Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Оценка мутагенного действия факторов окружающей среды микроядерным методом на клетки органов выделительной системы

На правах рукописи

Шереметьева Светлана Михайловна

ОЦЕНКА МУТАГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ МИКРОЯДЕРНЫМ МЕТОДОМ НА КЛЕТКИ ОРГАНОВ ВЫДЕЛИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ

14.00.07.-Гигиена 03.00.15.- Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Г

/

МОСКВА-2006

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н Сысина РАМН в лаборатории генетического мониторинга и лаборатории цитогистологии

Научные руководители:

доктор биологических наук Сычева Людмила Петровна

доктор биологических наук Беляева Наталия Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Новиков Сергей Михайлович доктор биологических наук Абилев Серикбай Керимович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Защита диссертации состоится 13 апреля 2006 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.009.01 в ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им.А.Н.Сысина РАМН по адресу: 119992, г. Москва, ул. Погодинская, д. 10/15, строение 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН

Автореферат разослан----------------- 2006 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук

Беляева Наталия Николаевна

XOO£A

&-IQ8

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Своевременное и корректное выявление мутагенов для запрета или ограничения их использования - одна из основных задач гигиены окружающей среды [Сычева Л.П., Рахманин Ю.А. и соавт., 2005; Бочков Н.П., Чеботарев А.Н., 1989; Ревазова Ю.А., Журков B.C., 2001]. Это важно и для прогноза канцерогенной активности факторов, поскольку положительные результаты краткосрочных тестов анализа мутагенной активности химических соединений рассматривают в качестве прогностических показателей наличия у них канцерогенных свойств. Некоторые авторы считают, что генотоксические исследования могут стать альтернативой классическим методам оценки канцерогенной активности [Douglas G.K et al, 1988; Ashby J. et all, 1996]. Исследование канцерогенности одного химического соединения общепринятым методом требует проведения двухлетних дорогостоящих экспериментов, поэтому трудно представить, чтобы такие исследования приобрели массовый, опережающий характер. Подобное положение обязывает признать, что краткосрочные тесты для выявления мутагенных химических веществ играют роль своеобразной «просеивающей» программы для выявления потенциальных канцерогенов.

В ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН разработана система оценки мутагенного эффекта факторов окружающей среды с учетом органной специфичности, основой которой является полиорганный микроядерный тест [Сычева Л.П., 2002]. Он позволяет с большей долей вероятности, по сравнению с другими краткосрочными тестами, прогнозировать канцерогенные свойства исследуемого фактора и определять органы-мишени. Однако в этой системе оценка мутагенного эффекта в органах выделительной системы разработана недостаточно. Подобного рода исследования мутагенного действия химических соединений на клетки мочевого пузыря и почек единичны. В то же время установлено, что многие вещества, в том числе ароматические амины, соли тяжелых металлов, хлорорганические соединения индуцируют рак в этих органах. По данным ВОЗ рак мочевого пузыря по частоте встречаемости среди всех злокачественных новообразований, уступает только опухолям желудка, пищевода, легких и гортани. В мире ежегодно регистрируется около 170 000 - 200000 новых случаев рака мочевого пузыря и среднегодовой темп прироста составляет 3,34% [Старинский В.В., с соавт., 2002; Чисов В.И., с соавт., 2000].

Установлено, что химические соединения, образующиеся в производственных процессах кожевенной, анилинокрасочной, резиновой, электрокабельной, каучуковой промышленности, а также некоторые лекарственные препараты обладают генотоксической и канцерогенной активностью в клетках мочевого пузыря человека и лабораторных животных [IARC, 1981; Двойрин В.В. с соавт., 1996: Maltoni С. et all. 1996; Плисс Г.Б., 1996]. РОС. НАЦИОНАЛЬНА.''

БИБЛИОТЕКА

Открытие возможности определять генотоксические повреждения в эксфолиативных клетках, полученных неинвазивным способом, позволило использовать микроядра в качестве маркера для выявления ранних канцерогенных изменений в эпителиальных тканях [Stich H.F., Rosin М.Р., 1983;1984; Rosin М.Р.,1992; Majer B.J. et al., 2001]. Однако для эксфолиативных уротелиальных клеток человека соответствующие методические основы разработаны недостаточно.

В связи с этим целью исследования являлась оценка микроядерным методом мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов выделительной системы. Для ее достижения сформулированы следующие задачи:

1. Усовершенствовать методы оценки цитогенетического эффекта факторов среды в клетках органов выделительной системы экспериментальных животных и человека.

2. Определить контрольные уровни цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках органов выделительной системы животных и в эксфолиативных уротелиальных клетках человека.

3. Оценить временные и дозовые закономерности действия модельного мутагена на цитогенетические и цитотоксические показатели в клетках мочевого пузыря млекопитающих.

4. Изучить мутагенное действие химических соединений и у-излучения на эпителиальные клетки мочевого пузыря млекопитающих.

Научная новизна. Впервые:

- В оценку цитогенетического эффекта в уротелиальных клетках мочевого пузыря включен новый показатель - доля клеток с ядерными протрузиями. Установлена высокая значимая корреляция этого показателя с микроядрами (0,52- 0,72; р<0,001).

- В анализ уротелиальных клеток мочевого пузыря включены дополнительные кариологические показатели (частота двуядерных клеток; клеток с центральной ядерной перетяжкой; клеток с атипичной формой ядра), изменение которых может указывать на цитотоксическое действие исследуемого фактора.

- Разработан и апробирован неинвазивный метод комплексной оценки эксфолиативных уротелиальных клеток человека по цитогенетическим и кариологическим показателям.

- Проведена количественная оценка и определены дозовые параметры цитогенетического и цитотоксического действия на эпителиальные клетки мочевого пузыря мышей и/или крыс диоксида азота, диоксидина, диоксазида, метиленового голубого, профлавин ацетата, стронция, цезия, циклофосфамида, продуктов дезактивации химических отходов (люизита, иприта, совтола).

- Определены дозо - временные зависимости цитогенетического эффекта циклофосфамида в клетках мочевого пузыря от длительности воздействия и времени после окончания воздействия.

- Установлены ориентировочные фоновые частоты кариологических показателей в эпителиальных клетках мочевого пузыря у контрольных животных и в эксфолиативных уротелиальных клетках человека.

Практическая значимость. Применение разрабатываемой методологии позволяет значительно увеличить объем получаемой информации о цитогенетическом и цитотоксическом действии фактора, повысить надежность качественной и количественной оценки мутагенных свойств химических соединений в экспериментах на млекопитающих и при обследовании людей.

Материалы исследований по корреляции частоты клеток с микроядрами и протрузиями, оценке других кариологических показателей в органах выделительной системы использованы при разработке:

- изобретения «Способ неинвазивной диагностики цитогенетического и цитотоксического действия различных факторов на организм человека» [заявка № 2005108225, приоритет от 24.03.05];

- методических рекомендаций «Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека», утвержденных Председателем Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ академиком РАМН Ю.А.Рахманиным [Москва, 2005. - 37с].

Результаты экспериментальных исследований по изучению мутагенной активности использованы при обосновании гигиенических нормативов:

- диоксида азота - разовая ПДК рекомендована к утверждению Комиссией по санэпиднормированию МЗиСР РФ РФ [протокол от 28.12.04 г.] [Справка о внедрении №2 от 25.01.05 г.].

