Автореферат и диссертация по медицине (14.01.23) на тему:"Применение коллагенового геля в лечении стрессового недержания мочи" (Экспериментальное исследование)

На правах рукописи

0055ЭО'"~

Королев Павел Владимирович

ПРИМЕНЕНИЕ КОЛЛАГЕНОВОГО ГЕЛЯ В ЛЕЧЕНИИ СТРЕССОВОГО НЕДЕРЖАНИЯ МОЧИ

(Экспериментальное исследование)

14.01.23 —урология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва

2013

31 ОКТ 2013

005536730

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России (ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России)

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Синякова Любовь Александровна, профессор кафедры урологии и хирургической андрологии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России

Официальные оппоненты:

Мартов Алексей Георгиевич — доктор медицинских наук, профессор (ФГОУ ДПО «Институт повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства» России, заведующий кафедрой урологии; Городская клиническая больница №57 Департамента здравоохранения г. Москвы, заведующий урологическим отделением)

Кривобородов Григорий Георгиевич — доктор медицинских наук, профессор (ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России, профессор кафедры урологии)

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России

диссертационного совета Д 212.203.01 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» (117292, г. Москва, ул. Вавилова, д. 61, ГБУЗ ГКБ №64 ДЗМ).

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале УНИБЦ (Научная библиотека) РУДН по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

Автореферат разослан « Ж ¿/¿'¿Мё^^7 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор И.М. Ордиянц

Защита состоится

заседании

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Проблема недержания мочи у женщин является не только медицинской, но и социальной, так как значительно снижает качество жизни и отражается на психическом состоянии пациенток. Недержание мочи, по данным «Международного общества по недержанию мочи», определяется как «непреднамеренная потеря мочи, которая представляет собой гигиеническую или социальную проблему для человека». Особое значение недержание мочи приобретает в гериатрии, так как с возрастом частота и степень тяжести инконтиненции возрастает (Coll-Planas L, et al., 2008). Существует несколько факторов риска для развития стрессового недержания мочи у женщин, а именно: возраст, ожирение, курение и ранее перенесенное хирургическое вмешательство, но одними из самых важных являются беременность и естественные роды (Richter НЕ, et al., 2005). У пожилых людей, недержание мочи, как правило, является частью комплекса заболеваний, которое возникает в связи с возрастными изменениями в тазовых органах (Ruby СМ et al., 2009).

По литературным данным последних эпидемиологических исследований на примере жительниц мегаполиса, получена следующая статистика: в возрасте 25—34 лет частота недержания мочи составляет 9%, увеличиваясь после 55 лет до 36% (Адамян JI.B. и соавт., 2008). Согласно работам зарубежных авторов, распространенность симптомов недержания мочи у женщин в мире достигает 37% и более, на лечение которых ежегодно в США тратится порядка 12 миллиардов долларов (Abrams Р, et al., 2008; Lightner D, et al., 2009). Значимость указанного заболевания определяется не только его высокой частотой, но и существенным снижением качества жизни больных (Кривобородов Г.Г., 2010).

В ряде литературных источников указывается, что к концу прошлого века насчитывалось более 200 методов консервативного лечения и 250 вариантов оперативных вмешательств по поводу недержания мочи (Лоран О. Б., 2010; Пушкарь Д.Ю., 2009). Столь большое количество предлагаемых способов оперативного лечения, по-видимому, обусловлено недостаточной

\

эффективностью применяемых операций, свидетельством чему является также и высокая частота рецидивов заболевания, составляющая от 10 до 40% (Долгих Т.А., 2008). Большинство из оперативных методов лечения направлены на сужение просвета уретры, либо транспозицию дна мочевого пузыря, либо создание обструкции в области его шейки и укрепление тазового дна. В последнее время отмечается тенденция к минимизации и упрощению техники оперативных вмешательств. Приоритет отдается слинговым операциям, как наиболее надежным среди многочисленных оперативных вмешательств при стрессовом недержании мочи (Славутская О.С., 2008; Abrams Р, et al., 2010; Dugan Е, et al., 2009). Петлевая пластика позволяет сократить длительность операции, уменьшить объем хирургической травмы, добиться быстрой социальной адаптации пациенток. Однако, выполнение вышеупомянутого вида оперативного лечения, особенно на этапе освоения, может сопровождаться целым рядом серьезных осложнений, таких как: ранение мочевого пузыря, уретры, кишечника, сосудов малого таза; обструкция мочевых путей; инфекции мочевых путей; остеомиелит лонных костей; образование спаек в полости малого таза (Мартов А.Г., 2008; De Таугас R, 2011).

Поиски новых методов лечения стрессового недержания мочи у женщин являются весьма актуальными. Требуется разработка более эффективных методов лечения, которые позволили бы снизить частоту интраоперационных и послеоперационных осложнений и обеспечить максимальную реабилитацию больных.

