Автореферат и диссертация по медицине (14.00.08) на тему:Применение лиофилизированной амниотической оболочки в лечении воспалительных заболеваний роговицы

На правах рукописи

ФЕДОРОВА

Елена Анатольевна

Применение лиофилизированной амниотической оболочки в лечении воспалительных заболеваний роговицы

14.00.08 - глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2004

Работа выполнена в Российском государственном медицинском университете

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Батманов Юрий Евгеньевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Душин Николай Васильевич доктор медицинских наук Слонимский Юрий Борисович

Ведущее учреждение:

ГУ НИИ глазных болезней РАМН

Защита диссертации состоится «_»_2004 г. в «_» часов на

заседании диссертационного совета Д 208.071.03 в Российской медицинской академии последипломного образования (123995, Москва, ул. Баррикадная 2/1).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке РМАПО (125445, г. Москва, ул. Беломорская 19)

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Мосин И.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема оптимизации методов лечения воспалительных заболеваний роговицы в современных условиях приобретает особую актуальность в связи с широкой их распространенностью, рецидивирующим течением, опасностью снижения остроты зрения и развитием слепоты. По расчетным данным, в стране воспалительными заболеваниями глаз страдают около 16 млн. человек, составляя 40.2% амбулаторного приема и до 50% госпитализированных (Южаков А.М.,1991). Многообразие микроорганизмов, вызывающих заболевания глаз, полиморфизм клинических проявлений одной и той же инфекции обуславливают трудности дифференциальной диагностики инфекционной офтальмопатологии (Анджелов В.О., Кричевская Г.И., 2001), задерживают начало квалифицированного лечения.

Наблюдения последних лет свидетельствуют о серьезных сдвигах в эпидемиологии воспалительных заболеваний роговицы (Майчук Ю.Ф.,1999). Немаловажную роль в изменении структуры и росте заболеваемости инфекционными кератитами играет появление новых этиологических факторов, лежащих в основе патологических изменений в переднем отрезке глаза. Одним из них, к примеру, является микротравматизация роговицы при ношении контактных линз (КЛ). По данным FDA с КЛ связано до 13 тысяч бактериальных кератитов в год на 26 млн. носителей КЛ. Бурное развитие современных микрохирургических технологий, внедрение новых операций, увеличение числа амбулаторных вмешательств так же вносят некоторое количество осложнений воспалительного характера в этиологическую структуру инфекционных заболеваний глаз.

С другой стороны, параллельно сдвигам в этиологических факторах развития инфекции, меняются и сами возбудители - растет число резистентных штаммов микроорганизмов ко многим наиболее часто применяемым антибактериальным препаратам. Данные последних исследований свидетельствуют о сдвиге в сторону более агрессивной грамотрицательной микрофлоры. Соотношение грамположительных и грамотрицательных возбудителей за последние 5 лет изменилось с 81,1%/18,1% до 51,4%/48,6% (Goldstein M.N. 1999).

Таким образом, становится понятной необходимость поиска новых комплексных подходов к лечению данной патоло

В последние годы в клинической медицине заметно возрос интерес к использованию тканей, представляющих собой биогенные стимуляторы. Одной из таких тканей является амниотическая оболочка (АО). Впервые в медицинской практике амниотическую мембрану (AM) применил в 1910 году Davis в кожной трансплантологии (Davis J.W. 1910). В офтальмологии ее используют с 40-х годов. Применение амниотической оболочки в качестве ткани для трансплантации регламентировано законом РФ от 22.12.1992г. № 4180-1 (с изменениями от 20.06.2000г.) «О трансплантации органов и (или) тканей человека».

Особое место трансплантация AM занимает в лечении различных заболеваний роговицы (Зубович В. С, 1963; Батманов Ю.Е. Егорова К.С., 1990; Беляев О.Б., 1996; Алешаев М.И. с соавт., 1999; Bapat С. V., 1973; Appelbaum P. С, 1980; Adds PJ, Dart JK., 1993; Harminder S Dua, 1999; Azuaro-Blanco A., Harminder S Dua 1999; Bae-Li Hsi, 2002; Bajaj M. S., Panda A.,2002). Доказана способность АО активизировать процессы репаративной регенерации в роговице посредством содержащихся в ней биологически активных энзимов, а также веществ, предупреждающих эпителиальный апоптоз и угнетающих развитие фиброза (Harminder S Dua, Azuaro-Blanco А., 1999; Каспаров А.А., Труфанов С.В.,2001).

Широкие возможности применения АО в офтальмологии, в частности для лечения инфекционных кератитов, ставят вопрос о разработке комплексных методик амниопластики, создании необходимых запасов трансплантационного материала и наиболее эффективных методах его консервации.

Цель исследования: разработать комплексный метод лечения воспалительных заболеваний роговицы с использованием консервированной методом лиофилизации амниотической оболочки.

Задачи:

1. Разработать комплексный метод лечения воспалительных заболеваний роговицы с использованием кератопластики лиофилизировапной амниотической оболочкой и консервативной терапии.

2. Разработать способ консервации амниотической оболочки человека методом лиофилизации.

3. Изучить тканевые изменения в амниотической мембране человека,

происходящие в процессе лиофилизации, хранения и последующей регидратации.

4. Проанализировать антимикробную активность лиофилизированной амниотической оболочки в разные сроки от момента консервации, в сравнении с нативным амнионом.

5. На основании полученных результатов определить сроки хранения и использования трансплантатов из лиофилизированной амниотической оболочки человека.

Научная новизна.

Впервые в нашей стране разработан комплексный метод лечения воспалительных заболеваний роговицы, в оспове которого лежит кератопластика с использованием консервировашюй AM человека. Впервые разработана методика заготовки и консервации AM человека методом лиофилизации. Описаны физические и морфологические изменения, происходящие в ткани амниона в процессе лиофилизации, хранения и последующей регидратации. Проведены исследования, доказывающие высокую антимикробную активность консервированной AM в отношении некоторых возбудителей инфекционных кератитов: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Citrobacterfreundi.

Практическая значимость.

Определены показания и противопоказания к кератопластике лиофилизированной АО для лечения воспалительных заболеваний роговицы. Разработаны практические рекомендации по применению лиофилизированной AM, показана целесообразность использования данной методики лечения при различных воспалительных заболеваниях роговицы.

Определены оптимальные сроки хранения и использования трансплантатов из лиофилизированной AM. Морфологически доказана возможность создания депо лекарственных препаратов в трансплантате, усиливающих действие AM на воспалительный процесс в роговице.

Внедрение результатов исследований в практику.