- смеси триэтаноламинных солей сульфированных полихлорированных бифенилов и сульфированного трихлорбензола при пероральном поступлении в организм лабораторных животных. ОДУ этих соединений в воде водных объектов утверждена Минздравом РФ [ГН 2.1.5.1316-03].

Результаты по оценке мутагенной активности смесей РМ1 (продуктов нейтрализации люизита) и РМ2 (продуктов нейтрализации иприта) использованы при комплексной оценке степени эффективности обезвреживания и утилизации этих отходов и при обосновании гигиенических рекомендаций по технологии их переработки [Справка о внедрении от 02.02.05г.].

Работа выполнена в лаборатории генетического мониторинга в рамках плановых тем ГУ НИИЭЧиГОС им.А.Н.Сысина РАМН «Разработка методологии оценки мутагенного эффекта в клетках органов дыхательной и выделительной системы», 2003-2005 гг., № госрегистрации 01200303902; «Гигиенические основы управления качеством внутренней среды современных общественных зданий» 2005-2007г., № госрегистрации 01200502722; "Разработка системы методов обоснования и верификации эколого-гигиенических нормативов химических веществ в окружающей среде на основе компьютерного моделирования и экспериментальных исследований", 20032005 гг., № госрегистрации 01200303903.

Исследования проведены совместно с лабораториями ГУ НИИЭЧиГОС им.А.Н.Сысина РАМН: комплексного эколого-

гигиенического нормирования (зав. - д.м.н. О.О.Синицина); гигиены почвы (зав. - д.м.н., проф., И.А.Крятов), питьевого водоснабжения (зав. - д.м.н. Р.И.Михайлова); гигиены атмосферного воздуха (зав.- д.м.н., проф., М.А.Пинигин); цитогистологии (зав. - д.б.н. Н.Н.Беляева); и другими институтами: ГУП МосНПО Радон (рук. группы - д.б.н. А.Н.Осипов); ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ (рук. лаборатории - д.м.н. С.М. Шарова); ГУ НИИ фармакологии (рук. лаборатории - д.м.н., проф., А.Д.Дурнев).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции молодых ученых «Развитие научного творчества молодежи -объект постоянного внимания В.А.Рязанова» [Москва, 2003]; 2-м съезде токсикологов России [Москва, 2003]; 3-м съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров [Москва, 2004]; 5-м съезде Российского общества медицинских генетиков [Уфа, 2005]; Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Окружающая среда и здоровье" [Суздаль, 2005].

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 3 - в центральной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Текст изложен на 156 страницах машинописи, иллюстрирован 43 таблицами и 11 рисунками. Указатель литературы содержит 150 источника, из них 52 отечественных и 98 иностранных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Методические основы оценки мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов выделительной системы (почки, мочевой пузырь) экспериментальных животных и человека.

2. Зависимость цитогенетического и цитотоксического эффекта модельного мутагена и канцерогена - циклофосфамида в клетках мочевого пузыря мышей от длительности воздействия, дозы и времени после окончания воздействия.

3. Качественные и количественные параметры цитогенетического и цитотоксического действия химических веществ (метиленового голубого, профлавин ацетата, диоксида азота, диоксидина, диоксазида), смесей (продуктов нейтрализации люизита, иприта, совтола) при ингаляционном и пероральном воздействии, низких доз у-излучения на клетки органов выделительной системы.

Материал, методы и объем исследований. В работе исследован циклофосфамид - модельный мутаген и канцероген, индуцирующий опухоли мочевого пузыря; химические вещества (метиленовый голубой, профлавин

ацетат, диоксидин, диоксид азота, диоксазид, соли цезия и стронция), смеси (продукты нейтрализации люизита, иприта, совтола) и у-излучение (табл.1). Экспериментальные исследования выполнены на 333 животном (мышах и крысах) при анализе 1000 клеток каждого органа. Методика получения и анализа препаратов эксфолиативных клеток мочевого пузыря человека апробирована при анализе уротелиальных клеток 19 здоровых волонтеров. Цитогенетический анализ проведен с использованием микроядерного теста на клетках органов выделительной системы.

Таблица 1.

Объем, методы и схемы проведенных исследований

Факторы Исследуемые дозы, уровни и длительность воздействия Объект исследования, количество животных Исследуемые показатели Типы клеток Число клеток

Циклофосфамид 10, 20 мг/кг в течение 3, 7, 14, 21, 30 дней Мыши (СВАх *С57В1/6)Р, (102) Доля клеток с микроядрами, ядерными протрузиями, двумя ядрами, ядерной перетяжкой и с атипичной формой ядра Эпителиальные клетки мочевого пузыря 102000

РМ1 (продукты нейтрализации люизита) 1,56 7,8, 39 мг/кг (1/250, 1/50,1/10 ЛДю) в течение 8 дней Мыши (СВАх хС57В1/6)Р, (21) Доля клеток с микроядрами, ядерными протрузиями, двумя ядрами и с ядерной перетяжкой Эпителиальные клетки мочевого пузыря 21000

РМ2 (продукты нейтрализации иприта) 3,6, 18,92 мг/кг (1/1250, 1/250, 1/50 ЛД») в течение 6 дней Мыши СВАхС57В1/6 (15) 15000

Соли цезия, стронция и у-излучение 70 мг/л и 0,17сГр/сутки в течение 40 дней Мыши СВА (30) Доля клеток с микроядрами Кл коркового вещества почек, эпителиальные кл мочевого пузыря 48000

70 мг/л и 0,17 сГр/сутки в течение 270 дней Мыши СВА (28) Доля клеток с микроядрами, ядерными протрузиями, двумя ядрами, ядерной перетяжкой и с атипичной формой ядра Эпителиальные клетки мочевого пузыря 28000

Диоксидин 10,100 и 300 мг/кг (1/60, 1/6и'/2ДЦ50) в течение 16 дней Мыши С57В1/6 (25) Доля клеток с микроядрами, ядерными протрузиями, двумя ядрами и с атипичной формой ядра Клетки коркового вещества почек 25000

Метиленовый голубой 0,01,0,05, 0,25 мг/кг Белые крысы (24) Доля клеток с микроядрами, ядерными Эпителиальные клетки мочевого 24000

Профлавин ацетат 0,01,0,05,0,25 мг/кг Белые крысы (24) протрузиями, двумя ядрами, ядерной перетяжкой и с атипичной формой ядра пузыря 24000

Диоксазид 25 мг/кг (1/24 ЛД»)в течение 3 месяцев Белые крысы (10) 10000

Диоксид азота 1 0 мг/мЗ в течение 2 и 5 суток, 20 мг/мЗ в течение 2 суток и 45 мг/мЗ в течение 4 часов (1/16,1/8,1/4ЛД») Белые крысы (31) 31000

ПХДС-Т (продукты нейтрализации совгола) 0,005, 0,05, 0,5 мг/кг (1/1000, 1/100, 1/10 ЛД») в течение 3 месяцев Белые крысы (22) 22000

19 волонтеров Эксфолиа- тивные уротелиа-льные клетки человека 19000

Приготовление препаратов эпителиальных клеток мочевого пузыря и коркового вещества почек проводили путем фиксации органов в формалине не менее двух недель с последующей диссоциацией в КОН. Препараты изолированных клеток окрашивали ацетоорсеином-светлым зеленым [Сычева Л.П. и соавт., 2001].