Учитывая наметившуюся современную тенденцию к минимизации хирургических пособий, использование парауретрапьного введения объемообразующих средств становится все более актуальным.

Вместе с тем данные исследований по оценке эффективности и клинической ценности коллагенового геля как объемообразующего средства в отечественной литературе не представлены, а в зарубежной нет сравнения применения данного объемообразующего средства при лечении недержания мочи у женщин. Сравнительный анализ полученных в эксперименте

отдаленных результатов позволит сделать вывод о клинической ценности и эффективности конкретного метода.

Цель исследования — определение возможности применения коллагенового геля в качестве объемообразующего материала для малоинвазивных операций (парауретральной инъекции) при недержании мочи (на основании экспериментальных данных).

Задачи исследования:

1. Оценить безопасность и эффективность использования коллагенового геля как объемообразующего материала для парауретральной инъекции.

2. Изучить изменения элементов соединительной ткани в области введения коллагенового геля у животных разных возрастных групп в динамике.

3. Провести сравнительную оценку пролиферативной активности клеток фибробластического ряда в зависимости от концентрации геля и возраста животного.

4. Изучить состояние микрососудистого русла в месте введения коллагенового геля (электронная микроскопия, рентгенологическое исследование).

Научная новизна

Впервые проведено экспериментальное исследование коллагенового геля в качестве объемообразующего вещества в концентрациях 7% и 15% у животных разных возрастных групп, что позволило выявить отличия скорости образования соединительно-тканной манжетки в зависимости от возраста экспериментального животного и концентрации коллагенового геля.

Экспериментально создана модель представления о патогенезе, заключающаяся в особенностях изменений элементов соединительной ткани парауретральной области у животных разных возрастных групп.

Впервые проведен эксперимент по определению длины капилляров в месте введения коллагенового геля с использованием рентгенконтрастных веществ.

Практическая значимость

Доказано, что в отличие от других изученных объемообразующих веществ, коллагеновый гель не мигрирует из места инъекции, после его введения не возникает аллергической реакции, отсутствуют признаки абсцедирвоания в месте введения. Положительный эффект от применения геля наступает гораздо быстрее, в отличие от изученной ранее в эксперименте коллагеновой пластины Коллост. В отличие от пластины, при использовании которой эффект удержания мочи создается лишь за счет формирования соединительно-тканной манжетки в течение первых 6 месяцев, в настоящем эксперименте эффект наступает с момента введения геля за счет самого объемного вещества, а затем за счет формирования соединительнотканной манжетки в месте введения в связи с чем сохраняется более длительный эффект от терапии. Формирование соединительно-тканной манжетки происходит уже через 1 месяц после введения геля.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. После введения геля 15% концентрации животным младшей возрастной категории уже через 14 дней наблюдается активная секреция коллагеназы.

2. У животных старшей возрастной группы, после введения коллагенового геля в концентрации 15% формирование соединительно-тканной манжетки отмечено через 1 месяц.

3. Максимальная скорость образования клеток пролиферативного ряда достигнута при концентрации геля 15 % у животных в возрасте 6-8 месяцев на 14 сутки эксперимента.

4. При парауретральной инъекции коллагенового геля скорость и интенсивность развития микрососудов в месте введения прогрессивно нарастают с повышением концентрации геля.

Апробация работы

Результаты проведенного исследования доложены на региональной научно-практической конференции посвященной тридцатилетию детской урологии г. Волгограда и Волгоградской области (2012)., совместном заседании сотрудников кафедры урологии и хирургической андрологии РМАПО и сотрудников кафедры урологии РУДН, 14, 20, 21, 41 урологических отделений больницы им. С.П.Боткина и сотрудников отдела оперативной хирургии и клинической лимфологии РМАПО (2012), апробация «Применение коллагенового геля в лечении стрессового недержания мочи» (экспериментальное исследование) (2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано шесть научных работ, три из них - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Личный вклад

Автор самостоятельно спланировал и организовал эксперимент, определил этапы ввода и вывода экспериментальных животных. Во время эксперимента принимал личное участие во всех этапах процесса (постановка эксперимента, имплантация коллагенового геля, организация и уход за животными, ведение учетной документации, выведение животных из эксперимента, подготовка материала для исследования, участие в проведении микроскопической обработке полученного материала, проведение статистической обработки и анализе полученных результатов исследования). Принимал непосредственное участие в апробации результатов эксперимента и разработке практических рекомендаций, самостоятельно подготовил и опубликовал основные публикации по выполненной работе.

