Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Особенности иммунного и цитокинового статусов у больных первичной открытоугольной глаукомой

На правах рукописи

Рукина Дарья Александровна

Особенности иммунного и цитокинового статусов у больных первичной открытоуголыюй глаукомой

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 С

.А. ,/.

Владивосток - 2012

005042809

005042809

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Владивостокский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор, Маркелова Елена Владимировна Официальные оппоненты:

Запорожец Татьяна Станиславовна, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» СО РАМН, заместитель директора по науке

Калинина Елена Петровна, доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Владивостокского филиала ФГБУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» СО РАМН - Научно-исследовательский институт медицинской климатологии и восстановительного лечения

Ведущая организация: ФГБУ «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России, г. Москва

Защита состоится 24 мая 2012 года в 10 часов на заседании диссертационного совета ДМ 208.007.02 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Владивостокский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ по адресу: 690002, г. Владивосток, проспект Острякова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Владивостокский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Автореферат разослан 19 апреля 2012 года

Ученый секретарь

диссертационного совета Шаркова Валентина Александровна

Общая характеристика работы Актуальность темы. В офтальмопатологии глаукома занимает особое место в связи с широким распространением в мире, постоянным ростом заболеваемости и как лидирующая причина необратимой слепоты и инвалидности по зрению [Нестеров А.П., 2004; Caprioli J.A. et al., 2009].

Несмотря на огромные успехи, достигнутые медицинской наукой в разработке разных аспектов глаукомы, сохраняется много неясного в главных проблемах болезни: ранней диагностики, механизмах патогенеза глаукоматозного процесса, эффективности терапии. Это связано с полиморфизмом клинической симптоматики, многофакторностью патогенеза, латентным течением ранних стадий заболевания. По актуальности обозначенных проблем наибольший вес занимает первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ), около 50% случаев которой остаются недиагностированными [Астахов Ю.С., 2006; Волков В.В., 2008; Wong, Т. et al., 2007; Caprioli, J. A. et al., 2009]. В этой связи возрастает значимость ранней диагностики болезни, новых подходов к ее выявлению, скрининговых обследований населения, составляющего группы риска развития глаукомы.

Наименее изученной проблемой глаукомы является выявление иммунных процессов в патогенезе ПОУГ. Исследования различных авторов показали влияние клеточных и гуморальных факторов иммунитета в развитии механизмов деструкции, дегенерации и атрофии при глаукоме [Стукалов С.Е., Захарова И.А., 1989; Должич Г.И., Бирюкова Н.В., 2008; Еричев В.П. с соавт., 2009; Страхов В.В., Алексеев В.В., 2009; ROnkkO S. et al., 2007; Malvitte L. et al., 2007; Kutchey J. et al., 2010]. Однако эти работы немногочисленны, результаты их противоречивы и отражают отдельные факты иммунных нарушений. Комплексных исследований, затрагивающих патогенез болезни с позиций клинической иммунологии, нет. Расширенное изучение параметров клеточного и гуморального звеньев иммунитета (спектр цитокинов, иммуноглобулины, матриксные металлопротеиназы) у пациентов ПОУГ позволит расширить понимание механизмов иммунопатогенеза заболевания и разработать критерии ранней диагностики болезни.

Цель работы - на основе комплексной оценки иммунных механизмов патогенеза разработать дополнительные критерии тяжести первичной открытоугольной глаукомы и ранней диагностики этого заболевания у пациентов групп риска.

Задачи исследования:

1. Установить изменение системного и локального цитокинового статуса (IL-6, IL-17, IFN-y, TGF-ßl, TGF-ß3) в зависимости от тяжести глаукомного процесса.

2. Оценить степень информативности системных и локальных уровней матриксной металлопротеиназы-9 (ММР-9) и ее комплекса с тканевым ингибитором (MMP-9/TIMP-1) у пациентов первичной открытоугольной глаукомой.

3. Определить и оценить степень изменения некоторых показателей адаптивного гуморального иммунитета (системной продукции IgM, G, А и локальной продукции slgA) у пациентов ПОУГ.

4. Провести сравнительный анализ цитокинового статуса, иммуноглобулинов основных классов, матриксной металлопротеиназы-9 и ее комплекса с тканевым ингибитором I типа у пациентов, составляющих группу риска по развитию первичной открытоугольной глаукомы (миопия, гипертоническая болезнь II-III ст., сахарный диабет II типа).

