Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Противоопухолевая цитотоксическая активность тромбоцитов

ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

УДК 512.112. 94. 017. 014. ' 615. 276.41-084.

14. 00.14 - 01ПЮ10ПШ АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1996 Г.

Работа выполнена в Онкологическом научном центре РАМН им. Блохина (директор-акад. РАМН, проф. Н. Е Трапезников).

Научный руководитель - доктор медицинских наук

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук, профессор.

Ведущая организация - Институт Иммунологии ИЗ Ш

Защита диссертации состоится 6 июня 1996 г. в 13 часов на еаседании диссертационного, совета К 001.17.01. при ' онкологическом научном центре РАЫН (115478, г. Москва, Каширское шоссе,24)

0 диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОВД РАМН ( 115478, г. Шсква, Каширское шоссе, 24)

Ц. Е Киселевский

академик РАМН, А. А. Воробьев

доктор медицинских наук, профессор, 3. Г. Кадагидве.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного Совета' доктор медицинских наук, профессор

Е С. Турусов

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕШ. Исследования последних лет свидетельствуют о новых физиологических функциях тромбоцитов, напрямую не связанных с тромбообразованием и обусловленных уникальным сочетанием в них структурно-функциональных систем., характерных как для железистых, так и фагоцитирующих клеток. Первые данные о способности тромбоцитов лизировать опсонизированные эритроциты цыплят, человека и меток мастоцитомы (Shin et. al. ,1974) были впоследствии подтверждены исследованиями (Soper et. al., 1982), которые показали включение тромбоцитов в антитело-зависимую клеточную цитотоксичность. Joseph et. al. в 1985 установили, что тромбоциты, полученные от больных с шистозомомато-зом, in vitro лизируют эритроциты с помощью IgE и С-реактивно-го белка. В работах Л. И Трубчаниновой с соавт. в 1994 году впервые было показано, что цитотоксическая активность тромбоцитов ВИЧ-инфицированных больных зависит от клинической стадии заболевания. Ibele et. al. в 1985 году описали способность тромбоцитов в отсутствии антител лизировать клетки меланомы и аденокарцшомы почки человека. Противоопухолевая цитотоксическая активность тромбоцитов онкологических больных была доказана исследованиями С. Е Быковской (1991) на опухолевых линиях человека HeLa, ACL, Kfolt-4.

Sagava et.al. в 1990 году на NK-чувствительной линии хронического миелоидього лейкоза К-562 наблюдали в световом микроскопе выраженные морфологические изменения клеток-мишеней уже через 4-5 часов после контакта с тромбоцитами при 37*С в атмосфере 5 % С02. Данные, полученные А. Ф. Быковским при электронно-микроскопическом исследовании показали, что тромбоциты, ад-

- г -

•'сорбированные на поверхности опухолевых клеток-мишеней, подобно Т-лимфоцитам, изменяют свою ультраструктуру, включая гипертрофию аппарата Гольджи, увеличение секреторных гранул и скопление их в области контактной боны. Эти работы свидетельствуют о роли тромбоцитов в системе иммунобиологического- над-вора. Вместе с тем, данные малочисленны и весьма противоречивы и не дают Окончательных представлений о противоопухолевой ци-тотоксической активности тромбоцитов. Высказывались предположения об участии протеаз, поскольку инкубация тромбоцитов с ингибиторами протеав снижала цитотоксический эффект. Имеются данные о высвобождении из секреторных гранул тромбоцитов при контакте с клетками- мишенями биологически активных соединений. обладающих вазоактивным и антимикробным действием, однако механизм цитотоксического действия до настоящего времени практически остается неизученным. Представляет интерес участие эндогенных иммуномодуляторов - интерлейкинов и колониестимулиру-юпщ факторов, рецепторы которых обнаружены на мембранах тромбоцитов (БсЬаиГеНэегеег еЬ.а1, 1994, 51ито<1а еЬ. а1., 1993) в активации цитотоксических функций тромбоцитов.-

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Основной ЦЕЛЬЮ настоящей работы было исследование противоопухолевых цитотоксических свойств тромбоцитов эдоровых доноров и онкологических больных, особенности механизма их действия: влияния иммуномодуляторов .(интерлейкинов), фактора активации тромбоцитов, колониестимулирухвдх факторов, модуляторов ионных каналов.

- з -

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Используя цитотоксический.тест, исследовать динамику ци-тотоксической активности.тромбоцитов онкологических больных в зависимости от распространенности ваболевания, морфологической характеристики, локализации, размеров опухолей и проводимого лечения (оперативного, химио-, иммуно-, лучевой терапии).

