Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Консервирование концентратов тромбоцитов и их лечебная эффективность

[! ь ^ ;■'

шшистерство здравоохранения российской федерации всероссийский гематологический научный центр

акадеш1я наук украины институт проблеа\ криобиологии и криол1едицины

На правах рукописи

КОМПАНИЕЦ

Антонина Михайловна

УДК 615.361 : 111.13.7.014.41

КОНСЕРВИРОВАНИЕ КОНЦЕНТРАТОВ ТРОМБОЦИТОВ И ИХ ЛЕЧЕБНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ

14.00.29 — гематология и переливание крови

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва 1992

Работа выполнена во Всероссийском гематологическом научном центре Министерства здравоохранения Российской Федерации и Институте проблем криобиологии и криомеди-цины Академии наук Украины.

Научный консультант

заслуженный деятель науки РСФСР, доктор медицинских наук, профессор В. А. Аграненко.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л. А. Жеребцов, доктор медицинских наук В. М. Городецкий, доктор медицинских наук, профессор В. Б. Хватов.

Ведущее учреждение — Санкт-Петербургский научно-нс-следовательский институт гематологии и переливания крови Минздрава РФ.

Защита диссертации состоится «...». . . . 1992 г.

в «... » часов на заседании специализированного совета Д.084.64.01 в Научно-исследовательском институте детской гематологии Минздрава РФ (117513, Москва, Ленинский проспект, 113).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ ДГ Минздрава РФ.

Автореферат разослан « » . . 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

А.Е.Бухны

finST.'üTD'i

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

с", 2. :'■. !:з,¡is Отд-эл Ы 'иссертгция- -

•г/ально&ть проблемы. Разработка эффективных методов

ввдёлёлжя а консервирования концентратов тромбоцитов /КТ/ для лечебной' практика является одним из важных разделов современной трансфузнологяа.

Последние 15-20 лат отмечены постоянным ростом потребности в тромбоцитах, особенно в гематологических и онкологических клиниках, так как их трансфузии явшшсь эффективным методом профи -.¡тактики и - терапии, тромбоцитопенического геморрагического синдрома при гемобластозах и. депрессиях, кроветворения, позволившим значительно снизать легальность а риск, осложнений, связанных со спонтанной, кровоточивостью / Ковалева 1.Г.,1978; Воробьев А.И., Городецкий: В.М., 1980, 1981; Фа%штеЁи Ф.Э. и соавт., 1987; Gardner FH 1974; chang Hi et а1 , 1976; Kahn ПА ,1йГ/. Трансфузии. KT дают возможность проводить, в полном объеме современные программы интенсивной противоопухолевой терапии, в том

л .

числе, в период выраненной депрессии кроветворения /Воробьев А.И,, 1974, 1985;.,Гор0деЦки-1 В.М., 1Э8Г, 1991; Murphy S. et al.,1982; dlichter SJ ., 1983/; В США, например, число трансфузий KT за период, а 1971 па ЗЭ80 гг. врзросло с 410.СОО. до 2.860.000 / на 538$ /, а о I960 по 1986 гг. ещё на 191$ /feuchter sj ,1990/.

Такоа увеличение числа трансфузий KT, особенно в экстренных случаях, требует,наличия тастоянац* запасов, функционально полно'-ценных тро^оцнтов, что' определяется эффективным методами их ввделения из донорской крова и консервирования. За рубежом эта проблема в целом решена с внедрением в практику специальной аппаратуры для заготовки и фракционирования цельной крови, различных гемоконсервантов, автоматических сепараторов клеток крови, аппаратов для перемешдвашм KT, а также с разработкой "нового поколения пластикатных контейнеров повышенной газопронлцаемсст/., пу.:-

— С -

мененга которых позволило продлить срок консервирования ГТГ при 22°С до 5 дней /Snyder EL it aL, 1986; Rock G. 1986; Holms S.et al. 1989; 'Guiiison н. et .a., 1990/. В ir стоящее время интерес иоследов ате -ей сконцентрирован на разработке методов пдлучения КГ., обедненных лейкоцитами, с целью предупреждения развития у больных аллоиммунизации и рефрактерности к траяофузиям. тромбоцитов /Brand A.et alX988;Ho'gman CP Д989;вг1Ьезол L et al,I990/.

В нашей стране адекватная транс|узионная терапия тршбоцд-топенического геморрагического синдромадолгое время проводилась лишь в зфупных медицинских центрах а учреждениях /Баранов А.Е. и соавт. 1976,1977; Агранепко В.А., 1979, IP83,I9u5; Воробьев А .И, •Городецкий. В A., 1980, 1981; Городецкий B.U., IS3I, 1983/, в ос -новном из-за отсутствия доступных методов ввдеяешя и консерви -рования 1СГ, а также специальной аппаратуры.

В лаборатории консервирования крови и её компонентов с середины 70-х годов с нашим участием ведутся исследования по созданию и изучение отечестведнят пластикаитх контейнеров, установлению возможности юс использования для хранения компонентов .крови., разработке специальной аппаратуры для веремевивашь Щ и до, ~ настоящее время перед наш била поставлена задача проведения' полного цикла исследований, вршштнх в шровой иракткде, направленных на определение оптимальных условий н длительности хране -ния КТ в серийных контейнерах отечественного производства, отягчающихся от зарубежных .отработку эффективных режимов ввделгеяия тромбоцитов из отдельных доз донорской крот, заготовленной на отечественных гемоконсервантах, изучение их иор$офункцаональной полноценности. На заключительном этале исследований требовалось вз;-чить лечебнуг з^ективногть .трансфузий свежезаготовяешлл И консервирован.':!« КТ у больных с тромбоцитопеническиы геморраги -

Ч-- ML,', синдромом. •'.',■

Методы криоконсервирования тромбоцитов hp получили широкого распространения у нас в стране а за рубежом, в основном из-за недостаточно! их эффективности, громоздкой технологии и высокой, стоимости. / Chernoii AJ et ai., 1989/. Не лишены недостатков криозалцшше вещества, применяющиеся в качестве криопро-текторов для, тромбоцитов - диметигсудьфоксид, диматилацеташд, глицерин /Än-itage W 1986; ¿'ahy GM 1986; van Prooijen HC et al., 1986/. Вместе, с тем, в последние годы вновь отмечен интерес к этой проблема, поскольку криоконсервирование предоставляет воз -ыожность долгосрочного хранения KT, создания, запасов аутологич-ных клеток, тромбоцитов, типированных по антигенаь. системы HIA / van Imhoff GW et al 1983; Murphy MP et alI986; Slichter SJ 1990/.

■ В исследованиях по криоконсервировашю тромбоцитов по-прежнему остается актуальным поиск эффективного, нетоксичного крио -протектора, В. этом плане интерес представляют соединения ряда амидрв^ а также полиолы, представители которых /диметилацетачид, глицерин., 1,2-пропандиол/ применяются для криоконсервирования ¡грсмбоцятоа и других клеток, крови. 'Важной задачей является также определенна оптимальных условий замораживания тромбоцитов» В частности, актуально изучение этапа фазового перехода вода-лед, оценг.а влияния внеклеточного переохлаждения на сохранность тромбоцитов с целью отработки ¿штйм&дмоё. программы замораживания КГ. с итобряннш'и криозащитныш веществами.

Диссертационная^ работа выполнена в соответствии с планами научянг исследований НИИ переливания ¿рови Всероссийского гематологического научного центра /№ госрэгистрациг 01870003445, !Ь госрегистрации 09100026236/, а также планом научных работ Института проблем криобиологии и криомедицины АН Украины / К госрегистрации 018200086769/. ' •

Цель и задачи исследования. Главной целью, настоящего исследования явилась разработка методов выделения, консервирования и криоконсервирования концентратов тромбоцитов для обеспечения потребностей, клиники, а аакже изучение лечебно! эффективности их трансфузий при тромбоцитопенических геморрагия*.

Для-достижения указанной цела в работе решались следующие; задачи:

- разработать метод выделения КТ из отдельных доз донорской / крови с целью получения оптимального числа функционально полно -ценных тромбоцитов, обедненных примесью лейкоцитов и. эритроцитов;

- исследовать влияние-на ыорфофункциональнке свойства тром-, боцитов в продессе хранения таких факторов, как температурный

реним, метод выделения и консервирования, концентрация клеток в КТ; • .

- разработать экспериментально и.научно-обосновать метод, консервирования КТ при положительной, температуре с использованием отечественной апиаратуры;

- исследовать и обосновать лечебную эффективность трансфу- -зий консервированных тромбоцитов' в сравнении со свекезаготовленным" у больных с тромбоцитопеническшл геыоррагическлм синдромом;

' - оценить влияние на лечебную.эффективность трэрсфу-зий све-жезаготсвленнгх и консервированных КТ наличия у больных аллош-мунизации, спленомегаяии, лихорадки на фоне инфекционных и сзп- . тических осложнений;

- исследовать .:р;юпротекторные свойства соединений рядов амидов и полиолов при замораживании тромбоцитов с целью выбора

■ :тибного криопротектора; сопоставить цитотоксичность и крио-криспротекторную активность веществ с их химической структурой п ж-которыми физико-хишческими свойствами; -

- нсслсдовагь ллкяаие переохлаждения влеклегочноЛ среды на цздгиишо^ фозотюго перехода во«а-лед на сохранность фИо-

5 -

консервированных тромбоцитов;

- определить оптимальные условия /криопротектор, его концентрация, программа охлаждения/ и разработать метод криоионсер-впрования тромбоцитов, способствующий сохранности их мор£офунк-ционатьной. полноценности.

Научная новизна. Выполнены комплексные исследования, включающие разрг1отку и научное обоснование методов выделения и консервирования Iii при. положительной температуре. Показана лечебная эффективность у больных с тромбоцитопзническш, геморрагическим синдромом трансфузиЗ. консервированных тромбоцитов в сравнении; со свежезаготовленннми, а такке влияние на неё аллоиммунизации, спле-номегалш лихорадки, на фоне инфекционных и септических осложнении

Впервые при замораживании тромбоцитов проведено системное изучение криопротекторных свойств а цитотоксилности. 21 соединения рядов полиолов и амидов,, оксиэтилированных производных глицерина и. амидов. Установлена з; зисимость их цитотоксичн^сти и криопро -текторяой активности от некоторых флзико-химических свойств; определены наиболее, перспективнее вещества для использования в качест-' ве криопротекторбв для тромбоцитов; синтезирован новый криопротектор - i-монометиловий эфир глицерина /а.с. № 1298203, 1986 г./.

Впервые па тромбоцитах человека показана отрицательная роль переохлаждения вняклеточной среды в их повреждении при заморажи-зании. Разработана оригинальная ступенчатая программа замопажи-вания тромбоцитов. Определены оптимальные условия криоконсервирования KT /криопротектор, его концентрации, программа -зхлааденит/ а разраоотан способ их криоконсервирования, способствующий сох ■ ранности основных показателей морфофункиональных свойств тромбоцитов / И 4680905/30-14/055875, 1992 г./.

Теоретическая и практическая значимость работы. Экспериментально и клинически обоснована возможность консервирован;!я Л :•

отечественных пластикатных контейнерах при температуре 2?.+1°С в течение. 3-5 дней. Продемонстрирована зависимость эффективности хранения от таких факторов, как метод выделения КТ, температурный режим, вариант перевешивания.

Разработан метод получения оптимальных количеств тромбоцитов из лейкотромбоцитарного с^оя отдельных доз донорской крови со сниженной, примесью лейкоцитов и. практически полным отсутствием примеси эритроцитов в КГ, характеризующийся меньшей травматиза-цией тромбоцитов в сравнении с методом их выделения из обогащенной тромбоцитами плазмы. .

Установлена высокая лечебная эффективность трансфузий'. кон-,сервированных КТ, сопоставимая с трансфузиями свежезаготовленных тромбоцитов, у больных о тромбоцитопеническшл геморрагическим сивдромсч. ■ .

Предложенные методы выделения в консервирования КТ из от -дельных доз донорской крови в отечественных пчастикатных контейнерах внедрен- в практику работы СПК/ВШЦ ,г.Москва /с 1988 г./, а также в Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова /с 1989 г./, Львовском НИИ гематологии и переливания крс зи /о 1989. г./, в Грузинском ЮС* переливания крови, СПК г.Твери, г.Тулы, г.Казани.' • По итогам исследований разработан соответствующий инструктивный материал, утвержденный Минздравом СССР в 1987 г.

Разработанные методы выделения, консервирования и криокон-сервирования КТ позволят обеспечивать потребности лечебных учреждений в тромбоцитах для трансфузий, в том числе аутологичных, что будет способствовать проведению рациональной трансфузионной терагчи тромбоцитопенических геморрагий.

Основные положения, выноскмые на зшциту.