Внедрение в практику

Результаты эксперимента с 2012 года внедрены в учебный процесс кафедры урологии и хирургической андрологии РМАПО и используются

преподавателями кафедры на теоретических занятиях с ординаторами и курсантами, в лекционном материале и методических рекомендациях. Представленные материалы дают представление слушателям о преимуществах указанной методики по сравнению с традиционными методами.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы, содержащей собственные исследования и их результаты, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 141 страницах текста, иллюстрирована 4 таблицами, 2 графиками, 17 диаграммами, 34.рисунками. Библиографический указатель содержит перечень из 212 работ: 115 отечественных и 97 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалом для исследований явились экспериментальные животные -белые крысы (самки) линии Вистар, вне репродуктивного периода, в возрасте от 6 до 8 месяцев и весом до 150 гр., и в возрасте 30-36 месяцев, весом до 250 гр. В первый эксперимент, направленный на обоснование реактивных преобразований в парауретральной области после инъекции геля Коллост включено 66 лабораторных животных. Все они были разделены на три группы:

Первую группу (контрольную) составили 6 животных (3 крысы - в возрасте 68 месяцев и 3 — в возрасте 30-36 месяцев) без имплантации биоматериала.

Вторая группа была представлена 30 животными (из них 15 в возрасте 68 месяцев и 15 в возрасте 30-36 месяцев). Этой группе животных путем инъекции в парауретральную область вводили гель Коллост в концентрации 7%.

Третью группу составили 30 животных (из них 15 в возрасте 6-8 месяцев и 15 - 30-36 месяцев соответственно), которым в парауретральную область произведена инъекция геля Коллост в концентрации 15%. Забор биологического материала осуществляли через 14, 30, 60, 120, 180 суток от начала эксперимента.

Для изучения процессов реваскуляризации в зоне инъекции геля нами проведен эксперимент по влиянию геля Коллост на ангиогенез, в котором исследовалось состояние микрососудов адвёнтициальной оболочки уретры с применением количественного метода подсчета длины капилляров на единицу объема соединительной ткани, который включал группу из 54 животных, которые были разделены на 3 группы:

Первую (контрольную) составили 6 животных (3 крысы — в возрасте 6-8 месяцев и 3 - в возрасте 30-36 месяцев) без имплантации биоматериала.

Вторая группа была представлена 24 животными, из них 12 в возрасте 68 месяцев и 12 в возрасте 30-36 месяцев. Вышеупомянутой группе путем инъекции в парауретральную область ввели гель Коллост в концентрации 7%.

Третью группу составили 24 животных, которым в парауретральную область произведена инъекция геля Коллост в концентрации 15%, из них 12 в возрасте 6-8 месяцев и 12 - 30-36 месяцев. Забор материала осуществлялся на 1,3, 5, 7 сутки эксперимента.

Для исследования состояния микрососудов адвёнтициальной оболочки уретры с применением количественного метода подсчета длины капилляров на единицу объема соединительной ткани, была группа из 44 животных, которые были разделены на 3 группы:

Первую (контрольную) составили 4 животных (2 крысы - в возрасте 6-8 месяцев и 2 - в возрасте 30-36 месяцев) без имплантации биоматериала.

Вторая группа была представлена 20 животными, из них 10 в возрасте 68 месяцев и 10 в возрасте 30-36 месяцев. Вышеупомянутой группе путем инъекции в парауретральную область ввели гель Коллост в концентрации 7%.

Третью группу составили 20 животных, которым в парауретральную область произведена инъекция геля Коллост в концентрации 15%, из них 10 в

возрасте 6-8 месяцев и 10 - 30-36 месяцев. Выведение из эксперимента животного осуществлялось на 14,30, 60,120, 180 сутки.

Операция по введению коллагенового геля Коллост осуществлялась следующим образом: обезболивание проводили с использованием препарата Рометар 2% раствора, вводившегося внутримышечно из расчета 0,2 мл на 1 кг веса крысы. Рометар является антагонистом центральных а-2-адренорецепторов, оказывает успокаивающее, миорелаксирующее и обезболивающее действие, стимулирует центральные и периферические арецепторы. При парентеральном введении вызывает быстрое наступление диссоциированной анестезии. Начало действия наблюдалось после введения через 5-15 минут, продолжительность составляла 1,5-3 часа. Животное фиксировалось. Соблюдая правила асептики и антисептики, нижнесрединным разрезом мобилизовался мочевой пузырь. Парауретрально, в области средней трети уретры вводили 0,1 геля Коллост в концентрации 7. или 15% соответственно (в зависимости от экспериментальной группы). Каждой крысе проводилось по 4 инъекции геля Коллост на 3, 6, 9 и 12 часах условного циферблата. Рана послойно ушивалась. Продолжительность операции в среднем составляла 30 минут. С целью профилактики инфекционных осложнений вовремя и в течение 2 суток после операции внутримышечно вводился Гентамицин в дозе 1 мг/кг. После операции животных содержали в индивидуальных клетках для исключения зализывания и травмирования ими ран. Условия содержания животных и работа с ними проводилась с учетом рекомендаций хронобиологии, хрономедицины и Положения Министерства здравоохранения и социальной защиты по работе с лабораторными животными (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г. «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», Приказ МЗ СССР № 1045-73 от 6.04.1973 г.).

