

Подписано в печать 05.03.2002 г. Бумага «Куш Lux». Ризография. Тираж 100 экз. Зак. 270.