Научная новизна. На основании комплекса иммунологических данных (система цитокинов, маркеры синтеза и деградации компонентов межклеточного матрикса, иммуноглобулины), исследованных в сыворотке крови, слезной жидкости и влаге передней камеры глаза, установлено участие иммунных воспалительных реакций в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы.

Повышенные уровни матриксной металлопротеиназы-9 и дефицит TGFß-1 в слезной жидкости пациентов с первичной открытоугольной глаукомой сопряжены с тяжестью заболевания.

Выявлен дисбаланс продукции матриксной металлопротеиназы-9 (ММР-9) и ее комплекса с тканевым ингибитором (MMP-9/TIMP-1), особенно на локальном уровне, является ведущим фактором в ранних механизмах ремоделирования межклеточного матрикса с деструктивным потенциалом в структурах органа зрения.

Определены информативные ранние иммунологические критерии риска развития глаукомы у пациентов группы риска развития первичной открытоугольной глаукомы (миопия любой степени, гипертоническая болезнь II-III ст., сахарный диабет II типа).

Практическая значимость работы. Дополнительным критерием тяжести глаукоматозного процесса является повышение уровней ММР-9 и дефицит TGFß-1 в слезной жидкости пациентов первичной открытоугольной глаукомой. Для ранней диагностики первичной открытоугольной глаукомы разработаны критерии, основанные на определении повышенных локальных уровней IL-17 и ММР-9 у пациентов, составляющих группу риска развития глаукомы (миопия разной степени, гипертоническая болезнь II-III ст., сахарный диабет II типа). Определена диагностическая значимость повышенных уровней секреторного slgA у пациентов ПОУГ как критерия развития первичной открытоугольной глаукомы.

Материалы диссертации легли в основу:

1. Методических рекомендаций «Иммунологические методы диагностики первичной открытоугольной глаукомы», утвержденные Департаментом здравоохранения Приморского края и ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России, внедренных в практику работы офтальмологической службы края и учебный процесс кафедр офтальмологии и патологической физиологии.

2. Заявки на изобретение «Способ прогнозирования заболевания первичной открытоугольной глаукомой» (№2012109270 от 12.03.2012).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Дисбаланс в системной и локальной продукции цитокинов, матриксной протеазы-9 и ее комплекса с тканевым ингибитором являются важными звеньями развития хронического иммунного воспаления при первичной открытоугольной глаукоме.

2. Чрезмерное повышение секреции провоспалительных цитокинов 1Ь-6, ГЬ-17, ШИ-у на фоне активации гуморального звена иммунитета формируют деструктивный потенциал иммунного воспаления в органе зрения.

3. Иммунные нарушения у пациентов с миопией, гипертонической болезнью и сахарным диабетом II типа позволяют отнести их к группе риска возникновения первичной открытоугольной глаукомы. Наличие этих сопутствующих хронических заболеваний усугубляет прогрессирование и тяжесть глаукоматозного процесса.

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации представлены и обсуждены на: VI Дальневосточном конгрессе «Человек и лекарство» (Владивосток, 2009), XI и XII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Владивосток, 2010, 2011), заседании Всероссийской школы иммунологов (Санкт-Петербург, 2010), 14-ом Международном конгрессе по иммунологии (Япония, Кобэ, 2010), Краевом обществе офтальмологов, приуроченном к Всемирному дню борьбы с глаукомой (Владивосток, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, включенных в «перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора и кандидата наук», утвержденный ВАК.

Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии планирования исследования, формирования групп пациентов, включенных в исследование, сборе материала, проведении аналитического обзора отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме,

интерпретации, анализе и статистической обработке полученных результатов исследования.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 135 страницах компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, двух глав собственных наблюдений, заключения и выводов. Список литературы содержит 257 источников, в том числе 128 отечественных и 129 иностранных авторов. Текст иллюстрирован 20 рисунками и 18 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Обследование пациентов и забор исследуемого материала проводился во взрослом отделении микрохирургии глаза ГБУЗ «Краевой клинической больницы №2» г. Владивостока (клинической базы ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России) в течение 2009 - 2011 гг. Для выполнения поставленных задач использовано комплексное клиническое, биохимическое, инструментальное и иммунологическое исследование у 145 человек: 80 пациентов с первичной открытоугольной глаукомой, 35 пациентов из группы риска по развитию первичной глаукомы, в которую включены лица с миопией разной степени, гипертонической болезнью II-III стадии (ГБ), сахарным диабетом II типа в стадии компенсации (СД) (табл.1). Возраст обследованных пациентов колебался от 35 до 75 лет, средний возраст составил 57,0±3,2 года. Женщин - 78 (67,8%), мужчин 37 (32,2 %). Контрольную группу составили 30 офтальмологически и соматически здоровых добровольцев, возраст которых был сопоставим с контингентом больных ПОУГ (51,4±3,0 года). Диагноз первичной открытоугольной глаукомы был установлен согласно требованиям Российского национального руководства по глаукоме [Егоров Е.А. с соавт., 2008]. Всем пациентам проводились общее клиническое обследование и комплекс методов офтальмологического исследования: визометрия, биомикроскопия, авторефрактометрия, офтальмоскопия, тонометрия, тонография, периметрия, конфокальная лазерная сканирующая

