Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Применение пенициллиназы в качестве маркера в иммуноферментном анализе для диагностики бруцеллеза

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА. ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ 1ШЧНО-ИССЛЕДОВАТЕ1ЬШЙ ИНСТИТУТ "ШКРОБ"

На правах рукописи

Ш И М К О Игорь Борисович

ПРИМЕНЕНИЕ ПЕШЩШШНАЗИ В КАЧШТВЕ МАРКЕРА В МОТОФШЯИТНОМ 'АНАЛИЗЕ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЁЗА

14.00,36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов 1991

Работа выполнена в Научно-исследовательском протквочумю институте Кавказа и Закавказья.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессо] Таран И.Ф., доктор медицинских наук, профессор Левк М.И.

Официальные оппонента: доктор медицинских наук, профессс Адамов Л.К., кандидат медицинских наук, старший научный сотрз ник Тешраяиева Г.А.

Ведущая оргаяизация: Волгоградски": научно-исследовательский противочумный институт Министерства здравоохранения СССГ

Автореферат разослан

Защита состоится " " ¿¿-¿^3-^1991 г. в ^? часов на заседании специализированного Совета К 074.32,01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Вс союзном ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовател ском противочумном институте "Микроб" (410601, г. Саратов, ул Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института "Микроб".

Учений секретарь специализированного Совета,

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник

Девдориани З.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

А к туальность проблемы. Бруцеллёз от-ся к антролоэооноздам инфекциям, поражающим как людей, так ьскохозяйственных животшх, что обусловливает огромный причиняемый им здоровью населения и народному хозяйству, тоящее время во многих регионах страны, в тем числе в Ста-льском крае, сохраняются активные очаги бруцеллёза. Работа оздоровлению включает иммунологический мониторинг с при-ием различных серологических методов лабораторной диагнос-из которых наиболее перспективным является иммунофермент-нализ (ИФА), обладающий общепризнанными высокой специфич-и и чувствительностью. Однако, наряду с достоинствами, ИФА применяемых вариантах не лишен и ряда недостатков, зачас-репятствующих широкому применению метода на практике. К южно отнести необходимость в специальной фотометрической 1атуре дая учета результатов, относительную трудоемкость лки при отсутствии средств автоматизации, потенциальную грогенность и мутагенность некоторых субстратов, вероятность (положительных результатов, обусловленных присутствием фер->в-маркеров в исследуемом биологическом материале, отсутст-¡ли труднодоступяость стандартных диагностических препара-I др. Одним из возможных направлений усовершенствования ИФА лея поиск новых, более совершенных ферментных маркеров и ?рат-индикаторных систем. Большой интерес в этом плане предмет уже нашедший применение в ИФА высокоактивный фермент гриального происхождения пенициллиназа, полностью отсутст-та в тканях и биологических жидкостях человека и теолокров-кивотных. К достоинствам пенициллиназы относительно распро-1ешшх ферментных маркеров (в т.ч. пероксидазы грена) сле-отнести ее доступность и дешевизну, высокую (в 30 раз вы-*ем пероксидазы) ферментативную активность. Кроме того, ком-яты субстрат-индикаторной системы для аенициллиназы доступ-удобны в обращении и безвредны для здоровья экспериментато-оубстратом является пенициллин, а хромогеном - готовый ап-ай препарат йодинол темно-синего цвета, по обесцвечиванию poro под действием продуктов гидролиза субстрата судят о

результатах анализа.

Цель работы заключается в разработке и усове шенствовании высокочувствительных и специфичных иымунофермент ных тест-систем с применением пенищшшназы в качестве ферыен та-маркера для определения антител к возбудителю бруцеллёза.

Задачи исследования:

1. Разработать методику приготовления антивидовых км?дуно пенищшшназных конъюгатов и их применения в ИФА.

2. Разработать тест-систему ИФА диагностическую антивидо вую пенициллиназную для определения антител при бруцеллёзе у людей.

3. Изучить диагностическую ценность и сопоставить основа характеристики иммунопенициллиназной тест-систеш ИФА для onpi деления антител пря бруцеллёзе у людей с аналогичной коммерче* кой пероксидазной тест-системой, а также с традиционными серологическими методами.

4. Разработать тест-систему ИФА диагностическую антивидовую пенициллиназную дая определения антител при бруцеллёзе у мелкого рогатого скота (MPC).

5. Изучить диагностическую ценность и сопоставить основш характеристики иммунопенициллиназной тест-системы ИФА для onpi деления антител при бруцеллёзе у MPC с традиционными серологическими методами.