2. Сравнить эффекторные свойства тромбоцитов и ЫНК здоровых доноров, • онкологических больных в цитотоксическом тесте против аденокарциномы легкого (ACL)- и NK-чувствительных клеток.

3. Исследовать цитотоксическую активность тромбоцитов ин-тактных мышей и особей с привитыми опухолями на панели перевиваемых 1слеток-гдшней, в зависимости от сроков после трансплантации опухолей и резистентности разных линий мышей. -

4. Исследовать влияние биологически активных веществ с разным механизмом действия на цитотоксичесгае функции тромбоцитов и мопонуклеаров периферической . крови (1Ш) больных и эдоровых доноров.

МУЧНАЯ ШШГМ: Е работе показано, что цитотоксичность тромбоцитов онкологетеских больных зависит от распространенности заболевания, проводимого лечения, однако достоверных различий в зависимости от локализации опухоли не отмечено.-

Впервые показало, что на фоне проводимых курсов химиотерапии, цитотокепческая активность тромбоцитов онкологических больных достоверно (р<0.05) снижается по сравнению с контрольными больны),и и здоровыми донорами.

Выявленные закономерности наблюдались при наиболее часто встречаемых органных локализациях опухолевого процесса: раке легкого, желудка и раке молочной железа Тромбоциты больных,

получавших адоптивную иммунотерапию независимо от локализации, стадии и морфологических характеристик опухолей на фоне или в промежутках между курсами полихимиотерапии, сохраняли исходную цитотоксичность и способность к активации эндогенными иммуно-модуляторами.

Установленная корреляционная зависимость между цитотокси-ческой активностью тромбоцитов и ШК здоровых доноров, онкологических Сольных, подтверждает наличие у пластинок крови противоопухолевых свойств и их способность выполнять зффекторные функции, не связанные с тромбообразованием.

Впервые была исследована способность тромбоцитов мышей с разной эффективностью .подавлять пролиферацию сингенных и алло-генных клеток-мишеней в зависимости от сроков после подкожной имплантации суспензии опухолевых клеток.

Установлено, что колониестимулирувдие факторы и эндогенные иммуномодуляторы - интерлейкины - вещества рецепторного механизма действия, могут повышать цитотоксические свойства тромбоцитов не только здоровых доноров, но и онкологических больных. Следовательно, тромбоциты онкологических больных сохраняют способность к модуляции противоопухолевой цитотоксической активности. Возможно это обусловлено наличием и функциональной сохранностью рецепторов или рецепторных полей на. мембранах тромбоцитов. Выявленные в ходе экспериментов данные о влиянии модуляторов фосфоинозитольного каскада: активаторов натриевых и кальциевых ионных каналов, фактора активаши тромбоцитов и активатора протеинкиназы С форбол-12-миристата-13-ацетата, на цитотоксическую активность тромбоцитов предполагают участие сложных механизмов активации, общих для мононукдеарных иммуно-компетентных клеток и безъядерных пластинок крови.

Ш'ШГО-ГРЛГГЛМЕСгсЛЯ ЗНАЧИМОСТЬ: Полученные данные дополняют, имеющееся представления о репертуаре эффекторов противоопухолевого иммунитета и механизмах действия эндогенных иммуномоду-ляторов на цитотоксические свойства тромбоцитов. Результаты экспериментальных исследований позволяют считать целесообразным проведение мониторинга цитотоксичности МНК и тромбоцитов для получения дополнительных сведений о состоянии противоопухолевого иммунитета.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ состоялась на объединенной конференции торакального и диагностического отделений, лабораторий клеточного иммунитета, клинической радиоиммунологии НИИ КО, механизмов регуляции иммунитета НИИ Канцерогенеза, экспериментальной диагностики опухолей НИИ ЭДиТО ОНЦ РАМЕ

.ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения собственных данных, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы.. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста. Работа содержит таблиц, ' ри-' сунков, основной текст изложен на страницах. Библиография содержит 214 источника.

Материалы и методы исследования. В качестве эффекторов были использованы тромбоциты периферической крови 30 здоровых доноров и 102 больных, с доброкачественными (2), злокачественными новообразованиями (85) и неонкологическими заболеваниями (15).

