Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Особенности течения онкологических заболеваний у детей с различной экспрессией маркеров опухолевой прогрессии

На правах рукописи

Моргун Андрей Васильевич

ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У ДЕТЕЙ С РАЗЛИЧНОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ МАРКЕРОВ ОПУХОЛЕВОЙ

ПРОГРЕССИИ

14 00 09 - педиатрия

14 00 16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Красноярск - 2007

003062806

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», на кафедре детских болезней №1 с курсом ПО и в НИИ молекулярной медицины и патобиохимии

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Таранушенко Татьяна Евгеньевна Салмина Алла Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РЛМН Манчук Валерий Тимофеевич

доктор медицинских наук, профессор Савченко Андрей Анатольевич

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава» (г Москва)

Защита состоится _2007 г в /Л. часов

на заседании диссертационного совета Д 208 037 01 при ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (660022, г Красноярск, ул П Железняка 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Красноярская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (660022, г Красноярск, ул П Железняка 1 )

Автореферат разослан 'у7^"' ¿/^ 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета /7 кандидат медицинских наук, доцент Гончарук 3 Н

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Существенные достижения в диагностике онкологических заболеваний и определение молекулярных особенностей отдельных опухолей позволяет прогнозировать успешность терапии после первых циклов химиотерапии Однако результативность применения программ полихимиотерапии при солидных новообразованиях ниже, чем при онкогематологических заболеваниях Так при лейкозах терапия оказывается успешной у 85-90% больных, а при солидных новообразованиях детей успешность терапии варьирует от 40 до 65%

Успех противоопухолевой терапии обеспечивается правильно подобранной комбинацией режимов интенсивной терапии и сопроводительного лечения Эффективность уничтожения опухолевых клеток зависит от их чувствительности к химиотерапии, активности процессов пролиферации и гибели клеток в ткани опухоли (Т Hongo, 1997, 2002)

Результативность лечения значительно возросла в результате разработки высокоагрессивной химиотерапии Но, несмотря на повышение эффективности лечения, многие пациенты получают неадекватную цитостатическую нагрузку вследствие отсутствия оценки эффективности воздействии терапии на саму опухоль Кроме того, отмечается появление резистентных к химиотерапии больных В связи с этим наиболее вероятно, что пути повышения эффективности лечения онкогематологических заболеваний лежат в направлении изучения биологических основ противоопухолевой терапии (D Boer, 1998, D Kravtsov, 1998)

Механизмы действия противоопухолевых препаратов различаются (проникновение сквозь клеточную мембрану, пути внутриклеточного взаимодействия) и направлены на достижение одной цели - включение в клетках программы апоптоза, что является конечным этапом сложного процесса противоопухолевой активности (ЕБ Владимирская, 1997, 1998,

2000, 2003, С Thompson, 1995, J-Ph Vial, 1997, Е Solary, 2000, D M Gorman,

2001, RA Franklin, 2000) Характерной особенностью опухолевых клеток является нарушение программы апоптоза на различных ее этапах, что мешает реализации циторедуктивного действия противоопухолевой терапии и лежит в основе развития лекарственной резистентности (Е Б Владимирская, 1997, 1998, 2003) Также нельзя забывать, что скорость и степень разрушения опухоли зависит не только от скорости смерти ее клеток, но и от скорости пролиферации и массы пролиферирующих клеток Предпринимаются попытки изучения связи гибели опухолевых клеток с их биологическими особенностями при опухолевой прогрессии у детей Однако, остается

неясной роль отдельных маркеров опухолевой прогрессии (выраженность апоптотической гибели клеток, пролиферативная активность и экспрессия маркеров лекарственной устойчивости) при злокачественных новообразованиях головного мозга, рабдомиосаркомах и остеосаркомах у детей Исходя из этого, настоящее исследование представляется актуальным

Цель исследования Выявить молекулярные механизмы опухолевой прогрессии (эффективность апоптоза, пролиферативная активность, экспрессия маркера лекарственной устойчивости) при отдельных онкологических заболеваниях у детей и обосновать возможность внедрения в практику указанных диагностических технологий

Задачи

1 Изучить клинические особенности дебюта основных онкологических заболеваний с уточнением частоты выявляемое™ ведущих симптомокомплексов при данной патологии

2 Оценить эффективность апоптоза клеток опухолевой природы у детей с солидными опухолями

3 Определить пролиферативную активность опухоли по результатам регистрации экспрессии антигена Кл-67

4 Уточнить роль экспрессии Р-гликопротеина в развитии лекарственной устойчивости у детей со злокачественными новообразованиями

5 Обобщить данные о значении маркеров пролиферативной активности, лекарственной устойчивости и выраженности апоптоза на исход заболеваний

Научная новизна

1 Впервые в детской онкологии подтверждена концепция прямой взаимосвязи выраженности апоптоза с частотой метастазирования при опухолях головного мозга и обратная зависимость между активностью апоптоза и метастазами рабдомиосарком и остеосарком Установлено отсутствие существенных изменений эффективности апоптоза опухолевых клеток на фоне терапии при злокачественных новообразованиях головного мозга, и доказанное нараст апие интенсивности запрограммированной гибели клеток при рабдомиосаркомах и остеосаркомах после химиотерапии

2 Доказано, по результатам динамического исследования экспрессии антигена Кл-67, отсутствие значимых влияний выраженности пролиферации в опухолевой ткани при рабдомиосаркомах и причастность пролиферативной активности опухоли к бессобытийной выживаемости детей при злокачественных новообразованиях головного мозга (основные возрастные подгруппы 3-6 лет и 11-17 лет) и остеосаркомах независимо от возраста

3 Выявлены особенности экспрессии маркера лекарственной устойчивости Р-гликопротеина увеличение показателя на фоне проводимого

лечения у больных с рабдомиосаркомами (преимущественно возрастная группа старше 11 лет), отсутствие динамики показателя на фоне терапии при опухолях головного мозга и остеосаркомах, и влияние экспрессии Р§р на выживаемость при всех изучаемых новообразованиях (высокие значения экспрессии Р-гликопротеина в подгруппе умерших пациентов) 4 Установлено, что наиболее информативными тестами для прогнозирования исходов при новообразованиях головного мозга являются исходный уровень апоптоза и экспрессии Pgp в комбинации с динамикой пролиферативной активности, ггри рабдомиосаркомах - исходные значения и динамика апоптотической активности, при остеосаркомах - показатели апоптотического индекса, пролиферативной активности и экспрессии Р§р до начала лечения и на фоне химиотерапии у детей

Личный вклад соискателя Научные результаты, обобщенные в диссертационной работе Моргуна А В , получены самостоятельно Диссертантом выполнено лично

- определение цели, разработка конкретных задач работы и плана их выполнения,

- составление протоколов клинического, лабораторного исследований,

- набор клинического материала - динамическое клиническое обследование пациентов с солидными новообразованиями,

- проведение иммуногистохимических исследований,

- создание компьютерной базы данных обследованных и пролеченных больных,

- статистическая обработка материала исследований и интерпретация результатов

Практическая значимость работы

1 Проведенное исследование подтвердило возможность использования маркеров опухолевой прогрессии (экспрессия Кл-67, экспрессия Рдр, эффективность апоптоза) для прогностических целей у детей

2 Полученные результаты позволяют оптимизировать терапевтическую тактику ведения пациентов и могут использоваться при планировании комплексного индивидуального лечения детей и в прогнозировании опухолевой прогрессии

3 Обозначены достоверно значимые показатели, характеризующие особенности течения заболеваний (выраженность апоптоза, пролиферации и экспрессия Р-гликопротеина) и позволяющие выделить группу больных с высокой вероятностью неблагоприятных исходов

Положения, выносимые на защиту 1 Выраженность апоптоза в опухолевой ткани отражает прямую его взаимосвязь с частотой развития метастазов опухолей головного мозга и обратную зависимость между активностью апоптоза и метастазами

рабдомиосарком и остеосарком, что является информативным методом прогноза исходов онкологических заболеваний у детей