I. Научное обосног-ише условий, метода и длительности кон-сррс1:у;0Бшиш в отечественных пластикатных контейнерах функцио -

нальпо' полноценных КТ, выделенных из обогащенной' тромбоцитами плазмы и лейкотромбоцитарного слоя отдельных доз донорской, крови.

2. Метод криояонсэрвирования КТ с ограждающими растворами, содержащими новый криопротектор I,2~пропандиол или глицерин ,и замораживании по оригинальной ступенчатой; программе',' опособст-

•вующий. сохранности корфофуйкциояальных свойств тромбоцитов.

3. Лечебная эффективность трансфузяй консервированных при 22+1°С КТ, проявляющаяся прекращением или уменьшением тромбоци-топешгческой кровоточивости, увеличением числа циркулирующих тромбоцитов. Сопоставимость лечебной эффективности трансфузий консервированных КГ с трансфузиями сЕекезаготовленных тромбоцитов-.

Апробация, работа. Основные положения работы доложены и обсуждены на научных конференциях ВШЦ МЗ И /1988,- Г990 гг./, научных конференциях и заседаниях Ученого совета ИПКиК АН Украины / 1934,1985,1991 гг./; Е-й Всесоюзной конференции по теоретически! я прикладным вопросам криобиологии / Харьков, 1984 г../; П Ук, райнском съезде гематологов и траяофузаологов /Киев, 1986 г./; 71 съезде фармакологов Украины Дарькоз, 1990 г./; Ш мезда гематологов а траисфузиологоз Узбекистана»/ Ташкент, 1990 г,/; Ш Всесоюзном съезде гематологов н трансфузиологов /Киров, 1991/; П ЫзадународпоШ конференции по криобиологии / Харьков, 1992г./,

Публикации. По теме диссертации опубликовано работы,

свидетельство на изобретение и решение о вы-на об ре те низ.

С1р.у^1ура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора.литературы, описания материалов и мзтедов исследо-■ ваяия, трех глав собственных исследований, заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста, иллюстрированы таблицами и рисунками. Список цнти-

ровашюй литературы включает работ отечественных к ejioot-• ранлых авторов, .

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ' ' '

' Материал е штоды исследовании

Объектом иооледоваиаЁ являлись концентраты тромбоцитов, выделенные из отдельных доз /500 мл/ консервированной, донорской" крови.методом дифференциального центрифугирования о использованием рефрижераторных цоитрифуг и систем строзкшс и счотаерешик отечественных плаохшсатных контейнеров /'Теыакон" »"Компоплао?9/« Процедуру Бццелениз тромбоцитов осуществляли в вергкз' 2-4 ч oí момента крозодачи, центрифугирование проводили при ташзратуре . 22^Г°С. Всего в экоперишнгах по выделения и консервированию : тромбоцитов' исследовано G4S KI. В раде опытов по хранению КГ в ■ условиях положительных температур/ сравнение температурного рэ-шша, варианта перемешивания/, а такае в экспериментам по врио -консервированшо. дая исследований объединяли тромбоцихи,-Ьояучбн ные из 2-х и более доз крови»идентичной по спстзмз ABO к резус-' фактору, _ \\

Лра положительных температурах /22°С, 4°0/ ШЕ'Кршша в отечественных властЕкатлих коатайнерах серийного лро'^лодоке/ из поливэдшлхлорзда, тоотшоотш SÓ0 ш, о продолыжа рифЕзш;-ями на внутренней поверхности.

При 22°С КГ хранили, в тзчонш 7 дней в уояовгак постояшк го перемешивания в автомагачеокдх Шаалка?:-Ш11су'йс10рах - фх^&'.и "Heiiner baba" ила отечзстзенном аппарате АНЕ 2-48 /спорость 2 об/мин, круговой вариант .перзмзшшшия, температура 22¿I°C/. В исследованиях по изучению влияния на тромбоциты у&иова£ перемешивания для хранения использовала аппарат, оовершаздпй олоз-ное вращательно-колебательное двияениа в трех плоскостях со'ско ростью 15 и 30 об/мин, а такке аппарат, Покачивающий контейнеры

- э -

п горизонтальной плоскости со скоростью 45 ЦИКЛОВ В' мип,

йра 4°0 КТ- хранили, в электрохолодальникэ в течение 3-х дней. Криопоноервирование КТ осуществляла о веществами1 ряда али -£акизсггах двдоз, рдца лолиолоэ» а'тагом с 10$ раствором даме-талоульфокояла в шгасмэ /контроль/. Сшгиа, очистка веществ и ксслэловшша вх физико-химических овойотв ооущэ отвлялись трупг-пой хшщсоз отдела краопротекторов ЩЩиК АН. Украины /руководитель - ci.il.0. Л.А.Хакина/.

Изучение ирзопротвкторных сзойотв веществ и оценку их вли-.яшгл па. морфофуйкци.ональные. свойства тромбоцитов в период экви -лпсЗрацяа /вдтотоясичяооть/ проводили о растворами, содержащими 3, 10 Я 155? кояц-з.тгрг.цта ¡шатунных соединений в плазме. Образца! КТ евмора^зваид з изталлачэокях контейнерах, вместимостью 10 мл, алюминиевых кснтаШюрая, ¡вместимостью 50 мл, а таете в контейнерах из адюмзнюзвой фольги./8-10 мл/. При изучении влияния на сохранность тромбоцитов фактора переохлаждения попользовали модифицированные' контейнеры с теплоотводшцим стержнем /А.Н.Но-ззкоз, С.Т.0лейшпс,1985/. Охлаждение проводили в аппарате, прог -> раммного замораяиваяся /изготовитель - опытное производство ШКиК АН Украины/; регистрацию программы вели по медь-капелевой термо -паре, установленной; в одном из контейнеров партии.

1'Была проведена оценка эффективности линейных режимов замораживания: I/ 1°С/шшдо -7о°С; 2/ Ю°С/мин до -'.0°С; 3/ 20°СДгая до -70°С; 4/ 30°С/мин до,-70°С с поледующиы погружением в жидкий азот. В -исследованиях по оптимизации условий криоконсервирования КТ применили ступенчатые /нелинейные/ программы замораживания. Контейнеры с КТ хранили в бункере с жидким азотом при -196°С от 24 ч до 2,5 лет. Замороженные тромбоциты оттаивали в водяной' бале при температуре воды 37°С.

Изучение функциональной полноценности тромбоцитов проводи-■ ли непосредственно после выделения КТ из дозы консервированной

крови, ежедневно в процессе хранения при положительных темпера-.турах, после 30- и 60-минутной экспозиции с изучаемыми криозащит-шшп веществами, а также после оттаивания замороженных образцов, В опытах по крЕоконсервированиа веред проведением исследований; • 1 испытуемые вещества удаляли, из клеточной взвеси центрифугированием, тромбоциты ре суспендировали, в аутологвчной! плазме.

Оценка КТ давалась по следующим параметрам:, подсчет числа тромбоцитов в фазовоконтрастном микроскопе /Нетерс В.К'. ,1976/; подсчет числа лейкоцитов и эритроцитов в КГ; морфологический: контроль в фазовоконтрастном микроскопе /метод Zucker м ивогег-li J ,1954/; определение рЕ капиллярным электродом па рН-мэтрз . фирмы "Radiometer " при 22°С, а такав отекяянлшл.электродом на рН-мзтре. 53-А? измерение рН, pOg и pCOg на газовом анализатора "avl "; определение содержания внутриклеточного-/бяояшшогсг центный метод/; измерение агрегации на одиночный,/АДФ/ и парный: /АДФ и арахидоновая кислота/ стимулы /фотометрзчэскп£ метод/; определение реакции, на гипотонический шое /катода iiandin kj et al 1970 и. Kim вк &. Baidini м ,1974/. В серпа. опытов определяли концентрацию молочной' кислоты в ЗСТ /£ер*.:знтаа2внцй г,утод/;1шток-сивнооть пэреЕИсного окисления- лшшдов /ПОЛ/ мембран тромбоцдоов, Ендуцированного закионым.железом /Лисовская И.Л. и соавт.,1980/; ретрактильнуи активность тромбоцитов /Скопана С.Б, ,1975/.

Клинические исследования основызаэтся иа 755 трансфузпях КТ, произведенных III больные с гемобдастозаыз и епяастнчесьой ■ • -анемией.

Возраст больных /53 азшдан и 58 мужчин/ был в пределах от. 15 до 77 лет; 99 из III пациентов /89#/ были не старка 50 лет.

Критериями лечебной эффективности трансфузий сЕекезаготов-леыных и консервированных КТ служили: ; I/ динамика клинического течения геморрагического синдрома; 2/ число тромбоцитов в периферической крови больных до трансфу-

- II -

зип 5 чераз I п 18-24 ч посла трансфузии1 3/ скорректированный: прирост тромбоцитов чараз I и 18-24 ч посла трансфузии;

А/ пооттранофузиошшИ выход тромбоцитов череа, I и 18-24 ч

поолз трансфузии;

5/ время. кровотечения по Бике .

1^пос"?лти№аскнй эффект оценивали по прэкращзншэ или уменьшили» кровоточиво ста различной локализации в первые ' чэрвливания', отсутствию овеаих геморрагии в течение ' 2-3 дней после трансфузий., исчезновению 1Ш уменьшению геморра-гий. на слизистых полости рта, кожа лица, туловища и конечностей.

Подсчет числа тромбоцитов у больных производили в фазовоконт-растном микроскопа, в камере Еоряэва, Соотношение взятой крови и г.емсйшзирующей. жидкоотя ооотавляло 1)60, количество тромбоцитов сосчитывала в 50-квадратах.

Скорректированный прирост тромбоцитов /ОПТ/ рассчитывали по формуле:

число тромбоцитов число тромбоцитов площадь поверх-поола пэсэлшэания " до переливания л ности тела

опт о —-=—.——-.- *

количество перелитых тромбоцитов /х 10**/ Пооттрансфузионный выход тромбоцитов /ГОТ/ рассчитывалия но формуле:

число тромбоцитов число тромбоцитов „ объем после переливания "" до переливания крови

количество перелитых тромбоцитов / х 10п/ -В процессе трансфузнонного мониторинга у больных система -тдчески определяли наличие в периферической крови лимфоцитотоксических антител ЮА-специфичнос-ги /лимфоцитотоксический тест Тега-вак1 р ,1968/, а такяе антитромбоцитарных антител /у.а.Вогп еь ¡и 1976/.

Статистическую обработку проводили методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента.

- 12 -

Диссертация выполнена в лаборатории консервирования крови е её компонентов /заведующий - Заслуженный деятель науки РСФСР, проф. 'В.Л.Аграненко/ Всероссийского гематологического научного' центра МЗ РФ /директор - академик АМН, проф. Л.И.Воробьев/, а так-• не в отделе криопротекторов Института проблем криобиологии и крко-ыедицияы Ж Украины /директор - академик Ж Украины,. проф.В.И.Гри-щенко/. Отдельные фрагменты работы выполнены совместно о к.б.н. Р.И,Волковой и к.б.н.Д.В.Балезииой - сотрудниками лаборатории' консервирования крови и её компонентов; к.б.н.Л.П.Порешиной -сотрудником лаборатории шмуногематологяи /заведующий - академик АМН Е.А.Зотиков/; д.м.н. A.M.Полянской и аспирантом Хан Чором -.сотрудникам»; отделения гематологии /руководители гПроф.Ф.Э.Файнш-тейн,к.м.н.В.Г,Савченко/*, М.И.Демичевой - заведующей отделением заготовки компонентов.крови СПК; к.х.н, Л.Н.Новиковым,к,б.н.А,В.Еп колонко, к.б.н.С.Т.Олейник - сотрудникам отдела криопротекторов /руководитель - проф. Луговой В.И./ ИШиК Ж Украины.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЕ.

ч

Консервирование концентратов тромбоцитов при полоеттельных температурах.

При разработке методов консервирования КТ в условиях положительных температур било исследование влияние на эффективность хранения тромбоцитов таких факторов, как температурный режим, вариант перемешивания, метод выделения из отдельных доз донорской крови, концентрация клеток, рН и др.

' Выделение тромбоцитов из отдельных доз донорской крови осуществляли двумя методами: из обогащенной тромбоцитами плазмы / ОТП/ и из лейкотромбоцитарного слоя консервированной крови

/ лтс/.

Нами проведена оптимизация метода выделения КТ из ЛТС с применением отечественной аппаратуры. Для этого была исследова-

на и проанализирована эффективность 8 режимов двухэтипного центрифугирования 414 доз' консервированной крови, отличающихся по жесткости и времени. центрифугирования на I и П этапах, Эффективность режимов выделения оценивали по таким- параметрам, как общее содершгаа тромбоцитов в концентрате / хЮ11/» концентрация клеток. / хЮ12/л/, объем КТ /мл/, количество концентратов, содержащих более 0,5х10^тромбоцитов, примеоь лейкоцитов и эритроци -тов з КТ.