Метод комплексного лечения воспалительных заболеваний роговицы с использованием кератоамниопластики лиофилизированной АО человека используется в практической работе стационара ОКБ, материалы диссертационной

5

работы включены в учебный план работы кафедры глазных болезней ФУВ РГМУ, используются в лекционном курсе для ординаторов, аспирантов и слушателей кафедры.

Положения, выносимые на защиту.

1. Метод комплексного лечения воспалительных заболеваний роговицы с использованием лиофилизированной АО является эффективным, безопасным, экономичным, простым в исполнении; позволяет сократить сроки стационарного лечения, снизить количество осложнений, улучшить исходы заболевания.

2. Лечебное кератопокрытие лиофилизированной АО при тяжелых деструктивных поражениях роговицы может служить предварительным этапом подготовки глаза к радикальным хирургическим вмешательствам, например сквозной пересадке роговицы.

3. Способ консервации АО методом лиофилизации позволяет сохранить ее важнейшие биопластические свойства (прочность, эластичность) в течение длительного времени; является эффективным, экономичным, не требует применения химических консервантов, изменяющих биохимический состав и структуру нативной ткани.

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации доложены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы воспалительных заболеваний глаз», НИИГБ им. Гельмгольца (20-21 ноября 2001 г. Москва), научно-клинической конференции кафедры глазных болезней ФУВ РГМУ совместно с сотрудниками Офтальмологической клинической больницы (17 декабря 2003г. Москва).

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Библиография включает 219 источников, в том числе 137 работ отечественных и 82 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами, 20 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследований.

1. Технологическая цепь заготовки АМ состояла из следующих этапов:

1. Отбор амниотической оболочки - амнион вместе с плацентой получали в ходе кесарева сечения от здоровых женщин. Все доноры были обследованы стандартными методами на сифилис и ВИЧ инфекцию, а также методом ПЦР на хламидии, вирусы простого герпеса, гепатитов А, В и С, цитомегаловирусы.

2. В лаборатории АО отделяли от хориона тупым методом, промывали 3-х кратно стерильным изотоническим физ. раствором от сгустков крови, просушивали с обеих сторон фильтровальной бумагой. Затем трепаном выкраивали фрагменты диаметром 28-30 мм и помещали в стерильные одноразовые чашки Петри.

3. Лиофилизация осуществлялась на аппарате 8Б 6 (СИет1аЬ Англия). Чашки Петри с амнионом замораживали до Т-40°С в морозильной камере, затем подвергали лиофилизации в течение 24 часов до остаточной влажности 2-5%.

4. Стерилизация. На последнем этапе проводили у- стерилизацию герметично упакованных в отдельные стерилизационные пакеты образцов АО. Доза у облучения 25 КГр, наивысшая допустимая доза облучения - 35 КГр.

2. Исследование физических параметров трансплантационного материала. Для изучения изменений физических параметров АО в процессе лиофилизации производили измерения массы и размеров нативной, лиофилизированной и регидратированной АМ. Регидрагацию осуществляли в I группе стерильным физ. раствором, во II - раствором гентамипина 4% (2 мл в течение 40-60 мин.). В заключение производили математическое вычисление количества антибиотика, содержащееся в каждом трансплантате и статистическую обработку полученных результатов.

3. Материал иметодыморфологических исследований.

Для оценки изменений в ткани амниотической оболочки, происходящих в процессе лиофилизации и последующей регидратации, методами световой и электронной микроскопии, были исследованы образцы свежей, лиофилизированной и регидратированной АО в разные сроки от момента консервации (всего 35) .

4. Материал иметодымикробиологическихисследований.

Целью исследования явилось изучение воздействия АО, консервированной методом лиофилизации, на некоторые виды патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, вызывающих заболевания роговицы. Для выделения наиболее часто встречающихся возбудителей проводили посевы патологического отделяемого 25 больных с кератитами и язвами роговицы. Перечень использовавшихся в работе бактериальных штаммов и источники их получения представлены в таблице 1

Таблица 1.

Наименование штаммов Источник получения

1. Staphylococcus aureus Выделен из клинического материала на кафедре микробиологии РГМУ, Москва

2 Escherichia coli

3.Citrobacter freundii

4.Pseudomonas aeruginosa

5.Candida spp.

Антимикробную активность АО in vitro определяли по отношению к следующим, выделенным из патологического отделяемого с поверхности язв и инфильтратов роговицы, условно-патогенным индикаторным микроорганизмам: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Citrobacterfreundii, Pseudomonas aeruginosa, Candida spp. Суточные культуры микроорганизмов центрифугировали и по стандарту мутности 0,5 McFarland готовили взвеси в физиологическом растворе с концентрацией 1,5 х 108 м.т/мл. На поверхность плотной питательной среды ВШ agar (Difco, USA) наносили 2 мл взвеси исследуемых микроорганизмов и стерильным пинцетом помещали сегменты АО. Учет результатов проводили после инкубации в течение 24 часов при температуре 37°С. Степень антимикробной активности оценивали на основании величины диаметра зоны задержки роста бактерий вокруг амниона.

Опытная группа посевов подразделялась на пять серий: в I-ой использовали часть нативной AM, во II-ой - сегменты лиофилизированной AM со сроком хранения 7 дней, в Ш-ей - лиофилизированной со сроком хранения 52 дня, в IV-ой -

срок хранения от момента лиофилизации составил 185 дней, в V-ой- 340 дней, в VI-ой - 501 день. В контрольной серии посевы производили на питательную среду без амниона. Опыты по определению антимикробной активности АО по отношению к каждому штамму повторяли 3 раза.

Результаты и их обсуждение.

В ходе изучения изменений физических параметров амниотической оболочки в процессе лиофилизации установлено, что вес лиофилизированной AM по сравнению с нативной уменьшается на 87%, после регидратации - восстанавливается до несколько меньших значений: 0,084 ± 0,008г - вес нативной AM; 0,011 ± 0,001г -вес лиофилизированной AM; 0,064 ± 0,005 г - вес регидратированной AM (p< 0,01).

В среднем линейные размеры (диаметр) сегментов амниона в процессе лиофилизации уменьшались на 1,4 ± 0,52 мм, после регидратации размеры трансплантата возвращались к исходным величинам: 28,49 ± 0,410 - диаметр нативной АО; 28,43 ± 0,415 — диаметр регидратированной АО (р<0,01).

Результаты морфологических исследований. В результате лиофилизации AM значительно истончается и уплотняется - толщина эпителиального слоя уменьшается на 63,3 %, общий размер сокращается примерно на 66%. На гистологических препаратах отмечается гомогенизация ее слоев. Эпителиальный слой становится прерывистым за счет десквамации части клеток и резкого истончения близлежащих эпителиоцитов. По мере хранения вышеописанные изменения в ткани амниотической мембраны становятся несколько более выраженными.