офтальмоскопия, ультразвуковое исследование глаз, электрофизиологическое исследование глаз. Уровень внутриглазного давления в 67,5% случаев был в пределах нормальных значений, в 27,5% - умеренно-повышенным, 5% - высоким.

Таблица 1.

Структура и количество обследованных

Количество пациентов

Группы обследованных Абс. %

Контрольная группа 30 -

ПОУГ общая группа: 80 100

1 группа (начальная и развитая стадии) 42 52,5

2 группа (далеко-зашедшая и 38 47,5

терминальная стадии)

ПОУГ без сопутствующей патологии 38 47,5

ПОУГ с сопутствующей патологией: 42 52,5

ПОУГ+миопия 18 22,5

ПОУГ+гипертоническая болезнь 14 17,5

II-III ст. 10 12,5

ПОУГ+сахарный диабет, II тип

Группа риска развития ПОУГ: 35 100

Миопия 14 40

Гипертоническая болезнь II-III ст. И 31,4

Сахарный диабет, II тип 10 28,6

В качестве биологических материалов для иммунологических исследований использовалась венозная кровь, слезная жидкость и влага передней камеры глаза. В сыворотке крови и слезной жидкости определяли уровни цитокинов ІЬ-6, 1Ь-17, №N-7, ТСРр-1, Тврр-З, матриксной металлопротеиназы-9 секреторного типа человека (ММР-9) и ее комплекса

с тканевым ингибитором (MMP9/TIMP1), сывороточные иммуноглобулины основных классов А, М, G и секреторного иммуноглобулина A (slgA). В переднекамерной влаге исследовали уровни цитокинов IL-17 и IL-6.

Определение сывороточных иммуноглобулинов основных классов, секреторного иммуноглобулина А в слезной жидкости проводили с использованием специфических тест-систем «Вектор-Брест» (г. Новосибирск) сэндвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа, согласно прилагаемой инструкции. Определение уровней цитокинов в сыворотке крови, слезной жидкости, а также компонентов внеклеточного матрикса выполняли с использованием специфических тест-систем «R&D Diagnostics Inc.» (USA) сэндвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа, согласно прилагаемых инструкций. Учет результатов проводили с помощью иммуноферментоного анализатора «Multiscan» (Финляндия). Расчет количественных параметров проводили путем построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы. Количество выражали в пг/мл, нг/мл. Для статистической обработки результатов использованы методы описательной, параметрической и непараметрической статистики: W-критерий Шапиро-Уилка, непараметрический критерий Манна-Уитни, коэффициент корреляции Пирсона, критерий Для выявления чувствительности и специфичности изменения выбранных параметров использовали метод линейной регрессии с построением ROC-кривых.

Результаты исследования и их обсуждение

Известно, что при хорошо изученном финале болезни (гибели зрительного нерва) первичное звено и клетки - мишени неясны. Поэтому в основу наших исследований легли поиски предикторов развития глаукоматозного процесса, ранних диагностических маркеров и иммунных механизмов его прогрессирования. Анализ многочисленных литературных данных, посвященных глаукоме, свидетельствует о системном поражении соединительнотканных структур глаза, эндотелия микроциркуляторного русла

и нейротрофических нарушениях зрительного нерва и его окружения. Такая системность нарушений функционирования нервной, сосудистой, соединительной ткани одного органа может быть связана с дисфункцией иммунной системы и развитием хронического иммунного воспаления.