В соответствии с классификацией ВОЗ, принятой в 1984 году больные были объединены в группы по клиническим стадиям,- локализации, размерам опухолевого узла, проводимому лечению. Исследования динамики цитотоксичеекой активности тромбоцитов он-

1 кологических больных в процессе противоопухолевой терапии проводились на фоне лечения цитостатиками ( вепезид, 5-фторура-цил, цис-платин), а также высокодозной лимфохимиотерапии (ЛХГ) с 30 X превышением доэ препаратов.

Тромбоциты вдоровых доноров и больных тестировали против опухолевых линий ACL, К-562, Kfolt-4, мышей ЛИНИЙ BAL.B/c, C57BL/6 против сингенных и аллогенных опухолевых клеток-мишеней: Rag, Е1-4, В-16, а также Thym-B, Т-20.

Тромбоциты выделяли последовательным центрифугированием ге- ' париниэированной (20 ед. /мл) периферической крови, а затем. плазмы, обогащенной тромбоцитами. После 3-х кратной отмывки, полученный осадок ресуспендировали в 1 мл рабочей культураль-ной среды RPMI-1640. Тромбоциты подсчитывали методом фазово-контрастной микроскопии в камере Горяева. Все процедуры проводились в пластиковой или силиконизированной посуде для избежания активации тромбоцитов при контакте их со стеклом. В полученной суспензии тромбоцитов не было примесей мононуклеарных клеток. МНК выделяли по методу Boyum et. al. (1968).

Цнготоксическмй тест. Чувствительный колориметрический метод с использованием витального красителя 3-С4,5-диметилтри-ааола-2-илЗ 2,5-дифенил тетразолия бромида НГТ (Sigma,М 2128), основан на избирательной способности митохондрий живых клеток восстанавливать ШТ в формазан, кристаллы фиолетового цвета. Клетки-мишени (Км) и эффекторы (Эф) в соотношении 1:100 инкубировали в цитотоксическом тесте при 37°С в атмосфере' 5 X С0В. Через 18 часов вносили стерильный раствор-МГТ (5 мг/мл в фос~ фатном солевом буфере) по 10 мг/лунку 96-луночной плоскодонной планшета По истечении 4-х часов, необходимых для образования формааана, супернатант удаляли, не нарушая слой клеток-мише-.

ней. Кристаллы формазана растворяли в( диметилсульфоксиде(01>Б0)-, который вносили стандартно по 150-200 мкл/ лунку. Оптическая плотность была измерена сразу же после полного растворения кристаллов формазана или спустя 30 минут после добавления DM50 на спектрофотометре ( Titertek Multiscan MCC 1340 P. Flow Laboratory) при длине волны 540 нм. На основании данных оптической плотности в контрольных и опытных лунках расчитывали процент погибших1 клеток-мишеней после контакта с эффекторами.

• РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Цитотоксическая активность тромбоцитов здоровых доноров. Средние значения цитотоксической активности тромбоцитов периферической крови 30 здоровых доноров тестированных на ACL с МТТ, составили 32.5 +6.4 Z. При значительных индивидуальных колебаниях у отдельных доноров от 1 % до 72Z, цитотоксическая активность тромбоцитов у большинства обследованных, лиц-находилась в диапазоне от 15 до 45 %. Параллельно были тестированы ЫНК этих же доноров, средние значения цитодитической активности которых составили 55 ± 4.2 %.

Цнтотоксдаеская активность тромбоцитов ошгалогичесютх больных. Для оценки цитотоксической активности тромбоцитов онкологических больных, 85 обследованных пациента были распределены по группам в зависимости от распространенности заболевания, локализации и размеров новообразований. Цитотоксическая активность тромбоцитов онкологических больных определялась при тех же условиях, что и у здоровых доноров. На I (2 пациента) и II (7), клинических стадиях средние значения цитотоксической активности тромбоцитов составляли соответственно 42+10.3 % и 32+3.6 Z. В III (29) и IV (47) клинических стадиях наблюдалось достоверное по сравнению со здоровыми донорами (Р< 0.05) сни-

жение цитотоксичности тромбоцитов до 27+5.9 X и 19.4+0.24 X соответственно.

У больных с солидными новообразованиям! без метастазов в отдаленные органы не удалось выявить достоверных отличий в ци-тотоксичности тромбоцитов в зависимости от размеров опухолевого увла (по системе ТИМ).