2 Динамический анализ пролиферативной активности по результатам регистрации антигена К.1-67 позволяет использовать указанный параметр у всех пациентов с остеосаркомами, а также в возрасте 3-6 и 11-17 лет при опухолях головного мозга для оценки эффективности терапии, и выделить группы детей, угрожаемых по развитию метастазов

3 Выраженность экспрессии Pgp характеризует возможность развития лекарственной устойчивости на фоне проводимой химиотерапии и позволяет определить группы пациентов со злокачественными опухолями, изначально устойчивыми к воздействию химиопрепаратов

Внедрения в практику Практические рекомендации внедрены в учебный процесс кафедры детских болезней №1 КрасГМА, в работу отделения гематологии/онкологии КГУЗ «Красноярская краевая детская больница», в учебный процесс кафедры биохимии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, научный процесс НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГОУ ВПО КрасГ МА Росздрава

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на практической конференции педиатров г Красноярска (сентябрь 2006 г), на научных конференциях кафедры детских болезней № 1 с курсом ПО Красноярской государственной медицинской академии (2005-2006 п ), заседании Проблемной Комиссии по педиатрии, акушерству и гинекологии Красноярской государственной медицинской академии (2 апреля 2007 г)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ Из них 1 в издании, рекомендованном ВАК РФ

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста, иллюстрирована таблицами и рисунками и состоит из введения, 7 глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 222 источника (58 отечественных и 164 иностранных) Иллюстрирована 14 таблицами и 35 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объект и методы исследования

Объектом исследования были 70 детей со злокачественными опухолями головного мозга, остеогенной саркомой и рабдомиосаркомой (средний возраст -11±4,3 лет) Дети в исследуемую группу были отобраны из 121 пациента Краевой детской клинической больницы с солидными

опухолями, находившимися в отделении онкологии/гематологии в 2004-2006 гг Критерии включения в целевую группу

• возраст детей от 1 года до 17 лет включительно,

• злокачественные опухоли мозга, рабдомиосаркома, остеогенная саркома,

• возможность взятия биоптата до и после проведения химиотерапии,

• подписание информативного согласия на проводимые обследования

Критерии исключения

• проведение химиотерапии до оперативного вмешательства,

• наступление летального исхода до взятия повторной биопсии,

• отказ ребенка и/или родителей от обследования

Все пациенты включенные в исследование были разделены на три нозологические группы соответственно диагнозу I - дети с опухолями головного мозга (37 человек), II - рабдомиосаркомой (16 человек), III -остеогенной саркомой (17 человек) Каждая из групп была разделена соответственно полу (мальчики и девочки), возрасту (0-2 года, 3-6 лет, 7-10, 11-7 лет, а также 0-10 лет и 11-17 лет), исходу заболевания (умершие и живые), наличию метастазов (есть или нет) Разделение на возрастные группы осуществлялось следующим образом 0-2 года - дети до 2 лет 5 мес 29 дней, 3-6 лет - от 2 лет 6 мес до 6 лет 5 мес 29 дней, 7-10 лет - от 6 лет 6 мес до 10 лет 5 мес 29 дней, 11-17 лет - от 10 лет 6 мес В соответствии с поставленными задачами в каждой из рассматриваемых групп выделялись подгруппы с учетом половой принадлежности, возраста, наличия метастазов и исходов по основному заболеванию В последующем рассмотрены молекулярные особенности опухолей в выделенных нозологических группах Пациентам проводились стандартные исследования клинический анализ крови, биохимический анализ крови, иммунологические методы исследования, ПЦР, исследование на ВИЧ, исследование системы гемостаза, методы визуализации изображения, УЗИ внутренних органов, ЭхоКГ, ЭКГ, ЭЭГ и холтеровское мониторирование

Специальные методы исследований Детекция апоптоза проводилась методом TUNEL (TdT-mediated dUPT nick end labeling) в депарафинизированных срезах опухолевой ткани при помощи набора Mebstain Apoptosis Detection kit (Immunotech, France) согласно протоколу фирмы-производителя После депарафинизации и 30 минутной инкубации с 10% козьей сывороткой при 37°С на срезы наносился рабочий раствор с компонентами реакционной смеси Для детекции ядерного материала срезы докрашивались йодидом пропидия Участки специфической межнуклеосомной фрагментации ДНК, соответсгвующие местам включения меченых нуклеотидов в цепочку ДНК, регистрировались при микроскопии среза (люминесцентный микроскоп "Люмам"), результаты архивировались и

анализировались с помощью приставки "Nikon Coolpix 4500" Подсчитывалось общее количество TUNEL+ клеток не менее чем в 20 полях зрения (х900) с последующим расчетом апоптотического индекса на 300 клеток (АИ - доля TUNEL+ клеток, выраженная в процентах от общего количества клеток) За низкий уровень апоптоза принимались значения от 0 до 5% За умеренный от 5,1 до 10% Апоптозный индекс выше 10,1% расценивался как высокий

Опредечение экспрессии антигенов Ki-67 и Р-гликопротеипа проводилось двойным непрямым методом иммуноферментного окрашивания Для определения экспрессии Ki-67 использовались первичные моноклональные антитела MIB-1 в рабочем разведении 1 100 (DAKO, Дания) Антителами для детекции Р-гликопротеина были первичные антитела JSB1 в рабочем разведении 1 50 (Novocastra, Англия) В качестве вторичных антител использовались ФИТЦ-меченые антимышиные моноклональные антитела (Иммуносорбент, Москва) в разведении 1 200 Иммуногистохимические исследования проводилось в

депарафинизированных срезах по протоколам производителя После депарафинизации следовала 30-минутная инкубация (+37°С) в 15 мкл 10% раствора инактивированной козьей сыворотки в фосфатно-солевом буфере во влажной камере Затем на образцы тканей наносили 15 мкл первичных антител в рабочем разведении и инкубировали в течение часа в термостате (+37°С) во влажной камере После отмывки в фосфатно-солевом буфере, на каждый препарат в темной комнате наносили 15 мкл вторичных антител Получасовая инкубация осуществлялась при +37°С во влажной камере На всех этапах осуществлялась 2-кратная отмывка препарата 5-минутной инкубацией с раствором фосфатно-солевого буфера После отмывки на стекло наносили по 15 мкл монтирующей жидкости, накрывали покровным стеклом и микроскопировали при увеличении х900 Использоватась люминесцентная (УФ-лучи, зеленый светофильтр) и иммерсионная микроскопия Производили подсчет 300 клеток для выявления относительного количества позитивных и негативных клеток Для каждого образца осуществлялся негативный контроль Для определения выраженности пролиферативной активности рассчитывался пролиферативный индекс (ПИ - доля Ki-67+ клеток, выраженная в процентах от общего количества клеток) Положительные результаты для Р-гликопротеина ранжировались следующим образом слабое окрашивание менее 10% клеток - низкая экспрессия, слабое окрашивание более 10% -умеренная, сильно выраженное окрашивание более 10% - выраженное На основании результатов окраски повышенным уровнем считались образцы с умеренной и выраженной окраской

Методы статистического анализа До проведения статистического анализа оценивался характер распределения рядов на нормальность Для оценки статистической значимости количественных показателей с нормальным распределением использовались методы параметрической статистики (средняя арифметическая и стандартное отклонение, при уровне значимости - р<0,05) Для рядов, не имеющих нормального распределения, использовались методы непараметрической статистики (различия количественных показателей между двумя группами оценивалась по критерию Манна-Уитни, сравнение трех и более групп осуществлялось с использованием критерия Крускала-Уоллиса, сравнение групп до и после лечения проводилось с использованием критерия Уилкоксона при уровне значимости - р<0,05) Бессобытийную выживаемость рассчитывали с момента начала исследования до возникновения события, которыми считались рецидив, смерть, потеря из-под наблюдения в соответствии с методом Kaplan-Meier

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Отдельные клинико-биологические особенности злокачественных опухолей головного мозга у детей.