Результаты анализа изменений ряда медиаторов иммунного ответа (цитокинов, матриксной протеиназы-9 и ее комплекса с ингибитором I типа) в сыворотке крови и слезной жидкости, проведенного с целью уточнения механизмов иммунного ответа, демонстрируют комплекс нарушений, свойственных хроническому иммунному воспалению. Так, у пациентов ПОУГ обнаружены гиперцитокинемия преимущественно провоспалительных 1Ь-6, 1Ь-17, №N7 и сниженные значения цитокинов с супрессорной функцией ТОРР-1 иТСРр-З (рис.1).

Сыворотка крови Слезная жидкость

1Ь-6 1

ШГ

1Ы7

ММР-9

1 ТвРВ-З

Т(Ш~

-4 -2 0 2 4

1Ь6

ШУу

ПИ 7

ММР-9 |

Т^-З

тауг

4 -2 2 4 Е 8 10

Рис.1 Схематическое изображение дисбаланса уровней иммунологических показателей относительно границы контроля ( | ) у пациентов ПОУГ.

Степень изменений в двух биологических жидкостях характеризовалась разнонаправленностью. Так, продукция 1Ь-6 была выше в системном кровотоке по сравнению с локальной, а продукция 1Ь-17, напротив, доминировала в слезной жидкости. Исследование влаги передней камеры также выявило высокую локальную гиперцитокинемию 1Ь-6, 1Ь-17 и не имело значительных

преимуществ с исследованием слезной жидкости. Секреция металлопротеиназы-9 также преобладала локально. Содержание цитокинов группы TGFp (TGFp-1 и TGFp-З), напротив, отличалось несколько сниженной концентрацией как в системном кровотоке, так и локально, что, может быть, связано как с их потреблением при гиперергических воспалительных реакциях, так и недостаточностью продукции.

Установлено, что миопия, гипертоническая болезнь, сахарный диабет II типа нередко сочетаются с ПОУГ [Должич P.P., 2006; Астахов Ю.С. с соавт., 2006; Короев А.О., 2008; Шкребец Г.В., 2010]. Дисбаланс иммунных показателей наблюдался и у пациентов категории риска возникновения глаукомы. Важно отметить, что некоторые звенья патогенеза ПОУГ и этих хронических заболеваний сходны, что проявлялось и закономерностью изменений иммунологических показателей (рис. 2).

Сыворотка крови Слезная жидкость

ММР-9 IL-17 ■И

IFNy IL-6

■Ж

TQFP-1

TGFB-3

-4 -2 0 2 4 6

ММР-9 |

IL-17 ¡а

IFNy ж

1Ы5 1

TGFP-C

TGFjEH

-5 0 5 10 15

Рис. 2 Схематическое изображение дисбаланса уровней иммунологических показателей относительно границы контроля ( I ) у пациентов группы риска ПОУГ.

Так, у пациентов группы риска возникновения ПОУГ системная концентрация 1Ь-6 была увеличена вдвое (у больных втрое), а локальная - в 10 раз по сравнению с контролем и вдвое превышала показатели у больных ПОУГ. Уровень провоспалительного №N-7 значительно превышал таковые у контрольной группы и больных ПОУГ как системно, так и локально

(соответственно в сыворотке крови и слезной жидкости в 5 и 2 раза). Эти факты мы склонны расценивать, как признаки раннего иммунного воспаления, свойственного хроническим заболеваниям, которые нередко сочетаются с ПОУГ. Сывороточные концентрации другого цитокина 1Ь-17, отражающего ТЪ-17 ответ, у пациентов группы риска были вдвое выше, а локальные, напротив, втрое меньше, чем у больных ПОУГ.

Высокую степень специфичности (90,9%) и чувствительности (82,1%) 1Ь-17 при уровне его диагностического критерия >1,44пг/мл демонстрировали результаты ЯОС-анализа (рис.3 А).

Sensitivity

0 20 40 60 80 100 Specificity, %

Sensitivity,

%

0 20 40 60 80 100 Specificity, %

А

Sensitivity,

0 20 40 60 80 100 Specificity, %

10^ 8С

Sensitivity, % Bt)

С

20 40 60 80 100 Specificity, %

Рис. 3 ЯОС-кривая оценки локальной продукции 1Ь-17 у пациентов: с ПОУГ (общая группа - А), миопией в сочетании с ПОУГ и без нее (Б), ГБ в сочетании с ПОУГ и без нее (В), СД II типа в сочетании с ПОУГ и без нее (Г)

Сравнительный анализ оценки локальных уровней IL-17 у пациентов отдельных подгрупп (миопия, гипертоническая болезнь (ГБ), сахарный диабет II типа (СД) также показал его диагностическую ценность для ранней диагностики ПОУГ. Так у больных с миопической рефракцией (группа риска) отмечалось увеличение концентрации цитокина в 2,8 раз, а в сочетании с ПОУГ в 6,6 раз. Результаты ROC-анализа демонстрировали (рис. ЗБ) максимально высокую чувствительность (100%) и специфичность (100%).