Для ускорения получения результатов исследования нами была разработана оригинальная методика приготовления препаратов ex tempore. Метод заключается в выделении мочевого пузыря после забоя животного, соскабливании эпителиальных клеток слизистой оболочки скальпелем и нанесении клеточной массы на предметное стекло в каплю эмбриональной телячьей сыворотки с последующим распределением клеток по стеклу. Окраску препаратов проводили по стандартной схеме.

Препараты эксфолиативных уротелиальных клеток человека готовили по разработанной нами оригинальной методике, отличающейся от ранее предложенного метода Stich H.F. и соавторов (1983) по параметрам центрифугирования мочи, условиям фиксации, окраски и анализа препаратов. Наш метод подготовки препаратов, в отличие от предложенного другими авторами, позволяет анализировать не менее 1000 клеток.

Для оценки цитогенетических нарушений в клетках выделительной системы, помимо регистрации клеток с микроядрами, нами введен дополнительный показатель - «частота клеток с ядерными протрузиями». Протрузии - шаровидные, нитевидные или иной формы ядерные структуры в цитоплазме, четко отграниченные от ядра и соединяющиеся с ним перемычкой. Это ДНК-содержащие образования, которые красятся по методу Фельгена. Установлено, что протрузии могут включать фрагменты хромосом (в некоторых протрузиях метка не выявляет центромеры), отставшие при нарушении веретена деления хромосомы (в некоторых протрузиях выявляется

центромера). Кроме того, они могут образовываться при элиминации амплифицированной ДНК [Shimisu N. et al.,1998;2000; Miele M. et al.,1989] или ДНК-репарационных комплексов [Haaf Т. et al.,1999]. Таким образом, частота клеток с микроядрами и/или протрузиями является индикатором мутагенного и канцерогенного действия исследуемого фактора.

С целью комплексной оценки цитогенетического и цитотоксического действия на анализируемых препаратах дополнительно учитывали двуядерные клетки, клетки с центральной перетяжкой ядра (показатели нарушения или ускорения пролиферации клеток) и клетки с атипичной формой ядра.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной статистической программы STATISTICA for Windows 6.0. Сравнение долей клеток с нарушениями между опытными и контрольной группами проводили по критерию у^ [Margolin В.Н., Risko К. J., 1988]. Массив данных по каждому показателю оценивали с помощью корреляционного и регрессионного анализа.

Результаты исследований

1. Оценка цитогенетических и цитотоксических повреждений в клетках органов выделительной системы контрольных животных

Обобщенные средние данные по частоте цитогенетических и цитотоксических показателей для мочевого пузыря контрольных животных и человека представлены в таблице 1.1.

Частота клеток мочевого пузыря с микроядрами у мышей линии СВА составила 0,50±0,29%о; у мышей (CBA*C57B1/6)F1 - 0,75±0,19%о. Для всех мышей контрольных групп средняя частота клеток с микроядрами -0,69±0,16%о. Доля клеток мочевого пузыря с микроядрами у белых беспородных крыс в среднем составила 0,71±0,29%о.

У мышей доля клеток мочевого пузыря с ядерными протрузиями в среднем составила 1,28±0,36%о; у крыс-3,21±0,74%о.

Доля двуядерных клеток на суспензионных препаратах мочевого пузыря мышей и крыс составила 14,96+2,87%о и 12,46±1,65%о соответственно (табл.1.1).

Впервые у контрольных животных в эпителиальных клетках мочевого пузыря установлен уровень таких показателей, как частота клеток с центральной ядерной перетяжкой (средняя частота клеток у мышей-14,53±2,34%о, у крыс - 33,92±3,89%о) и доля клеток с атипичной формой ядра (средняя частота клеток у мышей - 126,36±13,95%о, у крыс - 37,89±5,73%о) (табл. 1.1).

Таблица 1.1.

Средние значения фоновых показателей клеток органов выделительной системы животных и человека

Исследуемые объекты Средние значения показателей в наших исследованиях в %ак m пределы варьирования показателя (min - шах) Средние значения показателей по данным литературы, %о

Доля клеток с микроядрами Доля клеток с протрузи-ями Доля двуя-дерных клеток Доля клеток с ядерной перетяжкой Доля клеток с атипичной формой ядра Микроядра

Мыши СВА (контрольные животные, 9 мышей) 0,50+0,29 1,25±0,95 12,50±3,38 13,50+2,06 9,5012,53 -

Мыши (СВАхС57В1/6)Р1 (контрольные животные, 24 мыши) 0,75+0,19 1,29+0,4 15,3713,31 14,7112,72 152,318,68 1,40-3,33%» [Сычева Л П, 2002]

£ средних значений сонтрольных мышей СВА и (СВА><С57В1/6)Р| 0,69±0,16 (0-3) 1,28±0,36 (0-4) 14,9612,87 (1-58) 14,53+2,34 (0-49) 126,36113,95 (6-240) -

Белые крысы (контрольные животные, 23 животных) 0,71+0,29 (0-6) 3,21+0,74 (0-19) 12,46+1,65 (1-30) 33,9213,89 (8-79) 37,8915,73 (3-104) 0,42-0,59%» [Сычева Л П, 2002]

эксфолиативные уротелиальные клетки человека (19 волонтеров) 0,31±0,11 (0-1) 0,53±0,19 (0-3) 1,21 ±0,44 (0-8) 1,95+0,53 (0-8) 7,89+1,29 (0-23) 0,12%. [Anwar WA, Rosin MP, 1993], 0,14%. [Fontana L at al ,2001], 0,66*. [Burgaz S, Iscan A, 1995]; 1,404. [Hofseth L J at al, 1996] 2,73%. [Jen M N at al, 2002]

Нами исследованы микроядерным методом цитогенетические и цитотоксические показатели в эксфолиативных уротелиальных клетках 19 условно здоровых людей, в возрасте от 25 до 70 лет. Средние значения кариологических показателей, определенные у волонтеров, представлены в таблице 1.1.

2. Оценка временных и лозовых параметров цитогенетического и цитотоксического эффектов циклофосфамида в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей-гибридов (СВАхС57В1/6)Е1

Зависимость цитогенетического и цитотоксического эффекта от длительности действия мутагена. Отмечено, что динамика доли клеток с микроядрами и протрузиями в мочевом пузыре мышей через сутки после 3, 7, 14,21 и 30-кратного введения циклофосфамида в дозах 10 и 20 мг/кг различна и зависит от действующей дозы циклофосфамида. При действии дозы в 10 мг/кг максимальный эффект наблюдался на 7 сутки и сохранялся в течение месяца, тогда как при действии 20 мг/кг изменение эффекта носило флуктуирующий характер (рис.2.1). Снижение цитогенетического действия циклофосфамида в дозе 20 мг/кг на 14 сутки введения мутагена можно объяснить увеличением уровня генетических повреждений в клетках мочевого пузыря, приводящих к их элиминации. Подобный феномен снижения клеток с генетическими повреждениями при действии высоких доз мутагена отмечен в ряде других исследований (Сычева Л.П., 2002).