6. Разработать тест-систему ИФА диагностическую антивидовую пеяициллиназную для определения антител при бруцеллёзе у крупного рогатого скота (КРС).

7. Изучить диагностическую ценность и сопоставить основнь характеристики иммунопенициллиназной тест-системы ИФА для опре деления антител при бруцеллёзе у КРС с традиционными серологическими методами.

8. Разработать тест-систему ИФА диагностическую пешщшшк назную на основе стафилококкового белка А (СБА), сопоставить е основные характеристики при определении противобруцеллёзных ал тител с антиьидовыми пенициллияазшьш тест-скст^-..а\ж ИФА, а

кже с традиционными серологическими методами.

9. Изучить возможность и разработать методику применения пенициллиназном ИФА для определения антител при бруцеллёзе лиакрилонитрильного волокна в качестве твердофазного носи-ля.

Научная новизна. В результате проведенных следований впервые определены оптимальные параметры приготог-ния и применения иммуноферментных диагностических препаратов, вгацих в основе антивидовые иммуноглобулины, меченные фермен-и пенициллияазой. Отработаны оптимальные условия проведения нициллиназного ИФА при определении антител к возбудителю ^гцеллёза. Впервые разработаны тест-системы ИФА диагностичес-з антивидовые пенициллиназные для определения антител при уцеллёзе у лвдей, №0 и КРС. Впервые сопоставлены основные рактеристики ИФА при использовании антивидовых пенициллиназ-х и аналогичных коммерческих пероксидазных конъюгатов, а так-пенициллиназного ИФА с традиционными серологическими метода-определения антител при бруцеллёзе. Впервые проведена апро-л,ия тест-систем ИФА диагностических иммунопенициллиназных я определения антител при бруцеллёзе в полевых условиях при оведении эпидемиологического и эпизоотологического обследо-яия активных очагов бруцеллёза. Впервые разработана методика иготовления и применения в ИФА денищшшназных конъюгатов на иове СБА, определены основные характеристики пенициллиназной ст-системы ИФА на основе СБА. Впервые разработана методика □ведения пенициллиназного ИФА с использованием полиакрилсни-ильного вал окна в качестве твердофазного носителя.

Практическая значимость. Иммунофер-йтный метод определения антител к. возбудителю бруцеллёзной Секции с использованием фермента пенициллиназы обладает вы-кой чувствительностью, специфичностью, экономичностью, про-зодительнсстью и воспроизводимостью результатов. Метод гюз-ляет определять антитола к возбудителю бруцеллёза как на ргн-х стадиях, заболевания, таге и при хроническом точении инфек-к. Ввиду отсутствия фермента-маркера в исследуемом материале кноположитольнне результаты анализа исключаются. Пеницилли-

назяые диагностические препараты стабильны и стандартизованы, методика постановки пенициллиназного ИФА проста, не требует специальной регистрирующей аппаратуры доя учета результатов и может быть освоена практическими работниками медицинских и ветеринарных лабораторий. В полевых условиях показана возыошюстз и целесообразность использования пенициллиназного ИФА в практике эпидобследования населения неблагополучных по бруцеллёзу хозяйств, что значительно повысит качество эпидемиологического мониторинга. Результаты наших разработок могут быть использованы в качестве технологической схемы производства различных вариантов диагностических наборов пенициллиназного ИФА для диагностики бруцеллёзной инфекции.

Апробация работы и внедрение в практику. Разработанные диагностические пеницилли-назные тест-системы ИФА апробированы при проведении эпидобследования активных очагов бруцеллёза Ставропольского края и КЧАО в 1987-1989 гг., а также при проведении испытаний в НПО "Аллерген".

Материалы диссертационной работы представлены на:

- институтских и межлабораторных конференциях Научно-исследовательского противочумного института Кавказа и Закавказья в 1987-1990 гг.;

- 6-й краевой научной конференции "Особо опасные инфекции на Кавказе", Ставрополь, 1957 г.;

- ХУШ съезде Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова, Алма-Ата, сентябрь 1989 г.;

- областной научной конференции молодых ученых "Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций", Ростов-на-Дону, 17-20 октября 1989 г.;

- отраслевом совещании "Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций", Оболенск, 1-2 ноября 1989 г.;

- всесоюзной конференции "Актуальные вопросы профилактики бруцеллёза и организации медицинской помощи больным", Новосибирск, 24-25 ноября 1989 г.