Установлена сопряженность глаукоматозного процесса с высокой локальной концентрацией IL-17 в слезной жидкости пациентов с миопией (Х,2=3,375 с 1 степенью свободы, р=0,05).

Подобная закономерность наблюдалась у пациентов с сахарным диабетом II типа (СД) и гипертонической болезнью (ГБ), факторы патогенеза которых имеют сходные черты с ПОУГ: генетические, сосудистые (дисфункция эндотелия), нейроэндокринные. Диагностический критерий IL-17 у этих больных составил >1,44 пг/мл (соответственно ROC-анализ для СД: Sensitivity 83,3%, Specificity 100%, для ГБ: Sensitivity 88,9%, Specificity 100%) (рис З.Г и З.В). Следовательно, следует считать локальную гиперцитокинемию IL-17 дополнительным маркером ранней диагностики ПОУГ, а, возможно, и предиктором ее развития у категорий риска.

Высокие уровни IL-17 и низкие TGFP-3 коррелировали с усилением продукции матриксной металлопротеиназы-9 (соответственно г=0,65 и г=-0,6).

Известно, что характер экспрессии ММР-9 имеет общие черты с действием реактантов острой фазы воспаления, регулируя продукцию цитокинов (IL-6, IL-17, TGFP), миграцию лейкоцитов в очаг воспаления (Назаров П.Г., 2001).

У больных ПОУГ избыточная системная продукция металлопротеиназы-9 компенсировалась образованием ее комплекса с ингибитором (коэффициент ММР-9 / MMP-9/TIMP-1 был близок к показателю у здоровых) (табл.2). Напротив, концентрация МПП-9 в слезной жидкости превышала уровень ее комплекса с ингибитором в 5 раз, что может являться ключевым фактором в

механизмах нарушения регуляции процессов ремоделирования в структурах трабекулярной сети, решетчатой пластинке склеры и диске зрительного нерва. Таким образом, секреторная активность комплекса была недостаточна для нивелирования высоких концентраций ММР. Так, коэффициент соотношения ММР-9 и ее комплекса с ингибитором в сыворотке не отличался от контроля, а в слезной жидкости был увеличен в 5 раз, что убедительно доказывает значение дисбаланса этих медиаторов в иммунопатогенезе ПОУГ.

Таблица 2

Содержание ММР-9 и комплекса ММР-9/Т1МР-1 в сыворотке крови

и слезной жидкости пациентов с ПОУГ и группы риска ее развития

Группы Сыворотка крови Слезная жидкость

обследованных п ММР-9 ММР-9 / Т1МР-1 ММР-9 ММР-9 / Т1МР-1

М±т, нг/мл М±т, нг/мл М±т, нг/мл М±т, нг/мл

Контроль 30 192,2±19,05 4,3±0,7 34,8±2,86 0,15±0,01

Пациенты ПОУГ общ. 80 252,3±19,2* 7,0±0,3*# 206,5±27,8*# 0,19±0,01

ПОУГ 1 группа 42 236,2±34,8 6,3±0,5* 143,±21,3* 0,16±0,008

ПОУГ 2 группа 38 271,0±19,5* 7,5±0,5* 274,1±47,3*# 0,22±0,02

ПОУГ без 38 215,4±17,4 5,6±0,3* 221,5±42,6*# 0,20±0,03

сочетанной патологии

ПОУГ: с сочетанной 42 285,1±28,8* 7,4±0,4* 184,0±31,7*# 0,20±0,01*

патологией

ПОУГ+миопия 18 234,4±25,5 6,8±0,5* 184,3±50,5*# 0,15±0,002#

ПОУГ + ГБ 14 335,9±55,1* 8,3±0,8* 258,3±79,9*# 0,23±0,003*

ПОУГ + СД 10 268,0±41,4 8,8±0,6* 145,2±13,4*# 0,22±0,02*#

Группа риска: 35 262,2±26,8 7,4±0.9* 108,7±21,3* 0,19±0,02

Миопия 14 214,5±36,6 4.5±0,1 96,3±26,6* 0,16±0,007

ГБ 11 372,8±53,1* 10,9±1,4* 155,6±47,9* 0,23±0,04*

СД 8 213,0±18,5 7,3±1,6* 57,0±2,5* 0,18±0,004*

Примечание: *достоверность показателей групп пациентов с контролем, # групп пациентов ПОУГ и группы риска.