Рис. 2.1. Цитогенетическое действие циклофосфамида на клетки мочевого пузыря мышей.

Цитогенетический эффект циклофосфамида в дозах 10 мг/кг и 20 мг/кг выявлен по статистически достоверному увеличению доли клеток с микроядрами на всех сроках введения мутагена (за исключением 14х суток воздействия дозы 20 мг/кг), а также статистически достоверному увеличению

частоты клеток с ядерными протрузиями (за исключением 3-х суток воздействия дозы 10 мг/кг).

Выявлена высокая значимая корреляция частоты клеток с микроядрами и протрузиями (при действии дозы 20 мг/кг 11=0,72, Р<0,001, с1£=34; при дозе 10 мг/кг 11=0,52, Р<0,001, £^=34).

Зависимость цитогенетического и цитотоксического эффекта в клетках мочевого пузыря мышей от времени после окончания 4-кратного введения циклофосфамида в дозе 10 мг/кг

Цитогенетический эффект (статистически достоверное превышение над контролем) сохранялся в клетках мочевого пузыря на всех сроках (1, 3, 7, 21 сутки) после окончания четырехкратного воздействия циклофосфамида, тогда как эффект в клетках костного мозга достоверно определялся только через 1 сутки после окончания введения мутагена (рис.2.2).

Рис. 2.2. Доля клеток мочевого пузыря с микроядрами и протрузиями в зависимости от длительности после окончания введения циклофосфамида.

3. Мутагенный эффект химических соединений, у-излучения в клетках мочевого пузыря экспериментальных животных

Установлено цитогенетическое действие метиленового голубого по увеличению доли клеток с протрузиями в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей при действии дозы 0,05 мг/кг (минимально-действующая доза). Также статистически достоверно увеличилась доля клеток с атипичной формой ядра в группах при действии доз 0,05 мг/кг и 0,25 мг/кг, что указывает на

цитотоксическое действие исследуемого вещества. Эти же дозы вызывали статистически достоверное снижение доли двуядерных клеток и клеток, имеющих ядерную перетяжку (табл. 3.1).

Таблица 3.1.

Направленность изменений исследуемых показателей при действии химических соединений и смесей на эпителиальные клетки мочевого пузыря

Воздействующие агенты Среднее значение показателя в %о ± т

Доля клеток с микроядра ми Доля клеток с протруз-иями Доля двуядерных клеток Доля клеток с ядерными перетяжками Доля клеток с атипичной формой ядра

Циклофосфамид 10 мг/кг 3 дня -Т-~ ■. = ш» = тт

7 дней шт шив ят А * я

14 дней тш яянв ЯШ = =

21 дней шт. =

30 дней «и язвв ш = =

20 мг/кг 3 дня шягт ■в к ^ *

7 дней жав шшт = шшт 1

14 дней = шшш 1И1 = I

21 дней яяя шш ■■ = г г .

30 дней ■■ =

Количес тво дней после 4х кратного воздейст вия 10 мг/кг 1 день = = = V:.

3 дня шшт ■в = МП =

7 дней ш а ИЗ 1 А

21 дней рр!И ЯННШ = = =

Метиленовый голубой (4 мес) 0,01 мг/кг = = = •Ша =

0,05 мг/кг = шв ЁШ ШВВк

0,25 мг/кг = =

Профлавин ацетат (1 мес) 0,01 мг/кг = = МИ от ИИИ

0,05 мг/кг = = ни ямти =

0,25 мг/кг = = в ут

Диоксазид 25 мг/м' в течение 3 месяцев = = щщ /ЩЩ =

Диоксид азота 10 мг/м3 в течение 2 суток = - ti Vut ■ . t •

10 мг/м3 в течение 5 суток = — iJH Ш«а î i

20 мг/м3 в течение 2 суток = = «ОрМ! =

45 мг/м3 в течение 4 часов = = «M**

Соли цезия 70 м г/л 40 дней = - - - -

270 дней = = =

Соли стронция 70 м г/л 40 дней = - - - -

270 дней = =

у-излучение 0,17 сГр/сутки 40 дней = - - - -

270 дней = = = = *" гtJLl

Соли цезия и у-излучение 40 дней = - - - -

270 дней = = = = =

Соли стронция и у-излучение 40 дней = - - - -

270 дней = = = = =

РМ1 (продукты нейтрализации люизита) 8 дней 1/250 ЛД» = = " S -

1/50 ЛД» = = шя = -

1/10 ЛД50 = шт = шш -

РМ2 (продукты нейтрализации иприта) 6 дней 1/1250 ЛД» = = ■H шт -

1/250 ЛД» = = = = -

1/50 ЛД50 = шт ЯШ ГЗЯРЪ -

ПХДС-Т (продукты нейтрализации совтола) (3 мес) 0,005 мг/кг = = = = =

0,05 мг/кг = = = = =

0,5 мг/кг = = = = =

»

Примечание' РР достоверные повышение эффекта по сравнению с контролем (критерий %2) Л достоверные снижение эффекта по сравнению с контролем (критерий х2) = нет достоверно значимых изменений - показатель не анализировали

Профлавин ацетат не индуцировал микроядра и протрузии в клетках мочевого пузыря крыс, но вызывал статистически достоверное повышение частоты двуядерных клеток и клеток, имеющих ядерную перетяжку, при действии всех исследованных доз. Увеличение клеток с атипичной формой ядра выявлено при воздействии самой низкой дозы (табл.3.1).

Диоксазид (25 мг/кг) не индуцировал микроядра и протрузии в клетках мочевого пузыря крыс, но вызывал статистически достоверное изменение частоты двуядерных клеток и клеток с ядерной перетяжкой (табл. 3.1).

Диоксида азота (10, 20, 45 мг/м3) не оказывал цитогенетического действия на клетки мочевого пузыря крыс, но индуцировал цитотоксическое действие всех исследованных концентрациях. Во всех группах выявлено статистически достоверное повышение доли двуядерных клеток, клеток, имеющих ядерную перетяжку, и клеток с атипичной формой ядра (табл.3.1).

Соли цезия, стронция и у~излУчение (270 дней воздействия). Цитогенетическое действие не обнаружено, но выявлен цитотоксический эффект данных факторов в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей (рис.3.1).

■ микроядра

□ протрузии

□ ядрасперет Ш2хядерн

■ атипич фор ядра

контроль

Sr+гамма изл

Рис.3.1. Цитогенетический и цитотоксический эффект изолированного и сочетанного действия цезия, стронция и у-излучения в эпителиальных клетках мочевого пузыря при 270 дней воздействия.

Установлено цитогенетическое действие смеси продуктов нейтрализации люизита (РМ1, 1/10 ЛД50) и иприта (РМ2, 1/50 ЛД50) на клетки мочевого пузыря экспериментальных животных по увеличению частоты клеток с протрузиями (рис.3.2; 3.3). Цитогенетический эффект увеличивался с повышением исследуемых доз.

Рис. 3.2. Доля клеток с микроядрами и протрузиями в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей после 7-кратного введения РМ1.