При регидратации происходит восстановление толщины AM до 68,3% (эпителиального слоя до 61,1%) от ее первоначального значения. Восстановленный эпителий вместе с тонким слоем подлежащей соединительной ткани представляют собой единый плотный конгломерат, оставшиеся в меньшем количестве фибробласты остаются жизнеспособными. Следует отметить, что деструктивных изменений в ткани как лиофилизированной, так и регидратированной AM не зависимо от срока хранения мы не отмечали.

{ V» V» Ж » О * •< .»чх», ччч,

Рис 1 Лиофилизированная амниотическая мембрана (срок хранения 501 день) Усиление плотности и степени гомогенизации амниона. Десквамация части клеток из эпителиального слоя (1) Полутонкий срез Окраска метиленовым синим-фуксином Ув х 100 Рис 2 Регидратированная амниотическая мембрана. Отдельные микровизикулы в цитоплазме эпителиальных клеток (Т) Микроворсинки практически отсутствуют Депо жидкости в глубоких слоях соединительнотканной основы Полутонкий срез Окраска метиленовым синим-фуксином Ув х 160

Таким образом, лиофилизация позволяет сохранить важнейшие физические свойства АМ (прочность, эластичность, большой предел при растяжении), дающие возможность с успехом использовать ее в качестве биологически активного барьера для лечения таких заболеваний как длительно персистирующие дефекты эпителия роговицы, ожоги и язвы Кроме этого, в глубоких слоях соединительной ткани в результате регадратации происходит расслоение волокон с образованием своеобразного депо жидкости Эта особенность измепения морфологической структуры АМ в ходе лиофилизации была использована нами для создания депо лекарственных препаратов (гентамицин 4%), усиливающих положительное действие трансплантата на воспалительный процесс в роговице

По нашему мнению, высушенные в вакууме в замороженном состояния биоткани имеют ряд преимуществ перед аллотрансплантатами, консервированными другими методами

1 Низкое содержание воды в них позволяет сохранить их биопластические свойства в течение длительного времени

2. Использование физического способа заготовки ткани исключает необходимость применения химических консервантов, изменяющих биохимический состав и структуру нативной ткани.

Результаты исследования антимикробной активности амниотической оболочки Установлено, что как нативная, так и консервированная методом лиофилизации AM способна ингибировать рост и размножение индикаторных штаммов, за исключением P. aeruginosa.

Рис 3. Антибактериальная активность амниотической обочочки Зона задержки роста Staphylococcus aureus вокруг лиофилизированной AM. (срок хранения 52 дня).

Антимикробное действие АО, по-видимому, можно объяснить присутствием в ней субстанций с противомикробным действием (интерфероногены, секреторный иммуноглобулин А, ßlaußlc - глобулины, бактерицидин, ß - лизин и др.), которые, не теряют своей активности в ходе лиофилизации и, после регидратации, диффундируя в агар с индикаторными штаммами условно-патогенных микроорганизмов, препятствуют их росту и размножению. В I-ой группе посевов с использовздшем свежей АО на поверхности питательной среды, зоны задержки роста микроорганизмов составили соответственно: для St. aureus - 41,4 ± 2,4 мм, Е. coli - 38,3 ± 0,95 мм, Citr.freundu - 38,4 ± 1,68 мм, Candida - 37,6 ± 1,5 мм. В чашках Петри с посевом Pseudomonas aeruginosa отмечали сплошной рост микроорганизмов во всех исследуемых группах. Во II, III, IV и V группах антибактериальное действие

амниотической мембраны сохранялось примерно на одном уровне, однако отмечали некоторое уменьшение диаметра зон задержки роста индикаторных штаммов по сравнению с I группой (1 >2, р< 0,01). Достоверных различий в антимикробной активности лиофилизированного амниона в сроки хранения от 1,5 месяцев до 1 года получено не было (р>0,11). /табл 21. В VI группе зона задержки роста была минимальной (менее 1,5 ± 0,53мм), однако роста микроорганизмов по поверхности амниотической мембраны отмечено не было.

Таблица 2.

Антимикробная активность амниотической оболочки.

I группа Диаметр зоны задержки роста м/о П группа Диаметр зоны задержки роста м/о Ш группа Диаметр зоны задержки роста м/о IV группа Диаметр зоны задержки роста м/о V группа Диаметр зоны задержки роста м/о

S. aureus 41,4 ±2,4 35,7± 0,35 35,1± 0,83 35Д ±0,53 34,8 ±0,55

Е. coli 38,3 ±0,95 35,2 ±0,73 34,2 ±0,55 34,3 ± 0,35 33,8 ± 0,73

Citr.Freundii 38,4 ±], 68 35,0 ±1,6 33,9 ±0,53 34,4 ±0,53 34,4 ±0,53

Candida spp. 37,6 ±1,5 34,6 ± 1,55 33,3 ±1,58 34,0 ±1,0 33,6 ±0,53

Таким образом, установлено, что лиофилизированная AM со сроком хранения до 1 года обладает высокой антимикробной активностью в отношении следующих возбудителей инфекционных кератитов: St. aureus, E. coli, Citr.freundii, Candidaspp. При хранении АО в лиофилизированном состоянии более 1 года (1 год и 4,5 месяца) антимикробная активность снижается, однако остается достаточной для предотвращения распространения микроорганизмов по поверхности трансплантата.

II. КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований. Для решения поставленных в работе задач нами было обследовано 118 больных с различными воспалительными заболеваниями роговицы, находившихся на лечении в 6 хирургическом отделении ОКБ г. Москвы в период с октября 2001 по сентябрь 2003гг. Среди них мужчин - 59, женщин - 59. Возраст варьировал в пределах от 18 до 79 лет. Количество пациентов с поверхностными кератитами составило 32 человека (27,1%); с кератитами, осложненными иридоциклитами - 80 (67,8%); с язвами роговицы - 6 (5,1%).

Наблюдалось следующее распределение этиологических факторов, вызвавших различные формы поражений роговицы: травма - 29 (24,6%), осложнения хирургических вмешательств - 8 (6,8%), использование мягких контактных линз - 4 (3,4%). Среди эндогенных факторов превалировала герпес вирусная инфекция - 30 (25,4%), реже причиной кератитов послужил сахарный диабет I и II типов - 2 (1,7%), болезни соединительной ткани - 1 (0,9%), заболевания мочеполовой системы - 4 (3,4%). У 39 пациента (33,9%) выяснить этиологию воспалительного процесса в роговице не удалось.

Наиболее частыми жалобами больных были: светобоязнь, слезотечение (98,3%), боль (93,2%), чувство инородного тела в глазу (84,6%), снижение остроты зрения (98,3%), покраснение глаз (100%). Частота и выраженность той или иной жалобы зависела от формы и тяжести поражения роговицы.