С учетом результатов исследования материалы представлены:

1) "Методическими рекомендациями по приготовлению антиви-¡х шлыунопешшдалиназных конъюгатов и их применению для косвенного определения антител к возбудителю бруцеллёза и 1",

2) "Инструкцией по изготовлению и контролю тест-системы гнопенициллиназной моноклональной дая идентификации капсуль-з антигена Ф-1 возбудителя чумы",

3) положительным решением от 22.06.1990 г. на изобретение луносорбент дая твердофазного иммуноферментного анализа" тка Я 4474530/13-126153-1988 г.),

4) "Экспериментально-производственным регламентом на тест-гему иммуноферментную пенициллиназную для выявления антител

бруцеллёзе у людей",

5) "Временной фармакопейной статьей на тест-систему имму-эрментную пенициллиназную дая выявления антител при бруцел-з у людей",

■6) "Инструкцией по применению тест-системы иммунофермент-

пенициллиназной для выявления антител при бруцеллёзе у люк

7) "Временной фармакопейной статьей на конъюгат для имму-ерментного анализа пеницшшшазный антивидовой (антитела гностические против иммуноглобулинов человека, меченные ицшшшазой)",

8) "Инструкцией по применению конъюгата дая иммунофермент-о анализа пенициллиназного антивидового (антитела диагности-кие против иммуноглобулинов человека, меченные пенициллина)",

9) "Экспериментально-производственным регламентом на тест-тему иммуноферментную дая выявления противолептоспирозных ител",

10) "Временной фармакопейной статьей на тест-систему имму-ерментную дая выявления противолептоспирозных антител",

11) "Инструкцией по применению тест-системы иммунофермент-

ной для выявления противолегггоспирозшх антител",

12) рационализаторским предложением Ji 36/225 "Применение йодинола в качестве хромогенного индикатора в иммуноферментноь анализе",

13) рационализаторским предложением Л 14/88 "Приспособление для промывки ниток в процессе ИФА",

14) рационализаторским предложением № 15/88 "Усовершенствование методики постановки твердофазного ИФА",

15) рационализаторским предложением Ji 12/42 "Приспособление для мерного концентрирования жидкости".

Публикации. Основное содержание работы отражено в 10 опубликованных статьях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (I глава), собственных исследований (6 глав), заключения, выводов и списка основной использованной литературы. Объем диссертации 201 страни ца машинописи, включая 17 таблиц и 20 рисунков. Список литературы содержит 361 источник, из них на иностранных языках 236.

Положен и-я диссертации, выносимые на защиту.

1. Разработанные и оптимизированные методики приготовлена и применения в тест-системах ИФА для определения антител при бруцеллёзе различных иммуноферментных конъюгатов с пенициллина зой в качестве фермента-маркера.

2. Преимущества диагностических пеницшцшназных тест-систем ИФА перед другими серологическими методами.

3. Возможность и целесообразность применения разработанных диагностических пеницшшшазных тест-систем ИФА в практике эпидемиологического и эшэоотологического обследования активных очагов бруцеллёза.

4. Возможность, методические приемы и преимущества исполь зования в пеницшшшазном ИФА полиакрилонитрильного волокна в качестве твердой фазы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Материалы и методы.

Для экспериментального заражения лабораторных животных, а также дая получения специфических бактериальных антигенов использовали штаммы бруцелл: В. melitensis 565, В. abortus 544, В. abortus 19.

Лабораторные животные - кролики пород "Шиншилла", "Белый великан", весом 1,5 - 2 кг в количестве 25 шт., а также морские свинки весом 250-300 г, в количестве 97 шт. - использовались дая их заражения, вакцинации, иммунизации.

На наличие антител к возбудителю бруцеллёза серологически исследовали 4464 сыворотки крови'- из них 80 сывороток кроликов, 97 сывороток морских свинок, 1010 сывороток КРС, 714 сывороток MPC и 2563 сыворотки лвдей. Весь исследуемый материал хранился и обрабатывался с соблюдением требований действующих режимных документов.

. В работе применяли следующие серологические тесты: реакцию Хедпдьсона (PI), реакцию агглютинации Райта (РА), антигло-булиновую реакцию Кумбса (РК), реакцию пассивной гемагглютина-ции (РИГА), реакцию нейтрализации антител (РНАт), реакцию связывания комплемента (РСК), реакцию иммунодиффузии в геле. При постановке ИФА пользовались методикой "двойных антител".

Дая получения бактериальных антигенов культуру бруцелл выращивали на мясо-пептонном печеночном агаре, обеззараживали охлажденным ацетоном и, после контроля стерильности, высушивали. Антигены бруцелл получали: экстракцией трихлоруксусной или уксусной кислотой с последующим щелочным гидролизом или без него (Лабораторные метода диагностики бруцеллёза. Москва, 1968), вторичным алнилсульфатом натрия (Цыбин Б.П., 1976), ультразвуковой дезинтеграцией клеток с водносолевой экстракцией (Афанасьев Е.Н., 1984).