Также выявлено цитотоксическое действие практически всех доз исследованных смесей по увеличению частоты двуядерных клеток, что косвенно свидетельствует об увеличении пролиферативной активности в мочевом пузыре, и клеток, имеющих ядерную перетяжку (табл.3.1). Показано соответствие органов-мишеней (мочевой пузырь) действия смесей РМ1 и РМ2, с органами-мишенями мутагенного и канцерогенного действия исходных соединений по данным литературы.

Рис. 3.3. Доля клеток с микроядрами и протрузиями в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей после 5-кратного введения РМ2.

Установлено отсутствие цитогенетического и цитотоксического эффекта продуктов нейтрализации совтола (ПХДС-Т) при пероральном трехмесячном введении в клетках мочевого пузыря крыс; отсутствие цитогенетического эффекта в эпителиальных клетках мочевого пузыря мышей при действии низких доз у-излучения на уровне трехкратного повышения природного радиоактивного фона, при изолированном и сочетанном действии солей цезия и стронция с у-излучением в течение 40 дней.

Важным органом выделительной системы при изучении цитогенетического действия факторов окружающей среды являются почки. На клетках почки нами изучен эффект диоксидина в дозах 10, 100 и 300 мг/кг в течение 16 дней на 25 мышах; изолированного и сочетанного действия солей цезия (70 мг/л), стронция (70 мг/л) и у-излучения (0,17 сГр/сутки) в течение 40 дней на 26 мышах. Проведен анализ 51000 клеток от 51 животного, однако в них не выявлены микроядра или протрузии.

Обсуждение

В проведенном исследовании усовершенствованы методические основы применения микроядерного теста, предложенные Л.П.Сычевой (2002), и разработан новый метод анализа цитогенетических и цитотоксических изменений в клетках органов выделительной системы животных и человека. Включенные в анализ дополнительные показатели значительно повышают чувствительность метода и позволяют более обоснованно (на основании анализа не одного, а пяти показателей) давать заключение о генетической безопасности и токсичности исследуемого фактора. Это особенно важно в связи с тем, что исследования цитогенетического эффекта в клетках органов выделительной системы пока только начинаются и требуют постоянной верификации. Определены средние значения и пределы варьирования пяти показателей в клетках мочевого пузыря мышей или крыс, а также в эксфолиативных клетках человека, для которых впервые разработана неинвазивная методика их получения.

При исследовании клеток почки не выявлен цитогенетический и цитотоксический эффекты. В то же время в клетках почек установлено ДНК-повреждающее действие диоксидина при действии дозы 200 мг/кг [Абилев С.К., Абдразаков М.М., 1991]. Следовательно, при действии диоксидина можно было бы ожидать наличие цитогенетического действия этого вещества. Мы считаем, что отсутствие микроядер или протрузий в клетках почек связано с низким уровнем их пролиферации. Клетки почек, как и печень, характеризуются низкой интенсивностью деления [Беляева H.H., 1997], поэтому возможные повреждения ДНК не реализуются в виде микроядер. Одним из методов стимуляции клеток почки к делению является удаление одной из почек. Однако этот метод сложен, кроме того, нефроэктомия влияет на состояние целого организма и может косвенно искажать показатели цитогенетического действия исследуемых факторов. Наши исследования

показали, что изучение цитогенетического эффекта химических соединений в клетках почек требует специальной стимуляции пролиферативной активности, поэтому в дальнейшем мы исследовали, в основном, клетки мочевого пузыря экспериментальных животных и человека.

В клетках мочевого пузыря лабораторных животных изучена динамика изменений показателей на разных сроках 30-суточного (30-кратного) ежедневного введения мутагена, а также элиминация клеток с повреждениями после окончания 4-суточного введения мутагена, что позволяет оптимизировать схему исследования мутагенной активности факторов в клетках мочевого ^

пузыря лабораторных животных. Разработанные подходы применены при оценке безопасности 13 различных факторов в совместных с гигиеническими лабораториями и учреждениями исследованиях. Среди изученных факторов такие приоритетные, как диоксид азота и длительное низкоинтенсивное гамма-излучение, продукты нейтрализации иприта и люизита, совтола. Важно отметить, что мутагенным действием обладали немногие исследованные факторы, однако почти все проявили в той или иной степени цитотоксическое действие. Эти данные также имеют важное значение, поскольку, наряду с другими показателями, позволяют определить референтные дозы и дать дополнительную информацию к заключению о безопасных уровнях исследуемых факторов.

Выводы

1. Для токсикологической оценки факторов окружающей среды, прогноза канцерогенного действия и донозологической диагностики при обследовании людей разработаны методические основы оценки цитогенетического и цитотоксического эффектов микроядерным методом в клетках органов выделительной системы:

-новый метод приготовления суспензионных препаратов мочевого пузыря мышей и крыс ex tempore;

- неинвазивный метод приготовления и анализа препаратов эксфолиативных уротелиальных клеток человека;

- новый количественный способ анализа исследуемых клеток органов выделительной системы с учетом пяти показателей (частоты клеток с микроядрами; с протрузиями; частоты двуядерных клеток; клеток с центральной ядерной перетяжкой ядра; с атипичной формой ядра);

-учет клеток с ядерными протрузиями включен в анализ в качестве дополнительного показателя цитогенетического действия на основании *

данных литературы о возможных механизмах образования протрузий и полученных нами в эксперименте с циклофосфамидом данных о высокой значимой корреляции этого показателя с долей клеток с микроядрами (при действии дозы 20 мг/кг (R=0,72, Р<0,001); при дозе 10 мг/кг (R=0,52, Р<0,001);

-учет других кариологических показателей (частоты двуядерных клеток; клеток с центральной ядерной перетяжкой; клеток с атипичной формой

ядра) включен в анализ для оценки цитотоксического действия исследуемых факторов.

2. Уровни цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках мочевого пузыря контрольных животных и в эксфолиативных уротелиальных клетках условно здоровых людей на данном этапе могут служить ориентировочными фоновыми показателями: средняя доля клеток с микроядрами у мышей - 0,69%>; у крыс - 0,76%о; у человека - 0,31%о; доля клеток с протрузиями у мышей - 1,28%о; у крыс - 3,23%о; у человека -0,53%о; доля двуядерных клеток приблизительно одинакова у мышей (14,96%о) и крыс (15,56%о) и значительно ниже у человека (1,21%о); доля клеток с центральной ядерной перетяжкой варьирует от 14,53%о у мышей до 33,64%о у крыс, при 1,95%о у человека.

3. Определены дозовые и временные закономерности изменения цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках мочевого пузыря мышей при действии циклофосфамида - модельного мутагена и канцерогена, индуцирующего опухоли мочевого пузыря:

-при ежедневном постоянном введении циклофосфамида в дозе 10 мг/кг максимальный эффект наблюдается на 7 сутки и сохраняется на этом уровне в течение месяца, тогда как при действии циклофосфамида в дозе 20 мг/кг изменение эффекта носит флуктуирующий характер;

- после окончания четырехсуточного введения циклофосфамида в дозе 10 мг/кг максимальный цитогенетический эффект в клетках мочевого пузыря выявляется на 3 сутки, далее эффект снижается к 7 и 21 суткам, но при этом достоверно превышает контрольный уровень. В то же время в костном мозге достоверные отличия выявляются только через сутки после окончания воздействия, а на 3, 7 и 21 сутки эффект уже не отличается от контроля. Установленные закономерности позволяют оптимизировать схемы экспериментальных исследований.