Высокая специфичность ММР-9, как молекулярного маркера деструктивных процессов у пациентов ПОУГ подтвердил анализ ЯОС-кривых в подгруппах больных миопией, гипертонической болезнью (ГБ), сахарным диабетом II типа (СД) в сочетании с ПОУГ и без нее (рис. 4). Определен дополнительный диагностический критерий ПОУГ у пациентов с миопией:

ММР-9 >61,8 нг/мл (ЯОС-анализ чувствительность 85,7%, специфичность 80,0%). При более высоких концентрациях ММР-9 риск возникновения глаукомы у этой категории больных значительно увеличивается. При проведении КОС-анализа у пациентов с сахарным диабетом чувствительность и специфичность исследования локальной концентрации ММР-9 оказались максимальными (100%), а диагностический критерий составил >61,8 нг/мл. ЯОС-анализ у соответствующих подгрупп пациентов с гипертонической болезнью не отличался высокой специфичностью (50%) при сохранении высокой чувствительности при определении ММР-9 (критерий >66,1нг/мл).

О 20 40 60 80 100 Specificity, %

Sensitivity

0 20 40 60 80 100 Specificity, %

Sensitivity, %

40 60 80 Specificity, %

Sensitivity,

%

40 60 80 Specificity, %

В

г

Рис. 4 ЯОС-кривая оценки локальной продукции ММР-9 у пациентов с ПОУГ (общая группа - А), миопией в сочетании с ПОУГ и без нее (Б), ГБ в сочетании с ПОУГ и без нее (В), СД II типа в сочетании с ПОУГ и без нее (Г)

Характерно, что 1Ь-17 совместно с 1Ь-6 и комплексом ММР-9/Т1МР-1 стимулирует развитие эпителиальных фибробластов, эндотелиоцитов, митохондриальную недостаточность, что усиливает воспалительный процесс с аутоиммунным повреждением ткани в зоне воспаления. Высокие локальные уровни ММР-9 (х2=5,96 с 1 ст. свободы, р=0,015) и дефицит локальной продукции ТвРр-1 (%2= 3,9 с 1 ст. свободы, р=0,04) зависели от тяжести проявлений глаукомного процесса.

Результаты исследования гуморального звена иммунитета складывались из анализа системной и локальной продукции иммуноглобулинов (^С, 1§М, ^А, б^А). Сывороточные уровни иммуноглобулинов изменялись мало как у больных ПОУГ, так и у пациентов, составляющих группу риска развития болезни. Локальные концентрации секреторного иммуноглобулина (э^А) превышали нормальные параметры как у больных ПОУГ (в 3,5 раза), так и во всех подгруппах риска развития глаукомы (в 2,5 раза), что свидетельствует об активации гуморальных механизмов иммунопатогенеза у больных ПОУГ (рис.5).

Рис. 5 Уровни б^А в слезной жидкости у пациентов ПОУГ и подгрупп риска ее развития

Следует учесть значение избыточной активации 1Ь-6 и регуляторные функции ТОрр-1 и ТСРр-З, индуцирующих переключение всех классов иммуноглобулинов на в^А. Это дает право считать гуморальные реакции

одним из важных звеньев в развитии иммунного воспаления при первичной открытоугольной глаукоме. Селективное накопление slgA в слезной жидкости свидетельствует об усилении защитной функции слизистых относительно любого антигена, токсина, аутоантигена, а также о стремлении ограничить развитие патологического процесса.