При клинико-биомикроскопическом обследовании больных блефароспазм выявляли в 29,7%, отек век в 5,9%, гиперемию и отек конъюнктивы в 58,5%. Перикорнеальная или смешанная инъекция глазпого яблока имела место в 100% случаев. Чувствительность роговицы была снижена в 24,6%. Различные по форме, цвету, глубине и локализации инфильтраты роговицы выявляли в 94,9%, распад гнойных инфильтратов с образованием язв в 5,1%. Гиперемия и отек стромы радужной оболочки в 67,8%, экссудативная реакция различной степени выраженности во влаге передней камеры в 38,1%, гипопион в17,8%.

Клинические методы обследования. Всем больным проводили тщательное офтальмологическое обследование, включающее исследование остроты зрения с коррекцией и без нее, биомикроскопию, флюоресцеиновую пробу, определение

чувствительности роговицы, офтальмоскопию, пальпаторную тонометрию, эхографию для оценки состояния стекловидного тела и оболочек глаза, фоторегистрацию.

Лабораторная диагностика проводилась для выявления возбудителя заболевания и включала микроскопию мазков с конъюнктивы и изучение посевов на питательные среды соскобов с поверхности язв и инфильтратов роговицы.

Все обследованные пациенты были распределены на 3 группы в зависимости от вида проводимого лечения. Первая группа включала 33 больных, которым, наряду с антибактериальной или противовирусной консервативной терапией при недостаточной ее эффективности выполняли биопокрытие роговицы свежей АО. Во второй группе больных (30 человека) в качестве биопокрытия использовали лиофилизированную AM. Контрольную группу составили 55 больных с различными формами поражения роговицы, которым проводили традиционную консервативную терапию.

Показанием к амниопластике как свежей, так и лиофилизированной АО служило отсутствие положительного эффекта от проводимой консервативной терапии в течение 3-5 дней от начала лечения в стационаре. Распределение больных в сравниваемых группах по полу и возрасту представлено в таблице 3.

Таблица 3.

Группа Пол Возраст

м ж До 20 лет 21-60 лет Старше 60 лет

I группа 16 (48,5%) 17 (51,5%) 1 (3,1 %) 21 (63,6 %) 11 (33,3%)

II группа 16 (53,3%) 14 (46,7%) 2 (6,6 %) 20 (66,7 %) 8(26,7%)

III группа 27 (49,1%) 28 (50,9%) 4 (7,3%) 29 (52,7%) 22 (40%)

Во всех трех группах большинство составили больные в возрасте от 21 до 60 лет, то есть наиболее активный трудоспособный контингент.

Методика операции. Лиофилизированную АО перед использованием насыщали 2 мл стерильного 4% раствора гентамицина в течение 40-60 минут. Обработку операционного поля проводили по общепринятым правилам. После ретробульбарной (2% раствор новокаина/ 2% раствор лидокаина - 2,0) и инсталляционной (0,4% раствором инокаина) анестезии на роговицу накладывали АО мезенхимальной поверхностью кнутри. У больных с язвами роговицы перед наложением амниотического покрытия удаляли детрит с поверхности и краев язвы. AM фиксировали к неповрежденной конъюнктиве 8-12 узловыми швами шелк 8/0 (рис.4). Под конъюнктиву вводили 0,2 мл 4% раствора гентамицина. По окончании операции накладывали асептическую повязку.

Результаты и их обсуждение. В результате проведенного лечения положительный эффект был достигнут у всех больных.

Основными критериями для сравнительной оценки результатов изучаемых методов лечения были: снижение выраженности роговичного синдрома и жалоб больных, время эпителизации/рубцевания дефекта роговицы и резорбции инфильтратов, динамика остроты зрения, исход (выздоровление, улучшение) и длительность пребывания больного в стационаре. Анализ полученных результатов проводили отдельно для каждой нозологии (кератит, кератоиридоциклит и язва роговицы).

Эффективность лечения в первой группе, составила 97%. У одного пациента в раннем послеоперационном периоде (3 сутки после операции) наблюдалось отторжение трансплантата. Показатели динамики воспалительного процесса в ходе лечения представлены в таблице 4.

Рис.4 Техника наложения амниотического покрытия.

Показатели динамики воспалительного процесса в I группе.

Таблица 4.

Критерии Нозология

Кератит Кератоиридоциклит Язва роговицы

Снижение выраженности роговичного синдрома (сутки) 1,09 ±0,29 1,27 ± 0,45

Время эпителизации дефекта роговицы/рубцевания, резорбции инфильтратов 5,2 ±0,69 7,7 ±0,9

Динамика остроты зрения 0,7 ± 0,2 0,42 ± 0,2

За период наблюдения (от 6 месяцев до 1,5 лет) в 6,7% случаев (у 2 больных) отмечен рецидив заболевания роговицы. В обоих случаях имела место герпесвирусная инфекция.

Во второй группе больных применяли амниопластику лиофилизированной АО. Эффективность лечения составила 93,3%. Отторжение биопокрытия на вторые сутки после операции в данной группе отмечалось только в одном случае. У одного больного в связи с неэффективностью амниопластики и консервативного лечения была выполнена СКП. Динамика воспалительного процесса в роговице при данном варианте лечения отражена в таблице 5. Случаев рецидивирования воспалительного процесса среди пациентов этой группы отмечено не было.

Таблица 5 .

Критерии Нозология

Кератит Кератоиридоциклит Язва роговицы

Снижение выраженности роговичного синдрома (сутки) 1,23 ±0,43 1,33 ±0,48 1,46 ±0,62

Время эпителизации дефекта роговицы/рубцевания резорбции инфильтратов (сутки) 5,8 ±0,83 8,1 ±0,9 15,5 ±0,98

Динамика остроты зрения 0,6 ±0,24 0,39 ±0,2 0,14

* В таблицу не включены данные о больном, которому в связи с неэффективностью лечения была выполнена сквозная пересадка роговицы. 16

В третьей, контрольной, группе больных, получавших только консервативную терапию, в связи с отрицательной динамикой 2 пациентам было выполнено промывание передней камеры, у 3 - СКП, у 1 - энуклеация. Эффективность лечения составила 89,1%.

Таблица 6.