Выделение иммуноглобулинов из сывороток проводили при помощи сульфата аммония ( Kekvdek я., 1940), полиэтиленгли-коля 6000 ( Poison л. et al., 1964), или каприловой кисло-

ты ( Лед-ЪисЬ и. et а1., 1969).

Концентрацию белка определяли по методу М.ГЛ. зг-китогс! (1976). Статистическую обработку результатов проводили по Бей-ли (1970).

2. Разработка и оптимизация методики приготовления а н т и в и д о в ы х и м м у н о п е н к ц и л -линазных конъюгатов.

Ввиду отсутствия в молекуле пенищшшназы углеводной част,; пэриодатный метод конъюгировашш фермента с иммуноглобулинами ( 'Такаде 0ь аХ., 1974) оказался неприменим. Нами для приготовления иммунопенициллиназных конъюгатов взят за основу и оптимизирован метод одноэтапной сшивки посредством глутарового альдегида ( .\тг:ае :>., 1963). Учитывая высокую ферментативную активность пеницшшшазн, экспериментально при конъюги-ровании подбирали соотношение и удельную концентрацию ингредиентов, при которых конъюгаты в ИОЛ обладали наибольшей активностью и чувствительностью. Оптимизированная методика конъюгиро-вания пенициялиназы с антиввдовыми иммуноглобулинами закаталась в следующем: к 0,5 мл 0,1 М фосфатно-солевого буфера рН 7,2 (ФСБ), содержащего 3 мг иммуноглобулинов, добавляли равный объем того не буфера, содержащего 3 ыг фермента. Туда ке при тщательно:: перемешивании добавляли 0,05 мл глутарового альдегида. Смесь перемешивали 2 часа при комнатной температуре, после чего днализовалк 18 часов при 4СП 1рстпв 3-х емзн ФСБ.

При сравнении трех методик выделения иммуноглобулинов ан-тпвкдозол сиворсткп (сульфатом аммония, капрнловзй кислотой и ко^иоталенгликолем В000) доя их последующего связинана,: с фермент л.; установлено, что наиболее эффективно выделои::с лосред-<:'г:-т.: полиэтиленглтаоля 6000.

условиях эксперимента при определен;!;: специфических ан-::тэ.1 в сыворотках крови вакцинированных юш оаразенких бруцеллезом кроликов и морских свинок показано преимущество ИФА с применением антивадовых шмунопеннцшшшазных конъюгатов перед такими традиционными серологическими методами, как РЛ и РПГА.

3. Разработка диагностической пенициллияазяой тест-системы ИФА для определения антител при бруцеллёзе у людей.

Бактериальный антиген, сорбированный на твердую фазу, не лько определяет нозологическую специфичность ИФА, но и влия-на чувствительность анализа. Сравнивали липололисахарид ЛС) бруцелл, полученный экстракцией трихлоруксусной кислотой; (лисахарид, очищенный из предыдущего антигена щелочным гидро-13ом; белковололисахаридный антиген, выделенный уксуснокислой ;стракцией; белковолипополисахаридный антигенный комплекс, поденный с помощью вторичного алкилсульфата натрия; антиген зуцелл водорастворимый, полученный солевой экстракцией из дез-ггегрированной ультразвуком суспензии бруцелл, а также цельные 1етки убитых бруцелл в виде диагностикума единого стандартного 1Я реакции агглютинации. Б результате исследования в ИФА при знсибилизации пластин различными антигенами бруцелл 1082 сыво-эток здоровых доноров, 78 сывороток людей с различными заболе-шиями небруцеллёзной этиологии, 155 сывороток людей, вакцини-званных против туляремии, а такке 90 сывороток больных бруцел-ззом (в различных формах и стадиях) установлено, что при испо-ьзовании в неочищенном виде водорастворимого солевого экстрак-а бруцелл отмечаются ложноположительные результаты ИФА, тогда ак при применении других антигенов неспецифический титр не ревышал уровня 1:100. При использовании для сенсибилизации ластин цельных клеток чувствительность ИФА оказалась низкой. ФА с применением остальных антигенов обладал высокой специфи-ностыо и чувствительностью, причем наибольший уровень чувст-ительности отмечен при использовании для сенсибилизации ластин ЛПС сруцел. Сенсибилизацию-проводили в 0,1 M ФСБ рН 7,2 ■ объеме 0,1 глл в течение 3-х часов при 37°С или в течение 18 асов при 4°С, или комбинировали с равным эффектом оба температурных и хронологических режима. Пластины с сорбированным в ;онцентравдп 10-50 мкг/мл антигеном использовали в ИФА без по-■ери его чувствительности в течение I месяца с момента сексибя-шзацш.