В результате' проведенного анализа, по наиболее высокому выходу тромбоцитов в КТ из дозы консервированной крови были отобраны следующие реяи&ш;

I этап центрифугирования ~ 2150<з х 20 мин;

П. этап, центрифугирования1' - 190з х 10 мин или 180е х 12 мин.'

Выделение КТ из ОТП проводили при режима дифференциального центрифугирования;

I этап-центрифугирования - 68 ог х 13 мин;

П этап центрифугирования - 2800& х 20 мин.

При выделении данными режимами КТ из ЛТС в среднем получали 0,67+0,16 и 0,68+0,17 хГО^тромбоцитов из дозы консервированной крови; при выделении КТ из ОТП - 0,75+0,15 хЮ-^тромбоцитов /здесь и далее- приведены %с>//таблица I/. Общее число тромбоцитов и их концентрация были выие в КТ, полученных из ОТП /соответственно на II и 14% /, однако, различия между этими показателями для методов выделения не' носили достоверного характера.

В КТ, выделенных из ОТП, содержалась значительная, видимая примесь эритроцитов и в 5-о раз больше лейкоцитов до сравнению с КТ, выделенными из ЛТС / соответственно 1,2+0,3 и 0,22+ 0,15 х

о

х 10 лейкоцитов/.

Значения рН практически не отличались - 6,84+0,06 для КТ, выделенных из ОТП, и 6,87+0,07 для КТ из ЛТС.

,. ■ Таблица I

Сравнительная характеристика методов выделения концентратов тромбоцитов из отдельных доэ донорокой' крови Ai ±d/..

Матоды ввделония 1СГ

Сравниваемые показатели

ив обогащенной тромбоцитамц плазмы

ххв лейкотромбо-■ цитарного олоя

Доза консервированной крови, мл

Режимы центрифугирования 1-Й В50П П-й втап

Результирующая сила воздействия на тромбоцит, Н

Концентрация тромбоцитов, х 1012/л

Объем концентрата тромбоцитов, мл

Количество тромбоцитов в доза КТ, х Ю11

Примесь лейкоцитов в КТ, х Юа . "

рН

ATI, мкмоль/Ю11

РГШ, %

РГШ, ^мшГ1

Агрегация, %

/АДФ 200 мкмоль/

Агрегация, %

/АДФ 200 мкмоль и арахидоновая кислота ммоль /

Допустимые сроки хранения КТ при 22+1°С, дни

500680 ^ х 13 мин 2400 ^ х 20 мин

1,89 х ИГ10

1,42 + 0,41

55 i б

0,73+0,15 '

1,20+0,30 6,84+0,06 4,7 + 0,8

52 + 16 6,2 + 1,9

38 + ш 51 + 12

■ 500

2150 j. х 20 mm 190 5- х 10 мпд

Ill х Ш

-10

ч

\ \

1,19^0,30

64 + Ю

0,67+0,16

0,22+ t>,15 6,87+0,07 5,3 + 1,6

60 + 12 10,8+ 4,5

46 + 26 67+17 5

- 15 -

Сравнительное-изучение свекозаготовлешшх КТ, выделенных двумя методами, показало, что эти тромбоциты характеризуются высоким уровнем функциональной полноценности, однако, между ними имеются определенные различия в зависимости от способа их получения.

Так, содержание внутриклеточного АТФ было выше в тромбоцитах, выделенных из ЛТС, в сравнении о соответствующими показа -телями для КТ из ОТП - 5,3ни1,6 и 4,7+0,8 мкмоль/101Гтромбоцитов /различия статистически'недостоверны, р:=»0,05/ /табл.Г/.

Способность, тромбоцитов агрегировать под воздействием одиночного /АДФ/ и парного /АДФ и арахидоновая кислота/ стимулов также,была вше для КГ, выделенных из ЛТС, причем,средняя величина агрегации этих тромбощгаз на парный стимул достоверно отличалась от соответствующего показателя для КТ, выделенные из ОТП, - 67+17 и. 51+12$, р/ 0,05 /табл. I/. Различия между сгздни-ш показателями агрегации тромбоцитов., На одиночный сттлул не носили достоверного характера /соответотвенго 46+2& и 38+18$,р/0,5/.

i

Тромбоциты, полученные двумя методами,1 характеризовались высоким уровнем устойчивости к осмбтическому шоку. Сравнение параметров реакции тромбоцитов на гипотонический шок /РГШ/ в зависимости от способа их выделения: не проводилась, так как методики измерения реакщш отличались'величиной осмотической нагрузки на тромбоциты для КТ из ЛТС £ КТ 21 ОТП.

. Таким образом, оба. метода выделения КТ позволяли получать из дозы консервированной, крови достаточно большое количе тво физиологически активных тромбоцитов. Вместе с тем, существуют определенные различия между методами как по их эффективности /общее число и концентрация клеток.в КТ/, так и по уровню функционала ной п -ляоценности свегезаготовленных трогбоцитов. ■

Устаноатегние различия обусловлены, по-видалому, спсг^фи-

фичестсима особенностями мето; )в выделения КТ из ЛТС и из ОТП, ■ которые отличаются разной последовательностью чередования низких и высоких скоростей ;;рнтрЕфугпроваг"тя на I и П этапах выделения / табл. 1/ и основываются на двух разных моделях фракционирования цельной крови.

■Этап приготовления КТ очень вакен, Tai: как в процессе выделения тромбоциты соприкасаются с чужеродшаш. поверхностями, подвергаются механическим воздействиям /центрифугирование, ручная обработка, ресуспендирование/, которые мог^т их активировать или поввездать, интенсифицируя таким "образом метаболические про-■ цессы в сравнении с уровнемзл vivo , вызывая пои j® содержимого . тромбоцигарных гранул н т.д. Все это ысеет явиться причиной снижения функциональной активности г гемостатетеского потенциала тромбоцитов, отразиться на результатах консервирования и. лечбб -ной эффективности трансфузии IíT.

По условиям выделения КТ пз ОТП, на I этапе с помощью1 мягкого це н трк&утарoeehil i цельной крови- получав® обогащенную тромбоцитами плазму. Концентрат получает на Я а 'аде центрифугирования жестк1ш осахденкем троглбоцдтов на дно контейнера я врде плотного ос£ ta. Сразу после центрифугирования расуспзндярозать глотки--на удается, поэтому общепринят I,5-часовой лзрзод "еоиоя", в тачание которого тромбоциты продолжают находиться в тесноу ьгазккеточвоа контакте, и лишь затем их ре суспендируют легким рузниз расх::рги-:;-ем осадка в контейнере или помещением на мсивлку. iboeicE иного ^тсазательств, что ^ jTOt Период выделения, начиная с еосткого осаждения тромбоцитов и оканчивая ресуспендированном, происходит акт,.-.;аг"я тромбоцитов, возможна потеря содержимого аль^а-гранул />- yd: i- И ot, а-1 . ,I9üI; Shimi ии Т. <;t al.1985; Packhnm Илс.аДЭ87/ ÍI; глда- иальнш пр ¡имуществом катода виделенвя КТ из JE2X? яв-.♦ftisscsj кеклшешгс этого неблагоприятного дол троыбоцк/ов этапа-

- 17 -

приготовления. При жестком центрифугировании гчльной. крови на I этапе гнделения с целью концентрации тромбоцитов в лейкотром-боцитарном слое, кровяные пластинки оседают на относительно большую площадь эритроцитной "додуика", вследствие чего не происходит такого жесткого их ноятаета со стенкой контейнера и склеивания между собой, как при наделении из ОТП. В результате мягкого цент-рифугировгнил ЛТС па Е этаье выделения лейкоциты и эритроциты оседают на дна контейнера, а тромбоциты остаются взвешенными в плазме. Поэтому придавйом методе выделения не требуемся ресус-пзядгтрования ?рогбоцят£га, а также исключен период их тесного межклеточного контакта /период "покоя" при ввдеяениа ТГ из ОТП/,

Вмзсае с -гоу, при получашха, ИТ из ЛТС возможна активация тромбоцитов в резу.,.отате их "онтакта о лЕайкоцптагш в лейкотром-боцитарногл. слоа, под воздеГштвкеи' стимулпрущего пластинка фактора /РА»/у\ который внсвободдается из лейкоцитов при центрифугировании /-паса й.,1984 /.

Ещё один фактор, коториЛ иш учитывали при оценке КТ, выделенных двуая методами - это сила механического воздействия на тромбоцит / р/.' рассчитанная по формула дас г 2 и ТЬек м. /1984/, в ¿соответствии, с которой вельлна у лаходитоя в яр-мой зависч -мости ?т жесткости центрифугирования. Общая результирующая сила механического воздействия на тромбоцит, при выделении КТ из ЛТС 'состакп.а 1|1х1(Гт%; а при выделении КТ из ОТП - 1,89 х 10*%,

о О .

т.е.- г 1,7 раз? больше.

Недостатком метода выделения К_ из ЛТС является потенциальная опасность, потерь тромбоцитов н П этапе выделения, при центрифугировании сравнительно небольших объемов ЛТС /П5-1е5г,-л/ в контейнерах, вместимостью 300 мл. Поэтому необходимым услспи ел1 уставного выделения тромбоцитов из ЛТС является поддир,.--.ал ж вертикального ппояепия контейнере? г,о ьр^мя цги1т^кТуги;йьот:1,

предупреждение образования ск ~адок' и оседания контейнера на дно центрифужного стакана. В наших исследованиях, избежать значительных пбтерь клеток удалось за счет использования пентрифужных стаканов овальной /"корытообразной"/ формы, в которые помещали одновременно 6 пар сдвоенных, контейнеров, содержащих ЛТС. Такое компактное их размещение препятствовало оседанию контейнеров' в процессе центрифугирования. Возможен и второй способ - закрепление контейнеров перед центрифугированием меаду жесткими шсасти -намиг-вкладышами.

Вместе с тем, полностью исключить потери определенной части. тромбоцитов, оседающих на дно контейнера тесте о лейкоцита. ми и эритроцитами при втором центрифугировании, пока не удается. Этим объясняется меньшее, содержан'ю тромбоцитов в КТ из ЛТС по сравненю с КТ, выделеннымь из ОТЛ.

Важным преимуществом КТ, выделенных из ЛТС, является меньшая примесь лейкоцитов и практически полное отсутствие примеси эритроцитов, -Результаты исследований'Beutier е.et al.,/1980/, Savage в. /1982/, Gottschali EL et al., /1984/ Показали, что примесь лейкоцитов в КТ может ухудшать1результаты юисервирования тромбоцитов. Кроме, того, снижение содержания лейкоцитов в кон ~ центратах имеет важное значение для предупреждения или отсрочки развития аллои,.л!уиизации у Зольных, получающих систематические трансфузии тромбоцитов / Schiffer СА et al. ,,1983; Aoter EH ,1988; Slichter SJ ,1390/.

Нами было исследовано влияние методов выделения КТ на эффективность их последующего консервирования наряду с такими фактора., л, чак температурный режим хранения и вариант перевешивания.

Оценка эффективности 7-дневного консервирования тромбоцитов при 22iI°C проводилась i;j совокупности показателей их функционально.' полноценности в процессе хранения в термостатированной авто-

матической мешалке /круговой вариант- перемешивания, скорость. 2 об/мин/.

Общепризнано, что лучшим индикатором сохранности КТ при 22°С является величина рН: её снижение в процессе хранения шиш 6,0 сопровождается резким ухудшением показателей, посттраясфузи-онной выживаемости., укорочением длительности циркуляции тромбоцитов /Murphy S & Gardner FH 1975; Slichter SJ.Harker И976/. Повшенка ptl КТ вше ?,4 также неблагоприятно для сохранности тромбоцитов.

Величина рН КТ, выделенных из ОТП, в первые два дня хранения. практически не изменялась, достоверно снижаясь на 3-й день хранения /табл. 2/. Критическое'падение рН /ниже 6,0/ в этой серии экспериментов отмечено дважды: в одном случае на 5-й день хранения, во вторам - на,7-й, что в процентном отношении к числу исследованных КТ состазило 8 и 20%.

■ Величина рН КТ, выделенных из. JITG, в первые 3 дня хранения оставалась стабильной /табл. 2/. Достоверное её снижение отмечено посла'4-го дня хранения, а после 7 дней среднее значение pli составило 6,48+0,33, причем в 5 из'40 исследованных КТ /12% / этот показатель был ниже 6,0. На 5-й день хранения КТ из JITC падение рН ниже критического уровня выявлено в I из 48 исследованный концентратов /2% /.