Прослежена зависимость цитотокеической активности тромбоцитов от уровня дифференцировки (степени злокачественности) опухолей на аденокарциноме (29 больных с аденокарциномой легкого, молочной железы и желудка сгруппированы в соответствии с классификацией ВСЯ, по степени дифференцировки (низко-, умеренно-, высокодифференцированные варианты). В контрольной группе больных (без лечения), с низкодифференцированными вариантами аде-нокарциномы, цитотоксичность тромбоцитов ниже, чем при высоко-дкфференцированных и составляет 29+7.1% и 42. 5+10. О % соответственно. Однако, независимо от степени дифференцировки опухолевых клеток, отмечено сходство динамики цитотоксичности тромбоцитов при полихимио- и адоптивной иммунотерапии.

При плоскоклеточном раке не выявлено достоверных отличий в цитотокеической активности тромбоцитов в зависимости от степени дифференцировки опухолей. Так при- - нивкодифференцированном плоскоклеточном раке цитотоксическая активность тромбоцитов составляла 24 X, умереннодифференцированном'- 30 %, а при более зрелом варианте - 34 %. При недифференцированных опухолях ( скиррозный, солидный и др.) цитотоксичность тромбоцитов была ниже, чем при более дифференцированных - аденокарциноме и плоскоклеточном раке.

В засисимости от проводимого лечения у онкологических больных наблюдались достоверные отличия (Р<0.05) в цитотоксичность

тромбоцитов (рис. 1). так при высокодозной лимфохимиотерапии и-полихимиотерапии цитотоксическая активность тромбоцитов снижалась до 15£3.67. и 9±2.4Z у больнцх в III и IV клинических стадиях, а после радикальных операций соответственно до 20±4.3 X и 12+3. 3 %. Адоптивная иммунотерапия ИЛ-2 и ЛАК-клетками в сочетании с лимфохимиотерапией и химиотерапией достоверно (р<0.05) в 2 раза повышала цитотоксическую активность тромбоцитов по сравнению с контрольными больными и составляла 51-бЗХ.

Сравнительная щтяскснчсская гишсгкость тромбоцитов и 1ШК онколопяеских больные н здоровых доноров. Цитотоксическая активность UHR коррелирует с таковой у тромбоцитов как здоровых доноров, так и онкологических больных (82) с новообразованиями различной локализации: молочная железа (Ш), желудок, пищевод, легкое, иная локализация опухолей, у 9 больных с неонкологи- • ческими заболеваниями (цирроз печени, язва желудка, панкреатит) , а также у 18 здоровых доноров..

Тромбоциты периферической крови онкологических и йеонкологи-ческих больных, а так?© здоровых доноров в среднем обладали' одинаковым уровнем цитотоксичности против линии ACL (32 + 3.5%, 33+8. IX, 32+6.4 % соответственно). Цитолитическая активность МНК онкологических больных на.II и III стадиях заболевания была достоверно выше (63+3.ЗХ и 72+4.6 7. соответственна, по сравнению с таковой у здоровых доноров (58+4.7 %). В IV стадии у обследованных больных цитотоксичность МНК достоверно (Р<0.05) снижалась по сравнению со здоровыми донорами и составляла в среднем 42+4.3 %. Не выявлено достоверных различий в цитотоксичности тромбоцитов и ШК в зависимости от локализации опухолей.

Здоровыв Контр. Лечен. ПХГ Р/о ЛХТ ИЛ-2

f^vaftvw** ..............

в Ш St. о IV SU

Рис. 1 Сравнительная цитотоксичность тромбоцитов здоровых доноров, первичных (Контр.) и больных, подвергавшихся разным видам лечения №чен.): полихимиотерапия (ПХТ), хирургические опера-' ции (Р/0), лимфохимиотерапия (ЛХТ) и адоптивная иммунотерапия с ил-2 (ИЛ-2), в III и IV клинических стадиях (St). * - достоверные отличия (р<0.05) от здоровых доноров.

123 Tpomb. О ШПС

Рис. 2 Сравнительная цитотоксичность тромбоцитов и МНК здоровых. доноров(3дор.), неонкологических (Неонкол.) и онкологических больных с локализацией опухоли в легком, желудке, молочной же-леве (ЫЖ), печени. * - достоверные оглицнн ([40.05)

- 11 -

Нами было установлено, что NK-чувствительные клетки К-562 эффективно лизируются как МНК, так и тромбоцитами здоровых доноров и онкологических больных, .что позволяет сделать предположение о наличии у тромбоцитов NK-подобной активности.