ю.

Видовая специфичность анализа при определении в ИФА бруцеллёзных антител обусловлена иммуноферментши антивидовым конъю-гатом. В данной тест-системе в качестве конъюгата использовали кроличьи иммуноглобулины против глобулинов сыворотки человека, меченные ферментом леншдошшазой по разработанной нами (п. 2) методике. При исследовании 65 сывороток крови больных бруцеллёзом людей сравнивали чувствительность ИФА с применением двух антивидовых коныогатов: пенициллиназного и коммерческого перок-свдазкого. Оба конъюгата имели рабочее разведение 1:1000, условия проведения ИФА были одинаковы. При проведении корреляционного и регрессионного анализа полученных результатов отмечена высокая степень их взаимосвязи (г = 0,94), в то же время средний геометрический титр неницаллиназного ИФА выше, чем перокси-дазного. Особо следует отметить гораздо более высокую наглядность и четкость результатов пенициллиназного ИФА, чем перокск-дазного, что обусловлено отсутствием при использовании пеницил-линазы "шлейфа" лунок с переходной окраской хромогена. Это обстоятельство позволяет производить точную визуальную оценку результатов пенициллиназного ИФА без специальной регистрирующей аппаратуры.

Достоинства пенициллиназного ИФА в полной мере проявились при проведении полевых испытаний тест-системы в сравнении с традиционными серологическими методами. В условиях передвижной автолаборатории исследовано 1005 сывороток крови работников животноводства из 14 активных очагов бруцеллёза. Показано преимущество антивидового пенициллиназного ИФА в чувствительности перед РА, РК и РПГА. Диагностическая пенициллиназная тест-система ИФА зарекомендовала себя удобной и перспективной дая практического применения в системе эпидемиологического надзора за бруцеллёзной инфекцией непосредственно в ее очагах.

4. Разработка диагностических пенициллиназных тест-систем ИФА д. ля определения антител при бруцеллёзе у мелкого и у крупного рогатого скота.

Распространенность бруцеллёзной инфекции среди сельскохо-

зяйственных животных, в основном MFC и КРС, сохранение мнсгочис-ленных очагов бруцеллёза обусловили разработку пенициллиназных тест-систем ИФА для определения антител у этих видов животных.

Для получения сывороток, содержащих антивидовые иммуноглобулины, проводили иммунизации кроликов глобулиновой фракцией сывороток здоровых ягнят или телок по 3-х-этапной схеме (Фри-мель, 1989). Раствор иммуноглобулинов 4 мг/мл в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда вводили по 0,25 мл внутрикож-но в подушечки стоп всех четырех конечностей дробно до 1,0 мл эмульсии на каждого кролика. Через 8 недель раствор иммуноглобулинов 4 мг/мл в физиологическом растворе вводили по 0,5 мл каждому кролику ежедневно в течение 3-х дней: в 1-й день - внутримышечно в верхнюю часть бедра, во 2-й и 3-й дни - внутривенно в ухо. Через неделю все манипуляции второго этапа иммунизации повторяли. Через'7 дней после заключительного этапа иммунизации проводили обескровливание, если титр антивидовых антител в сыворотках при исследовании их в реакции иммунодиффузии с раствором антигена был не ниже 1:4.

Для приготовления иммуноферментных конъюгатов фракцию иммуноглобулинов из антивидовой кроличьей сыворотки выделяли посредством полиэтиленгликоля 6000 и конъюгировали с пеницяллина-зой по разработанной нами (п. 2) методике. Такие конъюгаты имели рабочее разведение не ниже 1:200. Пластины для ИФА сенсибилизировали бруцеллёзным ЛПС.

Для определения неспецифического уровня антител, выявлявшие пеницшшшазным ИФА в сыворотках здоровых животных, -исследовали 438 сывороток MPC и 364 сыворотки КРС здорового невакци-яированного поголовья из благополучных хозяйств. Кроме того, пдя исключения влияния случайной или естественной иммунизации в пенициллиназном ИФА исследовали 76 сывороток новорожденных тгаят и 69 сывороток тёлок в возрасте до. I месяца. Уровень тигра антител, выявляемых во всех группах здоровых сывороток с юмощью пенициллиназных тест-систем ИФА, не превышал 1:100.