Таким образом, в процессе 7-дневного хранения при 22+1°С рН основной массы КТ оставался выше 6,0. В КТ, выделенных из ЛТО, этот показатель изменялся медленнее и был выше: так, на 5-й день хранения средние значения-pli КТ из ЛТС были несколько выше рН КТ из ОТП на 3-й день хранения /соответственно 6,71+0,28 и 6,66+0,24 , табл. 2/. Установленные различия можно было бы объяснить меньшей концентрацией тромбоцитов в КТ из ЛТС. Однако сопоставление динамики этого показателя в процессе хранения

Таблица 2

Характеристика функциональной полноценности концентратов тромбоцитов преде их выделения из донорской крови и'в процессе консервирования в течение 7 дней при температуре 22*1 С, 1,1 + ¿г. •■

[оказатели

(Срок ¡хранения, •¡дни. • .

Методы эыделедия ЕТ

из, обогащенной

{.из лейкотромбо-¡- цитарного слоя,.

1 ! . , ( Ц + 6 . .. .Л • 1. • к

0 6,84+ 0,06 . 13 Ь-0,5 6,87+0,07 • 47

I 6,84+ 0,^6 31 1 0,01 .7,03+0,10 13 ■

га 3 6,66+ 0,24 23 1 0,05 6,20 +0,24 46 .

5 6,50+. 0,86 . 13 1 0,05 6,71+0,23 48

7 6,42+. 0,43 5 . 1 .0,5 6.,48+0,за.., ,.. 40 ,

0 4,7 +■ 0,8 5 5,3 £ 1,6 27

АТФ I 4,0 +1,1 17 ¿'0,05 • 5,0 + 1,3 II

икиоль/Ю^ 3 3,2 + 0»9 15 1 0»05. . 4,7 + 1,5 14

5 3,1 + 045 9 1 0,05 3,9 +• 0,8 28'

7 1,9 + 0,7 ;з . 1 0,01 3,2 + 0,8 , ■15

0 52 + 16 ■ 10' 60 12 18

I 59 + 17 25 61 + 15 37

3 54 + 22 18 \ 50 17 27

5 50 + 12 8 \\о ± 10 33 -

•7 20 + II 4 БЗ ± 12' ..16

0. 5,2 + 1.9 10 ' 10,1 -Л 4,5 18

РГШ, I 6,9 + 4,2 25 о а + 3,7 Б?

3 3,9 + 1,7 1В 7Д + 2,0 2?

5 3,1 + 1,7 10 4,0 + 1.2 33

7 2,0 + 0,3 4 3,3 + 1,2 16

Агрегация 0 51 + 12 8 /0,05 67 + 17 12

/Ш 200 ык1л I 43 . + 15 ' 10 2 0,05 56 + 14 12

и арахидоно,- :3 39 19 17 /0,01 67 ■ ± 14 12

вая кислота 2 ымоль/ 5 30 и 18 /0,5 40 + 19 19

7 22 + 12 5 1 0,05 40 + 7 . 5

о 0 38 ... 1В ' 8 46 + 26 12

агрегация, I 1Ь + 17 19 1 0|02 28 + 21 ■ 12

¿00 3 10 10 ■ 16 — 8 + 8 12

..<К.,ЮЛЬ / 5 . й + ь 6 - А 3 12

0 0

КГ, выделенных двумя мотодамп, и содержащих примерно одинаковые концентрации тромбоцитов показало, что и а этих условиях рН КГ, полученных из ЛТС, изменялся медленнее а был выше соответствующих значений, для КТ, выделенных из ОШ.

Известно, что эффективность консервирования тромбоцитов при 22°С, поддержание, р!1 КТ в оптимальных пределах, особенно арЕ высоких концентрациях клеток, зависит от газопроницаемости штстикатных, контейнероь, в которых, они хранятся.

Нами парачлельно Исследованы параметры, косвенно характеризующие газопроницаемость пластзкатыых нонтзГшеров в динамике хранения - парциаль'ное. иалряжеше кислорода /рОд/, парциальное напряжение углекислого газа /рСО^/ и рЕ КТ» Установлено, что 5-дневноа хранение КТ' при 22+1°С в поливиншшгоридных контейнерах отечественного производства сопровождалось увеличением парциального напряжения кислорода а уменьшением парциального напряжений углекислоты в концентратах кче'ток, при этом величина рН в первые 3 дня хранения, практически, не изменялась, снижаясь к 5-му дню хранения, Полученные данные свидетельствуют о хорошей газопроницаемости отечественных пластикатных контейпров, их пригодности для хранения КТ -з-условиях комнатной температуры.

Концентрация тромбоцитов, в КТ, выделенных из ЛТС, в течение первых 4-х дней хранения практически не изменялась по сравнению с исходным уровнем, достоверно, снижаясь на 5-й день хранения в среднем на 10%.

Что касается концентрации тромбоцитов в КТ из ОТП, то в первые 1-2 дня хранения изменения этоп показателя были минимальны /+2-3$ /, причем наблюдалось как уменьшение, те.; и увеличение числа троыб.оцитов - последнее, по-видимому, за счет полного расхождения агрегатов клеток,, образующихся при выделении тромбоци -тов дрннкм методом. На 5-й день хранения концентрация тромбоцитов

в КТ', полученных из ОТП, уменьшалась в среднем на 8-9$.

Исследование' морфологии тромбоцитов, сохраняемых при температуре 22+1°С, в фазовоконтрастном микроскопе выявило сохранность дискоидной формы, характерной, для свежезаготовленных кровяных пластинок. Б течение первых 3-х дней храпения КТ, выделенных из ЛТС, содержание дискоидных форм в них достоверно не изменялось; появление дегенеративно измененных.тромбоцитов отмечено после 4-5. дне£ хранения при падении рЫ КТ до 6,3-6,0 и ниже.

Показатели, содержания .внутриклеточного АТФ в тромбоцитах в процессе их 7-дневного хранения при 22+1°С были достоверно выше для КТ, выделенных из ЛТС /табл. 2/. В первые 3 дня хранения . КТ из ЛТС уровень внутриклеточного АТФ достоверно не менялся, •снижаясь на 5.<~е сутки в ореднем на 26$. При хранении КТ, выделенных из ОТП,■содержание АТФ в тромбоцитах к концу 1-го дня уменьшалось в среднем на 15$, на' 3-й и 5-й'дни - соответственно на 32 и 38$. Сопоставление полученных данных показало, что средний уровень внутриклеточного АТФ в КГ ЛТС на 5-й день хранения, был выше, соответствующего показателя для из ОТП на 3-й день хранения /соответственно 3,9+0,8"н 3,2+0,9 мкмоль/10**тромбощг-тов, р/0,05/, а уровень АТ2) в свеяезаготовлешшх тро.гЗс:р'тах,• полученных из ОТП, соответствовало содержанию внутриклеточного АТФ в тромбоцитах из ЛТС на 3-й день хранения /табл. 2/. Мояно предположат, что более низкий уровень АТФ в КТ из ОТП в донь выделения,, а такке более значительные потери внутриклеточного АТФ в процессе хранения этих тромбоцитов являются следствием большей их травматизации при получении данным методом в сравнении с методом выделения КТ из ЛТС.

Средние показатели Р1Ш, полученные в динамике хранения КТ, выделенных из ОТП и из ЛТС, между собой не сравнивали-, так как тромбоциты при исследовании подвергались разной осмотической наг-

руэге, измерения проводились па разных приборах.

Б процессе хранения КТ из ОТИ абсолютная величина РШ до 5-го дня практически не изменялась, однако, начальная скорость обратной фазы реакции / достоверно снижалась к 3-му дню

хранения в среднем на 38$. В последующие дни сниж.-ше начальной скорости РГШ продолжалось - на 50$ к 5-му дню и на 68$ - 7-му дяэ храпения. Некоторое увеличение показателей РГШ к концу 1-го дчя хранения по сравнению с походным уровнем может расцениваться ¡как свидетельство активации /травматизации/ тромбоцитов при этом методе выделения, а также возможности последующего восстановлении / в какой-то степени/ их функциональных свойств.

?~дпешоо храпонио при 22+1°С КТ из ЛТС сопровождалось постепенным сшшзшшм парша трое РГШ. Абсолютная величина РГШ изменялась мрллзнио, достоверное её уменьшение отмечено только на 5-й день хранения. Болзе выраженным было снижение начальной скорости рэакции, динамика которой в процессе хранения бьша сходной с из-маношюм этого показателя при хранении КТ, выделенных из ОТП /табл. 2/.

Хранение КТ при 22+1°С сопровождалось быстрой потерей способности тромбоцитов агрегировать под воздействием АДФ /табл. 2/: в некоторых КТ на 3-й и 5-й дни хранения агрегация на одиночный стимул отсутствовала независимо от метода их получения. Одншсо в первые сутки хранения способность тромбоцитов к АДФ-агрегации сохранялась и была достоверно выше для КТ из ЛТС по сравнению с КТ, выделанными из ОТП /соответственно 28+2Г и'18+17$, р/0,02/. Вместе о тем, на протяжении всего срока консервирования сохранялась агрегация тромбоцитов в о-вет на парный / АДФ и арахидоновап кислота/ стимул, моделирующий условия, приближенные к естественным. Средние показатели агрегации тромбоцитов, выделенных из ЛТС, в первые 3 дня хранения практически не изменялись, снижаясь на

по сравнению о исходным уровнем лишь к 5-му дню хранения /р/0,05/. Показатели агрегации тромбоцитов, выделенных из ОТП, достоверно онижадись к концу 1-го дня хранения, в последующие дни сохранялась тенденция к их снижению /табл. 2/. Следует «5У метить, что пооле 5-ти дней консервирования КГ при 22+1°С сохранялось в среднем 60$ агрегации тромбоцитов на парный отимул по отношению к исходному уровню независимо от метода выделения, хотя по абсолютной, величине показатели агрегации были выше для КТ, выделенных из ЛТС.

Сопоставление результатов хранения К! при 22°С и 4°С кока-зало, что температурный режим сам по себе окавыво&т большое влияние на монофункциональные свойства тромбоцитов г во многом определяя уровень их сохранности, в процессе консервирования.

При кратковременной, в течение 3-х дне£, хранении КТ при 4°С количество тромбоцитов уменьшалось в среднем на 14%, в контейнерах образовывались видимые мелкие агрегаты. Исследование образцов КТ в фазовоконтраотном микроскопе, обнаруживало микроагрегаты, тромбоциты характеризовались сферической формой; полная потеря дпско-видности. отмечалась в первый день хранения при 4°С. Солодовое консервирование КТ сопровождалось быстрым снижением показателей реакции на гипотонический иок - величины РГШ и начальной скорости фазы обращения: на 46 и 52$ в 2-й день хранения и на 67 и 65$ на 3-й день хранения, что соответствовало снижению параметров РГШ на 5-й и 7-Й дни хранения КТ при 22+1°С. Отмечено значительное снижение уровне внутриклеточного АТФ - на 4056 в первый день хранения, в последующие дни этот показатель изменялся медленнее. Вместе с тем, консервированные при 4°С тромбоциты выявили высокие показатели агрегационной активности: величина агрегации на одиночный стимул /АДФ/в первые 2 дня хранения была выше /105125%/ или соответствовала аналогичном показателям для свежезаго-

топленных КТ, уменьшаясь на 3-й день в среднем на 20$.' Величина рЕ КТ в процессе хранения снижалась незначительно - в среднем на 0,1 за 3 дня консервирования.

Анализ полученных данных указывает, что хяррктерной особенностью холодового хранения КТ является стабильность рН и хорошая

сохранность агрегационной. активности тромбоцитов. Однакочнеобра-

1

тимал потеря тромбоцитами диокоидной форма, низкие показатели РГШ, значительное. снижение уровня внутриклеточного АТФ косвенно свидетельствуют о возможном ухудшении посттрансфузионной выживаемости этих тромбоцитов. Следует отметить, что резкое падение уровня иоследуемих. показателей ДТШ, АТФ/ наблюдалось в 1-й день хранения при 4°С, в последующие дни тенденция к их снижению сохранялась, по достоверных различий между показателями для Г, 2 и 3-го дней хранения не установлено. Tasoe быстрое изменение морфо-функциональных свойств тромбоцитов по оравнению с результатами их хранения при 22°С обусловлено, по-видимому, специфическим неблагоприятным действием охлаждения, которое описано многими исследователями / Kim ВК & Bbldini М ,1972; Kattlove НЕ ,1974/.

Таким образом, сопоставление>результатов консервирования Ю при 22°С и 4°С показало, что комнатная температура /22+1°С/ предоставляет возможность более эффективного и длительного их хранения.1 Вместе с тем, консервирование КТ при 4°С имеет и овои положительные стороны. Помимо отмеченных выше стабильности рН и сохранности гемостатической функции, это прежде всего гораздо более низкая опасность бактериального роста в КТ, а также простота хра нения /электрохолодильник/.