Из 37 человек с опухолями головного мозга вошедших в исследование 25 детей (67,6%) составили мальчики, 12 (32,4%) девочки Манифестация заболевания наступала у большинства детей данной группы в зозрасте -1117 лет (19 из 37 пациентов, что составило 51,4%)

Основные клинические проявления опухолей головного мозга При изучении локализации опухолевого процесса нами установлено, что преимущественной областью поражения был мозжечок - в 40,5% случаев и полушария мозга - 27%, реже опухоль располагалась в лобной (18,9%) и височной (13,5%) долях Похожие данные приводят другие авторы (D Miltenburg, 1996, ММ Константинова, 2002, А Г Самошенков и др, 2002, В И Данилов и др, 2002, Т J MacDonald et al, 2003) Ведущими клиническими симптомокомплексами (рис 1), сопутствующими злокачественным новообразованиям мозга, были цефалгия (70,3%), астенический синдром (70,3%), неврологические проявления (51,3%), зрительные нарушения (10,8%), указанные проявления по частоте встречаемости соответствуют литературным данным (Т J MacDonald et al, 2003)

На следующем этапе работы исследовались молекулярные маркеры опухолевой прогрессии в образцах злокачественной ткани и проводилось сопоставление полученных результатов с особенностями клинического течения болезни, с результатами лечения и исходами заболевания пациентов с онкологическими заболеваниями головного мозга

70,3

51,3 51 3

- i С, 1

- - .м.

10,в

цефэлгив Нарушение астенически* Зрительные

походки синдром нарушении

Симптом

Рис. 1. Встречаемость клинических симптомов у детей с ОГМ в дебюте заболевания

В качестве молекулярных маркеров опухолевой прогрессии изучались выраженность запрограммированной гибели клеток, пролиферативная активность в опухолях {на основании регистрации уровня экспрессии антигена К1-67) и экспрессия антигена лекарственной устойчивости (Р-гликопротеин). После проведения иммуногистохимического исследования образцов опухолей головного мозга получены следующие результаты (табл. 1).

Таблица 1

Иммуногистохимическая характеристика опухолей головного мозга (М±<3)

N ЛИ ПИ Pgp

До терапии 1 loeле терапия До терапии 11осле терапии До терапии После терапии

Мальчики 25 17,3±3 18,4±3,2 12,2±2,5 8,3±1,9* 9,5±1,3S 9.8±1.4*

Девочки 12 13,5*4,2 15*3,8* 6,3*0.7 4,1 ±0,9* 15*1,9* 15,3*2,3"

Все дети 37 16,6±2,4 17,9*2,5* 10* 1,7 6,9*1,3* 11,3±и 11,б±1,3

3-6 лет I12 (3,2±3,5 14,9*3,9 11,1±3,8 7,5±3,1* 13±2,1 12±2,4

7-10 лет 6 16,8=6,3 18.6±6.4* 6±1,1 5±1,4 7,2*2 7,2*1,6

11-17 лет 19 18,2*3,7 19,5±3,4 10.7±2,3 7,2±1,8* 11,7±1,5 12,7*1,8

0-10 лет 18 15,1 ±3,3 17,1 ±3,6 9,3±2,5 6,6*2,1 10,9*1,6 10,3*1,7

Живые 33 13,7±3,2 14±3,5 6,2*0.7 7,1*Г 10,5*1,1" 10,6±1,2В

Умершие 4 18,1 ±3,2 19,9*3,4 13,6*6.7 13.6*1,6* 20,7*3,2* 22,3*3,5"

Метастазы 12 27*3,7" 28,5*3.8 15,8=5,5 17,8—5,9" 15,6*5,5 17.8±6

Без метастазов 25 15,4*2,7" 17,1*2.9* 9,4*1,7 0,8*1,4"* 10,8*1 10,8*1,2

Примечание:

* - р<0,05 при сравнении одной подгруппы до и после терапии (критерий Уилкоксона).

# - р<0,05 при сравнении подгрупп между собой (критерий Манпа-Уитни и критерий К рус кал а-У о л л и еа).

Особенности апоптоза опухолевых клеток у детей с опухолями головного мозга. В ходе нашей работы установлено отсутствие тендерных и возрастных отличий в уровне апоптоза (табл 1) При оценке исходных значений апоптотической активности отмечена некоторая тенденция к увеличению данного показателя у умерших детей - 18,1, против 13,7 Наряду с этим имеются достоверно более низкие значения АИ у детей без метастазов опухолей головного мозга - 15,4, против 27,0 (р<0,05) На фоне проведенного лечения зарегистрировано увеличение АИ, что соответствует сообщениям других авторов (Т Belhocine, 2002, S Lacour, 2001) Не обнаружено статистически значимых различий уровня запрограммированной клеточной гибели у выживших и умерших детей, при сохранении тенденции к более высокой выраженности апоптоза у умерших детей Подобные результаты опубликованы другими авторами и указывают на неоднозначные влияния апоптотической активности на исходы при опухолях головного мозга (А Migheli, 1994) Важно отметить, что у детей без метастазов, до и после терапии, уровень апоптоза был значительно ниже, чем у детей с метастазированием опухоли В некоторых исследованиях показано, что высокий уровень апоптоза ассоциируется с высоким уровнем метастазирования опухолей головного мозга (A Korshunov и др , 1999) Подобная ситуация наблюдается при меланоме и некоторых видах рака (S Ugurel, 2001, U Tormanen, 1995, H Kawasaki, 1998) Возможные причины развития такого состояния опубликованы в работах отдельных авторов, так О Tachibana (1995) указывает на повышение уровня апоптоза, вследствие увеличения экспрессии FAS-рецепторов при прогрессировании астроцитом головного мозга При нарастании атипии и прогрессировании опухолей головного мозга отмечается также увеличение уровня апоптоза в опухоли (S Weis'oerg et al, 2001)

Особенности пролиферации опухолевых клеток у детей с опухолями головного мозга. Исследовав исходную выраженность экспрессии Ki-67 в образцах опухолей головного мозга, мы не обнаружили тендерных и возрастных различий пролиферативной активности у детей с данной патологией (табл 1) Однако, отмечается тенденция к более высоким значениям указанного параметра у мальчиков (12,2, против 6,3 у девочек), умерших (13,6, против 6,2) и при метастазировании (15,8, против 9,4) На фоне проведенной терапии установлено изменеиие пролиферативной активности в опухолевой ткани со снижением ПИ в возрастной группе 11-17 лет, что совпадает с данными других авторов (EJ Wexler, 2000, С С Бессмельцев, 2004) Важно, что высокая пролиферагивная активность наблюдается у умерших детей по сравнению с выжившими пациентами -13,6, против 7,1 (р<0,05) и в случаях метастазирования опухоли -17,8, против 6,8 в подгруппе пациентов без метастазов (р<0,05) Полученные результаты

совпадают с данными других исследователей при изучении глиобластом и термином (MA Mizoguchi, 2000, W Chen, 2006) В подгруппе умерших детей и при метастазирующих опухолях индекс пролиферации был высоким и не имел существенной динамики на фоне терапии Подобные данные получены другими авторами при изучении глиом головного мозга (D J Rades, 2004, J Haapasalo, 2005) В ходе работы нами установлено влияние экспрессии антигена Ki-67 на длительность бессобытийной выживаемости при высоком уровне пролиферативной активности время бессобытийной выживаемости было короче, чем при низких значениях ПИ (р<0,05), что не противоречит результатам исследований других авторов (Т Fuse et al, 2000)