Для сравнения по чувствительности пенициллиназных тест-зистем ИФА с РА и РПГА исследовали 200 сывороток MPC больного тоголовья из не благополучных по бруцеллёзу хозяйств, а также

447 сывороток прошедшего вакцинацию против бруцеллёза поголовья КРС. Число положительных сывороток, выявленных с помощью ИФА, больше, чем с помощью других реакций. При статистической обработке результатов установлено, что активность позитивных сывороток выше в пенициллиназном ИФА, который обладает более высокой чувствительностью, выраженной средним геометрическим титром.

5. Конъюгат стафилококкового белка А с ферментом пени-циллиназой для определения антител при бруцеллёзе с помощью ИФА.

Вариант "двойных антител" предусматривает использование в ИФА при исследовании сывороток различных видов кивотных или человека того антивидового коныогата, который соответствует исследуемому виду. Однако ИФА приобретает свойство универсальности при использовании в качестве основы иммуноферментных конъюгатов стафилококкового белка А (СБА), обладающего способностью взаимодействовать с большинством субклассов сывороточных МШфОГЛО-булинов.

Для конъюгирования СБА с ферментом пенищшшназой нами оптимизирован одноэтапный метод глутаральдегидной сшивки, при-«вняемый при приготовлении антивидовых конъюгатов (п. 2). Экспериментально установлено, что наибольшей чувствительностью (при наименьшем уровне неспецифичности) обладает ИФА с использованием конъюгатов, содержащих СБА и пенициллиназу в соотношении 4:1 (по белку) при удельной концентрации фермента 2 мг/ш. Такие конъюгаты имели рабочее разведение не ниже 1:400.

СБА, а также и иммуноферментные конъюгаты на его основе, не одинаково взаимодействуют с сывороточными микроглобулинами различных видов животных - необходимым условием взаимодействия являйтся наличие в сяворотке шосроглобулинов определенных субклассов. Так, результаты ухе начальных экспериментов показал;., что содержащие специфические бруцеллёзные антитола сыворотки человека, кролика, морской свинки, КРС в ИФА с конъюгатами на

жопе CEA позитивны, тогда как даже заведомо содержащие в вы-жих титрах бруцеллёзные антитела сыворотки МРС оказываются грицателышми. Это позволило сделать заключение о невозможного определения бруцеллёзных антител у МРС в ИФА с применением шъюгатов на основе СБА.

С целью сравнения по критерию чувствительности ИФА при пользовании пенициллиназных конъюгатов на основе СБА с такими геологическими методами, как РА и РПГА, а также с актпвидошм !нициллиназным ИФА, во всех этих реакциях исследовали 64 сыво-1тки вакцинированных, а также экспериментально зараженных бру-ллёзом кроликов, 72 сыворотки вакцинированных морских свинок, 16 сывороток КРС вакцинированного против бруцеллёза поголовья, также 48 сывороток больных бруцеллёзом людей. Все сыворотки ведомо содержали бруцеллёзные антитела. Сенсибилизацию плас-н для ИФА осуществляли бруцеллёзным ЛПС. Анализ полученных иных показал, что при достоверности во всех случаях сравне-я корреляция между результатами ИФА при использовании пени-ллиназных конъюгатов на основе СБА и других серологических стов невысока. По чувствительности ИФА с применением конъюга-в на основе СБА несколько превосходит РПГА, выше РА, однако тупает антивидовому пенищшшназному ИФА.

5. Ниточный и м м у н о ф е р м е н т н ы й анализ ( Н И Ф А ) .

Одним из путей усовершенствования твердофазного ИФА явля-2п поиск новых сорбентов. Наш предложено использовать в ка-зтве твердофазного носителя в ИФА производимые коммерчески гкк из полимера полиакрилонитрила (ПАН). Нить имеет форму зокнистого тугосплетенного тяжа, состоящего из тонких воло-1 с большой (больше, чем у стандартной лунки полистироловой ютины для ИФА) суммарной поверхностью; В ИФА нами использо-■ю подтвержденное экспериментально свойство ПАН сорбировать фочно удерживать на поверхности иммунореактанты, и в частно-I, бруцеллёзный ЛПС.

Разработку варианта ИФА, в котором в качестве твердой фазы юльзуется полиакрилонитрильная нить и в качестве маркера

антивидовых антител - фермент пешшиллиназа, проводили на моде ли ИФА, направленного на поиск бруцеллёзных антител в сыворотках ладей.