4. Методы оценки цитогенетических и цитотоксических показателей клеток органов выделительной системы мышей и крыс апробированы при действии 12 различных факторов в рамках комплексных токсикологических исследований. Впервые при анализе клеток мочевого пузыря лабораторных животных установлено:

- цитогенетическое действие метиленового голубого (мутагена, характеризующегося интеркалирующим действием) в низкой дозе 0,05 мг/кг, соответствующей 5 ПДК; цитотоксическое действие в дозах 0,01-0,25 мг/кг;

- цитогенетическое действие смеси продуктов нейтрализации люизита, в которой определялись соединения мышьяка (генотоксического канцерогена, индуцирующего опухоли мочевого пузыря) в дозе, соответствующей 1/10 ЛД50; и цитотоксическое действие этой смеси в дозах, соответствующих 1/250; 1/50 и 1/10 ЛД»;

- цитогенетическое действие смеси продуктов нейтрализации иприта (генотоксического канцерогена, индуцирующего опухоли мочевого пузыря) в

дозе, соответствующей 1/50 ЛД50; цитотоксическое действие этой смеси в дозах, соответствующих 1/1250 и 1/50 ЛД50;

-цитотоксическое действие диоксида азота в концентрациях 10 мг/мЗ, 20 мг/мЗ, 45 мг/мЗ в динамике постоянного ингаляционного воздействия в течение 4, 24, 48 и 120 часов, увеличивающееся с длительностью воздействия;

-цитотоксическое действия солей стабильного цезия (70 мг/л); стронция (70мг/л); низких доз у-излучения (0,17 сГр в сутки) в течение 9 месяцев;

- цитотоксическое действие диоксазида при ингаляции в дозе, соответствующей терапевтической (25 мг/кг);

- отсутствие цитогенетического и цитотоксического эффекта: продуктов нейтрализации совтола (ПХДС-Т), сочетанного действия солей цезия и гамма-излучения (40 и 270 дней), стронция и гамма-излучения (40 и 270 дней), а также низких доз у-излучения в течение 40 дней.

5. Разработанный методический подход может быть использован, наряду с классическим микроядерным методом на клетках костного мозга, для изучения цитогенетического и цитотоксического действия различных факторов окружающей среды при их изолированном и совместном действии и разных путях поступления в организм. Анализ пяти показателей, характеризующих генетические повреждения и цитотоксический эффект на одних и тех же препаратах, позволяет повысить информативность метода, в том числе для определения референтных доз, и в целом повысить надежность оценки генетической безопасности изучаемых факторов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сычева Л.П., Коваленко М.А., Шереметьева С.М.. Дурнев А.Д., Журков B.C. Изучение мутагенного действия диоксидина полиорганным микроядерным методом. Бюлл. экспер.биол.мед. 2004.- №8.- С.188-190.

2. Сычева Л.П., Коваленко М.А., Шереметьева С.М., Можаева Т.Е., Журков B.C. Полиорганный микроядерный тест на эксфолиативных клетках человека.//Мед.генетика, т.4, 2005.- С.273.

3. Сычева Л.П., Шарова М.А., Коваленко М.А., Шереметьева С.М.. Журков B.C. Оценка мутагенной активности диоксазида микроядерным методом в опытах на крысах.//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. М-2005,- С.242-245.

4. Сычева Л.П., Коваленко М.А., Шереметьева С.М., Мельников A.M., Дурнев А.Д., Журков B.C. Оценка мутагенной активности диоксидина полиорганным микроядерным методом. //2й съезд токсикологов России. Тезисы докладов. М- 2003.- С.252-253.

5. Сычева Л.П., Коваленко М.А., Шереметьева С.М., Журков B.C. и др. Оценка цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках разных органов крыс при длительном потреблении питьевой воды при разных способах

водоподготовки. // 6-ой Международный конгресс ЭКВАТЭК-2004. Материалы конгресса. Часть II. М., 2004.- С.993.

6. Шереметьева СМ., Л.П. Сычева, Журков B.C. Оценка мутагенного эффекта факторов окружающей среды в клетках мочевого пузыря и почек мышей и крыс. Тезисы съезда ВОГиС.-2004, том II.- С.480.

7. Шереметьева С.М. Изолированное и сочетанное действие тяжелых металлов и у-излучения на клетки органов выделительной системы. //Теоретические основы и практические решения проблем санитарной охраны атмосферного воздуха (под ред. академика РАМН Ю. А.Рахманина). -М.-2003.-С.364-367.

8. Шереметьева С.М., Коваленко М.А. Оценка цитогенетического действия диоксида азота в клетках костного мозга, мочевого пузыря и легких крыс.// Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Окружающая среда и здоровье" (19-22 мая 2005 г., г. Суздаль) / Суздаль, 2005 .-С.511-514.

9. Беляева H.H., Сычева Л.П., Тепикина Л.А., Коваленко М.А.. Шереметьева С.М., Шамарин A.A., Голубева М.И. Необходимость использования морфо-функциональных, цитогенетических и кариологических исследований при обосновании класса опасности лекарственных отходов. //Сб. материалов III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медицинские отходы: проблемы и пути решения» М, 2005.-С.22-23.

Ю.Беляева H.H., Сычева Л.П., Журков B.C., Шамарин A.A., Коваленко М.А., Гасимова З.М., к.ф-м.н. Нейман-заде И.К., Чуприна О.В., Шереметьева С.М., Можаева Т.Е., Олесинов A.A., Шенцева Е.В., Александрова В.П., Пономарева О.Ю., Горелова Ж.Ю., Александровский С.Б, Стацук Т.В. Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека. Методические рекомендации. М.-2005.- 38с.

П.Сычева Л.П., Рахманин Ю.А., Губернский Ю.Д., Коваленко М.А., Шереметьева С.М.. Можаева Т.Е. Диагностика экологически обусловленных нарушений здоровья человека путем оценки цитогенетического и кариологического статуса буккального и назального эпителия. //В сб. «Экологически обусловленные ущербы здоровью: Методология, значение и перспективы оценки» Материалы Пленума НС по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и МЗ и CP РФ 22-23 декабря 2005 г. под ред. Ю.А.Рахманина. М.-2005.-С.488-490.

12.Синицына О.О., Ворожцов Г.Н., Кузнецова H.A., Полякова Е.Е., Калия О.Л., Головач E.H., Беляева H.H., Хрипач Л.В., Шереметьева С.М., Жолдакова З.И. Гигиеническая оценка фотодинамического метода обеззараживания воды с использованием метиленового голубого и профлавин ацетата. //Научный форум по гигиене и санитарии «ДДЦ 2006». Тезисы докладов. -М,- 2006.