Особенности лекарственной устойчивости опухолевых клеток у детей с опухолями головного мозга. В настоящей работе доказано присутствие тендерных различий (р<0,05) исходных показателей экспрессии Р-гликопротеина (табл 1) Для пациентов мужского пола характерна низкая, а для женского высокая экспрессия исследуемого антигена (9,5, против 15,0) Установлено достоверное (р<0,05) преобладание экспрессии Pgp в подгруппе умерших детей (20,7, против 10,5) Отмечена тенденция к повышению указанного параметра при метастазировании опухоли (15,6, против 10,8) Изменения экспрессии Pgp на фоне химиотерапии отсутствовали во всех рассматриваемых подгруппах с сохранением указанных выше тенденций и умеренным повышением экспрессии Р-гликопротеина в подгруппах умерших с 20,7 до 22,3, а также при метастазах опухолей - с 15,6 до 17,8 S Dallas (2006) указывает на влияние Р-гликопротеина на развитие лекарственной устойчивости опухолей ЦНС и быстрой гибели пациентов с высокой экспрессией исследуемого антигена, что не противоречит нашим находкам Высокую экспрессию антигена Pgp в отсутствии метастазов Z Burak (2003) объясняет тем, что Р-гликопротеин определяет развитие лекарственной устойчивости, но не влияет на развитие метастазов при злокачественных опухолях головного мозга В настоящей работе мы доказали влияние уровня экспрессии Р-гликопротеина на длительность бессобытийной выживаемости Для низкой экспрессии Р-гликопротеина характерна более продолжительное время бессобытийной выживаемости (р<0,05)

Таким образом, резутьтаты исследования опухолевого материала до начала химиотерапии показали увеличенные значения АИ при метастазах опухоли, отсутствие 1ендерных и возрастных различий в выраженности апоптоза и пролиферативной активности, высокую экспрессию Р-гликопротеина у девочек и умерших детей со злокачественными новообразованиями головного мозга На фоне лечения отмечено отсутствие динамики экспрессии Р-гликопротеина, увеличение апоптотического индекса (преимущественно у девочек и в возрастной подгруппе 7-10 лет), снижение пролиферативной активности во всех рассматриваемых подгруппах при

более высоких значениях указанного показателя у умерших детей и при метастазировании опухоли. Полученные данные выявили прямую взаимосвязь выраженности апоптоза с частотой метастазирования, что позволяет предположить не апоптотический вариант гибели опухолевых клеток (некроз?, вторичный некроз?), причастность пролиферативкой активности опухоли к бессобытийной выживаемости детей (основные возрастные подгруппы 3-6 лет и 11-17 лет) и отсутствие динамики экспрессии маркера лекарственной устойчивости на фоне терапии при установленном влиянии экспрессии Pgp на выживаемость пациентов со злокачественными новообразованиями головного мозга.

Отдельные клинико-биологические особенности р л б л о м и о с а р к о м

у детей.

Группа детей с рабдомиосаркомами (16 случаев) включала 10 (62,5%) мальчиков и 6 (37,5%) девочек. Манифестация заболевания наступала у большинства детей в возрасте 11-17 лет (у 12 из 16 пациентов, что составило 75%). С учетом гистологического варианта заболевания пациенты распределились следующим образом: эмбриональный вариант встречался у 11 детей (68,8%), альвеолярный у 2 (12,5%). В 3 (18,7%) случаях не удалось установить вариант опухоли.

Основные клинические проявления рабдомиосарком. Изучив локализацию опухолевого процесса мы установили преимущественное поражение области головы и шеи (37,5%), Патологический процесс одинаково часто встречался на туловище и в мочеполовой системе (31,25%), Ведущими клиническими симптомокомплексами (рис. 2), сопутствующими рабдомиосаркомам, были видимая припухлость в области поражения (87,5% случаев) и болевой синдром (43,8% детей). Снижение аппетита наблюдалось у 37,5%, потеря веса у 31,3% пациентов. Патологические проявления со стороны мочеполовой системы (кровоточивость из половых органов, дизурия) установлены у 4 девочек (25%).

100 90 30

1 о 60 50 10

30 20 10 о

ав

. --Ч г

39

_г 31 35 25

, 1 .1_

и : -1

с ч £.!

= £ I

5 К I

т

и

Синдром

а 5.

£ ° 5 § е

К!

£

£1

Рис. 2. Встречаемость клинических синдромов у детей с рабдомиосаркомами в дебюте заболевания

На следующем этапе работы изучались молекулярные особенности образцов рабдомиосарком и проводилось сопоставление полученных результатов с особенностями клинического течения болезни, с результатами лечения и исходами заболевания (табл 2)

Таблица 2

Иммуногистохимическая характеристика рабдомиосарком (М±8)

N АИ ПИ PgP

До терапии После терапии До терапии После терапии До терапии После терапии

Мальчики 10 17±1,7 23:4-2,5* 22,3±2,б 12,7±1,5* 12,4±1,3 14,3±1,9

Девочки 6 17,8±3,1 23,8±3,7* 35,5±8,8 22±5,6 10,2±1,5 12,3±1,2

Все дети 16 17,3±1,5 23,3±2* 27,3=3,9 16,2±2,5* 11,6±1 13,6±1,3

0-2 года 2 17,5±7,5 24,5±11,5 15±7 8±2 11,5±0,5 9,5±0,5

3-6 лет 2 13±1 15,5±0,5 17±2 11,5±0,5 14±1 9,5±0,5

11-17 лет 12 18±],7 24,4±2,1 * 31±4,6# 18,3=3,1"* 11,2±1,3 14,9±1,5#*

0-10 лет 4 15,3±3,4 20±5,4 16±3" 10,8±l,3tf 12,8±0,9 9,5±0,3#

Живые 7 22,7±1,6* 30,6£2 Iе* 19,6±3,1 12±1,7* 10,3±1,9 11,7±1,5

Умершие 9 13,1±]# 17,7±1,5Й* 33,2±5,8 19,4±3,9* 12,6±0,9 15±1,9

Метастазы 6 12±0,9* 15,8±1,4е* 38,3±7,7 23,2±5,2* 12,3±0,8 14,8±2,3

Без метастазов 10 20,5±1,7# 27,8±6,8#* 20,6±2,6 12±1,5* 11,1±1,б 12,8±1,6

Примечание

* - р<0,05 при сравнении одной подгруппы до и после терапии (критерий Уилкоксона)

# - р<0,05 при сравнении подгрупп между собой (критерий Манна-Уитни и критерий Крускала-Уоллиса)

Особенности апоптоза опухолевых клеток у детей с рабдомиосаркомамн В настоящем исследовании установлено, что исходный уровень апопгоза в опухолевой ткани у детей с рабдомиосаркомамн значительно превышал допустимые нормативные значения для нормальных тканей и не имел тендерных и возрастных различий как до, так и после лечения Отмечены исходно более низкие значения АИ (р<0,05) в подгруппе умерших детей - 13,1, против 22,7 у выживших и в подгруппе пациентов с метастазами - 12,0, против 20,5 у больных без метастазов, что свидетельствует о более благоприятном влиянии выраженности апоптотических процессов на возможные исходы заболевания и не противоречит данным других авторов (Р№Т РШегс е! а1 1996,1 Рйак е1 а1, 2000) Изучив динамические изменения исследуемого параметра на фоне химиотерапии, мы выявили увеличение выраженности апоптоза у всех детей (преимущественно в возрастной подгруппе 11-17 лет) с сохранением ранее найденных особенностей(р<0,05)

Особенности пролиферации опухолевых клеток у детей с рабдомиосаркомамн Исследовав выраженность пролиферации в образцах

рабдомиосарком, полученных до начала проведения химиотерапии, мы установили отсутствие половых различий, значительное преобладание активности пролиферации (р<0,05) у детей в возрасте 11-17 лет (31,0, против 16,0 в более младшем возрасте), тенденцию к более высоким значениям индекса пролиферативной активности у девочек - 35,5 по сравнению с мальчиками 22,3, у умерших - 33,2, против 19,6 у выживших, а также при метастазирующих опухолях - 38,3, против 20,6 при отсутствии метастазов Подобные данные представлены отечественными авторами (Р А Кешта, 2000), где указывается на отсутствие зависимости безметастатической выживаемости от пролиферативной активности опухолей у взрослых пациентов После проведенной химиотерапии отмечено снижение пролиферативной активности опухолей, при сохранении высокой пролиферативной активности в возрастной подгруппе 11-17 лет