Таким образом, анализ нарушений цитокинового статуса у больных ПОУГ и пациентов, составивших группу риска ее возникновения, позволяет предположить, что в начальной фазе иммунного процесса наблюдается транзиторный цитокиновый профиль, характеризующийся присутствием преимущественно провоспалительных цитокинов IL-6, IL-17 и, особенно, IFN-7 — ключевого цитокина Thl-иммунного ответа. Однако, далее провоспалительные цитокины, реализуя механизмы гиперчувствительности замедленного типа, инициируют иммунный ответ, ведущий к повреждению тканей и стимуляции гуморальных факторов ответа. В дальнейшем, в период формирования глаукомного процесса, цитокиновый профиль меняется и становится смешанным Thl — Thl7. Несмотря на то, что цитокины, продуцируемые Thl-клетками, подавляют развитие ТЬ17-клеток, было обнаружено, что при аутоиммунных процессах Т-клетки одновременно продуцируют IL-17 и IFN-y [Ярилин A.A., 2010]. Активизация субпопуляции Thl7, характеризующейся преимущественно локальными высокими значениями IL-6 и IL-17, инициирует в клеточных структурах глаза патологический характер иммунного ответа, связанный с персистенцией и хронизацией воспаления, что приводит к развитию иммунопатологических реакций и, возможно, аутоиммунному повреждению тканей в очаге воспаления, то есть в структурах глаза.

Субпопуляция Th-17 отличается уникальностью путей дифференцировки регуляторных лимфоцитов и, в большей мере, особенностью эффекторных функций как защищающих, так и индуцирующих местный хронический персистирующий воспалительный процесс с развитием иммунопатологических реакций и аутоиммунным повреждением тканей в очаге воспаления. Известно,

что развитие и экспрессия Th-17 клеток требует присутствия как IL-6, так и цитокинов семейства трансформирующих факторов роста (TGFP), продукция которых в наших исследованиях была снижена у всех обследованных пациентов в 1,5 - 3 раза. Сниженная локальная секреция TGFp может свидетельствовать о прогрессировании фибротических и деструктивных процессов. Следует отметить похожую динамику цитокина при миопии, гипертонической болезни и сахарном диабете II типа (снижение локальных уровней в 1,5 — 3 раза) в сочетании с ПОУГ и без нее. В свете поражения нервной ткани структур глаза - астроцитов, олигодендроцитов, микроглии и нейронов следует отметить, что данный спектр цитокинов экспрессируется именно этими клетками. Высокие уровни IL-17, IL-6 вызывают активную деструкцию нервной ткани в зоне воспаления, а низкие значения TGFp-1 и TGFP-3 в слезной жидкости могут расцениваться как прогностический фактор усиления нейродегенерации и гибели нейронов.

Таким образом, анализ результатов дает право утверждать об иммуноопосредованности глаукомной оптической нейропатии. Аутоиммунное воспаление, запущенное цитокиновым каскадом, не останавливается самостоятельно пока вся ткань, экспрессирующая аутоантиген, не будет разрушена и выведена из организма [Хаитов P.M. с соавт., 2000], поэтому ранняя диагностика предикторов глаукоматозного процесса у пациентов, составляющих группу риска возникновения глаукомы, представляется особенно важной.

Выводы

1. Изменения цитокинового статуса (высокие концентрации IFNy, IL-17, IL-6 и низкие TGF-pi, TGF-рЗ, как в сыворотке крови, так и в слезной жидкости) у больных ПОУГ свидетельствуют о превалировании смешанного Thl / Th-17 иммунного ответа.

2. Исследование локальной секреции цитокинов в слезной жидкости оказалось более информативным, чем в сыворотке крови. Дефицит локальной продукции TGFp-1 (%= 3,9 с 1 ст. свободы, р=0,04) и высокие локальные

уровни ММР-9 (х2=5,96 с 1 ст. свободы, р=0,015) сопряжены с тяжестью проявлений глаукомного процесса.

3. Концентрация матриксной металлопротеиназы-9 была повышена в 7 раз в слезной жидкости, в 1,5 раза - в сыворотке крови пациентов ГТОУГ. Увеличение локальной концентрации ММР-9 прямо зависело от повышения IL-17 (г=0,65) и дефицита TGFß-3 (г=-0,6). Локальные уровни ММП-9 существенно превышали содержание ее комплекса с тканевым ингибитором (MMP-9/TIMP-1).

4. Высокие значения уровней секреторного slgA у больных ПОУГ в отличие от системных величин IgM, IgG, IgA отражают вовлечение локальных гуморальных реакций иммунитета в иммунопатогенез заболевания.

5. Системные и локальные иммунологические сдвиги у лиц с миопической рефракцией, гипертонической болезнью II-III ст., сахарным диабетом II типа характеризовались меньшей выраженностью, чем у пациентов с ПОУГ, но с однонаправленной тенденцией, что позволяет считать эти заболевания предикторами возникновения глаукомы.