Критерии Нозология

Кератит Кератоиридоциклит Язва роговицы

Снижение выраженности роговичного синдрома (сутки) 1,76 ±0,76 2,410,97 3,7 ±0,87

Время эпителизации дефекта роговицы/рубцевания резорбции инфильтратов (сутки) 8,28 ±0,75 11,9 ±1,07 16,2 ±0,5

Динамика остроты зрения 0,43 ±0,3 0,35 ±0,23 0,13 ±0,1

* В исследование не включены данные о больных, у которых в связи с неэффективностью консервативной терапии были использованы дополнительные хирургические методы лечения

В первых двух группах в случаях отторжения трансплантата в раннем послеоперационном периоде выполняли повторную операцию. Аллергических реакций на биопокрытие не отмечено ни у одного больного. АМ оставалась полупрозрачной в течение всего периода лечения и позволяла вести динамическое наблюдение за течением воспалительного процесса в переднем отрезке глаза. Остатки биопокрытия удаляли на 5-7 день после операции, в зависимости от состояния роговицы.

Послеоперационный период у всех пациентов протекал без осложнений. Больные отмечали исчезновение болей, уменьшение слезотечения и светобоязни уже в первые 2-3 часа после операции. При сравнении времени эпителизации/рубцевания дефектов роговицы установлено, что заживление быстрее наступало в первой и во второй группах (р<0,01) (рис. 4). Закономерно, что во всех трех группах наиболее активная эпителизация с образованием полупрозрачных облаковидных помутнений отмечалась у больных с поверхностными кератитами.

Однако в третьей группе процессы регенерации протекали медленнее, и полное заживление дефектов эпигелия наступало только к 8-9 дню. При лечении пациентов с кератоиридоциклитами и язвами роговицы рассасывание инфильтратов и преципитатов, резорбция экссудата в передней камере, формирование Рубцовых помутнений при заживлепии глубоких дефектов роговицы активнее проходило в первой и второй группах. В третьей группе отмечали не только удлинение сроков эпителизации / рубцевания роговицы, но и формирование более грубых помутнений, в некоторых случаях, с интенсивной неоваскуляризацией.

Рис 5. Время эпителизации/рубцевания дефектовроговицы.

Высокую эффективность в отношении процессов репаративной регенерации в группах с амниопластикой по нашему мнению можно объяснить непосредственным действием веществ, содержащихся в ЛМ: эпидермальный фактор роста, трансформируемый фактор основной фибробластный фактор роста, эпдотелины, усиливающие пролиферацию, миграцию и дифференцировку стволовых клеток эпителия. Предотвращение интенсивной васкуляризации обусловлено наличием антиангиноидного фактора, вызывающего гемолиз эритроцитов и общим антигипоксическим действием АО. В результате клинических исследований достоверных различий в активности стимулирующего действия на процессы репаративной регенерации между свежей и консервированной ЛМ мы не получили

(р>0,01).

Сравнительный анализ динамики зрительных функций (рис.5) показал, что при лечении поверхностных кератитов более выраженные результаты отмечены при использовании метода амниопластики (р<0,01).

Рис б Динамика зрительных функций.

Острота зрепия к моменту выписки больных из стационара увеличилась - на 0,7 и 0,6 от исходной. В третьей группе динамика зрительных функций составила 0,43. Что касается больных с язвами роговицы достоверных различий в динамике рассматриваемого критерия получено не было (р> 0,01). Низкие зрительные функции у этих больных были обусловлены центральной локализацией поражения и соответственно формированием грубых рубцовых помутнений в оптической зоне роговицы Анализируя исходы заболевания и время пребывания больных в стационаре, установлено, что средний койко-день в группах с применением биологического покрытия из АМ снизился по сравнению с контрольной группой (р<0,05). В подгруппе пациентов с кератитом он составил 9,14, 9,58 и 11,85 соответственно. У больных с кератоиридоциклитом - 11,24; 12,05 и 14,5. В подгруппе больных с язвами роговицы независимо от вида лечения средний койко-день оставался достаточно высоким 16,0-18,0, что связано с изначально тяжелым состоянием глаза. В некоторых случаях, по нашему мнению, снижение

регенераторных способностей роговицы было обусловлено поражением стволовых клеток лимбалыюй зоны (2 пациента с язвами роговицы на фоне выраженной кератопатии после хирургических вмешательств).

Выздоровление в ходе лечения больных с поверхностными кератитами в первой группе получено в 75% случаев, улучшение - в 25% случаев, во второй группе - выздоровление у 85,7%, улучшение у 14,2% пациентов. В третьей группе процент больных, выписанных на амбулаторное лечение с улучшением, составил 47,3%, выздоровление отмечено у 52,7%.

В подгруппе пациентов с кератоиридоциклитами исходы заболевания распределились следующим образом: в I группе выздоровление 52,4%, улучшение 47,6%, во П группе выздоровление 52,4%, улучшение 47,6%, в контрольной группе выздоровление47,4%, улучшение 52,6%. Необходимо отметить, что во второй экспериментальной группе и в третьей контрольной, в связи с неэффективностью проводимой комплексной терапии, у четверых больных была выполнена СКП (1 больной из II группы, 3-больных из Ш группы). Исход заболевания в этом случае по общепринятым критериям был расценен как выздоровление. Таким образом, процент выздоровления в контрольной группе оказался достаточно высоким. У больных с язвами роговицы во второй группе у 1 пациента в исходе лечения достигнуто выздоровление, у 1 улучшение. В третьей группе у 75% (3 больных) -улучшение, 25% (1 больной) выздоровление. Среди пациентов контрольной группы одному больному с рецидивирующей язвой роговицы на слепом глазу (терминальная глаукома) была выполнена энуклеация. И, хотя консервативная терапия в данном случае оказалась неэффективной, исход заболевания расценен как улучшение.

Сравнивая результаты наших исследований с результатами других авторов, применявших свежую и замороженную АО человека в качестве биологического покрытия для лечения воспалительных заболеваний роговицы, мы пришли к выводу об практически полной идентичности полученных данных. Все исследователи отмечают быстрое снижение болей, купирование роговичного синдрома, сокращение сроков эпителизации. (Pinnita Prabhasawat 2001, Саидов 1994, Алишаев 1999, Симонова 1999, Батманов 1990). Однако, нами, как и большинством 20

хирургов (Каспаров 2001, А2гаго-В1апсо 1999), отмечена недостаточная эффективность амниокератопластики при лечении глубоких язв роговицы, развившихся на фоне тяжелых ожогов, множественных хирургических вмешательств, при синдроме Стивена - Джонса, где имеет место выраженная недостаточность лимбальных стволовых клеток. В таких случаях покрытие роговицы АМ может служить предварительным этапом перед выполнением других операций: трансплантации лимбальных клеток, сквозной кератопластики и их различных модификаций.

Анализируя результаты проведенных клинических исследований, мы пришли к заключению, что предлагаемый комплексный метод лечения с применением лиофилизированной АМ является эффективным и экономичным у больных с различными воспалительными заболеваниями роговицы, и является на сегодняшний день методом выбора.