С целью определения влияния геля Коллост на соединительную ткань парауретральной зоны, а также скорости и интенсивности ангиогенеза в месте имплантации мы использовали гистологические, иммуногистохимические,

электронно-микроскопические, морфометрические методы исследования и контрастную рентгенографию.

Биологический материал (ткани уретры в месте инъекции геля Коллост) после специальной обработки изучали с помощью светового микроскопа (Tesla BS-300, Hitachi ТМ3000) при увеличении 1610,40"° и 10010 (иммерсия). Для объективизации данных производилась фотосъемка на микроскопе МБИ15 на пленку Микрат-3 00.

С целью выявления пролиферативной активности фибробластов, макрофагов, плазматических клеток использовали моноклональные антитела PCNI, а также определяли уровень коллагеназы в клетках фибробластического ряда с помощью моноклональных антител (mc) С4 (коллагеназа 4). Полученные препараты изучали в микроскопе "Биолам-ИЗ" (Россия). Проводили подсчет окрашенных моноклональными антителами клеток в 10 полях зрения при увеличении объектива х 40, затем вычисляли среднее количество окрашенных клеток в одном поле зрения, разделив полученное число на 10.

Для морфологического исследования полученного в эксперименте материала мы использовали методику сканирующей электронной микроскопии нативных препаратов. Анализ проводили в сканирующем электронном микроскопе Phillips PSEM - 500х со съемкой на коммерческую широко - и узкоформатную пленку. Плотность лимфогемомикроциркуляторного русла в месте введения геля Коллост определяли с помощью методов СЭМНП. Полученные с помощью СЭМНП негативы проецировали с фотоувеличителя на бумагу "в клетку" при стандартном увеличении и обводили контуры микрососудов. Площадь сосудов определяли в процентах от общей площади препарата, которая измеряется в условных единицах.

С целью приготовления свежезамороженных срезов тканей экспериментальных животных для определения относительной плотности лимфо- и гемомикроциркуляторного русла в месте введения геля Коллост, мы использовали микротом - криостат МК-25.

Для изучения процессов реваскуляризации в зоне имплантации геля Коллост использовался рентген аппарат Philips Medio 50 CP и дигитайзер X Agfa - Gevaert N.V. После эвтаназии животного передозировкой препарата Фторотан, вскрывали брюшную полость, обнажая при этом нижнюю часть брюшного отдела аорты, который конюлировали стеклянным катетером, после чего вскрывали бедренные вены. Рентгенконтрастное вещество (Урографин 76% - 10,0 NaCl 0,9% - 10,0) вводили после перфузии кровеносной системы физиологическим раствором с добавлением гепарина (NaCl 0,9% -10,0 + Heparin sodium 50 тыс. ME (2 ампулы)) до истечении из бедренных вен прозрачной жидкости. После вышеуказанной процедуры на канюлю надевали шприц с рентгенконтрастным веществом и с помощью перфузомата со скоростью 1 мл/мин вводили раствор в кровеносные сосуды, по 3-5 мл каждому животному, по срокам, указанным в схеме постановки эксперимента. Затем крысу укладывали на рентгенконтрастную рамку и прицельно производили серию снимков. После получения серии ангиограмм с помощью цифровой аппаратуры получали стандартные снимки с увеличением в 10 раз.

Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере методом вариационной статистики с использованием программы Statistica 7,0 for Windows (Stat Soft Inc., США) с соблюдением общих рекомендаций для медицинских и биологических исследований. Для определения статистической значимости различий сопоставляемых средних величин использовали критерий Стьюдента (I) или непараметрические критерии Вилкоксона, Манна — Уитни. Сравнение качественных показателей производили с помощью метода Пирсон-х2 или точного критерия Фишера для малых выборок. Различие считалось статистически значимым при уровне значимостир < 0,05.

Эксперимент проведен на 164 экспериментальных животных. Выведение животных из эксперимента осуществлялось путем применения передозировки препарата Фторотан. Забор биологического материала в эксперименте №1 осуществляли через 14, 30, 60, 120 и 180 суток от начала эксперимента, в эксперименте №2 на 1, 3, 5 и 7 сутки, в эксперименте с использование

рентгенконтрастных веществ на 14, 30, 60, 120, 180 сутки. За время проведения эксперимента преждевременного выведения из эксперимента животных по состоянию здоровья не было.

Результаты исследования и их обсуждение Для изучения процессов реваскуляризации в зоне имплантации геля Коллост нами исследовалось состояние микрососудов адвентициальной оболочки уретры с применением количественного метода подсчета длины капилляров на единицу объема соединительной ткани с помощью методов СЭМ и наполнения сосудистой сети рентгенконтрастным веществом. Выявлена неравномерность скорости и интенсивности развития микрососудов в зависимости от условий микроокружения и возраста животных. Суммарная длина капилляров представлена в таблице 1.