Обязательным условием эффективного хранения КТ при температуре 22°С является постоянное мягкое перемешивание контейнеров с тромбоцитами, которое способствует газообмену между концентратами и внешней средой, удалению СОо , оксигенации КТ и поддержаиип

рН в оптимальных пределах. Результаты консервирования КТ при 22°С во, многом зависят от условий- перемешивания - адекватности газообмена, гидродинамических характеристик размешивания, обусловливающих кинетику тромбоцитов, степень их контакта со стенками пластикатных контейнеров, вероятность активации, /повреждения / кровяных пластинок.

В процессе отработки условий консервирования тромбоцитов при 22°С, для автоматического их перемешивания нами били использованы несколько аппаратов различной коптрукции, позволивших реализовать три варианта-размешиваний:' I/ в горизонтальной плоскости; 2/ в трех плоскостях, при слояном вращателыш-колебательнсм покачивании контейнеров о КТ; 3/ круговое,- вокруг широкой стороны контейнера. '

Сравнительный анализ эффективности эгих вариантов показал, что наиболее приемлемым для хранения тромбоцитов в отечественных полимерных контейнерах является круговое /циркулярное/ их перемешивал: з на автоматических мешалках « отечественной, ЛЛТ1 2—Î3, и фирмы " Hcimer ЬаЬь", со споростью 2 об/мин. Этот вариант' использовался нами в основной серии экспериментов по консервированию при температуре 22+1°С КТ, ввделашшх из 0TII н из ЛТС /табл. 2/, Хранение КТ, вццелеиных из ОТП, при автоматическом перемешивании в трех плоскостях /2~й вариант/ сопровождалось 'более' выраженным падением рЕ - в среднем на 0,57 х: концу, 3-го дня храпения, при сравнительно ; меренной концентрации тромбоцитов в КТ -1,2 - Г,ЗхЮ12/л, тогда как на циркулярной мешалке величина рН в эти ке сроки хранения снижалась в среднем на 0,18. Кроме того, ■ на 3-й день хранения установлено значительное - на Зд% - падение уровня внутриклеточного АТФ, снижение параметров РГШ на 32-40%. Таксе быстрое падение pli и, как следствие, низкие показатели сохранности тромбоцитов в сравнении с результатами их хранения на

круговой /циркулярной/ мзшашсв обусловлены, по-видимому, недостаточны!.! газообменом между КГ и внешней средой при данном варианте размешивания.

В процессе З-дпевного хранения ДТ на горизонтальной мешалке /1-й вариант/ величина рН снижалась ещё быстрее, в контейнерах появлялись видимые мелкие агрегаты, образование которых расценивалось как следствие активации кровяных'пластинок при размешивании, В первые 2 дня хранения показатели функциональной полноценности тромбоцитов /РГШ, АТФ/ оставались на высоком уровне, однако на 3-й день всегда отмечалось значительное их снижение .

Таким образом, предетавлвшшй анализ проведенных исследований свидетельствует о том, что оба метода выделения КТ отобранными режимами центрифугирования позволяют получать из дозы консервированной крови достаточно высокое число функционально полноценных тромбоцитов. Эффективность их последующего консер— ■ впрования в отечественных пластикатних контейнерах определяется условиями выделения 1(1, температуряод режимом хранения, ва -рчантом перемешивания.

Выделение КТ из ЛТС принципиально отличается от метода их получения из ОТО иояыяеЯ травматизацпей. кровяных пластинок, низ-п:гм содержанием лейкоцитоз /0,22+0,15 п 1,2+0,20 х 10®соответственно/ и отсутствием видимой примеси эритроцитов. Однако в КТ, выделенных из ОТП, вте обэде число тромбоцитов /0,75+ 0,15 и 0,67+0,16 хГО11/ к концентрация /1,42+0,41 л Г,15+0,3ОхЮ1?'л/, хотя эти различия статистически недостоверны. Тромбоциты, полученные из ЛТС, характеризуются более высоки,) уровнем показате -лей функциональной полноценности, например, агрегационной активности и содержания Енутрщ-ле точного АТЗ, что, по-видимому, обусловлено меньшей их травматьзацие* /¿ьишацией/ выделении данным методом.

Наиболее высокий уровень сохранности КТ получен в результате их консервирования при температуре 22+1°С в условиях пос -тоянного автоматического перемешивания на круговой /циркулярной/ мешалке со скоростью 2 об/мин, что явилось основанием для разработки и внедрения в производство "Термостатированного аппарата для автоматического перемешивания тромбоцитов" -АДТ 2-48, обес-нечивающегр условия для хранения концентратов кровяных пласти -нок в течение 3-5 дней.

Меньшая травматизация тромбоцитов при выделении КТ из ЛТС явилась фактором, определяющим более эффективное их хранение в отечественных пластикатных контейнерах в сравнении'с КТ из ОТП. Тромбоциты, выде.-.зшше из ЛТС и консервированные при температуре 22+1°С при постоянном перемешивании сохраняют основные показатели морфофункциональной полноценности в течение 5 дней. К концу 1-го дня хранения эти КТ аналогичны свежезаготовленным; в последующие 2-й и-3-й дай отмечались лишь незначительные изменения показателей, которые достоверно снижались к 4-5-му дню хранения, оставаясь при этом на достаточно высоком уровне. Даже после 7-ми дней хранения КТ не наблюдалось полного угнетения физиологичес -кой активности тромбоцитов при условии поддержания рН вы&е 6,0.

Тромбоциты, выделенные из ОТП, сохраняли показатели функциональной полноценности на достаточно высоком уровно в течение 3-х дней хранения при 22+1°С. По своим характеристикам эти 3-дневные КТ соответствовали КТ иг ЛТС на 5-й день хранения. Снижение уровня параметров функциональной полноценности КТ, выделенных иа ОТП, к 5-му дню хранения составляло 35-50$ от исходного уровня, в эти же сроки возможно падение рН ниже критического уровня /6,0/.

На основании полученных данных установлены допустимые сроки хранения тромбоцитов в отечественных пластикатных контейнерах при температуре 22+1°С: для КТ, выделенных,из ЛТС, в течение 5 дней; для КТ, выделенных из ОТП - 3 дня.

Криоконсервирование концентратов тромбоцитов,

С целью выбора эффективного и нетоксичного криопротектора-для тромбоцитов было проведено системное изучение 21 соединения двух рядов химических веществ - амидов, поллолоз, оксяэтилиро-ванных производных ацетамида и глицерина. Комплекс исследований включал направленный синтез некоторых соединений, очистку .и идентификацию всех вещаси,'изучение их физико-химических свойств, выяснение характера и особенностей, влияния на морфофункциональные

свойства тромбоцитов в период оквилибрации, всестороннюю оценку

1

криопротелторной активности и токсичности»

В ряду амидов исследованы диметилацетамид /ЛДАЦ/, ацетачид, форыамшд, диметилформамид, диэтилацэ.тамад, ацетилморфолин,/!/-^ -оксиэтил/ацетамид, /У./У-^з -диоксиэтил/ацетамкд, а также 4-ре фракции оксиэтилированного Л/~адеталэтаноламина /ОЭАц/.

Установлено, что 5,10 и 15$ растворы исследуемых амидов, за исключением растворов ОЭАц, оказывали выраженное влияние-на' морфофункциональные свойства тромбоцитов, подавляя агрегацию, ретракцию, снижая величину РГШ и вызывая самые"разнообразные изменения форда клеток после кратковременной /Э.0 мин/ экспозиции. Наиболее низкий уровень цитотоксичности установлен для растворов ацетилморфолина и ДМАЦ; растворы ОЭАц не оказывали неблагоприятного действия на тромбоциты.

При исследовании криопротекторной активности указанных соединений. наиболее высокие показатели сохранности тромбоцитов били .получены в результате их замораживания с 10$ растворами ОЭАц /1-я фракция/ в плазме: в КТ сохранялось в среднем 88$ тромбоцитов,их ретрактильная активность составила 80+2$ по отношению к свежезаготовленным кровяным пластинкам, величина РГШ - 35+2$; АЦФ-агре-гация - 10+1$. После замораживания тромбоцитов с 5$ растворами ДОАЦ и ацетилморфолина в плазме /начальная концентрация/ сохраня-

лись в среднем ¡35-90$ кле-гок, показатели их ретракции были соответственно 73+2 и РГШ - 29+3 и 32+2$, ДДФ-агрегации - 17+4 и 27+5$ АШ/.,

Для ацетомида, формашда, диметилформамада получен знача -гелыю более низкий уровень криозащитной активности по отношению к тромбоцитам.'Раствори даэтшшцеташда, -оксиэтил/ацвтама-

да и А/¡А/~(р -диоксиэтил/ацогачидп характеризовались высокой ци-тотоксичностью и полным отсутствием аффекта крпозащиты.

Анализ полученных данных указал на существование взапыосвя-зи между степенью токсичности амидов для тромбоцитов и уровнем их сохранности при замораживании о этими веществами. Тенденция к улучшению результатов чриоконсервирования тромбоцитов- вследствие снижения токсичности криозащитных веществ наглядно продемонотрирова-на примере ОЭАц, для которого получены нанболзо стабильные и высокие показатели сохранности КТ.

Была предпринята попытка установления однофакторной корреляции криопротекторной активности исследуемых амидов с их физико-химическими свойствами., которые в той или иной степени могут характеризовать поведение или свойства соединений в криобиол.огиче окой системе, моделируя взаимодействия типа "криопротектор^солй", "кри- . опротектор-вода", "криопротекторгбиомеибраиа". Допускается, что к этим свойствам относятся: минимальный размер молекул вещества, как одна из характеристик его проницаемости для биомембраны; вязкость водных растворов; поверхностная активность; теплота растворения вещества в воде, коррелирующая с энергией его гидратации; число гидратации; относительная константа диссоциации солей Д/аС1, КС2 в водных растворах; коэффициент распределения вещества в бинарной системе "вода-хлороформ", как характеристика способности ы.-щастЕа растворяться в липидах мембран. Однако четких однофак-торшх зависимостей сохранности тромбоцитов до и после криокон -С1 Нжрзкания ст отдельных '¡взкко-хишческих свойств веществ уста-

новить не удалось, отмечены лишь тенденции такой зависимости. Причиной неудачи явились, по-видимому, сложные взаимодействия . в многокомпонентной криобиологической системе, взаимосвязанное влияние одновременно нескольких свойств веществ, а также токсичность амидов.

В ряду полиолов были исследованы 1,2-пропандиол, глицерин, алкоксизамещенные эфгчы глицерина - 1-монометиловый эфир глицерина /1-ММЭГ/, 1-моноэтиловый эфир глщерина /1-МЭЭГ/, 1,3- и 1,2-' димвтпловыз эфлры глицерина /1,3- я 1,2-ДМЭГ/, 1,3- и 1,2-диэти-ловые эфиры глицерина /1,3- и 1,2-ДЭЭГ/, а также оксиэтилирован-ный глицерин со степенью полимеризации п=5 /ОЭГ, п=5/.

Комплексное изучение криопротекторных свойств и ццтотоксич-ности растворов полиолов позволило установить наиболее высокий ■ уровень криозащитной активности при замораживании тромбоцитов у 1,2-пропандиола, 1-ШЗГ, 03Г,п=5, а также глицерина,при очень низком уровне, цитотоксичностл этих веществ.

Сопоставление полученных данных по цитотоксичности и крис-протекторной активности исследуемых веществ с их физпко-химичсс-кими свойствами позволило выявить существование определенных закономерностей. Так с увеличением дайны и числа аякилышх радикалов /СНд ; С^д / цитотоксячность веществ возрастала, нриопро -текторная активность падала, параллельно о этим увеличивалась степень гадрофсбности соединений - показателя, коррелиру>::;°го с цц-тотоксическим действием указанных веществ.Вместе с тем, ввежелпо в молекулу глицерина только одной метальной группы позволило получить вещество /1-ШЭГ/, обладающее высоким уровнем криозащитной активности, низкой цлтотоксичяостыо, а также лишенное недостатков глицерина, по-видимому, за счет снижения вязкости и повышения

проницаемости для мембран тромбоцитов.

Полученные нами результаты позволили условно разделить исследуемые полиолн на две г'г.'чгц."

100 ^

so-

80

70 60 H

50 " 40 -

СО" -20 .

10 -

ЩЩ

nmi

m-ñ

ш*

WKi fe

1,2-пропандиол Глицерш I-ММЭГ

Ш

i,

m

mái

SI

$

i

fm í

ОЭГ /п=5/.

Рис. I. Показатели сохранности концентрате:'. тромбоцитов, после замораживания под защитой полиолов.

- количество тромбоцитов в КТ; ЩЗ - ретракция;

£3 - ЕГШ; Ш - ОДФ-агрегацп/..