Особенности лекарственной устойчивости опухолевых клеток у детей с рабдомиосаркомами. Изучив особенности исходной экспрессии Pgp, у пациентов с рабдомиосаркомами мы не выявили возрастных и половых различий Наблюдается незначительное преобладание экспрессии Р-гликопротеина у мальчиков (12,4, против 10,2 у девочек), умерших детей (12,6, против 10,3 у выживших) и при метастазах рабдомиосарком (12,3, против 11,1) При динамическом исследовании экспрессии маркера лекарственной устойчивости на фоне терапии отмечено значимое (р<0,05) нарастание экспрессии Р-гликопротеина у детей старше 11 лет (с 11,2 до 14,9), при тенденции к снижению показателя в возрастной подгруппе 0-10 лет (с 12,8 до 9,5) Наряду с этим имеется статистически значимое (р<0,05) различие выраженности экспрессии Pgp у детей возрастных подгрупп 0-10 лет и 11-17 лет (9,5, против 14,9) Объяснением указанного факта могут быть гормонально-метаболические особенности детского организма в пубертатный период и нарастание устойчивости тканей к ксенобиотикам по мере взросления На возможность увеличения экспрессии Р-гликопротеина при химиотерапии указывают другие авторы (J F Kuttesch et al, 1996, R W Johnstone et al 1999) В настоящем исследовании мы не установили влияния уровня экспрессии P-i ликопротеина на длительность бессобытийной выживаемости, что совпадает с мнением других авторов (К V Cullen, 2000)

Таким образом, в ходе исследования особенностей маркеров опухолевой прогрессии при рабдомиосаркомах установлено отсутствие половых различий в уровне апоптоза, экспрессии Ki-67 и Pgp до начала терапии Наряду с этим отмечен значительно более низкий уровень АИ у детей с метастазами и у умерших пациентов, а также двукратное превышение экспрессии Ki-67 в подгруппе детей старше 11 лет На фоне химиотерапии доказано снижение пролиферации с увеличением АИ во всех подгруппах и нарастание экспрессии Р-гликопротеина при самых высоких значениях

данного маркера у детей старше 1) лет. ! 1олученные данные подтверждают концепцию обратной зависимости между активностью апоптоза и м етаста з и ро в ан и е м рабдомиосарком с нарастанием запрограммированной гибели клеток при данной патологии, отсутствие значимых влияний выраженности пролиферации в опухолевой ткани на бессобытийную выживаемость детей и особенности экспрессии маркера лекарственной устойчивости {увеличение показателя на фоне проводимого лечения) преимущественно в возрастной подгруппе старше 11 лет.

Отдельные к л и н и ко-б но л о ги ч е с ки е особенности ост ей сарком

у детей.

В группе пациентов с остеогенной саркомой наблюдались 17 детей. Из них мальчиков 11 (64,7%), а девочек 6 (35,3%) человек. Манифестация заболевания в большинстве случаев наступала в возрастном периоде 11-17 лет - 14 детей (82,4%).

Основные клинические проявления остеосарком. При изучении локализации патологического процесса установлено преимущественное поражение длинных трубчатых костей - 14 детей (82,4%), реже плоских костей - а 3 (17,6%) случаях. Ведущими клиническими симптомокомплексами, которые сопутствовали рабдомиосаркомам, была триада - боль в области поражения, нарушение функции и припухлость; указанные признаки встречались у детей целевой группы в 100%, 82,3% и 70,6% случаях соответственно. Лихорадка присутствовала у 5 детей (29.4%).

Рнс. 3. Встречаемость клинических синдромы у детей с остеосаркомами в дебюте заболевания

На следующем этапе работы исследовались молекулярные особенности образцов рабдомиосарком и проводилось сопоставление полученных результатов с особенностями клинического течения болезни, с результатами лечения и исходами заболевания (табл. 3).

Таблица 3

Иммуцогистохимическая характеристика остеосарком (М±5)_

N АИ ПИ PgP

До терапии После терапии До терапии После терапии До терапии После терапии

Мальчики 11 25,7±3,9 37,6*4"* 13,6*3,2 9,9*2,5* 8,3*2,1" 8,1*1,4"

Девочки 6 19,4*2,2 23,9*3,5"* 28,9*5,3 16±2,8* 23*2,5" 18,4*2,2"

Все дети 17 23,1*2,6 31,9*3,2* 17,8±3 12,4*1,9* 14,4*2,4 12,2*1,7

11-17 лет 14 22,9±3 32,4±3,7* 17,3*3,6 11,8±2,3* 13*2,3" 11±1,б"

0-10 лет 3 24±4,4 29,7*6,7" 20,3*4,3 15,3*3,7* 20,7*8,3" 17,7*5,9"

Живые 9 28,4*3,8* 41,7*3,5"* 9,2*1,6" 6,6*1,1"* 6,8*1,8" 7*1,1"

Умершие 8 17,1*1,7" 20,9*0,8" 27*4,3" 19,1*2,2"* 22,9*2" 18,1*1,8"

Метастазы 9 22,4*4,3 28,3±4,6 24,2*4,7* 17,3±2,б"* 18,8*3,5" 15,8±2,4"

Без метастазов 8 23,9±2,7 36*4,2* 10*1,6" 7*1,2"* 9,4*2,3" 8,3*1,5"

Примечание

* - р<0,05 при сравнении одной подгруппы до и после терапии (критерий Уилкоксона)

# - р<0,05 при сравнении подгрупп между собой (критерий Манна-Уитни и критерий Крускала-Уоллиса)

Особенности апоптоза опухолевых клеток у детей с остеогенной саркомой. По результатам исследования исходного уровня апоптоза в ткани остеосарком не выявлено значительных (р>0,05) половых и возрастных различий в выраженности апоптотических процессов (табл 3) Установлены значительно более высокие значения величины АИ (р<0,05) у живых детей -28,4, против 17,1 у умерших Отмечено наличие тенденции (р>0,05) к более высокой апоптотической активности в образцах опухолей, полученных от мальчиков - 25,7, против 19,4 у девочек, у детей без метастазов - 22,4, против 23,9 при метастазировании опухоли и у пациентов подгруппы 0-10 лет - 24,0 против 22,9 в более старшей подгруппе На фоне проведенной химиотерапии зарегистрировано значительное (р<0,05) увеличение показателя АИ, о чем свидетельствуют аналогичные исследования, выполненные на взрослом контингенте больных (Р A Meyers et al 2005) При этом зафиксировано значительно (р<0,05) более высокие показатели АИ у мальчиков по сравнению с девочками (37,6, против, 23,9) и в подгруппе выживших (41,7, против 20,9 в подгруппе умерших) Учитывая значительное (р<0,05) преобладание выраженности апоптоза у мальчиков, а также более длительную бессобытийную выживаемость в данной подгруппе, можно предположить влияние апоптотических процессов на исходы заболевания

Особенности пролиферации опухолевых клеток у детей с остеогенной саркомой. В настоящем исследовании установлено отсутствие значимых половых и возрастных различий (р>0,05) пролиферативной активности в ткани остеогенных сарком до проведения химиотерапии (табл

3) Зарегистрирован более высокий (р<0,05) ПИ в подгруппе умерших детей по сравнению с выжившими пациентами (27,0, против 9,2), а также в случаях метастазирования опухолей (24,2, против 10,0) L Zhang (2006) и S S Nathan (2005) в своих исследованиях указывают о влиянии активности пролиферации (по другим маркерам) на длительность бессобытийной выживаемости при остеогенных саркомах В своей работе мы доказали отрицательное влияние (р<0,05) высокого уровня ПИ на время бессобытийной выживаемости (более короткое время бессобытийной выживаемости при высоком уровне экспрессии Ki-67)