ВЫВОДЫ

1. Метод комплексного лечения воспалительных заболеваний роговицы различной этиологии с использованием лиофилизированной амниотической оболочки является эффективным, безопасным, экономичным, простым в исполнении. Применение его в клинической практике позволяет сократить сроки стационарного лечения, снизить количество осложнений, улучшить исходы заболевания.

2. Распространенность воспалительных заболеваний роговицы на примере стационара ОКБ за период 1998 - 2002 годы остается на достаточно высоком уровне и составляет 190,4 ± 0,33 (1,91% от общего числа больных, госпитализированных за год), при этом около 50% составляют больные наиболее активного трудоспособного возраста. Наибольшую часть 39,4%-44,8% в структуре воспалительных заболеваний роговицы с тенденцией к росту занимают глубокие посттравматические и герпетические кератиты, осложненные иритами и иридоциклитами.

3. Разработан способ консервации амниотической оболочки человека путем высушивания в вакууме из замороженного состояния (лиофилизации), который

21

позволяет сохранять ее важнейшие пластические (прочность, эластичность) и биохимические (антимикробные, противовоспалительные, регенераторные) свойства в течение длительного времени (12-15 месяцев). Разработанный способ является эффективным, экономичным, простым в исполнении; не требует применения химических консервантов, изменяющих биохимический состав и структуру нативной ткани.

4. Тканевые изменения, происходящие в амниотической оболочке под действием лиофилизации, заключаются в гомогенизации и уплотнении составляющих ее слоев за счет' потери влаги. В процессе последующей регидратации происходит восстановление структуры и размеров (до 68,3%) амниотической оболочки. Деструктивных изменений в ткани как лиофилизированной, так и регидратированной амниотической мембраны независимо от срока хранения не выявлено.

5. Регидратация лиофилизированной амниотической оболочки лекарственными веществами позволяет создать депо препарата в глубоких слоях составляющей ее соединительной ткани, что усиливает положительное действие трансплантата на воспалительный процесс в роговице. Содержание антибиотика (гентамицин 4%) в амниотической мембране при насыщении ее 2 мл раствора в течение 40-60 мин составляет в среднем 0,054 ± 0,003 г (1,113 ± 0,033 мл).

6. В процессе лиофилизации, хранения и регидратации противомикробное действие амниотической мембраны снижается по сравнению с нативной в среднем на 10,2%. Лиофилизированная амниотическая оболочка со сроком хранения до 1 года обладает достаточно высокой активностью в отношении наиболее частых возбудителей инфекционных кератитов: St. aureus, E. coli, Citr.freundii, Candidaspp. При хранении амниотической оболочки в лиофилизированном состоянии более 1 года (1года и 4,5 месяца) антимикробная активность значительно снижается, однако остается достаточной для того, чтобы предотвратить распространение микроорганизмов по поверхности трансплантата.

7. Рекомендуемый нами срок хранения и использования амниотической оболочки, консервированной методом лиофилизации 12-15 месяцев.

Практические рекомендации.

1. При отсутствии эффекта от консервативной терапии у больных с инфекционными кератитами следует применять хирургические методы лечения для быстрого купирования воспалительных явлений и предотвращения опасных осложнений. В качестве такового может быть использован метод кератопластики лиофилизированной амниотической оболочкой.

2. У больных с глубокими язвами роговицы, развившимися на фоне выраженной недостаточности лимбальных стволовых клеток (тяжелые ожоги, множественные хирургические вмешательства, синдром Стивена - Джонса) кератопластика амниотической мембраной может служить предварительным этапом перед выполнением других операций: трансплантации лимбальных клеток, сквозной кератопластики и их различных модификаций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. ЕА Федорова, Ю.Е. Батманов, ИА Лещенко, А.В. Самойленко, С.И. Курченко «Современные аспекты и эпидемиологии и проблемы антибактериального лечения инфекционных заболеваний глаз» Актуальные вопросы воспалительных заболеваний глаз. Материалы научно-практической конференции 20-21 ноября 2001г. М.

2. ЕА Федорова, Ю.Е. Батманов, И.А. Лещенко «Особенности этиологии и антибактериального лечения кератитов» Журнал «Вестник оптометрии» №1 2002 г.

3. ЕА Федорова, Ю.Е. Батманов, В.М. Коршунов «Лиофилизированная амниотическая оболочка ее антибактериальная активность» V международная конференция «Здоровье, труд, отдых в XXI веке. (Профилактика, лечение, реабилитация в различные периоды жизни человека)»

4. ЕА Федорова, Ю.Е. Батманов, А.В. Самойленко «Применение лиофилизированной амниотической мембраны в лечении кератитов различной этиологии» Тезисы докладов второй научной конференции молодых ученых СОГМА. Владикавказ 2003г

5. Е.А. Федорова, Ю.Е. Батманов, И.А. Лещенко «Современные методы лечения бактериальных кератитов» Журнал «Вестник оптометрии» №6 2003 г

6. ЕА Федорова, Ю.Е. Батманов, АА Федоров «Морфологическое исследование амниотической мембраны человека, консервированной методом лиофилизации» Журнал «Офтальмология» том 1 №1 2004г.

7. ЕА Федорова, АЛО. Слонимский, Ю.Е. Батманов «Способ консервации амниотической оболочки». Заявка на изобретение № 2004107893 17.03.2004г.

Перечень использованных в работе сокращений.

AM - амниотическая мембрана

АО - амниотическая оболочка

ВГД - внутриглазное давление

КЛ - контактные линзы

МКЛ - мягкие контактные линзы

ОКБ - Офтальмологическая клиническая больница

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СКП - сквозная кератопластика

ААО - American Association of Ophthalmology

FDA - Food and Drug Administration

Подписано в печать 06.04.2004. Формат 60x90/16. Бумага офсетная п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 1196

АчИЗДАТЕЛЬСТВО

»-^МОСКОВСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ГОРНОГО УНИВЕРСИТЕТА

Лицензия на издательскую деятельность ЛР№ 062809 от 30.06.98г. Код издательства 5X7(03)

Отпечатано в типографии Издательства Московского государственного горного университета

Лицензия на полиграфическую деятельность ПЛД№ 53-305 от 05.12.97г.

119991 Москва, ГСП-1, Ленинский проспект, 6; Издательство МГГУ; тел. (095) 236-97-80; факс (095) 956-90-40

я-7839

Актуальность работы.

Проблема оптимизации методов лечения воспалительных заболеваний роговицы в современных условиях приобретает особую актуальность в связи с широкой их распространенностью (по расчетным данным, в стране воспалительными заболеваниями глаз страдают около 16 млн. человек, составляя 40.2% амбулаторного приема и до 50% госпитализированных) [84], рецидивирующим течением, опасностью снижения остроты зрения и развитием слепоты. Многообразие микроорганизмов, вызывающих заболевания глаз (бактерии, хламидии, вирусы, грибки, простейшие), отсутствие четко выраженных симптомов, характерных для конкретного возбудителя, полиморфизм клинических проявлений одной и той же инфекции обуславливают трудности дифференциальной диагностики инфекционной офтальмопатологии [4], задерживают начало своевременного квалифицированного лечения, и, как следствие, приводят к тяжелым исходам и большому количеству осложнений.