Таблица 1

Длина капиллярной сети (мкм в 1 мм2 среза) после введения геля Коллост 7% и 15% в парауретральную область

Сутки Скорость ангиогенеза при воздействии

Физ. раствор 0,9% (контроль) Коллаген 7% Коллаген 15%

Крысы 6-8 месяцев Крысы 30-36 месяцев Крысы 6-8 месяцев Крысы 30-36 месяцев

Первые 27,12 ± 1,3 49,13 ± 1,44* 43,13 ± 1,01 58,05 ± 1,88* 52,47 ± 2,19

Третьи 52,76 ± 3,52 108,27 ± 5,04* 67,01 ± 1,88 171,68 ± 9,55* 90,09 ± 3,17

Пятые 72,41 ±4,15 138,34 ± 7,07* 81,07 ± 2,1 230,41 ± 10,16* 124,21 ± 5,31

Седьмые 103,48 ± 4,01 173,11 ± 10,24* 111,35 ± 5,99 290,71 ± 12,01* 149,23 ± 6,23

*- р < 0,001 - статистически значимые различия

Анализируя гистологические препараты с помощью методов сканирующей электронной микроскопии нативных препаратов и рентгенологических методов, мы отметили, что суммарная длина капилляров в начальные сроки заживления прогрессивно нарастает. На первые — третьи сутки после введения геля у животных всех групп отдельные капилляры были расширены, базальная мембрана их была разрыхлена. Ткани, окружающие микрососуды, содержали форменные элементы крови. Наблюдалось смешанное полнокровие. С третьих - пятых суток эксперимента отмечалось интенсивное развитие капилляров соединительной ткани. Они образовали почкующиеся выросты и эндотелиальные тяжи. Сосудистые петли располагались перпендикулярно поверхности раны. Протяженность сосудистого русла в 1 мм формирующейся соединительной ткани в ранах у крыс второй и третьей группы (инъекция Коллагена 7% и 15 % соответственно) достоверно выше этого показателя для контрольной группы животных. На седьмые сутки эксперимента у крыс первый группы на полутонких срезах видно застаивание плазмы крови в верхних петлях капилляров. Непосредственно под полинуклеарным валом эритроциты образовали монетные столбики. В месте введения геля Коллост у животных всех исследованных групп наблюдалось смешанное полнокровие. В этот срок наибольшее развитие капиллярной сети выявлено у животных третьей группы молодого возраста. Данный показатель у них был статистически достоверно выше показателей длины капилляров у животных первой и второй групп. Наблюдалось выраженное митотическое деление эндотелиальных клеток в растущих капиллярах. Таким образом, под действием введенного геля Коллост в парауретральную область процессы ангиогенеза активируются. Суммарная длина микроциркуляторного русла по сравнению с контрольной группой животных увеличивается. Максимальные значения отмечены на 7 сутки в группе животных младшей возрастной группы после введения коллагенового геля в концентрации 15% и составляют 290,71 мкм в 1 мм2 среза, в то время как в контрольной этот показатель равен 103,48 мкм в 1 мм* среза.

Следовательно, при воздействии на клеточные структуры гелем Коллост рост капилляров в месте введения облегчается. В процессе перестройки ткани в месте инъекции происходит редукция микрососудистой сети и увеличение показателя васкуляризации (длины капиллярной сети). Степень редукции в условиях воздействия геля Коллост во второй и третьей группах гораздо больше, чем в контрольной группе животных, что свидетельствует об отсутствии формирования грубой рубцовой ткани. Данные свойства геля Коллост подтверждаются и отсутствием у экспериментальных животных инфравезикальной обструкции, стриктуры уретры в послеоперационном периоде. В процессе наблюдений ни в одном случае не было обнаружено воспалительного процесса, признаков абсцедирования или эрозии в зоне имплантации биоматериала.

В нашем исследовании особое значение имеют фибробласты, так как эти клетки активно синтезируют гликозаминогликаны и коллагеновые волокна, основные составляющие матрикса соединительной ткани. По результатам исследования интактных животных пролиферативная активность фибробластов в поле зрения микроскопа при стандартном увеличении равнялась 2,41 ±0,11 у животных 6-8 месяцев и 1,17 ± 0,03 абсолютных единиц у крыс в возрасте 30-36 месяцев. Через 14 дней от начала эксперимента митотическая активность популяции этих клеток у животных в возрасте 6-8 месяцев увеличилась до 6,18 ± 1,07 (р<0,05), а в возрасте 30-36 месяцев до 4,48 ± 0,31 соответственно (концентрация геля 7%), после инъекции геля в концентрации 15% количество фибробластов у особей в возрасте 6-8 месяцев увеличилось более чем в 3 раза и составило 8,11 ± 1,71, в подгруппе 30-36 месяцев 5,19 ±0,31 соответственно (Рис.1).