Особенности развития лекарственной устойчивости опухолевых клеток у детей с остеогенной саркомой В настоящей работе установлены более высокие показатели исходной экспрессии Р-гликопротеина (р<0,05) (табл 3) у девочек по сравнению с мальчиками (23,0, против 8,3), в возрастной подгруппе 0-10 лет (20,7, против 13,0 в более старшей подгруппе), у умерших пациентов (22,9, против 6,8 у выживших) и в случаях метастазирования опухоли (18,8, против 9,4) По литературным данным отношение к указанному молекулярному маркеру не является однозначным, ряд авторов демонстрируют отсутствие прогностической значимости экспрессии Pgp у больных с остеогенной саркомой (К Radig, 1997, M Posl, 1997, J S Wunder, 2000), однако, полученные нами результаты совпадают с мнением исследователей, изучавших указанный маркер у взрослых больных с данной патологией (J S Wunder, 1993, H S Chan, 1997, J S Wunder, 2005) Нами выявлено отсутствие значимых динамических изменений экспрессии Р-гликопротеина после химиотерапии Отмечена тенденция к снижению выраженности экспрессии изучаемого параметра в исследуемых подгруппах, кроме подгруппы выживших, где зарегистрировано незначительное увеличение экспрессии маркера лекарственной устойчивости с 6,8 до 7,1 В настоящей работе определено влияние уровня экспрессии Р-гликопротеина на длительность бессобытийной выживаемости, в случаях повышенной экспрессии Pgp длительность бессобытийной выживаемости была значительно меньше (р<0,05) Аналогичные результаты экспериментальных исследований приводят некоторые другие авторы (N Baldim, 1995, M Serra, 2003)

Таким образом, изучив молекулярные маркеры опухолевой прогрессии у детей с остеосаркомами до начала лечения, мы установили отсутствие половых и возрастных различий в выраженности апоптоза и активности пролиферации в опухолевой ткани, низкие значения АИ при неблагоприятном исходе заболевания, а также более высокие показатели экспрессии Ki-67 и Pgp в подгруппах умерших и пациентов с метастазированием опухоли (при этом прогностически неблагоприятное повышение экспрессии Pgp отмечалось у девочек и в возрастной подгруппе

0-10 лет) После проведения химиотерапии установлено увеличение АИ со статистически значимым превышением данного показателя у мальчиков по сравнению с девочками и в подгруппе выживших детей, снижение экспрессии Кд-67 (при сохранении более высоких значений в подгруппах умерших и при метастазировашш опухоли) и отсутствие динамики экспрессии Pgp Представленные выше данные свидетельствуют об обратной зависимости между активностью апоптоза и метастазами остеосарком, указывают на нарастание запрограммированной гибели клеток после химиотерапии, подтверждают причастность пролиферативной активности опухоли к бессобытийной выживаемость детей независимо от возраста, доказывают отсутствие динамики экспрессии маркера лекарственной устойчивости на фоне терапии и влияние экспрессии Р§р на продолжительность бессобытийной выживаемости детей с остеосаркомами

Учитывая разнонаправленность процессов апоптоза и пролиферации, мы выдвинули предположение о наличии корреляции между указанными процессами при онкологических заболеваниях у детей (табл 4) Не установлено взаимосвязи между исследуемыми процессами у детей с опухолями головного мозга Доказана обратная связь между АИ и уровнем экспрессии К1-67 при рабдомиосаркомах у девочек (г = - 0,81), в различные возрастные периоды показатель корреляции изменялся (более выраженная корреляционная зависимость в возрастной подгруппе 0-10 лет - г - - 0,97), но оставался статистически значимым В группе детей с остеосаркомами отмечена отрицательная связь между ЛИ и ПИ при метастазировании опухоли (г = - 0,69)

Таблица 4

Корреляция между уровнем апоптоза и экспрессией белка К167

в образцах опухолевой ткани у детей

Коэффициент корреляции

Опухоли головного мозга (п~37) Рабдомиосаркомы (п-16) Остео саркомы (п=17)

Мальчики 0,46 -0,14 -0,11

Девочки -0,34 -0,81* -0,64

Все дети 0,21 -0,48 -0,36

0-2 года

3-6 лет 0,02

7-10 лет -0,51

11-17 лет 0,42 -0,65* -0,14

0-10 лет -0,04 -0,97* -0,41

Живые -0,18 -0 35 -0,24

Умершие -0,34 -0,21 0,55

Метастазы 0,37 -0,19 -0,69*

Без метастазов 0,18 -0,18 0,29

Примечание * - р<0,05 (корреляция активности апоптоза и пролиферации опухолевых клеток в нозологических группах)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В целом, выполненное исследование, посвященное изучению молекулярных механизмов опухолевой прогрессии (эффективность апоптоза, пролиферативная активность, экспрессия маркера лекарственной устойчивости) при отдельных онкологических заболеваниях у детей, позволило представить научно-обоснованные данные по выраженности апоптотической активности при указанных нозологиях, определить лролиферативную активность опухоли, уточнить патогенетическую роль экспрессии Р-гликопротеина в развитии лекарственной устойчивости при солидных опухолях и предложить рекомендации по использованию указанных маркеров опухолевой прогрессии в диагностике и прогнозе исходов указанных заболеваний

Благоприятное

течение Гер увеличился в подгруппе ] 1 -17 лет,

У ^АИ > чу

Неблагоприятное течение

заболевания * - высокие показатели у девочек и умерших

Неблагоприятное течение

заболевания * - высокие показатели у девочек, умерших и при метастазировании

Рис. 4. Маркеры опухолевой прогрессии на фоне химиотерапии у детей

ВЫВОДЫ

1 Клинических особенностей дебюта заболеваний в исследуемых группах выявлено не было Ведущие клинические симптомы и их встречаемость соответствуют данным по России К биологическим особенностям злокачественных опухолей головного мозга, рабдомиосарком и остеосарком относятся различная выраженность пролиферации, вариант гибели опухолевой ткани, развитие устойчивости к лекарственным

препаратам, которые могут быть использованы для оценки эффективности химиотерапии, прогнозирования исходов заболевания и индивидуального подхода к лечению детей с указанной патологией

2. Особенностями апоптоза злокачественных новообразований у детей с опухолями головного мозга являются повышение апоптотической активности на фоне химиотерапии у девочек и у пациентов возрастной группы 7-10 лет, высокие исходные значения апоптотического индекса в случаях метастазирования опухолей и отсутствие зависимости между выраженностью запрограммированной клеточной гибелью и летальным исходом, при рабдомиосаркомах и остеосаркомах доказано нарастание апоптотического индекса на фоне проводимого лечения с установленным влиянием данного показателя на бессобытийную выживаемость (более высокие значения апоптоза в подгруппе выживших детей и в подгруппе без метастазов)

3 Пролиферативная активность опухолевой ткани, оцениваемая по уровню экспрессии антигена Кл-67, характеризуется высокими значениями экспрессии при рабдомиосаркомах, снижением показателя на фоне химиотерапии при всех изученных солидных новообразованиях, определяет исход заболеваний при опухолях головного мозга и остеосаркомах (низкая пролиферация у выживших и при отсутствии метастазов) и не влияет на бессобытийную выживаемость при рабдомиосаркомах

4 Лекарственная устойчивость по уровню экспрессии антигена Р^гр характеризуется исходно более высокими значениями данного показателя (преимущественно у девочек) в отсутствии существенной динамики Р-гликопротеина на фоне химиотерапии при более низкой бессобытийной выживаемости пациентов с опухолями головного мозга и остеосаркомами, при рабдомиосаркомах имеются высокие значения экспрессии Pgp и нарастание экспрессии изучаемого молекулярного маркера после лечения (возрастная группа 11-17 лет), что, возможно, определяет низкую эффективность терапии

5 Объем диагностических исследований с определением молекулярных маркеров определяется нозологической формой онкопатологии, наиболее информативными тестами для прогнозирования исходов при новообразованиях головного мозга являются исходный уровень апоптоза и экспрессии Р§р в комбинации с динамикой пролиферативной активности, при рабдомиосаркомах - исходные значения и динамика апоптотической активности, при остеосаркомах - показатели апоптотического индекса, пролиферативной активности и экспрессии Р§р до начала лечения и на фоне химиотерапии

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1 Для выявления групп детей угрожаемых по развитию неблагоприятных исходов онкологических заболеваний необходимо проведение динамического исследования с определением молекулярных маркеров на основе нозологической формы онкопатологии в специализированных отделениях

2 Для прогнозирования исходов при новообразованиях головного мозга наиболее информативными диагностическими тестами являются исходный уровень апоптоза и экспрессии Р§р в комбинации с динамикой пролиферативной активности