1-я группа - векесгва,- характеризующиеся слабил, гидрофоб-•ными взаимодействиями, высоким' уровням криопротекгорных свойств

п. наименее выраженным влиянием на морфофункциональные свойства •тромбоцитов до замораживания - 1,2-пропаздиол, 1-ММЭГ, глицерин.

2-я группа ■- • вещества,, характеризующиеся более выраженными гидрофобнытли взаимодействиями, с-наличием з молекулах двух метиль-яых или одной-двух этильных групп в разных•положениях, высокой, ци-тотоксичностью И' низким уровнем криопротекторных свойств -X,3-ДГЛ311, 1,2-даЭГ, 1-МЭЭГ, 1,3-ДЭЭГ, 1,2-ДЭЭГ. Вещества'расположены в по -рядка нарастания-цитотоксичности и падения я.иозащитной активности, вплоть до полного её отсутствия у 1,3-ДЭЭГ и 1,2-ДЭЭГ..

В результате- криоконсервирования тромбоцитов с 5$ раствора-Г,1;;: 1,2-пропандиола, 1-ЖЭГ, ОЭГ /п=5/ и 10$ раствором, глицерина •в-плазма,-при-скорости замораживания I к Ю°С/тш-, - сохранялись основные - показатели функциональной активности кровяных пластинок - ДР-агрегация, ретракция, РГШ, в КТ определялось 80-85$ тромбоцитов По отношению к-исходному уровню-/• рис. Г/. Достоверных раз-ДОТЛА между исследуемыми показателями. в зависимости от применявшегося вещества установлено, не было, хотя по абсолютной величине Наиболее, высокий уровень показателей получен для -1-МЫЭГ. Поело замораживания тромбоцитов, с 1,2-пропандиолом и I—Г.-Г-ЛЭГ в КТ определялось соответственно 20-25 и 10-18$ дискоидных- форм.

Таким образом, проведенные исследования позволили опрэде-ряд новых веществ, перспективных для использования в качество зриопротекторов при ааморатаваяия 'тромбоцитов - 1,2-прспандн-ол, 1-монометиловый эфир глицерина,' оксиэтилпрованный глицерин со степенью полимеризации равной 5 /ОЭГ, п=5/,' оксиэтилировачный ацетамид /I фракция/.

В исследованиях по ..оптимизации условий криоконсервирования КТ было установлено- вачепое значение фактора начального лереохлеа-

дения внеклеточной среды ;;л: по-т^ллюстн тро.о'н-птов при забора-

живании, показана необходимость целенаправленного управления процессом фазового перехода вода-^яед о целью стабилизации величины внеклеточного переохлаждения на низком уровне.

G учетом полученных данных проведена оптимизация программы замораживания тромбоцитов под защитой 1,2-пропандиола и глицерина.. Для этого кривая охлаждения была условно разделена на три этапа; 1-й этап - охлаждение суспеизии- тромбоцитов до начала кристаллизации внеклеточной среды; 2-й этап - охлаждение в зоне внеклеточной кристаллизации; 3-й этап - охлаждение после окончания кристаллизации. Для каждого этапа отрабатывали режим охлаждения, варьируя скорость замораживания, и определяли оптимальное значение конечной температуры каждого этапа, В результате проведенных исследований, были определены оптимальные паршет-ры ступенчатой программы замораживания тромбоцитов: со скоростью 1-2°С/мин до температуры начала кристаллизации защитной среды / -I * —X,5°С/-, далее со скоростью 0,4-0,6°С/мин до -6 -7°С, затем со скоростью 5-10°С/мин до -80 -s- -196°С.

Таким образом, проведенные исследования позволили отобрать эффективные и нетоксичные криопротекдоры для тромбоцитов, определить их оптимальную концентрацию и разработать оригинальную сту- • пенчатую программу замораживания тромбоцитов.

Условия замораживания КТ пом защитой 1,2-пропандиола /конечная концентрация 2,5-3$/ и глицерина /конечная концентрация 5-7,5$/ с применением ступенчатой программы охлаждения явились, основой разработанного метода криоконсервирования тромбоцитов, признанного изобретением Д> 4680905/30-14/055875, 1992 г./. В результате краоконсервирования тромбоцитов данным методом в ICI сохранялось 89+2 и 77+2$ кровяных пластинок /соответственно для 1,2-пропандиола и глицерина/, характеризующихся стабильным уровнем АДФ-агрегации - 30+3 и 33+2%, реакции иа гипотонический

шок - 33+3 и 36+3$, ретракции - 75+1 и 77+2%. После замораживания тромбоцитов с растворами 1,2-пропандиола в КТ определялось 30-40$ дискоидных форм. Подобные результаты были получены при криоконсервировании тромбоцитов с Х-Г,?ЛЭГ /2,5-3% конечная кон -црнтрация/, однако, дальнейшее использование этого вещества.будет возможно при условии получения его стабильной формы'в достаточных для практики количествах.

Лечебная эффективность трансфузий консервированных и. свежезаготовленных концентратов тромбо-чтоз.

Заключительным и наиболее, важным этапом оценки-гфуфелтивпос-ти разработок, касающихся методов выделения и консервировали" КТ, ■ &ш10 исследование их лечебной эффективности у больных с тромбоц"-топзничеоким геморрагическим синдромом. Эффек'шшость трансфузии консервированных КТ сравнивали с результатами. пр!иекэния свежеза-

• готовленных -тромбоцитов, в том числе полученных тромбоцлтаферезом от одного донора на автоматическом сешраторе клеток крови Рспу/а! С Б-3000.

На'- цинический опыт основывается на 755' трансфузиях КГ,

• произведенных III больным с гемобластозами /655 трансфуеий/ и апластической анемией /100 трансфузий/ /табл. 3/. Из них 481 трансфузия. КТ, 'КОНсерЕ :рован1ШХ-при;22°С, 21 трансфузия КТ, консервированных при 4°С, и 253 трансфузии свежезаготовлеиных КТ, пол/ -ченных из отдельных доз консервированной крови /104 трансфузии/

и методом автоматического тромбоцитафереза от лихого донора /149 трансфузий/.

Среди реципиентов КТ преобладали тя-злые больные с глубокой тромбоцитопенией л выраженным геморрагическим синдромом, обусловленными подавлением тромбоцитопоэза опухолевым процессом, интенсивной- цитостатической по'лихимиотерапией, аплазией кроветворения. Основными реципиентами КТ бил», вольные остсп'п -сикозами /та^л.З/:

таблица 3

Характеристики больных, получавших трансфузии консервированных и свежезаготовленных концентратов тромбоцитов.

Кольчеспзо трансфузии. КТ

Диагноз Число больных Всего консервированных при температуре свежезаготовлен-' " ных

22°С 4°С из отдельных доз кро ви методом тромбо-цитафе-реза

Острые лейкозы 83 5*3 348 19 79 197

Хронический

... .. и.!. О /терминальная стадия / 2 9 4 2 3 -

Ыиеломпад болезнь .. /Ш Б стадия/ I 6 4 . 3 •м

...иедодиспласти-ческий синдром 5 59 42 - 3 Г4

Лимфомы 4 29 17 - 5 7

Макрог""обулпнем:ш Ваиьденстреыа I 9 7 - I I

Апластическая анемия 15 100 59 ' ' 12. . 29

они получили 543 /72$ / из 755 трансфузий К'Г.

Тяжест« состояния больных была обусловлена глубокой анемией, л-йкоцитопенией. У 33 из 97 болы'ых с ге^областозаш в период проведения трансф"зий. КТ, ..а .фоне цитостатической тералии отмечалось развитие .инфекционных осложнений, преимущественно пневмоний /у. ^.'9 'больных/, ангин /у 8-ми/, септицемии /у 3-х/, сёптикопиемии / у 2/ проявляя ;ихся повышенной температурой, интоксикацией, У 14 больных цктостатическая терапия осложнилась развитием язвенно-некротического стоматита, у 7 - некротической энтеропатии, у 3-х развился геморрагический цистит.

347 /46$/ из- 755 трансфузий, были проведены с целью купирования трсгбоцитопенической кровоточивости различной, локализации. Частота развития геморрагического синдрома зависела от количества трочо'оцптов в периферической крови больных. В 75$ лучаез у больных с гемобластозами и d5$ - у больных апластической анемией геморрагии появлялись при тромбоцитопении от ~Г.000 до.10.ООО в мкл, соответственно в 16 и 12$ с гучасв - при'.числе тромбоцитов II.000-13.ООО/щи и лишь в 6$ случаев при гемобластозах и 1,5$ -при апалстической. анемии, кровоточивость развивалась при числе тромбоцитов 16.000-20.000/мкл. При числе тромбоцитов боле* .20.000 в мкл геморрагии наблюдались à 3-1$ случаев.

408 /54$/ из 755 тренсфузий проведены с целью -продупоедде-шш; развития кровоточивости при глубокой /менее 20.000/мкл/ тромбоцитопении у больных с гемобластозами в период проведения курса ' цптостатической по-чоимио терапии, а также при крайне низком cj -дерзании тромбоцитов в периферической крови у больных апластической анемией / от единичных до 10.000/мкл/.

В пащих исследованиях' прежде всего оценивалась динамика ю..1Ш1чесглх проявлений геморрагического синдрома.

Сравнительной анализ гемостатическто действия трансфузий свз-езаготовлеяньт: и коисервированиых при 22°С тромбоцитов сви -дэхэльсгвуют 6 том, что 1£Т, хранившиеся в "словиях комнатной температуры в течение 3-х дней сохраняют свою гемостатичсс: /н аг.кпз-пость и так ке эффективны, как и свежзаготовленные КТ. Так ч результате 201 /86$ / из'233 трансфуэий КТ, выделенных из ОТГ. и из JŒTC, и хранившихся в течение, 3-х дней при 22°С наблюдалось прекращение кровоточивости, а 27 /12$ / из 233 трансфуэий привели к уменьшению геморрагического синдрома. Из 103 траясфузий ссокеза-го: эвленяых КТ полный гемостаз отмечен при проведении Ь5 /32$/ переливаний, а уменьшение геморрагического синдрома - е результате 15 /14$ / траясфузий. Ге.моптйтическ'.1й"ой|«кт тр; псфуг:к;'; сьтаеза -

готовленных и консервированных при 22°С КТ находился в прямой за-■висимости от дозы перелитых тромбоцитов, локализации и выраженности кровоточивости. С увеличением количества перелитых тромбоцитов их лечебное деи^вие возрастало. ..

Анализ причин II /3% / неэффективных трансфузии свежезаго -товленных и коьсервированных при 22°С КТ, а к-ним мы относили так-ке случаи возобновления кровоточивости в первые сутки после переливания, показал, что в 2-х случаях они были связаны с недостаточной дозой перелитых тромбоцитов /менее Г "10**/; в 9 случаях''кратковременный эффект или его отсутствие наблюдали у болыы;:, рефрактерных к трансфузиям тромбоцитов вследствие развития аллоиммуниза-г ции, что подтверждено наличием лимфоцитотоксических антител в сь' ;воротке крови. _ ■ '

Прг трансфузиях КТ, консервированных в течение 1-х суток •при 4°С, отмечен кратковременный гемостатический эффект в 8 из II передаваний, 'проведенных больным острыми лейкозами. Отсутствие эффекта наблюдалось у 2-х нерефрактерных больных с маточным и.десне вым кровотечениями при трансфузии 2,7x10** и 2,5х10**тромбоци.-тов, а также " больной с кишечным кровотечением при'переливании 4,5хЮ**тромбоцитов, консервированных при 4°С»

Геыостатическую эффективность трансфузии КТ, функциональную полноценность перелитых тромбоцитов наиболее полно характеризует в^змя кровотечения. При переливании как свежезаготовленных, так и консервированных при 22°С тромбоцитов наблюдалось укорочение /нормализация/ времени кровотечения по вйк'У » которое до трансфу-•'зии превышало нормальные показатели в 4-10 раз, одновременно от -мечалос! прекращение явлений кровоточивости. Переливание яоиьер-вированных при 4°С КТ сопровождалось заметным уменьшением времени кровотечения-через I ч после трансфузии, через 18-24 ч этот показатель несколько возрастал, хотя оставался ниже исходного.