Для заметок

Заказ № 52/03/06 Подписано в печать 09.03.2006 Тираж 100 экз. Уел п л. 0,8

_ % ООО "Цифровичок", тел (095) 797-75-76; (095) 778-22-20 www.cfr.ru; e-maihinfo@cfr.ru

WOG к OS

"51 0»

Своевременное и корректное выявление мутагенов для запрета или ограничения их использования - одна из основных задач гигиены окружающей среды [Сычева Л.П., Рахманин Ю.А. и соавт., 2005; Бочков Н.П., Чеботарев А.Н., 1989; Ревазова Ю.А., Журков B.C., 2001]. Это важно и для прогноза канцерогенной активности факторов, поскольку положительные результаты краткосрочных тестов анализа мутагенной активности химических соединений рассматривают в качестве прогностических показателей наличия у них канцерогенных свойств. Некоторые авторы считают, что генотоксические исследования могут стать альтернативой классическим методам оценки канцерогенной активности [Douglas G.K et al, 1988; Ashby J. et all, 1996]. Исследование канцерогенности одного химического соединения общепринятым методом требует проведения двухлетних дорогостоящих экспериментов, поэтому трудно представить, чтобы такие исследования приобрели массовый, опережающий характер. Подобное положение обязывает признать, что краткосрочные тесты для выявления мутагенных химических веществ играют роль своеобразной «просеивающей» программы для выявления потенциальных канцерогенов.

В ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН разработана система оценки мутагенного эффекта факторов окружающей среды с учетом органной специфичности, основой которой является полиорганный микроядерный тест [Сычева Л.П., 2002]. Он позволяет с большей долей вероятности, по сравнению с другими краткосрочными тестами, прогнозировать канцерогенные свойства исследуемого фактора и определять органы-мишени. Однако в этой системе оценка мутагенного эффекта в органах выделительной системы разработана недостаточно. Подобного рода исследования мутагенного действия химических соединений на клетки мочевого пузыря и почек единичны. В то же время установлено, что многие вещества, в том числе ароматические амины, соли тяжелых металлов, хлорорганические соединения индуцируют рак в этих органах. По данным ВОЗ рак мочевого пузыря по частоте встречаемости среди всех злокачественных новообразований, уступает только опухолям желудка, пищевода, легких и гортани. В мире ежегодно регистрируется около 170 ООО - 200000 новых случаев рака мочевого пузыря и среднегодовой темп прироста составляет 3,34% [Чиссов В.И., Старинский В.В., 2002; Borden L.S. et all, 2003].

Установлено, что химические соединения, образующиеся в производственных процессах кожевенной, анилинокрасочной, резиновой, электрокабельной, каучуковой промышленности, а также некоторые лекарственные препараты, обладают генотоксической и канцерогенной активностью в клетках мочевого пузыря человека и лабораторных животных [IARC, 1981; Двойрин В.В. с соавт., 1996; Maltoni С. et all, 1996; Плисс Г.Б., 1996].

Открытие возможности определять генотоксические повреждения в эксфолиативных клетках, полученных неинвазивным способом, позволило использовать микроядра в качестве маркера для выявления ранних канцерогенных изменений в эпителиальных тканях [Stich H.F., Rosin М.Р., 1983; 1984; Rosin MP., 1992; Majer B.J. et all, 2001]. Однако для эксфолиативных уротелиальных клеток человека соответствующие методические основы разработаны недостаточно.

В связи с этим целью исследования являлась оценка микроядерным методом мутагенного действия факторов окружающей среды на клетки органов выделительной системы. Для ее достижения сформулированы следующие задачи:

1. Усовершенствовать методы оценки цитогенетического эффекта факторов среды в клетках органов выделительной системы экспериментальных животных и человека.

2. Определить контрольные уровни цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках органов выделительной системы животных и в эксфолиативных уротелиальных клетках человека.

3. Оценить временные и дозовые закономерности действия модельного мутагена на цитогенетические и цитотоксические показатели в клетках мочевого пузыря млекопитающих.

4. Изучить мутагенное действие химических соединений и у-излучения на эпителиальные клетки мочевого пузыря млекопитающих.

Научная новизна. Впервые:

- В оценку цитогенетического эффекта в уротелиальных клетках мочевого пузыря включен новый показатель - доля клеток с ядерными протрузиями. Установлена высокая значимая корреляция этого показателя с микроядрами (0,52 - 0,72; р<0,001).

- В анализ уротелиальных клеток мочевого пузыря включены дополнительные кариологические показатели (частота двуядерных клеток; клеток с центральной ядерной перетяжкой; клеток с атипичной формой ядра), изменение которых может указывать на цитотоксическое действие исследуемого фактора.

- Разработан и апробирован неинвазивный метод комплексной оценки эксфолиативных уротелиальных клеток человека по цитогенетическим и кариологическим показателям.

- Проведена количественная оценка и определены дозовые параметры цитогенетического и цитотоксического действия на эпителиальные клетки мочевого пузыря мышей и/или крыс диоксида азота, диоксидина, диоксазида, метиленового голубого, профлавин ацетата, стронция, цезия, циклофосфамида, продуктов дезактивации химических отходов (люизита, иприта, совтола).

- Определены дозо - временные зависимости цитогенетического эффекта циклофосфамида в клетках мочевого пузыря от длительности воздействия и времени после окончания воздействия.

- Установлены ориентировочные фоновые частоты кариологических показателей в эпителиальных клетках мочевого пузыря у контрольных животных и в эксфолиативных уротелиальных клетках человека. Практическая значимость. Применение разрабатываемой методологии позволяет значительно увеличить объем получаемой информации о цитогенетическом и цитотоксическом действии фактора, повысить надежность качественной и количественной оценки мутагенных свойств химических соединений в экспериментах на млекопитающих и при обследовании людей.

Материалы исследований по корреляции частоты клеток с микроядрами и протрузиями, оценке других кариологических показателей в органах выделительной системы использованы при разработке:

- изобретения «Способ неинвазивной диагностики цитогенетического и цитотоксического действия различных факторов на организм человека» [заявка № 2005108225, приоритет от 24.03.05];

- методических рекомендаций «Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека», утвержденных Председателем Межведомственного научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РФ академиком РАМН Ю.А.Рахманиным [Москва, 2005. - 37с]. Результаты экспериментальных исследований по изучению мутагенной активности использованы при обосновании гигиенических нормативов:

- диоксида азота - разовая ПДК рекомендована к утверждению Комиссией по санэпиднормированию МЗиСР РФ РФ [протокол от 28.12.04 г.] [Справка о внедрении №2 от 25.01.05 г.].

- смеси триэтаноламинных солей сульфированных полихлорированных бифенилов и сульфированного трихлорбензола при пероральном поступлении в организм лабораторных животных. ОДУ этих соединений в воде водных объектов утверждена Минздравом РФ [ГН 2.1.5.1316-03].

Результаты по оценке мутагенной активности смесей РМ1 (продуктов нейтрализации люизита) и РМ2 (продуктов нейтрализации иприта) использованы при комплексной оценке степени эффективности обезвреживания и утилизации этих отходов и при обосновании гигиенических рекомендаций по технологии их переработки [Справка о внедрении от 02.02.05г.].

Работа выполнена в лаборатории генетического мониторинга в рамках плановых тем ГУ НИИЭЧиГОС им.А.Н.Сысина РАМЫ «Разработка методологии оценки мутагенного эффекта в клетках органов дыхательной и выделительной системы», 2003-2005 гг., № госрегистрации 01200303902; «Гигиенические основы управления качеством внутренней среды современных общественных зданий» 2005-2007г., № госрегистрации 01200502722; "Разработка системы методов обоснования и верификации эколого-гигиенических нормативов химических веществ в окружающей среде на основе компьютерного моделирования и экспериментальных исследований", 20032005 гг., № госрегистрации 01200303903.