При оптимизации условий сенсибилизации бруцеллёзным ЛПС ниток ПАН установлено, что наиболее прочно антиген сорбируется на матрикс при обработке нитей раствором ЛПС 5С-100 мкг/мл в 0,1 М ФСБ рН 7,2 б течение 18-24 часов при шуттелировании с пс следуыцей обработкой раствором нейтрального белка (5% бычий сь вороточный альбумин или 2Ъ% нормальная лошадиная сыворотка) в течение 2 часов при 37°С. Такой антигенный сорбент сохранял специфическую активность при хранении при 4°С в сухом виде в течение I года (срок наблюдения), что позволяет одномоментно заготавливать большое его количество.

Удобным резервуаром для проведения НИФА оказались обычны; 96-луночкые полистироловде пластины для ИФА, в лунки которых помещали отрезки ниток и проводили последовательно все этапы ИФА. Титрованию исследуемого материала микропипеткой присутствие ниток в лунках пластины.не мешало. Для предотвращения уча< тия в реакции полистирола пластин, накануне их использования : НИФА, в каждую лунку на 2 часа при комнатной температуре внос: ли по 0,2 ил 9В° этилового спирта, после промывки водой еще 2 часа при 37°С обрабатывали 5% бычьим сывороточным альбумином или 25$ нормальной лошадиной сывороткой с последующей промывкой водой. Сорбция иммукореактантов в процессе НИФА на поверх ность лунок полистироловых пластин, обработанных описанным сп собом, не оказывала влияния на конечные результаты реакции, ч позволяло оставлять каждый отрезок нитки в своей лунке на про тяжении всего хода анализа, а пластины использовать в НИФА ын гократно.

Для предотвращения выскальзывания ниток из лунок в проце се промывки наш предложено специальное устройство, лредставл кщее собой крышку от микрогитровальной пластины с заклеенными пластмассовой мелкоячеистой сеткой отверстиями, соответствующими лункам пластины. При плотном прокатим такой крышки к пле стине лунки оказываются накрытыми сеткой, которая удепнивает нитки в лунках, не мешая свободному току промывочной кидкосп

Очевидно, что общая реакционная поверхность отрезка нитки 1ЛН зависит от его длины и определяет общую емкость сорбента-юсителя. Экспериментально установлено, что оптимальная длина )трезков составляет 3 см, более длинше отрезки неудобны в работе.

Для остановки цветной реакции при учете результатов НИФА южно просто извлекать из лунки с хромогеном нитку вместе с юрбировавшимся на ней имму.чореактивным комплексом. При этом цзетная реакция прерывается, а учет результатов производят по ¡ставшемуся в лунке хромогену, уже изменившему цвет. Однако гри реакционном объеме 0,1 мл с извлечением мокрой нитки из [унки в ней практически не оставалось хромогена, поэтому объем :убстратной смеси был увеличен до 0,2 мл. В этом случае в лун-се после извлечения нитки оставалось около 0,1 мл хромогена, [то позволяло учитывать результат, удлиняя, однако, время уче-:а до I часа.

Проведено сравнение основных характеристик НИФА с ИФА в !го традиционном варианте при использовании одного и того же штивидового ишуноленицкллиназного конъюгата и одной и той же зеференс-сыворотки. Отмечено, что неспецифический титр конъюгата в НИФА выше, чем в ИФА, в 4 раза, однако одновременно не юнее, чем в 4 раза, повышается и рабочее разведение конъюга, ?а, что наиболее важно в практическом отношении. При сравнении гувствительности НИФА и ИФА яри исследовании 30 сывороток боль-шх бруцеллёзом людей с использованием одного и того же антиви-ювого шдглунояеницпллиназного конъюгата в ИФА в рабочем разведши 1:800, а в НИФА 1:8000 установлена высокая степень взаимосвязи между результатами НИФА и ИФА при их достоверности. По £увствительности, выраженной средним геометрическим титром, ШФА превышает ИФА более чем втрое.'

В и В О Д и

I. Впервые разработана и оптимизирована методика приготовления антивидовых хплмунопе.чицшшшазшх конъюгатов и их применения в ИФА дая определения антител при бруцеллёзе.

2. В условиях лабораторного эксперимента, а также при эпидобследовании активных очагов бруцеллёза установлена более высокая чувствительность ИФА с применением антиввдошх иммуно-пенициллиназных конъюгатов относительно традиционных серологических методов определения антител при бруцеллёзе.

3. Экспериментально показано, что ИФА с применением антк-видовых пенщилликазных конъюгатов по чувствительности превышает или равен ИФА с использованием аналогичных коммерческих пер-оксвдазных конъюгатов.