3 При рабдомиосаркомах определение исходных значений и динамика апоптотической активности позволяют оценить эффективность терапии, прогноз заболевания и установить группу пациентов, не отвечающих на стандартные схемы лечения с высокой вероятностью низкой бессобытийной выживаемостью

4 В случаях остеосарком показатели апоптотического индекса, пролиферативной активности и экспрессии Pgp до начала лечения и на фоне химиотерапии помогают выделить группу детей, наиболее уязвимую по развитию лекарственной устойчивости и неблагоприятных исходов

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Моргун, А В Место опухотей ЦНС среди онкологических болезней у детей в красноярском крае / А В Моргун, О А Малютин, М В Борисова // Вопр совр педиатр - 2005 - Т 4 - С 355-356

2 Моргун, А В Прогностическое значение индекса Кл-67 при опухолях головного мозга / А В Мор1ун, А Б Салмина // Матер X конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» - Москва, 6-9 февраля 2006 С 390

3 Моргун, А В Структура первичных опухолей ЦНС у детей в Красноярском крае / А В Моргун, Т Е Таранушснко // Материалы X конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» - Москва, 6-9 февраля 2006 С 390-391

4 Моргун, А В Прогностическое значение индекса к1-67 после хичиолучевой терапии у детей с опухолями головного мозга / А В Моргун, Т Е Таранушенко // Сб матер региональной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» - г Томск, 20 апреля 2006 - С 4243

5 Неотложные состояния в онкологии / А В Моргун, Т Е Таранушенко, М В Борисова и др // Матер краевой научно-практической конференции «Неотложные состояния в педиатрии» - Красноярск, 25 - 26 апреля 2006 года - С 135-150

6 Моргун, А В Значение уровня экспрессии при остеосаркомах у детей / А В Моргун, Т Е Таранушенко, А Б Салмина // Врач-аспирант - 2006 - Т 6, № 15 -С 519-524

7 Моргун, А В Определение Р-гликопротеина и его прогностическое значение у детей с рабдомиосаркомой / А В Моргун // Матер V Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» - Москва, 24-26 октября 2006 -С 314

8 Значение маркеров прогрессии при опухолях головного мозга у детей / А В Моргун, Т Е Таранушенко, А Б Салмина и др // Сиб мед обозрение - 2007 - № 1 - С 13-17

9 Определение Р-гликопротеина при опухолях головного мозга у детей / А В Моргун, Т Е Таранушенко, А Б Салмина и др // Матер XI Конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» - М , 2007 - С 464-465

10 Региональные особенности первичной заболеваемости лейкозами у детей красноярского края / М В Борисова, 3 Н Гончарук, Т Е Таранушенко и др // Матер XI Конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» - М, 2007 - С 93-94

11 Morgun, А V Ki-67 expression in the pediatric brain tumors after chemoradiotherapy // A V Morgun, T E Taranushenko, L D Zykova // The XII Symp RJME, Krasnoyarsk, 2005 - Program & Abstr - P 298-299

12 Morgun, A V The place of tumors of soft tissues among oncological diseases in children of the Krasnoyarsk region / A V Morgun, M V Bonsova, О A Malyutm // The XII Symp RJME, Krasnoyarsk, 2005 - Program & Abstr - P 299-300

Список основных сокращений

АИ - апоптотический индекс

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ГОУ ВПО - государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

НИИ - научно-исследовательский институт

ОГМ - опухоль головного мозга

ПИ - пролиферативный индекс

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

УЗИ - ультразвуковое исследование

УФ - ультрафиолет

ЭКГ - электрокардиография

ЭхоКГ - эхокардиография

ЭЭГ - электроэнцефалография

Pgp - Р-гликопротеин

TUNEL - terminal deoxynucleotided transferase - mediated dUPT nick end labeling

Отпечатано в ООО «Поликом» 660017, г. Красноярск, ул. Ленина, 113, оф. 416 Тел.: (3912) 23-52-73, тел./факс: (3912) 29-63-58 Тираж 100 экз.

Существенные достижения в диагностике онкологических заболеваний и определение молекулярных особенностей отдельных опухолей позволяет прогнозировать успешность терапии после первых циклов химиотерапии. Однако результативность применения программ полихимиотерапии при солидных, новообразованиях ниже, чем при онкогематологических заболеваниях. Так при лейкозах терапия, оказывается успешной у 85-90% больных, aí. показатель безрецидивной выживаемости составляет в среднем только; 50%. При солидных новообразованиях детей- успешность- терапии варьируют от 40 до 65%

Успех противоопухолевой- терапии обеспечивается- правильно; подобранной комбинацией режимов интенсивной! терапии; и сопроводительного лечения. Эффективность уничтожения- опухолевых клеток зависит от их чувствительности к химиотерапии, активности процессов пролиферации и гибели клеток в ткани опухоли (Т. Hongo, 1997, 2002).

Результативность лечения значительно возросла в результате-разработки высокоагрессивной химиотерапии; Но, несмотря на повышение эффективности* лечения, многие пациенты получают неадекватную цитостатическую нагрузку вследствие отсутствия оценки эффективности: воздействии терапии на саму опухоль. Кроме того, отмечается появление резистентных к химиотерапии больных. В связи с этим наиболее вероятно; что пути повышения эффективности лечения онкогематологических заболеваний лежат в направлении, изучения биологических основ противоопухолевой терапии (D; Boer, 1998; D. Kravtsov, 1998).

Механизмы действия противоопухолевых препаратов различаются (проникновение сквозь клеточную мембрану, пути внутриклеточного взаимодействия) и направлены на достижение одной цели - включение в клетках программы апоптоза, что является конечным этапом сложного процесса противоопухолевой активности' (Е.Б; Владимирская, 1997, 1998, 2000, 2003;.С. Thompson, 1995; J-Ph.Vial, 1997; Е. Solary, 2000; D.M. Gorman, 2001; R.A. Franklin, 2000). Характерной особенностью опухолевых клеток является нарушение программы апоптоза на различных ее этапах, что мешает реализации циторедуктивного действия противоопухолевой терапии и лежит в основе развития лекарственной резистентности (Е.Б. Владимирская^ 1997, 1998, 2003): Также нельзя забывать, что скорость и степень разрушения опухоли зависит не только от быстроты смерти ее клеток, но и от скорости пролиферации и массы пролиферирующих клеток.

Однако до сих пор остается неясной роль отдельных маркеров опухолевой прогрессии (выраженность апоптотической гибели клеток, пролиферативная активность и экспрессии маркеров лекарственной < устойчивости) при злокачественных новообразованиях головного мозга, рабдомиосаркомах и остеосаркомах, в том числе у детей; Исходя из этого, настоящее исследование представляется актуальным.

Цель исследования.

Выявить молекулярные ' механизмы опухолевой прогрессии (эффективность апоптоза, пролиферативная активность, экспрессия маркера лекарственной устойчивости);при отдельных онкологических заболеваниях у J детей: и обосновать возможность внедрения в практику указанных диагностических технологий; г

Задачи.

1. Изучить клинические особенности дебюта основных онкологических заболеваний с уточнением частоты выявляемости ведущих симптомокомплексов при данной патологии. I 2. Оценить эффективность апоптоза клеток^ опухолевой природы у детей с солидными опухолями; ' 7

3. Определить пролиферативную активность опухоли по результатам регистрации экспрессии антигена Кл-67.

4. Уточнить роль экспрессии Р-гликопротеина в развитии лекарственной устойчивости у детей со злокачественными новообразованиями.

5. Обобщить данные о значении маркеров пролиферативной активности, лекарственной устойчивости и выраженности апоптоза на исход заболеваний.

Научная новизна.

1. Впервые в детской онкологии подтверждена концепция; прямой взаимосвязи выраженности апоптоза с частотой метастазирования при опухолях головного мозга и обратная зависимость между активностью апоптоза и метастазами рабдомиосарком иг остеосарком. Установлено отсутствие существенных изменений эффективности апоптоза опухолевых клеток на фоне терапии при злокачественных новообразованиях головного мозга, и доказанное нарастание интенсивности запрограммированной гибели клеток при рабдомиосаркомах и остеосаркомах после химиотерапии.