При изучении серии экспериментальных животных через 1 месяц после инъекции геля Коллост осмотр наружной оболочки уретры макроскопических изменений не выявил. При гистологическом исследовании препаратов с помощью световой микроскопии отмечено, что в данной зоне каких - либо воспалительных изменений в отличие от 14 - дневного срока не отмечено (полнокровия гемомикроциркуляторного русла, стаза крови в кровеносных

микрососудах, посторонних для рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани клеточных элементов). При исследовании той же зоны с помощью сканирующей электронной микроскопии обнаружены фрагменты геля, особенно хорошо выраженные в третьей группе крыс, которым вводили коллагеновый гель в концентрации 15%.

И 6-8 месяцев П 30-36 месяцев

Интзктные животные

нцентрзции 7% Гель в концентрации 15%

Виды эксперимента

Рис. I - Абсолютное количество фибробластов в 1 мм на 14 сутки эксперимента после введения геля в концентрации 7 и 15% животным разных возрастных групп

При окраске клеток фибробластического ряда моноклональными антителами типа РСМ установлено, что их пролиферативная активность была почти в два раза больше по сравнению с контрольным результатам и в группе экспериментальных животных в возрасте 6-8 месяцев составила 4,51 ± 0,61 (р >0,05) при введении 7% геля, и, 5,21 ± 0,47 при 15% концентрации соответственно. Что касается животных в возрасте 30-36 месяцев, то разница по сравнению с интактной группой составила 3 раза и абсолютное число фибробластов насчитывалось 3,01 ± 0,07 при инъекции 7% геля и 3,71 ± 0,71 при 15% концентрации (Рис.2).

17

1 5 | ^

I з

4,51

Интактные животные Гель з концентрации Гель в концентрации 7% 15%

Виды эксперимента

□ 6 -3 месяцев

□ 30-36 месяцев

Рис. 2 - Абсолютное количество фибробластов в 1 мм2 на 30 сутки эксперимента после введения геля в концентрации 7 и 15% животным разных возрастных групп

Однако, количество маркированных клеток, синтезирующих коллагеназу, было в 2,5 раза больше, чем в контрольной группе, и при введении 7% геля молодым особям составило 2,81 ± 0,37, при 15% - 3,11 ± 0,23 (р<0,001). В группах старшей возрастной категории эта цифра составила 1,74 ± 0,03 при 7% и 2,41 ± 0,23 (р<0,001) при 15% концентрации геля Коллост (Рис.3).

3,5 3 2,5 2

2,81

1 3

0,9

3,11

ш

¡й

□ 6-8 месяцев

□ 30-36 месяцев

1

Интактные животные Гель в концентрации 7% Гель н концентрации

15%

Виды эксперимента

Рис. 3 - Абсолютное количество маркированных клеток, синтезирующих коллагеназу в 1 мм2 на 30 сутки эксперимента после введения геля в концентрации 7 и 15% животным разных возрастных

групп

Полученные данные указывают, что и по прошествии 30 суток после инъекции геля Коллост в парауретральную зону в рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани продолжаются активные процессы синтеза основного аморфного вещества (гликозаминогликанов, волокнистых структур и коллагеназы, которая необходима для рассасывания, лизиса коллагеновых волокон зоны имплантации с последующим созданием новых популяций клеток фибробластического ряда и волокнистых структур, которые, как указывалось выше, начинают приобретать упорядоченное положение). Исследование пролиферативной активности макрофагов также выявило повышения их активности, как это было заметно через 14 дней после инъекции геля. После введения 7% геля молодым животным абсолютное число макрофагов составляло 5,18 ± 0,71, а при имплантации 15% геля - 6,07 ± 1,01. В старшей возрастной группе митотическая активность макрофагов была также в 2,5 раза выше по сравнению с контрольной группой и составила 4,21 ± 0,27 при 7% концентрации и 5,01 ± 0,61 при 15% концентрации соответственно. Таким образом, через 1 месяц после инъекции геля Коллост в парауретральную зону крыс мы обнаружили сохранение пролиферативной активности фибробластов, синтеза коллагеназы и что наиболее интересно, на наш взгляд, это начало формирования в зоне присутствия геля соединительнотканной «манжетки». Этот' процесс был наиболее выражен в старшей возрастной группе экспериментальных животных, которым вводился гель в концентрации 15 %.

Уровень пролиферативной активности макрофагов через 2 месяца практически достиг контрольных результатов: в группе животных 6-8 месяцев, после введения 7% геля Коллост составил 4,01 ± 0,51, в опыте с животными 30-36 месяцев данный показатель был равен 2,62 ± 0,11. Схожая картина на 60 сутки эксперимента наблюдалась в группе животных, которым в парауретральную область был введен 15% коллагеновый гель, показатель пролиферативной активности макрофагов у молодых особей был равен 3,71 ± 0,41, в старшей возрастной группе показатель составил 3,51 ± 0,09.