Щгготснссическая шсгивзгость тромбоцитов мьаей. В экспериментах использовано 51, в контрольных сериях-26 мышей. Цитотоксич-ность тромбоцитов оценивали после 18-часовой инкубации с клет-]ими-мишеням в цитотоксическом тесте с ШТ. Эффективность цитолиза опухолевых клеток тромбоцитами интактных мышей разных линий варьировала в пределах 16.3 - 59.1 %. Тромбоциты мышей BALB/c обладали более выраженной противоопухолевой активностью против клеток опухолевых штаммов EL-4, Rag, В-16 по сравнению с тромбоцитами мышей линии СВА и C57BL/6.

Исследование цитотоксического действия тромбоцитов интактных мышей C57BL/6 на эпителиальные (Rag - 27.7+1.7%), эмбриональные (Т-20 -13+1.1 %), лимфоидные (EL-4, Thym-B 37.5+3.4 % и соответственно 4.7+1.8 %), нейрогенные (В-16 - 26.7+1.5 X) штаммы опухолевых клеток показало достоверное различие'в способности тромбоцитов оказывать токсическое действие, на опухолевые клетки с разными гистологическими и функциональными характеристиками.

Полученные в данной серии экспериментов результаты свидетельствуют о том, что наибольшей цитотоксичностью обладают тромбоциты интактных мышей против дифференцированных опухолевых штаммов Rag, .Mel В-16 и EL-4. Низкодифференцированные эмбриональные линии Т-20 и Thym -В, утратившие линейную специфичность, практически не чувствительны к цитотоксическому действию тромбоцитов.

Динамика цитотоксичности тромбоцитов мышей C57BL/6 с приви-

той меланомой В-16 исследована на 7-е . 12 -е. 21-е сутки после подкожной трансплантации опухоли против перевиваемых линий опухолевых клеток-мишеней В-16 и.Rag (рис.4). Максимальная активность тромбоцитов мышей с привитыми опухолями отмечена на 12-ый день. Снижение противоопухолевой цитотоксической активности -тромбоцитов, полученных от мышей на 21 сутки может расцениваться как проявление иммуносупрессии, вызванной опухолевой экспансией. В целом эти результаты соответствуют полученным нами ранее данным по онкологическим больным. В частности, на II-III клинических стадиях имеет место повышение противоопухолевой активности тромбоцитов, а на IY стадии заболевания происходит снижение. Циготоксичность тромбоцитов мышей линии C57BL/6 с привитой меланомой В-16 против Mal В-16 и Rag достоверно отличались только на 12 сутки после трансплантации опухолей. В этот период регистрировалась наибольшая активность тромбоцитов против обеих тестируемых линий. Однако, цитотоксич-нос'ть тромбоцитов против аутологичных клеток (В-16) примерно в 2 раза превышала таковую для линии рака почки (Rag). Эти результаты повволяют предположить, что тромбоциты наряду с неспецифической противоопухолевой активностью могут обладать ан-тигенвависимой цитотоксичностью.

Следует отметить, что индекс цитотоксической .активности тромбоцитов экспериментальных мышей определялся в основном морфофункциональными характеристиками штаммов опухолевых клеток-мишеней. Так, тромбоциты мышей с привитыми опухолями (В-16. Т-20 и Thym-В) в равной степени оказывают цитотоксичес-кое'действие на опухолевые клетки одного штамма и с разной эф-фектив"остью подавляют трансформированные клетки разных штам-шв (табл.1).

% ЦИТОТОКСИЧНОСТИ -13-

eo

so 40 30

го 10

Rtj EL-4 D-ie

' (Ю C57B1/9 □ BAtB/o

Рис, 3 Цитотоксичность тромбоцитов интактных мышей C57BL/6 и BALB/c против опухолевых клеток линий меланомы В-16, Rag и EL-4.

*/, цитотоксичности

во 50 40 30 20 10 О

1

12

21

ДНИ

E3r>* Пыв

Рис.. 4 Динамика цитотоксичности тромбоцитов мышей С57ВЬ/в о привитой меданомой В-,16 протиз сингенных и аллогенных опухолевых линий в зависимости от сроков после имплантации опухоли.

к — р < о 05

л

А

Таблица 1.

Цитотоксичность тромбоцитов мышей C57BL/6 с привитыми опухолям (В-16, Т-20, Thym-B) против Б-15, Т-20, Thym-B.