Однако в ряда исследований уменьшение времени кровотечения после переливания консервированных при 4°С КТ было отмечено лшць к 18-24 ч, пооло трансфузии, гекостатический эффект при этом отсутствовал, '

Важным показателем лечебной эффективности трансфузий КТ является увеличение количества циркулирующих тромбоцитов в периферической крови больных. В качестве параметров прсттрансфузи-опной циркуляции консервированных п свежезаготовленных КТ использовали абсолютный прирост тромбоцитов, а также два стандартизированных показателя; скорректированный прирост тромбоцитов /ОПТ/ и посттраясфузнощшй" выход тромбоцитов /ЛВТ/ через I и 18-24 ч после трансфузии, которые в настоящее время общеприняты для оценки эффективности трансфузии. Эти показатели учитывают не только абсолютный прирост тромбоцитов, но к дозу перелитых КТ, а также массу и рост больного /СИГ/ или объем крови /ПВТ/ и поэтому с большей'достоверностью позволяют сравнивать эффективность раз-' личных методов консервирования и функциональную полноценность тромбоцитов, чем показатели их абсолютного посттрансфузионного прироста. _

Для адекватной оценки параметров посттрансфузяонной циркуляции специальные исследования были выполнены в группе из 38 больных / 33 о гемобластозами и 5 с апластической анемией/, у которых отсутствовали тяжелые, инфекционные осложения, сепсис, спленомега-лия, лихорадка / ЗЭ°С я более/, антитела Н1А~спецкфнчпости и ан-титромбоцитарные антитела.

Результаты исследований, суммированные в таблицах 4 и 5-, свидетельствуют о том, что трансфузии сЕсжезаготовленных и консервированных при 22°С КТ, выделенных двумя методами, больным с глу-богой тромбоцитопенией позволяли значительно повысить у них число циркулирующих тромбоцитов. Несголько более низкие показатели

Таблица 4

Показатели лосттрансфузиошгой циркуляции консервированных и свсгезаготовленных концентратов тромбоцитов, вццелннных из лейкотромбовдтарного слоя, при переливании больным с тромбоцятопеническям геморрагически синдромом / И + м/.

Характеристика КТ 'Доза пе-!релитых ¡тромбоци-!тов, тт ! - /х10 у 1 !Коли-!чест--!во !транс- Чисто' Количество- тромбоцитов у реципиента боль-! / х Ю9/л / Скорректированный прирост ттомбошгтов /х103ДгД01Г/

темпе рату! с]хж 1<а храпе-Гхране-иия, С !ния,дш 1 ных 1 _ ; До транс- Бреют после ттансс?пгзии,ч Время после трансЗягзии, ч

'! фузий ! фузии I 18-24 г I Г 18-24

. 22 0 2,8+0,1 30 • 20 13,7+1,6 44,3+4,0 3-1,7+7,0 17,3+0,9 13,8+0,9

22 I 3,1+0,1 73 38 12,0+1,1 46,3+2,4 18,0+0,5 13,0+0,5

'.22. 2 3,2+0,2 27 19 II,1+1,0 44,4+1,9 55-, 4+1,4 17,2+0,5 П,9+0,7 1

22 3 3,3+0,2 28 14 13,3+1,7 48,9+2,5 32,8+1,5 17,1+1,0 10,8+0,6 ,

4 I . 2,8+0,2 21 12 11,7+1,3 27,4+3,7 16,3+1,7 10,0+1,4 р/0,05 4,9+1,0 р/ 0,05

полученные методом автоматического. тромбо-йтгадеереза 0 3,4+0,1 40 34 13,2+1,8 48,3+3,0 31,4+2,4 15,4+1,7 - 9,0+0,8

р / 0,05 - достоверность различий с соответствующими показателями для свежеза-готовленннх тромбоцитов

абсолютного посттрансфузиониого прироста тромбоцитов через 1824 ч после переливания КТ, выделенных из ОТП и хранившихся 3 дня, по сравнению о соответствующими показателями для КТ из ЛТС могут свидетельствовать об ухудшении выживаемости этих клеток, укорочении длительности циркуляции, возможно, вследствие травматиза-ции при этом методе вцделешш.

Хранение КТ при 1°С резко ухудшало показатели .их посттранс-фузионной циркуляции у болышх /табл. 4/«

Показатели СПТ через I ч после трансфузии /СПТ'^/ свежо заготовленных и консервированных при 22°С КТ, выделенных из-ЛТС, были высоки независимо от длительности хранения тромбоцитов /табл. 4/; величина СПТ через 18-24 ч после их трансфузии /СШ^/ незначительно снижалась по мере хранения, оставаясь на высоком уровне. Достоверных различий глежду показателями СП^ и СПТо.^ для свекезаготовленных и консервированных тромбоцитов установлено пе было.

Для свежезаготовленных и консервированных КТ, выделенных из ОТП, также установлен высокий уровень СПТ через I и 18-24 ч • •после их трансфузий /табл. 5/, за исключением величины СПТ^ для тромбоцитов, хранившихся 3 дня, которая била достоверно ниже соответствующего показателя для свегозаготовлонякх клеток, хотя существенно не отличалась от аналогичного показателя для КТ из ЛТС /табл. 4 и 5/,

Расчет показателей ПВТ позволил получить сходную дпнежпку посттрансфузиониого прироста тромбоцитов. В соответствии с расчетными данными, через I ч после переливания свежо заготовленных и консервированных при 22°С КТ, полученных из ОТП и из ЛТС, а также тромбоцитов, полученных методов автоматического тромбоци-тафереза, в периферической кропи больных восстанавливатось в среднем 50$ перелитых кровяных яластинок. Ь ярсцеосс хр&леиил

Таблица 5

Показатели посттрансфузионной циркуляции консервированных и свекезаготовленных концентратов тромбоцитов, выделенных из обогащенной тромбоцитами плазмы, при * переливании больным с тромбоцитопеническим геморрагическим синдромом /М+м/.

Характер

-ястика

температу ра хранения, °С

Орок

хране-

шш.дни

Доза перелитых тромбо-

Число

чест-во

трансфузий

больных

Количество тромбоцитов у реципиента _/ х109/л /___

Скорректированный прирост тромбоцитов /х103Д^Д011/

До трансфузии

Время после трансфузия, -ч {Время посла трансфузии, ч

18-24

18-24

22 . 0 3,140,2 20 14 14,7+2,0 51,1+2,0 39,7+3,0 18,4+1,2 12,5+1,0

22 . I 3,440,1 23 14 12,6+1,7 44,6+4,0 36,8+2,5 18,5+1,0 12,4+0,9

22 3 ■3,3+0,2 13 6 15,8+1,6 46,9+3,0 29,1+1// X 3,2+1,3 8,1+1,6 р /0,05

Г,полученные методом автоматического тромбо-цктафереза 0 3,4+0,1 т 34 13,2+1,8 48,3+3,0 31,4+2,4 ■ ',6+1,7 - 9,0+0,8

.е* го

р / 0,05 -

достоверность различия с соогвзхетЕдвдиа показателей д'-В, тромбоцитов

-вегезатотовлзЕннх

тромбоцитоз при 22°С показатели ITOTj практически не изменялись, тогда как уровень ПВТ^ к 3-му дню хранения ICI из ЛТС снижался-в среднем,на а для КТ из ОТП - на 12$.

Полученные данные позволяют предположить, что изменения, развивающиеся в тромбоцитах в процессе хранения при 22°С, практически не сказываются на показателях их лосттрансфузионяого при -роста в первые часы ь еле переливания, но проявляются укорочением. выживаемости /длительности циркуляции/ клеток, что отчетливо обнаруживается к концу 3-го дня хранения - по снижению показателей СШзд и IIBTg^, которое более внратаио для КТ, 'полученных из обогащенной тромбоцитами плазмы.

В. результате переливания КТ, -хранившихся при 4°С, установлены низкие показатели СПТ и ПВТ что позволяет говорить о повреждении этих тромбоцитов в процессе холодового хранения, которое проявкется ухудшением показателей их досттрачсфузионнок циркуляции /посттрансфузиошшй прирост и. длительность циркуляции/-у больных.

Нами произведен расчет величины прироста тромбоцитов на I дозу КТ /I доза - КТ, выделенные из 50. мл донорской крови/ у нерефрактерных больных с глубокой - менее 20.000/мкл - тромбоцито-пенией. Установлено, что переливание Г КТ, свежезаготовленного пли консервированного при 22°С до 2-х дней, позволяет повысить уровень тромбоцитов в периферической крови больных в среднем на 6.500-7.000 в I мкл. Для КТ 3-х дней, хранения, при 22°С этот показатель составил 6.000 в I-мкл. Поэтому показатели посттрансфузи-онного прироста тромбоцитов находятся в прямой зависимости от дозы перелитых КТ, причем эта зависимость сильнее, чем от длительности консервирования тромбоцитов при 22°С.

Таким образом, представленные результаты исследований свидетельствуют, что трансфузии консервированных при 22°С КТ способствуют прекращению юп уме::* ;аю кровом • . ••••«попошг-

ни кровотечения и ушшчешш У больных числа циркулирующих тромбоцитов так ко 'еффэктквно , как и свежезаготовланныз КТ.

Бл::янко аллошлмушзецви и некоторых клинических факторов на эффективность трансфузии концэцтрагов тром-•боццтов. ' '

, Нами проанализировано алшшо на сффскиашоса трансфузай свеке заготовленных и консорвЕрозашс: Ш гагшх факторов, как спленалегалия, лихорадка, аллол&цушюецая. Алло и м м у н и э а Ц'И я. Развитие аллоишуяйзацшг исаяедо-вали у 71 больного /57 больных с гемоблаотоз&ми и 14 болышх о ашгастической анемией/, определяя в otlDopowcs. крови тчьНГА Eii-татела /лимфоцит-токсические антитело/ и ¿ишшла'к собсмэилш антигенам тромбоцитов. В наши иеследованиях йолышо получали трансфузии тромбоцитов как из отдельных доз крови, так и от одио-■ го донора, однаково всех случаях ато ^ыди КТ от неподобранных по антигенам системы HIA или тромбоцитарнш антигенам доноров.

Появление лимфоцитотоксических антител было установлено • у 37 /65$/ из 57 больных с гемобластозаш и у 8./57$ / из 14 больных с апластической анемией; аитцтромбоцитарные'антитела были обнаружены у Г больного с острым лимфобластным лейкозом. Сроки развития аллоиммунизации широко варьировали - от 6 дней д* 13 месяцев, в одном случае ачтиЧПА антитела появились-спустя • 5 лет после начала систематической трансфузионной терапии. В • наших исследованиях взаимосвязи мезду числом трансфузий КТ, эрит-роцитной массы к развитием аллоиммунизации установить не удатгось. - У 3-х больных с острыми лейкозами обнаружено всадаздайД^а, лимфо- • цитотоксических антител несмотря на интенсивную трансфузионную терапию. . • ■ • • • .

Что касается,влияния HIA-антител на показатели посттрансфу-зленкого прироста тромбоцитов, то у большинства больных их нали-

чио вызывало резкое ухудшение параметров поог'трансфузиоиной циркуляции кровяних пластинок, снижая иосттрапофузкошшй прирост . и укорачивал длительность циркуляции перелитых клеток /табл. 6/.

Таблица 6.'

Влияние различных фаторов, визнвадаих у больных рсфрактер-поотт) к тр&чсфузиям тромбоцитов, на показатели скорректированного поогтрансфузгонного прироста

" cm/xiaWt,^/ io11

Факторн, ВНЗЦВакШЗ

рефрактэриооть

время поело тр.г-юфузии, ч Г 18-24

Аююиюлупязацдат <11 81 3,0¿X,Q

Силзисшгшпш . 21 70 II,6¿0,0 Лшгорлдпа

/SD°0 и вист/ Ш . 61 ?,9¿0tÓ Аллоявдункп Р.ШТЯ

и. спл"по«агаиш 10 '45 3,9¿0/f . Лгслоякмуигпшия

п,_лпхоргшт В II. 4,s¿0,5

Сгошокзгояия -

я лихорадка О БО 7,^0,0

2,9+0,8 3,5+0,4

3,5+0,5. 1,0+0,2

О

1,8+0,4

2:.:зсто о тем,' у части йолыпа /6, 13$/ наличие анти-ША ангатйя ппйкпгг'Зскп па влияло на показатели посттрачсфузиопной.цирку.ш ; порелитих 'тромбоцитов.

С п л о п о м о г а л г? я. Известно, что посттрансфузиошшп прирост тромбоцитов у болып.'х с увеличенной селезенкой заметно сни-кезтея, что, как очятсат, 'является следствием повышенного долог--ровйния тромбоцитов у;:эла'чапаии органом.

Наг-ш проанализировала эффективность 78 трансфузий КТ у 24 больных о увеличенной сойезенкой, при этом другие осложнения -лихорадка, инфекция, НХА-антитела - у них при проведении трансфузий отсутствовали». В соответствии с размерами селезенки больные были раздолоны на три группы; 1~л группа - селезенка выступает

из-под реберной дуги на 2 см; 2-я группа - на 2-5 см; 3-я группа - на 5 см и более>

Разная степень увеличения селезенки неблагоприятно сказывалась на посттрансфузионной приросте тромбоцитов. При увеличении размеров селезенки до 2 см CIITj был 12,7+0,6 /шел, а через 18-24 ч /СПТ24/ - 7,3н0,8/мкл. В то не время при значительно большем увеличения селезенки / +5 - +50 см/ CIITj был 5,1+0,3 и 5,4+0,4 а СГГГ24 - 2,3+0,2/мкл и 1,9+0,4/ыкл после переливания свежезаготовленных и консервированных KT соответственно.