4. Впервые разработана диагностическая пенищшшназная тест-система ИФА дая определения антител при бруцеллёзе у людей.

5. В полевых условиях показана эффективность и целесообразность использования пенициллиназной тест-системы ИФА в системе иммунологического мониторинга.

6. Впервые разработаны диагностические пенициллиназные тест-систеш ИФА для определения антитал лрк бруцеллёзе у мелкого и у крупного рогатого скота, установлена их более высокая чувствительность относительно традиционных серологических методов.

7. Впервые разработана и оптимизирована методика приготовления конъюгатов стафилококкового белка А с ферментом пеницил-линазой дая определения антител при бруцеллёзе с помощью ИОЛ. Установлено, что по чувствительности ИФА с применением пеницил-линазных конъюгатов на основе белка А уступает антивидовому пе-нициллиназному ИФА и превосходит РА и РИГА.

8. Впервые разработана методика применения в качестве твердофазного носителя в ИФА полиакрилонитрилыюго волокна. Экспериментально установлено, что при этом чувствительность метода возрастает более чем втрое, увеличивается не менее, чем в 4 раза, и рабочее разведение конъюгата.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

I. Шимко И.В., Афанасьев E.H., Леви М.И., Таран И.Ф. Полу-

чение чистых антител против белкового водорастворимого антигена бруцелл методом аффинной хроматографии // Особо опасные инфекции на Кавказе. Тез. докл. 6-й краевой науч. конф. - Ставрополь, 1932. - с. 256-257.

2. Шимко И.Б., Шимко Т.А., Леви М.И., Таран И.Ф. Использование пенициллкназы в качестве фермента-маркера антивидовых антител в ИФА П Особо опасные инфекции на Кавкязе. Тез. докл. 6-й краевой науч. конф. - Ставрополь, 1987. - с. 381-382.

3. Шимко Т.А., Леви М.И., Шимко И.Б. Применение йодинола в качестве хромогена в ИФА // Особо опасные инфекции на Кавказе. Тез. докл. 6-й краевой науч. конф. - Ставрополь, 1987. -с. 383.

4. Шимко И.Б., Леви М.И. Использование полиакрилонитриль-ного волокна в качестве твердой фазы в ИФА для диагностики бруцеллёза // Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций. Тез. докл. обл. науч. конф. - Ростов-на-Дону, 1989.- с. 103-105.

5. Шимко И.Б., Леви М.И., Таран И.Ф. Эпидобследование очагов бруцеллёза с применением антивидовой пеницоллиназной тест-:истемы ИФА // Актуальные вопросы профилактики бруцеллёза и организации медицинской помощи больным. Тез. докл. всесоюз.

:онф. - (Новосибирск, 24-25 октября 1989 г.). - Москва, 1989. -108-Ш.

6. Шимко Т.А., Шимко И.Б., ЛеЕЯ М.И. Влияние качества глу-арового альдегида на свойства иммуноферментннх конъюгатов // ез. ХУШ съезда Всесоюзного общества эпидемиологов, микробко-огов и паразитологов им. И.И.Мечникова (г.Алма-Ата, сентябрь 989 г.). - Москва, 1989. - с. 135-136.

7. Шимко И.Б., Леви М.И., Таран И.Ф. Разработка имадунопе-здиллиназной антивидовой тест-системы ИФА для определения ан-ятел при бруцеллёзе у людей // Рук. деп. в ВИНИТИ, 1990. -394 - В. 90.

8. Шимко И.Б., Леей М.И., Таран И.Ф., Ельшжоз А.Т. Поле-ге испытания ж.:мунопеш1Цшштазной антивидовой тест-системы

ИФА в сравнении с традиционными серологическими методами определенна антител при бруцеллёзе // Рук. деп. в ВИНИТИ, 1990. -№ 395 - В. 90.

9. Шимко И.Б., Лави М.И., Таран И.Ф., Шимко Т.А. Конъю-гат стафилококкового белка А с ферментом пенициллиназой для определения антител при бруцеллёзе с помощью ИФА // Рук. деп. в ВИНИТИ, 1990. - № 396 - В.90.

10. Шимко И.Б., Таран И.Ф. Тест-системы ИФА пенициллиназ-ные для определения антител у лвдей и мелкого рогатого скота при бруцеллёзе // Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций. Материалы рабочего совещания (1-2 ноября 1990 г.). - Оболенск, 1990. - с. 133.

СКМ НПО "Ставмелиораиия" Заказ № 6 8 т. 100, 1091 г.