I X лизиса опухолевых клеток-мишеней:

опухолями В-16 • Т-20 1 Thym-B i

В-16 24.6 + 5. 35 6. 5 + 1. 21 1 6.3 + 1.42

Т-20 30.5 + 2.6 12.5 + 0. 96 1

Thym-B 20.5 + 2.74 7.75 + 1.5 111.75+ 1.24

1

Проведенное исследование показало, что тромбоциты мышей с привитыми опухолями не оказывают выраженного токсического действия в отношении низкодифференцированных (эмбриональных и утративших.линейную специфичность) опухолевых клеток.

Влияние биологически активных веществ на цитотоксическую активность тромбоцитов адороььи доноров я онкологических больных. Колониестимулирунщие факторы. Исследовано влияние колони-естимулирующих факторов( CSF): гранулоцит-макрофаг( GübCSF), гранулоцит (G-CSF), моноиит-макрофаг (М-CSF) в концентрациях 1; 10; 50; 100 международ, ед. /мл (ME/мл, IU/ml) на цитотоксическую активность тромбоцитов по отношению к ACL. В контрольной. серии экспериментов было установлено, что тестируемые факторы не оказывают токсического и ростсткмулирующего влияния на клетки-мишени и тромбоциты. Отмечено, что при контакте с клетками-мишенями в присутствии GM-CSF Цитотоксичность тромбоцитов здоровых доноров по сравнению с контрольными сериями достоверно повышается (р<0.05). Максимальное стимулирующее действие

Ш-СН7 наблюдается при соо-.ношении клеток-мишеней и тромбоцитов 1:10 и концентрации колониестимулирующзго фактора 50 МЕ/мл (рис. 5А).

Результаты исследования с 6-СБР и И-СЗ7 (рис. 5 Б, рис 6 А) свидетельствуют о сходном с БЫ-СЯ7 стимулирующем действии на противоопухолевую цитотоксическую активность тромбоцитов. Однако, в отличий от Ш-С5Р диапазоны оптимальных концентраций для Б-СБ? и !ЬСЯР были выше и составили от 50 до 100 МЕ/мл при соответственно больших соотношениях тромбоцитов и клеток-мишеней. Это может свидетельствовать о свойствах гемопоэтических ростовых факторов, стимулирующих клетки 6 разной степенью диф-ференцировки. Нельзя исключить- также и разную аффинность рецепторов тромбоцитов к этим факторам.

Нитсроюйшиы. Цри исследовании влияния ШЬ7 на цитотоксическую активность тромбоцитов здоровых доноров в условиях, аналогичных приведенным выше, было установлено, что Ш-7 повышает цитотоксическую активность тромбоцитов (рис. б Б). Максимальный активирующий эффект наблюдался при концентрации 1-10 НЕ/мл ИЛ-7 и соотношении 1:10. Вместе с тем, при концентрации 50 МЕ/мл и соотношенях 1:10, 1: 50 и 1:100 клеток-мишеней и эффекторов • наблюдалась тенденция к снижению токсического действия тромбоцитов. Концентрации ИЛ-7 от 50 - до 100 МЕ/мл не оказывали Баметного воздействия на активность тромбоцитов по сравнению с контролем. ИЛ-2, как и ИЛ-7 оказывал достоверное акти-

I

вирухлцее влияние на цитотоксическую активность тромбоцитов вдоровых доноров. Тромбоциты онкологических Сольных с исходно низкой цитотоксичностью сохраняли способность к повышению ее при действии на них. ИЛ-2 в концентрации 50 МЕ/мл с 28 + 5.0 7. до 51 +4.2 7..

1:0

— I Ш/ш1 -+- 10 Ш/т1 СО Ш/т1 "в" 100ГО/т1 -Н- Каитр.

1:10

А

1:60 1:100

Соотношение Кы/Эф

% цитотоксичности

—— 1 шли

-+- 10 Ш/т1 £ ВО Ш/т1 О -в- 100 Ш/ш1

-х- Контр.

1:100

Соотношение Кы/Эф

Рис.5 Влияние 6М-СБГ(А) и Б- СБГ(Б) на цитотоксическую активность тромбоцитов здоровых доноров.

%

^ дптотоксичностн

— 1 ГО/т1 -+- 10 Ш/ю1 "*■ 80 ш/щ| "О 100 Ш/ш1 -Н- 1аятр.

А

1:100

Соотношение Км/Эф

х-'ис. 6 Влияние М-С5Г( А) и ЯЯ-7(Б) на цитотоксическую активность тромбоцитов здоровых_доноров.

Возможно, что ИЛ-2, как и многие стимуляторы физиологические функций эффекторных клеток, активирует секрецию уже синтезирс ванных клетками цитолизинов, (или других цитотоксических факторов), не влияя на синтев de novo этих веществ.