Исследование через 4 и 6 месяцев показало практически те же результаты, полученные ранее, что свидетельствует о том, что уже через 3 месяца в соединительной ткани при введении жидкого коллагена 7 и 15% формируется соединительно-тканная манжетка, в основном представленная коллагеновыми волокнами и лежащими поблизости фибробластами. Через 6 месяцев после инъекции геля Коллост в парауретральную зону самок крыс мы обнаружили хорошо выраженную соединительно-тканную «манжетку», заместившую гель Коллост в результате активной деятельности клеток фибробластического ряда, которые за счет бурной секреторной активности в данном месте сформировали плотную оформленную соединительную ткань, не характерную для данного участка. Толстые коллагеновые волокна расположены параллельно друг другу рядом с такими же волокнистыми структурами, имеющими хаотичное расположение (Рис.4, 5). Зона, в которую был введен гель, стала напоминать вариант соединительной ткани, по морфологическому строению сходной с сухожилием. Наиболее заметные изменения обнаружены нами в группе животных в возрасте 30-36 месяцев, поскольку их соединительная ткань с возрастом утрачивает возможности восстановления в полном объеме.

Рис. 4 - Коллагеновые волокна в зоне инъекции 15% коллагенового геля через 6 месяцев от начала эксперимента животным в возрасте 6-8 месяцев (1-коллагеновые волокна). Сканирующая электронная микроскопия нативного препарата. Увеличение х 380

Рис. 5 - Коллагеиовые волокна в зоне инъекции 15% коллагенового геля через 6 месяцев от начала эксперимента животным в возрасте 30-36 месяцев. (1-коллагеновые волокна). Сканирующая электронная микроскопия нативного препарата. Увеличение х 380

Для изучения процессов реваскуляризации в зоне имплантации геля Коллост, нами исследовалось состояние микрососудов адвентициальной оболочки уретры с применением количественного метода подсчета длины капилляров на единицу объема соединительной ткани. При сравнении рентгенограмм животных младшей и старшей возрастных групп после введения 7 и 15% геля Коллост соответственно, существенная разница заключается в наличие вновь образованных микрососудов и организации сосудистого русла, что особенно прослеживается у животных 6-8 месяцев вне зависимости от концентрации геля. Анализируя данные, полученные при введении 15% геля Коллост, в обеих указанных выше группах, мы проследили ту же закономерность. У молодых животных восстановление сосудистых сетей, как правило, наблюдается через 30 дней от начала эксперимента, а у пожилых, как правило, через 2 месяца. Этим можно объяснить напряжение тканей, которое возникает в результате введения геля более высокой концентрации. В процессе экспериментального исследования случаев аллергической реакции на вводимый препарат выявлено не было, ни одно животное ранее установленного срока по состоянию здоровья из эксперимента не выведено, что говорит об отсутствии антигенности и хорошей биологической интеграции. Полученные в эксперименте данные свидетельствуют о возможности коллагенового геля Коллост ускорять

процессы реваскуляризации в месте инъекции, тем самым увеличивая скорость образования соединительно-тканной манжетки, что говорит о возможности коллагенового геля Коллост быть подходящей субстанцией для быстрого и устойчивого контакта с клетками организма. Таким образом, коллагеновый гель Коллост отвечает всем требованиям объемообразующего вещества и может быть рекомендован как материал для парауретральной инъекции.

ВЫВОДЫ

1. Безопасность использования коллагенового геля определяется отсутствием за время эксперимента местных аллергических реакций, нагноения ран, других осложнений, потребовавших выведения из эксперимента животных. На ранних сроках после введения геля эффективность связана с объемообразующими свойствами, а на поздних - механизм удержания обусловлен формированием соединительно-тканной манжетки.

2. Пространственная ориентация коллагеновых волокон после введения коллагенового геля уже через 14 суток приобретает более упорядоченный вид, за счет активной секреции коллагеназы, уровень которой увеличивается в 3,5 раза и составляет 4,47 ± 0,54, что сохраняется до 30 суток. К 60 суткам происходит двукратное снижение уровня коллагеназы и возвращение ее к исходным данным, сопоставимым с контрольной группой животных и к 180 суткам, когда у экспериментальных животных хорошо сформировалась соединительно-тканная манжетка.

3. Выявлена зависимость пролиферативной активности фибробластов от концентрации геля и возраста животных. Максимальное количество фибробластов определяется в тканях на 14 сутки животных 6-8 месяцев после введения 15% коллагенового геля и составляет 8,11 ± 1,71 (в 1 мм2), у животных в возрасте 30-36 месяцев количество фибробластов составляет 5,19 ±0,31 (в 1 мм2).