Выявлена зависимость величины СПТ от наличия у больных высокой лихорадки при таких осложнениях, как язвенно-некрота-ческий стоматит, ангина и другие /табл. 6/.

Суммированные в табл. 6 данные о влиянии различных факторов, •вызывающих рефрактерность больных к перелитым тромбоцитам, на показатели скорректированного посттрансфузионного прироота позволяют прийти к следующему заключению. При наличии у больного одного из клинических факторов или аллоиммунизации резко ухудшается эффективность трансфузий и через сутки после их проведения число тромбоцитов в периферической крови возвращается к. исходному уровню, может возобновиться кровоточивость. Однако .сочетание перечисленных факторов практически не позволяет при переливании повысить число тромбоцитов у больных и при этих состояниях чаще всего наблюдается развитие генерализоЕ иного тромбоцитопенического геморрагического синдрома. •

Меры практического преодоления сйту5ц>;Й 5 H?crosüpe7-

время являются одним из главных напрвлешш исследований трансфизиологов, особенно это касается аллоиммунизации. В любом случае, при её развитии больные должны получать KT от одного донора, совместимые по антигенам HIA и собственным антигенам тромбоцитов. . образом, разработанные методы выделения и консерви-

ровашя КТ в функционально полноценном состоянии, установленные высокие показатели их лечебной-эффективности будут способствовать совершенствованию работы по фракционированию донорской крови на компоненты, созданию запасов тромбоцитов и обеспечению ими лечебной, сети для проведения трансфузионной терапии ■ тромбоцатопенического геморрагического синдрома,

ВЫВОДЫ

1. Лечебная эффективность трансфузия, концентратов тромбоцитов при тромбоцитопенических геморрагиях определяется многими факторами, среди которых помимо клинического состояния и .длмун-ного статуса больного зедущими являются:

- доза трансфузий; ' : .

- сохранность функциональной полноценности концентратов тромбоцитов;

- условия выделения и хранения концентратов тромбоцитов, обеспечивающие созданге их запасов для плановых и экст- • репных трансфузий.

2. На основании экспериментального и клинического изучения функциональных свойств тромбоцитов после воздействия различных факторов /релит! центрифугирования, условия приготовления и хранения, вариант перемешивания, концентрация клеток, рН и др./ разработаны методы выделения и консервирования концентратов тромбоцитов из отдельных доз донорской крови, характеризующихся высоким уровнем их полноценности ¡п- ^подтвержденной ле -чебной эффективностью при трансфузионной терапьл тромбоцитепо -нического геморрагического синдрома.

3. Выделение концентратов тромбоцитов гз лейкотромбоцитар-ного слоя отдельных доз консервированной крови принципиально отличается от метода их получения из обогащенной тромбоцитами

плазмы меньшей траьматпзагпеп ь<ет1к, отсутствием примеси ирит-

роцитов и сниженным содержанием лейкоцитов, ч'.ю позволяет заготавливать тромбоцита с более высокими показателями функциональной полноценности непосредственно после приготовления и в процессе консервирования.

4. Установлены допустимые сроки хранения тромбоцитов в отечественных пластикатных контейнерах типа "Гемакон"."Компопласт" в условиях постоянного перемешивания, при температуре ¿2+1°С :■ для концентратов тромбоцитов, выделенных из лейкотромбоцитарного слоя - 5 дней, для концентратов тромбоцитов, выделенных из обогащенной тромбоцитами плазмы - 3 дня'. В эти сроки тромбоциты, выделенные из лейкотромбоцитарного слоя или из обогащенной-тромбоцитами плазмы, сохраняют высокий 'уровень показателей морфофунк-циопальной полноценности.

5. Консервирование концентратов тромбоцитов при 4°С'сопровождается быстрым падением уровня показателей морфофушщиональ-ной полноценности /на 45-50$ к концу 1-го дня хранения/ и пост-тргчефузионной циркуляции, что снижает лечебную эффективность

их а^ансфузий, проявляется кратковременностью гемостатического дейстзия при тромбоцитопеническом геморрагическом синдроме.

6. Установлена высокая криозащитная активность при 'замораживании тромбоцитов к низкая цнтотоксичпсть Г,2-пропандиола, 1-монометилового эфира глицерина /а.с. 1298203/, оксиэтили-рованиых производных глицерина и амидов. Показана перспектив -ность их применения в качестве криопротекторов для криоконсе^ви-рования тромосцит^в.1

7. Установлено повреждающее действие на тромбоциты фактора начального переохлаждения внеклеточной среды, доказана необходимость управления процессом фазового перехода вода-лед для стабилизации величины внеклеточного переохлаждения на низком уров-пг с целью повышения сохранности тромбоцитов лри замораживании.

8. Разработан метод криоконсервировашгя тромбоцитов с 1,2-пропандиологл или глицерином на основе ступенчатых программ ох -л "здения" /■■№ 4680905/30-14/055875/, позволяющий сохранять основные показатели их морфофункпиональной полноценности в течение 2,5 лот,

9. Трансфузии консервированных концентратов тромбоцитов. оказывают выражечный гемостатический э^Тхзкт у 'больных с тромбоци-топеническим геморрагическим синдромом, сопоставимый с трачсфу - * зиями свекезаготовленных тромбоцитов, проявллкккийся прекращением пли снижением интенсивности кровоточивости, увеличение .числа циркулирующих тромбоцитов, уменьшением времени кровотечения.

10. Снижений или отсутствие лечебной эффективности трансфузии достаточной дозы концентратов тромбоцитов не связано с длительностью их консервирования, а определяется наличием у больных таких факторов, как аллоимглунизация, лихорадка, спленомегалш. или их сочетаний, что проявляется низкими показателягли посттранс-фузионпого скорректированного прироста через I и 18-24 часа, отсутствием или кратковременностью гемостатическога действия, ¿аз-вьгием рефрактерности.

11. Разработанные методы выделения и консервирования концентратов тромбоцитов с применением отечественной аппаратуры позволяют совершенствовать работу учреждений "лужбы крови по фракционированию донорской крови на компоненты и способствуют обеспечению лечебной сети тромбоцитами для адекватной трансфузионрой терапии тромбоцитопеничеокого геморрагического синдрома. •

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Криоконсер: "5ров1.яие тромбоцитов. Б кн. Криоконсервироигшпо клеточннл суспензий. 1{иев. Паукова думка. 1983, с.107-120.

2. Мо'.Лофункциональныо- свойства тромбоцитов госле воздействия криопротектороь. Тез. докл. 2-,. Всесоюзно.'! конференции по

теоретическим и прикладным вопросам криобиологии. 1984, том I, с.153 /Соавт.: А.В.Черкашша/.

3. Проницаемость мембран тромбоцитов для воды и глицерина при различных температурных режимах. Рук,деп. р ВИНИТИ 26.03. 1985, }5 2112-85, .9 с. /Соавт.: А.Н.Новиков, С.Т.Олейник, А.Ё.Ни-коленко/.

4. Криопротекторные. свойства соединений ряда амидов при замораживании тромбоцитов. Рук. деп. в ВИНИТИ 26.03.1985 2Ш-85, 16 с. /Соавт.: Т.П.Лшшик, А.В.Николенко, А.Н.Новиков,М.И.Шраго/.

5. Криопротекторы и криоконсерванты /основные направления исследований/. Криооиология, 1985, J» 3, с 8-13. /Соавт.:М.И.Шраго, Л.Н.Новиков, Л.А.Ханина и др/.

6. Пути совершенствования криопротекторов и создания многоксм-понентных криозащитных сред. Тез. П Украинского съезда гемаюл.

и грансфузиол. Том Л. Киев,1986, с. 86. /Соавт. М.И.Шраго,Л.П.Ере дихина, Л.А.Ханина/.

7. Криопротектор. A.c. В 12908203,1986. Опубл. в Б.И.,1987, Jä II. /Соавт.: М.И.Шраго, Л.А.Ханина, С.В.Кощий и др./.

О. Изучение криозащитной активности веществ ряда алифатичесюп амидов при замораживании тромбоцитов. В сб. Научно-технический прогресс в медицине и фундаментальные проблемы биологии. Харьков 1987. с. 6Г. /Соавт,: А.В.Николенко, Т.П.Линник/.,

9. Метод выделения и коисервированш. концентратов тромбоцитов Материалы 60-й научно/' сессии ЦНИИГПК. Москва, 19^8.с,25-26. /Соавт.:Л.В.Балезина, Р.И.Волкова,'В.А.Аграненко и др./.

10. функциональная полноценность тромбоцитов прл различных режимах яамораж'зания. В Л. Моделирование криобиологичсеких проце сов. АН УССР. Харьков.1988, с.167-172. /СОсЛЗТ.: В.И.Луговой.А.В.:

коленко, С.Т.Олейник, И.А.Иванова/. .

11. Лечебная-эффективность консервированных концентратов тром

боцитов . Клиническая медицина, 1989, Js 12, с.74-80. /Соавь.: В.А.Агрцнбнко, Хан Чер, А.М.Полянская/.

12. Трансфузии консервированных концентратов тромбоцитов при тромбоцитопенической кровоточивости у больных острым!, лейкозами. Рук. деп. в ВИНИТИ П,10,1989, & 6216-В89, 13 с. /Соавт.:Хан Чер.

13. Синтез, структура, крнопротеигорные свойства оксиэтилиро.-: ванных амидов при применении их для к]. .юкоя сервирования клеточных оуспензий. В сб. Патофизиологические аспекты действия холода' ' на.организм, АН УССР. Харьков. 1989, о. 89-93. /Соавт.: В.И.Луго-вой, Л.А.Ханина, М.И.Шраго'и др./.

14.. Влияние веществ ряда полийяов на морфофункциональнке свойства тромбоцитов'. Рун. деп. в ВИНИТИ, 28.09.1989. № 6037-^89,13 с. . /Соавт.: А.В.Николенко, С.В.Кощий, И.А.Иваяова, В.И.Луговой/. . 15. Криопротекторные свойства зещзств ряда полиолов при замораживании тромбоцитов. В сб. Физико-химические свойства и биологическое дзЕствта ирзопротекторов. АН УССР. Харьков. 1990, е.- 94-98. /Соавт, А.В.Шжаленко, И.А.Иванова/.

16, Поро^чшдвяЗ эфир гл1Щерина: цитотоксичность и криоьротек- . .т.рная шиеыЮсть прг замораживании,тромбоцитов. В.сб. Физико-химические свойств0 и биологическое действие кри'опротекторов. АН УС СЕ • Харьков. 1830, с. 59-63.//Соавт.:■ А.З.Николенко,С.В.Кощий,И.А.Иванова/, ■ ' ' ' *

■ 17, Токсическш свойства и криопрогекторяая активность оксиэти-лнрованных ацетплз тан ол аминов. Фармакология. Со стояние и перспе..-тпвн исследований. Тез.' У1 съезда фармакологов Украины. Харьков, .1990,- с.' 51 .'/Соавт.: В.М.Гучок, М.И.Шряго, Л.А.Ханипа и др./.

18.' Оптимизация ме:одов фракционирования донорской крови на компоненты и'их консервирование. Тез. докл. Ш съезда гематологов и -рансфузиологов Узбекистана. Ташкент. 1990, с 20-21. /С^лет.: .Р.И.Волкова, В.Л.Голубева, Д.В.БаЯбзина и др./.

-5219. Выделение концентратов тромбоцитов из лийкотромбоцитар-ного слоя донорской крови и. их консервирование. Гематол. и траис-фус юл., 1991, Л 3, с. 29/ь2. /Соавт.: В.'А.Аграненко, Л.В.Бале-зина, Р.И.Волкова и др./.

20. Низкотемпературное консервирование тромбоцитов под защитой. реществ ряда полиолов. Тез. докл. Ш Гее союзного съезда гематологов и .трансфузиологов.'Киров, 1991, т.1, с. 64-65. /Соавт.: А.В.Николенко, В.И.Луговой, И.А.Иванова/.

21. Трансфузии консервированных концентратов тромбоцитов -показания, дозировка, лечебная эффективность. Тез, дткл. II- Всесоюзного съезда иматологов и трансфузиологов, Киров,1991. т. I, с. 433-434. /Соав..: В.А.Аграненко, Ф.Э.Файнштейн/.

22. Криоконсервирование тромбоцитов с веществами ряда полиолов. Тез. П Международной конференции по криобиологии. Харьков, 1992 , с. 86. /Соавт.: А.В.Николенко, 3.-ИЛуговой/.

Подписано к печати 18.05.92 г. Тират. 100, зак. 412 Типография' ¡.50 РФ