Модулятор натриеиьк ионных каналов-аконитин. Исследовано влияние аконитина-агониста натриевых каналов на цитотоксичес-кую активность тромбоцитов вдоровых доноров в диапазоне концентраций от 0.015 до 5 мг/мл. По сравнению с контрольными тромбоцитами, цитотоксичность которых составляла 32%, аконитин при концентрации 0.015 мг/мл достоверно (Р< 0.05) повышал цито-токсическую активность тромбоцитов здоровых доноров до 61%.

Активатор кальциевая каналов-Са-ионофор. Са-ионофор А 23187 ("Sigma") активирует эффекторные клетки при внедрении в плазматическую мембрану с последующей активацией находящейся в ней фосфолипазы, фосфоинозитида и каскада арахидоновой кисноты. Поэтому представлялось целесообразным исследование влияния Са-ионофора на активность тромбоцитов вдоровых доноров в зависимости от концентрации и времени инкубации. Нами было установлено, что цитотоксичность тромбоцитов вдоровых доноров и онкологических больных при контакте их с клетками-мишенями в присутствии Са-ионофора достоверно повышалась г.о сравнению с контролем. • Максимальная стимуляция цитотоксической активности тромбоцитов у здоровых доноров о 38+ 6.4 % до 58+5. 5 X отмечена при концентрации ионофора 100 нг/мл. Более высокие концентрации ионофора (1000 нг/мл) снижали активность тромбоцитов.

24-, 48-, 72-х часовые инкубации с Са-ионофором не влияли на цитотоксичность тромбоцитов здоровых доноров.

У онкологических больных цитотоксичность тромбоцитов при инкубации с Са-ионофором в тех же концентрациях возрастала

, - 19 -

с 28 +' 5,0 X в контроле) в среднем до 35 + 6. 5 X. Однако от-

ят ■

ючено, что Са-ионофор не активировал тромбоциты с исходно вилкой спонтанной цитотоксичностью.

Метаболит глвдеролфосфохолина - фактор активации тромбоци-•ов (PAF). Мы исследовали влияние PAF на цитотоксическую ак-•ивность тромбоцитов и ЫНК вдоровых доноров и онкологических ¡ольных в диапазоне концентраций от 5х10(-10) 'до 5х10(-2) юль/мл. Установлено, что наибольшую активность PAF проявлял в ганцентрации 5x10 б моль/мл. Достоверное повышение цитотоксич-юсти тромбоцитов отмечено у 12 из 19 обследованных доноров. В ФвднеМч цитотоксическая активность -тромбоцитов возрастала с 25+2. 2 X в контроле) до 45+3.1 X ( р < 0. 05). ©политические :войства ЫНК здоровых доноров при воздействии PAF возрастали в :реднем с 58+3.3 X до 72+ 4.6 X. Достоверное увеличение кил-[ерной активности МНК после их инкубации с PAF отмечалось в 72 ; случаев. Однако на МНК и тромбоциты вдоровых доноров с негодно высокой активностью PAF не оказывал стимулирующего дейс-

'ВИЯ.

Наряду с МНК и тромбоцитами здоровых доноров было исследо-lano влияние РАЕ на эффекторы онкологических больных в II-IV ¡тадии с раком желудка, молочной железы ( МЖ), легкого и иной юкализацией злокачественных новообразований. Гистотипы были федставлены аденокарциномой, ,перстневидноклеточным, плоскок-[еточным и протоковым инфильтрирующим для Ж Установлено, что ю сравнению со средними значениями цитотоксической активности щтактных эффекторов 28 + 5.0 X для тромбоцитов и 42 + 4.2 для • IHK, PAF повышает, цитотоксическую активность тромбоцитов до 35 ; 6.5 X (р< 0.05), .а в случае с МНК практически не влияет на iTOT параметр (39+4.6 Z). Модулирующее влияние PAF в целом со-

поставимо с действием ИЛ-2.

Активатор протеинкшоаы С - форбол-12-шристах-13-адотаз: (PUA). Влияние РИА на цитотоксичность тромбоцитов и 1ПК в диапазоне концентраций от 2 до 200 нг/мл (2нг/мл, 20 нг/мл, 200 нг/мл ) исследовано на эффекторах здоровых доноров против опухолевых клеток-мишеней ACL. Максимальный стимулирующий эффект РИА отмечен при концентрации 20 нг/мл.