2. Доказано, по результатам динамического исследования экспрессии антигена.Кл-67, отсутствие значимых влияний выраженности пролиферации в опухолевой ткани при рабдомиосаркомах, и причастность пролиферативной активности опухоли к бессобытийной выживаемости детей; при злокачественных новообразованиях головного мозгам (основные возрастные подгруппы 3-6 лет и И-17 лет) и остеосаркомах независимо от возраста.

3. Выявлены особенности экспрессии маркера лекарственной устойчивости Р-гликопротеина: увеличение показателя на фоне проводимого лечения у больных с рабдомиосаркомами (преимущественно возрастная группа старше 11 лет), отсутствие динамики показателя на фоне терапии при опухолях головного мозга и остеосаркомах, и влияние экспрессии Р§р на выживаемость при всех изучаемых новообразованиях (высокие значения экспрессии Р-гликопротеина в подгруппе умерших пациентов).

4. Установлено, что наиболее информативными тестами для прогнозирования исходов при новообразованиях, головного мозга являются исходный уровень апоптоза и экспрессии Pgp в комбинации с динамикой пролиферативной активности, при рабдомиосаркомах - исходные значения и динамика апоптотической активности, при остеосаркомах - показатели апоптотического индекса, пролиферативной активности и экспрессии Pgp до начала лечения и на фоне химиотерапии у детей:

Личный вклад соискателя.

Научные результаты, обобщенные в диссертационной работе Моргуна A.B., получены самостоятельно. Диссертантом выполнено лично:

- определение цели, разработка конкретных задач работы и плана их выполнения;

- составление протоколов клинического, лабораторного исследований;

- набор клинического материала - динамическое клиническое обследование пациентов с солидными новообразованиями;

- проведение иммуногистохимических исследований;

- создание компьютерной базы данных обследованных и пролеченных больных;

- статистическая обработка материала исследований и интерпретация результатов.

Практическая значимость работы.

1. Проведенное исследование подтвердило возможность использования маркеров опухолевой прогрессии (экспрессия Ki-67, экспрессия Pgp, i эффективность апоптоза) для прогностических целей у детей;

2. Полученные результаты позволяют оптимизировать терапевтическую V. тактику ведения пациентов и могут использоваться при планировании комплексного индивидуального лечения детей и в прогнозировании I опухолевой прогрессии.

3: Обозначены достоверно значимые показатели, характеризующие особенности течения заболеваний (выраженность апоптоза, пролиферации и экспрессия, Р-гликопротеина) и позволяющие выделить группу больных с высокой вероятностью неблагоприятных исходов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Выраженность апоптоза в опухолевой ткани отражает прямую его взаимосвязь с частотой развития метастазов опухолей, головного мозга и обратную зависимость между активностью: апоптоза и метастазами рабдомиосарком и остеосарком, что является; информативным методом? прогноза исходов онкологических заболеваний у детей.

2. Динамический анализ пролиферативной активности по результатам регистрации; антигена, Кь67 позволяет использовать указанный параметр у всех пациентов с остеосаркомами, а также в возрасте 3-6 и 11-17 лет при опухолях головного-мозгагдля оценки- эффективности терапии^ и выделить группы детей, угрожаемых^по развитию метастазов.

3. Выраженность экспрессии Pgp характеризует возможность развития лекарственной устойчивости на фоне проводимой химиотерапии и позволяет определить группы пациентов со злокачественными опухолями, изначально устойчивыми к воздействию химиопрепаратов.

Внедрения в практику.

Практические рекомендации внедрены; в учебный процесс кафедры детских болезней №1 КрасГМА, в работу отделения гематологии/онкологии КГУЗ;«Красноярская краевая детская больница»^ в учебный процесс кафедры биохимии с курсами5 медицинской- фармацевтической и токсикологической химии, научный процесс НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГОУ ВПО КрасГМА Росздрава.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на практической конференции педиатров г. Красноярска (сентябрь 2006 г.), на научных конференциях кафедры детских болезней № 1 с курсом ПО Красноярской государственной медицинской академии (2005-2006 гг.), заседании Проблемной Комиссии по педиатрии, акушерству и гинекологии Красноярской государственной медицинской академии (2 апреля 2007 г).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ. Из них 1 в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста, иллюстрирована таблицами и рисунками и состоит из введения, 7 глав, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 222 источника (58 отечественных и 164 иностранных). Иллюстрирована 14 таблицами и 35 рисунками.

ВЫВОДЫ.

1. Клинических особенностей дебюта заболеваний в исследуемых группах выявлено не было. Ведущие клинические симптомы и их встречаемость соответствуют данным по России. К биологическим особенностям злокачественных опухолей головного мозга, рабдомиосарком и остеосарком относятся различная выраженность пролиферации, вариант гибели опухолевой ткани, развитие устойчивости к лекарственным препаратам, которые могут быть использованы для оценки эффективности химиотерапии, прогнозирования исходов заболевания и индивидуального подхода к лечению детей с указанной патологией.

2. Особенностями апоптоза злокачественных новообразований у детей с опухолями головного мозга являются повышение апоптотической активности на. фоне химиотерапии у девочек и у пациентов возрастной группы 7-10 лет, высокие исходные значения апоптотического индекса в случаях метастазирования опухолей и отсутствие зависимости между выраженностью запрограммированной клеточной гибелью и летальным исходом; при рабдомиосаркомах и остеосаркомах доказано нарастание апоптотического индекса на фоне проводимого лечения с установленным влиянием данного показателя на бессобытийную выживаемость (более высокие значения апоптоза в подгруппе выживших детей и в подгруппе без метастазов).

3. Пролиферативная активность опухолевой ткани, оцениваемая по уровню экспрессии антигена Кт-67, характеризуется высокими значениями экспрессии при рабдомиосаркомах, снижением показателя на фоне химиотерапии при всех изученных солидных новообразованиях, определяет исход заболеваний при опухолях головного мозга и остеосаркомах (низкая пролиферация у выживших и при отсутствии метастазов) и не влияет на , бессобытийную выживаемость при рабдомиосаркомах.

4. Лекарственная устойчивость по уровню экспрессии антигена Pgp характеризуется исходно более высокими значениями данного показателя (преимущественно у девочек) в отсутствии существенной динамики Р-гликопротеина на фоне химиотерапии при более низкой бессобытийной выживаемости пациентов с опухолями головного мозга и остеосаркомами; при рабдомиосаркомах имеются высокие значения экспрессии Рдр и нарастание экспрессии изучаемого молекулярного маркера после лечения (возрастная группа 11-17 лет), что, возможно, определяет низкую эффективность терапии.

5. Объем диагностических исследований с определением молекулярных маркеров определяется нозологической формой онкопатологии; наиболее информативными тестами для прогнозирования исходов при новообразованиях головного мозга являются исходный уровень апоптоза и экспрессии Р§р в комбинации с динамикой пролиферативной активности, при рабдомиосаркомах - исходные значения и динамика апоптотической активности, при остеосаркомах - показатели апоптотического индекса, пролиферативной активности и экспрессии Pgp до начала лечения и на фоне химиотерапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ. 1. Для выявления групп детей угрожаемых по развитию неблагоприятных исходов онкологических заболеваний необходимо проведение динамического исследования с определением молекулярных маркеров на основе нозологической формы онкопатологии в специализированных отделениях.

2. Для прогнозирования исходов при новообразованиях головного мозга наиболее информативными диагностическими тестами являются исходный уровень апоптоза и экспрессии Р§р в комбинации с динамикой пролиферативной активности.

3. При рабдомиосаркомах определение исходных значений и динамика апоптотической активности позволяют оценить эффективность терапии, прогноз заболевания и установить группу пациентов, не отвечающих на стандартные схемы лечения с высокой вероятностью низкой бессобытийной выживаемостью.

4. В случаях остеосарком показатели апоптотического индекса, пролиферативной активности и экспрессии Р§р до начала лечения и на фоне химиотерапии помогают выделить группу детей, наиболее уязвимую по развитию лекарственной устойчивости и неблагоприятных исходов.