Наблюдения последних лет свидетельствуют о серьезных сдвигах в эпидемиологии воспалительных заболеваний роговицы [84]. Немаловажную роль в изменении структуры и росте заболеваемости инфекционными кератитами играет появление относительно новых этиологических факторов, лежащих в основе патологических изменений в переднем отрезке глаза. Одним из них, к примеру, является микротравматизация роговицы при ношении контактных линз (KJI). По данным FDA с KJI связано до 13 тысяч бактериальных кератитов в год на 26 млн. носителей KJI. Риск развития бактериальных кератитов при использовании KJI составляет от 0.21% до 0.28% в год. Имеется зависимость между типом KJI, временем ношения и риском развития поражений роговицы.

Бурное развитие современных микрохирургических технологий, внедрение новых операций, увеличение числа амбулаторных вмешательств 5 рефракционная хирургия, факоэмульсификация) так же вносят некоторое количество осложнений воспалительного характера в этиологическую структуру инфекционных заболеваний глаз.

С другой стороны, параллельно сдвигам в этиологических факторах развития инфекции, меняются и сами возбудители - растет число резистентных штаммов микроорганизмов ко многим наиболее часто применяемым антибактериальным препаратам. Это связано, как со свойствами самих возбудителей активировать механизмы формирования лекарственной устойчивости, так и с неадекватным применением противомикробных средств. Неправильное использование специфической антибактериальной и противовирусной терапии приводит к тяжелым последствиям для организма пациента: развитию дисбактериозов, аллергических реакций [83], хронизации патологического процесса. Что касается структуры возбудителей инфекционных кератитов, то необходимо отметить, что данные последних исследований свидетельствуют о сдвиге в сторону более агрессивной грамотрицательной микрофлоры, куда входит такой проблемный микроорганизм, как синегнойная палочка. Соотношение грамположительных и грамотрицательных возбудителей за последние 5 лет изменилось с 81,1%/18,1% до 51,4%/48,6% [172].

Таким образом, течение воспалительного процесса в роговице на современном этапе приобретает более тяжелый, длительный характер и представляет большие трудности в лечении.

К сожалению, в настоящее время нет регулярной отчетности и статистики по воспалительным заболеваниям роговицы, однако даже отдельные исследования, проведенные в Москве, Челябинске, Уфе подтверждают тезис о высокой распространенности и тенденции к росту этой группы заболеваний.

Исходя из выше изложенного, становится понятной необходимость поиска новых комплексных подходов к лечению данной патологии.

В последние годы в клинической медицине заметно возрос интерес к использованию тканей, представляющих собой биогенные стимуляторы. Одной из таких тканей является амниотическая оболочка - самый внутренний слой зародышевых оболочек человека.

Впервые в медицинской практике амниотическую мембрану применил в 1910 году Davis в кожной трансплантологии [168]. В офтальмологии ее используют с 40-х годов. Применение амниотической оболочки в качестве ткани для трансплантации регламентировано законом РФ от 22.12.1992г. № 4180-1 (с изменениями от 20.06.2000г.) «О трансплантации органов и (или) тканей человека». Настоящий закон определяет условия и порядок трансплантации органов и (или) тканей человека опираясь на современные достижения науки и медицинской практики, а также учитывая все рекомендации Всемирной Организации Здравоохранения.

Особое место трансплантация амниотической мембраны занимает в лечении различных заболеваний роговицы [3,8,9,113,115,143,178,199,211].

Метод послойной лечебной кератопластики далеко не новый. В качестве биологических покрытий предлагаются различные ткани: кадаверная роговица, фиброзная капсула почки, сухожильные трансплантаты, синтетические материалы и т.д. Однако в последнее время приоритет, благодаря его уникальным качествам, отдается трансплантату из амниона.

Амниотическая мембрана человека обладает высокой прочностью и пластичностью, однако не препятствует прохождению лекарственных веществ из конъюнктивальной полости, что дает возможность использовать ее в качестве универсального биологически активного барьера. Кроме этого, амниотическая оболочка является полупрозрачной и позволяет беспрепятственно наблюдать за динамикой патологического процесса в роговице. Доказана способность амниотической мембраны активизировать процессы репаративной регенерации в роговице посредством содержащихся в ней биологически активных энзимов 7 эпидермальный фактор роста, трансформируемый фактор Р, основной фибробластный фактор роста, эндотелины, усиливающие пролиферацию, миграцию и дифференцировку стволовых клеток эпителия), а также веществ, предупреждающих эпителиальный апоптоз и угнетающих развитие фиброза [178].

Широкие возможности применения амниотической оболочки в офтальмологии, в частности для лечения инфекционных кератитов, ставят вопрос о разработке комплексных методик амниопластики, создании необходимых запасов трансплантационного материала и наиболее эффективных методах его консервации.

Среди многочисленных методов, предложенных для консервирования тканей, особое место занимает высушивание из замороженного состояния. Лиофилизация - метод высушивания предварительно замороженной ткани, предназначенной для длительного хранения и последующего использования ее в клинической практике (Большая медицинская энциклопедия Т. 16,1960, С22-23). В офтальмологии разрешены к применению и успешно используются: лиофилизированная твердая мозговая оболочка для склеропластических операций (лицензия В167373 регистрационный № 623 от 03.12.1996), лиофилизированная кадаверная роговица для послойной кератопластики (авт. свидетельства 5037564 от 14.04.1992, 5038677 от 28.05 1992), высушенная над силикогелем амниотическая оболочка (патент РФ 2214091 С1 от 09.04.1992). Многими авторами доказано, что процесс лиофилизации сохраняет трансплантационные и пластические свойства тканей, не требует применения химических консервантов, изменяющих их биохимический состав; лиофилизированные трансплантата могут длительно храниться при комнатных условиях (до 5 лет), легко транспортируются на любые расстояния, не требуя при этом каких-либо особых условий [58,119,139].

Цель исследования: разработать комплексный метод лечения воспалительных заболеваний роговицы с использованием консервированной методом лиофилизации амниотической оболочки.

Задачи:

1. Разработать комплексный метод лечения воспалительных заболеваний глаз с использованием кератопластики лиофилизированной амниотической оболочкой и консервативной терапии

2. Разработать способ консервации амниотической оболочки человека методом лиофилизации.