Цитотоксическая активность тромбоцитов здоровых доноров при контакте их. с клетками-мишенями в данной серии экспериментов возрастала в среднем (с 24+4.3 % в контроле) до 37 + 5.1 % в присутствии Pitt, активации подвергались в большей степени тромбоциты с исходно низкой цитотоксичностью. У МНК РМА не вызывал достоверного повышения киллерных функций при 18-часовой 'инкубации. В то же время 48-ми часовая инкубация с FUA ( 20 нг/мл) значительно увеличивала литическую активность МНК здоровых доноров.

выводи.

1. Тромбоциты здоровых доноров и онкологических больных обладают противоопухолевой цитотоксической активностью.

2. У онкологических больных цитотоксическая активность тромбоцитов изменяется в зависимости от распространенности заболевания, морфологических особенностей опухолей, а также в процессе проводимого лечения.

3. Отмечена корреляционная зависимость цитотоксических свойств тромбоцитов и мононуклеаров периферической крови у здоровых доноров и онкологических больных. Тромбоциты наряду с мононуклеарами периферической крови могут быть отнесены к эф-

- 21 -

фекторам клеточного эвена противоопухолевого иммунитета.

4. У мышей с привитыми опухолями цитотоксическая активность тромбоцитов зависит от'стадии развития опухоли,

5. -Установлено, что эндогенные цитокины и ростовые факторы с рецепторным механиамом действия, экзогенные регуляторы кальциевых и натриевых ионных каналов мембраны способны модулировать цитотоксическую'активность тромбоцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛШГОВАШШХ ПО ТШВ ДИОСЕРТАЩШ.

1. Шрмаягович В. А., Давыдов М. И., Киселевский М. Е , Тугуз А. Р. Полоцкий Б. Е.

Аутолимфохимиотерапия немелкоклеточного рака легкого. Цито-токсичность лимфоцитов. Пути унификации. Теэисы II Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство", 10-15 апреля 1995, Шсква. - О. 202.

2. А. Р. Тугуз, М. Е Киселевский, А. М. Бунцевич, Д. R Комов, Б. Е. Полоцкий, Е А. Нормантович, ИГ. Комаров, Е. ЫРошин, С. IL Быковская. Цитотоксическая активность тромбоцитов и мононук-леаров периферической крови онкологических больных и здоровых доноров. Бш. экспер. биол. -1996. -N. 2 - С. 192-195.

3. Y. A. Tarasov, 'М. Y. Kiselevsky,' I. Q. Derevyanchenco, I. V. L' vov, A. R. Tuguz, A. tl Buntsevich. Effect of Lymphokinin of the cytotoxic activity of the peripheral blood mononuclear cells (MNC) in the cancer patients after radical operation. International Co-Conference of Environmental Pollution (ICEP95) Neuroimmuno Interactions,and Environmen' (ICONE 95). 17-24 July 1995. St.Petersburg. Russia. - P. 181.

4. M. V. Kiselevsky, A. R.Tuguz, D. N. Cherepovsky, A. M. Buntsevich, S. N. Bykovskay.

Enhancement of the platelet-mediated cytotoxity by IL-2 and

PAF. 9 th. Scientific Meeting Biological Therapy, Napa, California - 1994.- P.22. - A. 7.

5. V. Normantovlch, M.Davydov, (A Kiselevky, S. Yolkov, B. Polotsky, A. Tuguz.

The new possibilities of the auto-lymph chemotherapy non small cell lung cancer. The European Cancer Conference. Paris. -1995. THE EUROPEAN JOURNAL OF CANCER. -1995. -Vol. Sup. 5. -P.S229.

6. N. V. Malackova, M. V.Kiselevsky, /LRluguz, N. Bykovskaya. Cytotoxic activity of cancer patients platelets in vitro can be Increased with cytokines.

Annual Meeting Biological Therapy, Napa, California -1995;

Автор благодарен научному руководителю д. м. н; Ы. Е Киселевскому, рецензентам: к. б. н. Д. Е Казанскому и дГм. н. Е Ц Ту-пицыну ва ценные советы при обсуждении результатов.

Приношу глубокую благодарность профессору С. Е Быковской, министру здравоохранения Республики Адыгея к. м. н. К. Ю. Мамгетову и декану лечебного факультета Кубанской Медицинской Академии профессору А. X. Каде.

Участок множительной техники ОНЦ РАМН_

Полп.'к печати 25.4.?b Заказ : Тираж. 100 экз