4. Максимальное значение длины капилляров в 1 мм2 среза определяется на 7 сутки после введения 15% геля животным в возрасте 6-8 месяцев. Окончательное формирование сосудистой сети у животных 6-8 месяцев происходит к 30 суткам, у животных 30-36 месяцев к 60 суткам.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Коллагеновый гель может быть использован как средство для парауретральной инъекции при лечении стрессового недержания мочи у женщин.

2. Оптимальным для создания соединительно-тканной манжетки в парауретральной зоне является гель в концентрации 15%, которому следует отдать предпочтение.

3. В случае сохранения или возобновления симптомов недержания мочи, повторная инъекция коллагенового геля может быть повторена не ранее чем через 1 месяц — срок формирования соединительно-тканной манжетки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Синякова JI.A., Шишло В.К., Королев П.В. Влияние геля Коллост на элементы соединительной ткани уретры экспериментальных животных // Сборник научных трудов XXXXIII научно-практической конференции врачей филиала №1 ФГУ «ГВКГ им. Н.Н.Бурденко Минобороны России» «Актуальные вопросы оптимизации лечебно-диагностического процесса в условиях работы в составе крупного военно-лечебного объединения». Красногорск, 2011. — С.101-104.

2. Лоран О.Б., Синякова JI.A., Шишло В.К., Королев П.В. Клеточные изменения в парауретральной зоне экспериментальных животных при воздействии геля КоллостII Урология. — 2012. — №3. — С.19-22.

3. Лоран О.Б., Синякова Л.А., Шишло В.К., Королев П.В. Воздействие коллагенового геля на клетки соединительной ткани и кровеносных микрососудов в парауретральной области экспериментальных животных при старении. // Клиническая геронтология. — 2012. — Т.18.— №9 — 10, —С.7-12.

4. Лоран О.Б., Синякова Л.А., Шишло В.К., Королев П.В. Реактивные преобразования микрососудов в уретре экспериментальных животных при воздействии коллагенового геля (экспериментальное исследование) // Московский хирургический журнал. — 2012. — №2 (24). — С.33-37.

5. Лоран О.Б., Синякова Л.А., Шишло В.К. Воздействие коллагенового геля на макрофагальную систему в возрастном аспекте (экспериментальное исследование) // «Вестник лимфологии». — 2012. — №3. — С. 7.

6. Лоран О.Б., Синякова Л.А., Шишло В.К. Влияние коллагенового геля на макрофаги соединительной ткани (экспериментальное исследование) // «Вестник лимфологии». — 2012. — №2. — С. 52.

Королев Павел Владимирович (Россия) «Применение коллагенового геля в лечении стрессового недержания мочи» (Экспериментальное исследование)

Недержанием мочи называется состояние, при котором происходит непроизвольное подтекание мочи. Ослабление мышц тазового дна является основной причиной развития стрессового недержания мочи у женщин. Функция тазового дна может нарушаться вследствие одной или сочетания нескольких причин: ослабления тазовых мышц, повреждения соединительнотканных структур тазового дна, нарушения координации различных мышечных групп. Нами проведено исследование на экспериментальных животных, самках крыс белой линии Вистар, вне репродуктивного возраста, путем имплантации коллагенового геля в парауретральную область. Применявшиеся методы исследований дали возможность определить состояние микрососудистого русла в зоне инъекции, определить различие скорости ангиогенеза в зависимости от концентрации коллагена и возраста животного. Для изучения процессов реваскуляризации в зоне имплантации геля Коллост, нами исследовалось состояние микрососудов адвентициальной оболочки уретры с применением количественного метода подсчета длины капилляров на единицу объема грануляционной ткани. Результаты эксперимента показывают возможность применения коллагенового геля Коллост в качестве объемобразующего материала для парауретральных инъекций при недержании мочи.

Urinary incontinence is a condition in which the involuntary leakage of urine. The weakening of the pelvic floor muscles is a major cause of stress urinary incontinence in women. The function of the pelvic floor may be disrupted due to one or a combination of several factors: the weakening of pelvic muscles, damage to the connective tissue structures of the pelvic floor incoordination of the various muscle groups. We conducted a study in experimental animals, the female rats of Wistar white, regardless of reproductive age, by implantation of a collagen gel in the paraurethral area. The methods of research made it possible to determine the status of microvascular zone injection, to determine the difference in the rate of angiogenesis in relation to the concentration of collagen and age of the animal. To study the processes of revascularization in the area of implantation of the gel Collost, we investigated the status of microvascular adventitia urethra using a quantitative method of calculating the length of capillaries per unit volume of granulation tissue. The experimental results show the possibility of using collagen gel as Collost bulking material for the paraurethral injections for urinary incontinence.

Подписано в печать 16 октября 2013 г. Объем 1,0 усл. п. л. Тираж 100 экз. Отпечатано в типографии «Реглет». Заказ № 125 119526 г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 www. reglet, ru, +7 495 363 78 90