3. Изучить тканевые изменения в амниотической мембране человека, происходящие в процессе лиофилизации, хранения и последующей регидратации.

4. Проанализировать антимикробную активность лиофилизированной амниотической оболочки в разные сроки от момента консервации, в сравнении с нативным амнионом.

5. На основании полученных результатов определить сроки хранения и использования трансплантатов из лиофилизированной амниотической оболочки человека для лечения воспалительных заболеваний роговицы.

Научная новизна.

Впервые в нашей стране разработан комплексный метод лечения воспалительных заболеваний роговицы, в основе которого лежит кератопластика с использованием консервированной АМ человека. Впервые разработана методика заготовки и консервации АМ человека методом лиофилизации — высушивания в вакууме из замороженного состояния. Описаны физические и морфологические изменения, происходящие в ткани амниона в процессе лиофилизации, хранения и последующей регидратации. Проведены исследования, доказывающие 9 высокую антимикробную активность консервированной AM в отношении наиболее частых возбудителей инфекционных кератитов: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Citrobacter freundi.

Практическая значимость.

Определены показания и противопоказания к кератопластике лиофилизированной АО для лечения воспалительных заболеваний роговицы. Разработаны практические рекомендации по применению лиофилизированной AM, показана целесообразность использования данной методики лечения при различных воспалительных заболеваниях роговицы.

Определены оптимальные сроки хранения и использования трансплантатов из лиофилизированной AM. Морфологически доказана возможность создания депо лекарственных препаратов в трансплантате, усиливающих действие AM на воспалительный процесс в роговице.

Внедрение.

Метод комплексного лечения воспалительных заболеваний роговицы с использованием кератоамниопластики лиофилизированной АО человека используется в практической работе стационара ОКБ, материалы диссертационной работы включены в учебный план работы кафедры глазных болезней ФУВ РГМУ, используются в лекционном курсе для ординаторов, аспирантов и слушателей кафедры.

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации доложены на:

1. Научно-практической конференции «Актуальные вопросы воспалительных заболеваний глаз», проходившей в НИИГБ имени Гельмгольца 20-21 ноября 2001 году в Москве.

2. Научно-клинической конференции кафедры глазных болезней ФУВ РГМУ совместно с сотрудниками офтальмологической клинической больницы г. Москвы 17.декабря 2003 года.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Библиография включает 221 источников, в том числе 139 работ отечественных и 82 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами, 20 рисунками.

Положения, выносимые на защиту.

1. Метод комплексного лечения воспалительных заболеваний роговицы с использованием лиофилизированной АО является эффективным, безопасным, экономичным, простым в исполнении; позволяет сократить сроки стационарного лечения, снизить количество осложнений, улучшить исходы заболевания.

2. Лечебное кератопокрытие лиофилизированной АО при тяжелых деструктивных поражениях роговицы может служить предварительным этапом подготовки глаза к радикальным хирургическим вмешательствам, например сквозной пересадке роговицы.

3. Способ консервации АО методом лиофилизации позволяет сохранить ее важнейшие биопластические свойства (прочность, эластичность) в течение длительного времени; является эффективным, экономичным, не требует применения химических консервантов, изменяющих биохимический состав и структуру нативной ткани.

Выводы.

1. Метод комплексного лечения воспалительных заболеваний роговицы различной этиологии с использованием лиофилизированной амниотической оболочки является эффективным, безопасным, экономичным, простым в исполнении. Применение его в клинической практике позволяет сократить сроки стационарного лечения, снизить количество осложнений, улучшить исходы заболевания.

2. Распространенность воспалительных заболеваний роговицы на примере стационара ОКБ за период 1998 — 2002 годы остается на достаточно высоком уровне и составляет 190,4 ± 0,33 (1,91% от общего числа больных, госпитализированных за год), при этом около 50% составляют больные наиболее активного трудоспособного возраста. Наибольшую часть 39,4%-44,8% в структуре воспалительных заболеваний роговицы с тенденцией к росту занимают глубокие посттравматические и герпетические кератиты, осложненные иритами и иридоциклитами.

3. Разработан способ консервации амниотической оболочки человека путем высушивания в вакууме из замороженного состояния (лиофилизации), который позволяет сохранять ее важнейшие пластические (прочность, эластичность) и биохимические (антимикробные, противовоспалительные, регенераторные) свойства в течение длительного времени (12-15 месяцев); является эффективным, экономичным, простым в исполнении; не требует применения химических консервантов, изменяющих биохимический состав и структуру нативной ткани.

4. Тканевые изменения, происходящие в амниотической оболочке под действием лиофилизации, заключаются в гомогенизации и уплотнении составляющих ее слоев за счет потери влаги. В

103 процессе последующей регидратации происходит восстановление структуры и размеров (до 68,3%) амниотической оболочки. Деструктивных изменений в ткани как лиофилизированной, так и регидратированной амниотической мембраны независимо от срока хранения не выявлено.

5. Регидратация лиофилизированной амниотической оболочки лекарственными веществами позволяет создать депо препарата в глубоких слоях составляющей ее соединительной ткани, что усиливает положительное действие трансплантата на воспалительный процесс в роговице. Содержание антибиотика (гентамицин 4%) в амниотической мембране при насыщении ее 2 мл раствора в течение 40-60 мин составляет в среднем 0,054 ± 0,003 г (1,113 ±0,033 мл).

6. В процессе лиофилизации, хранения и регидратации противомикробное действие амниотической мембраны снижается по сравнению с нативной в среднем на 10,2%. Лиофилизированная амниотическая оболочка со сроком хранения до 1 года обладает достаточно высокой активностью в отношении наиболее частых возбудителей инфекционных кератитов: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Citrobacter freundii, Candida spp. При хранении амниотической оболочки в лиофилизированном состоянии более 1 года (1года и 4,5 месяца) антимикробная активность значительно снижается, однако остается достаточной для того, чтобы предотвратить распространение микроорганизмов по поверхности трансплантата.

7. Рекомендуемый нами срок хранения и использования амниотической оболочки, консервированной методом лиофилизации 12-15 месяцев.

Практические рекомендации.

1. При отсутствии эффекта от консервативной терапии у больных с инфекционными кератитами следует применять хирургические методы лечения для быстрого купирования воспалительных явлений и предотвращения опасных осложнений. В качестве такового может быть использован метод кератопластики лиофилизированной амниотической оболочкой.

2. У больных с глубокими язвами роговицы, развившимися на фоне выраженной недостаточности лимбальных стволовых клеток (тяжелые ожоги, множественные хирургические вмешательства, синдром Стивена -Джонса) кератопластика амниотической мембраной может служить предварительным этапом перед выполнением других операций: трансплантации лимбальных клеток, сквозной кератопластики и их различных модификаций.