Исследования проведены совместно с лабораториями ГУ НИИЭЧиГОС им.А.Н.Сысина РАМН: комплексного экологогигиенического нормирования (зав. - д.м.н. О.О.Синицина); гигиены почвы (зав. - к.м.н. И.А.Крятов), питьевого водоснабжения (зав. - д.м.н. Р.И.Михайлова); гигиены атмосферного воздуха (зав. - д.м.н., проф., М.А.Пинигин); цитогистологии (зав. - д.б.н. Н.Н.Беляева); и другими институтами: ГУП МосНПО Радон (рук. группы - д.б.н. А.Н.Осипов); ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ (рук. лаборатории - д.м.н. С.М. Шарова); ГУ НИИ фармакологии (рук. лаборатории - д.м.н., проф., А.Д.Дурнев).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции молодых ученых «Развитие научного творчества молодежи -объект постоянного внимания В.А.Рязанова» [Москва, 2003]; 2-м съезде токсикологов России [Москва, 2003]; 3-м съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров [Москва, 2004]; 5-м съезде Российского общества медицинских генетиков [Уфа, 2005]; Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Окружающая среда и здоровье" [Суздаль, 2005].

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 3 - в центральной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Текст изложен на 156 страницах машинописи, иллюстрирован 43 таблицами и 11 рисунками. Указатель литературы содержит 150 источника, из них 52 отечественных и 98 иностранных авторов.

выводы

1. Для токсикологической оценки факторов окружающей среды, прогноза канцерогенного действия и донозологической диагностики при обследовании людей разработаны методические основы оценки цитогенетического и цитотоксического эффектов микроядерным методом в клетках органов выделительной системы: новый метод приготовления суспензионных препаратов мочевого пузыря мышей и крыс ex tempore; неинвазивный метод приготовления и анализа препаратов эксфолиативных уротелиальных клеток человека; новый количественный способ анализа исследуемых клеток органов выделительной системы с учетом пяти показателей (частоты клеток с микроядрами; с протрузиями; частоты двуядерных клеток; клеток с центральной ядерной перетяжкой ядра; с атипичной формой ядра); учет клеток с ядерными протрузиями включен в анализ в качестве дополнительного показателя цитогенетического действия на основании данных литературы о возможных механизмах образования протрузий и полученных нами в эксперименте с циклофосфамидом данных о высокой значимой корреляции этого показателя с долей клеток с микроядрами (при действии дозы 20 мг/кг (R=0,72, Р<0,001); при дозе 10 мг/кг (R=0,52, Р<0,001); учет других кариологических показателей (частоты двуядерных клеток; клеток с центральной ядерной перетяжкой; клеток с атипичной формой ядра) включен в анализ для оценки цитотоксического действия исследуемых факторов.

2. Уровни цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках мочевого пузыря контрольных животных и в эксфолиативных уротелиальных клетках условно здоровых людей на данном этапе могут служить ориентировочными фоновыми показателями: средняя доля клеток с микроядрами у мышей - 0,69%о; у крыс - 0,76%о; у человека - 0,31%о; доля клеток с протрузиями у мышей - 1,28%о; у крыс - 3,23%о; у человека -0,53%о; доля двуядерных клеток приблизительно одинакова у мышей (14,96%о) и крыс (15,56%о) и значительно ниже у человека (1,21%о); доля клеток с центральной ядерной перетяжкой варьирует от 14,53%о у мышей до 33,64%о у крыс, при 1,95%о у человека.

3. Определены дозовые и временные закономерности изменения цитогенетических и цитотоксических показателей в клетках мочевого пузыря мышей при действии циклофосфамида - модельного мутагена и канцерогена, индуцирующего опухоли мочевого пузыря: при ежедневном постоянном введении циклофосфамида в дозе 10 мг/кг максимальный эффект наблюдается на 7 сутки и сохраняется на этом уровне в течение месяца, тогда как при действии циклофосфамида в дозе 20 мг/кг изменение эффекта носит флуктуирующий характер; после окончания четырехсуточного введения циклофосфамида в дозе 10 мг/кг максимальный цитогенетический эффект в клетках мочевого пузыря выявляется на 3 сутки, далее эффект снижается к 7 и 21 суткам, но при этом достоверно превышает контрольный уровень. В то же время в костном мозге достоверные отличия выявляются только через сутки после окончания воздействия, а на 3, 7 и 21 сутки эффект уже не отличается от контроля. Установленные закономерности позволяют оптимизировать схемы экспериментальных исследований.

4. Методы оценки цитогенетических и цитотоксических показателей клеток органов выделительной системы мышей и крыс апробированы при действии 12 различных факторов в рамках комплексных токсикологических исследований. Впервые при анализе клеток мочевого пузыря лабораторных животных установлено: цитогенетическое действие метиленового голубого (мутагена, характеризующегося интеркалирующим действием) в низкой дозе 0,05 мг/кг, соответствующей 5 ПДК; цитотоксическое действие в дозах 0,01- 0,25 мг/кг; цитогенетическое действие смеси продуктов нейтрализации люизита, в которой определялись соединения мышьяка (генотоксического канцерогена, индуцирующего опухоли мочевого пузыря) в дозе, соответствующей 1/10 ЛД50; и цитотоксическое действие этой смеси в дозах, соответствующих 1/250; 1/50 и 1/10 ЛД50; цитогенетическое действие смеси продуктов нейтрализации иприта (генотоксического канцерогена, индуцирующего опухоли мочевого пузыря) в дозе, соответствующей 1/50 ЛД50; цитотоксическое действие этой смеси в дозах, соответствующих 1/1250 и 1/50 ЛД50; цитотоксическое действие диоксида азота в концентрациях 10 мг/мЗ, 20 мг/м3, 45 мг/м3 в динамике постоянного ингаляционного воздействия в течение 4, 24, 48 и 120 часов, увеличивающееся с длительностью воздействия; цитотоксическое действия солей стабильного цезия (70 мг/л); стронция (70мг/л); низких доз у-излучения (0,17 сГр в сутки) в течение 9 месяцев; цитотоксическое действие диоксазида при ингаляции в дозе, соответствующей терапевтической (25 мг/кг); отсутствие цитогенетического и цитотоксического эффекта: продуктов нейтрализации совтола (ПХДС-Т), сочетанного действия солей цезия и гамма-излучения (40 и 270 дней), стронция и гамма-излучения (40 и 270 дней), а также низких доз у-излучения в течение 40 дней.

5. Разработанный методический подход может быть использован, наряду с классическим микроядерным методом на клетках костного мозга, для изучения цитогенетического и цитотоксического действия различных факторов окружающей среды при их изолированном и совместном действии и разных путях поступления в организм. Анализ пяти показателей, характеризующих генетические повреждения и цитотоксический эффект на одних и тех же препаратах, позволяет повысить информативность метода, в том числе для определения референтных доз, и в целом повысить надежность оценки генетической безопасности изучаемых факторов.