Рекомендации для внедрения в медицинскую науку и практику

1. Для дополнительной ранней диагностики ПОУГ рекомендованы следующие критерии: 1) повышенные уровни металлопротеиназы-9 (ММР-9), показатели которой в слезной жидкости превышают 52,5 нг/мл; 2) повышенные уровни секреторного иммуноглобулина А (slgA), показатели которого в слезной жидкости превышают 47,38мг/л; 3) повышенные уровни интерлейкина-17 (IL-17), показатели которого в слезной жидкости превышают 1,5 пг/мл; 4) повышенные уровни интерферона-у (ИФН-у), показатели которого в слезной жидкости превышают 5,84 пг/мл.

2. Дополнительными диагностическими критериями далеко-зашедшей и терминальной стадий ПОУГ являются увеличение локальных концентраций ММР-9 (более 164,1нг/мл) и снижение продукции TGFß-1 (менее 482,0 пг/мл).

3. Миопия, гипертоническая болезнь II-III ст., сахарный диабет II типа относятся к факторам риска развития первичной открытоугольной глаукомы.

Дополнительными критериями ранней диагностики ПОУГ являются гиперцитокинемия IL-17 и высокие уровни ММР-9 в слезной жидкости:

а) для пациентов с миопической рефракцией диагностически значимые показатели IL-17>3,22 пг/мл и ММР-9>61,8 нг/мл; б) для пациентов с гипертонической болезнью: IL-17>1,44 пг/мл; в) для пациентов с сахарным диабетом II типа: IL-17>1,44 пг/мл и ММР-9>61,8 нг/мл.

Превышение этих уровней диктует необходимость углубленного обследования этой категории пациентов на выявление ПОУГ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Рукина Д.А., Кириенко A.B. Значение матриксной металлопротеиназы в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы // Тихоокеанский медицинский журнал. 2011. №3. С. 41—43.

2. Рукина Д.А. Исследование содержание интерлейкина-17 у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой // Фундаментальные исследования. 2011. №7. С. 118-120.

3. Рукина Д.А., Догадова Л.П., Маркелова Е.В., Абдуллин Е.А., Осыховский А.Л., Хохлова A.C. Иммунологические аспекты первичной открытоугольной глаукомы // РМЖ. Офтальмология. 2011. №4. С. 162-165.

4. Рукина Д.А., Галай Р.В. Роль ИНФ-у в иммунопатогенезе первичной открытоугольной глаукомы // Вестник Уральской академической науки. 2010. №2/1. С. 194.

5. Rukina D., Markelova Е. General and Local levels of IL-2 and IL-6 in patients with POAG // International Immunology, Abstract of 14-th International Congress of Immunology, Kobe, Japan. 2010. Vol.22. №1, Day 4 (4/5). P. 124.

6. Рукина Д.А. Иммунологические нарушения у больных глаукомой // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докладов X Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. Владивосток: Медицина ДВ, 2009. - С. 61-62.

7. Рукина Д.А., Галай Р.В., Галай В.Н. Некоторые аспекты иммунопатологии глаукомы // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докладов X Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. Владивосток: Медицина ДВ, 2011. - С. 342.

8. Рукина Д.А., Кислякова И. С. Роль матриксной металлопротеиназы в иммунопатогенезе первичной открытоугольной глаукомы // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины: тезисы докладов X Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. Владивосток: Медицина ДВ, 2011. - С. 345-346.

9. Маркелова Е.В., Рукина Д.А., Догадова Л.П. Иммунологические методы диагностики первичной открытоугольной глаукомы. Методические рекомендации. Владивосток, 2012. - 16с.

Список сокращений

ГБ — гипертоническая болезнь

ИФА - иммуноферментный анализ

ПОУГ - первичная открытоугольная глаукома

СД - сахарный диабет

ШЫ - интерферон

^ - иммуноглобулин

1Ь - интерлейкин

ММР - матриксная металлопротеиназа ТЬ — Т-лимфоциты — хелперы

ТІМР — тканевой ингибитор матриксной металлопротеиназы ТвР - трансформирующий фактор роста

Рукина Дарья Александровна

Особенности иммунного и цитокинового статусов у больных первичной открытоугольной глаукомой

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 17.04.2012. Формат 60x84/16. Бумага писчая. Уч.- изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №365 Отпечатано в типографии ИПК МГУ им. адм. Г.И. Невельского 690059 г. Владивосток, ул. Верхнепортовая, 50а