Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Основы патогенеза, принципы диагностики и специфической коррекции геморрагической лихорадки Эбола в эксперименте

езидиум ВАК России

(решение от" ^ "

19*20., № >

присудил ученую степень/ с

Нач альник управления

наук

Министерство здравоохранения Российской Федерации Государственный научный центр биотехнологии и вирусологии

"Вектор"

На правах рукописи

Чепурнов Александр Алексеевич

Основы патогенеза, принципы диагностики и специфической коррекции геморрагической лихорадки Эбола в

эксперименте.

14.00.16 - патологическая физиология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: С.И.Колесников, академик РАМН.

А

I \: Кольцово - 1998 Г.

•с

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список использованных сокращений...............................................5

Введение....................................................................................... 7

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................20

1.1. Эндотоксический шок при геморрагических

вирусных лихорадках ......................................................................20

1.1.1. Геморрагические вирусные лихорадки..................................20

1.1.2. Развитие эндотоксического шока при геморрагических лихорадках............................................................21

1.1.3. Филовирусные инфекции........................................................27

1.2. Характеристика геморрагической лихорадки Эбола................30

1.2.1. Этиология..................................................................................30

1.2.2. Эпидемиология.........................................................................351.2.3. Устойчивость к химическим и физическим

факторам............................................................................................37

1.2.4. Патология.................................................................................38

1.2.5. Диагностика...............................................................................44

1.2.6. Специфическая профилактика и лечение..............................46

1.2.7. Лабораторные животные для изучения

лихорадки Эбола.................................................................................53

1.2.8. Заключение по обзору литературы.........................................55

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................57

2.1. Биологическая безопасность.......................................................57

2.2. Вирусные препараты....................................................................57

2.3. Животные......................................................................................59

2.4. Культуры клеток, питательные среды и

сыворотки, использованные в работе..............................................60

2.5. Титрование вирусных препаратов.............................................60

2.5.1. Титрование вируса Эбола (ВЭ) методом

негативных колоний под агаровым покрытием................................60

2.5.2. Титрование ВЭ на морских свинках........................................61

2.5.3. Титрование ВЭ на новорожденным белых мышах...............61

2.6. Проверка отсутствия остаточной инфекционности инактивированных препаратов

ВЭ на новорожденных белых мышах...............................................62

2.7. Определение виремии в пробах крови экспериментальных животных..............................................................62

2.8. Серологические реакции.............................................................62

2.8.1 Реакция связывания комплемента (РСК)................................62

2.8.2. Реакция нейтрализации (РН).................................................:63

2.8.3. Иммуноферментный анализ (ИФА).........................................64

2.8.4. Непрямой метод флюоресцирующих антител (НМФА).........65

2.9. Иммуногистохимические исследования.....................................67

2.10. Оценка инфекционности и отбор проб....................................68

2.11. Гематологические методы......................................................68

2.12. Методы изучения клеточного иммунного ответа..................69

2.13. Биохимические методы............................................................72

2.14. Методы исследования системы гемостаза............................74

2.15. Оценка влияния инактивированного вируса Эбола на колониеобразующую активность гемопоэтических предшественников у человека.........................................................75

2.16. Получение инактивированных цельновирионных препаратов для иммунизации и вакцинации экспериментальных животных..........................................................76

2.17. Получение рекомбинантных штаммов вируса осповакцины.......................................................................................77

2.18. Оценка иммуногенности инактивированных цельновирионных препаратов и рекомбинантных

штаммов ВОВ....................................................................................79

2.19. Оценка протективности.............................................................79

2.20. Иммунизация животных............................................................79

2.20.1. Иммунизация кроликов..........................................................79

2.20.2. Иммунизация овец и коз........................................................80

2.21. Отбор крови у животных...........................................................80

2.22. Инактивация иммунных сывороток..........................................81

2.23. Фракционирование иммуноглобулинов

спиртовым осаждением на холоду по Кону......................................81

2.24. Определение концентрации белка.........................................82

2.25. Испытание козьего иммуноглобулина

против болезни Эбола на добровольцах.........................................82

2.25.1. Введение иммуноглобулина..................................................82

2.25.2.Общее иследование состояния здоровья

добровольцев.....................................................................................83

2.25.3. Изучение клинико-лабораторных

показателей крови и мочи..................................................................83

2.26. Методы определения лечебного и

профилактического эффекта иммуноглобулина..............................83

2.27. Получение ДНК-зондов для определения

РНК вируса Эбола..............................................................................84

2.28. Статистическая обработка результатов...................................87

Глава III. Патофизиологические изменения,

влияющие на развитие эндогенного шока

при экспериментальной инфекции Эбола........................................89

3.1. Селекция лабораторных штаммов вируса Эбола.....................91

3.2. Исследование фагоцитарного ответа у восприимчивых и невосприимчивых к вирусу

Эбола животных...................................................................................95

3.3. Изменение биохимических и гемостатических показателей у морских свинок при введении

препаратов вируса Эбола с

различным уровнем вирулентности.................................................106

3.4. Динамика иммунологических показателей у морских свинок при введении различных

препаратов вируса Эбола.................................................................113

3.5. Изменения некоторых показателей гемостаза у нечувствительных животных

(кроликов) при введении препаратов ВЭ........................................127

3.6. Изучение иммуносупрессивных

свойств антигена вируса Эбола.......................................................132

3.7. Изучение влияния вируса Эбола на гемопоэз.........................137

3.8. Развитие аутоиммунных процессов при

экспериментальной инфекции Эбола.............................................140

3.9. Влияние повторных введений препаратов ВЭ на динамику иммунологических показателей

у кроликов и морских свинок.............................................................142

Глава IV. Разработка методов диагностики лихорадки Эбола (ИФА, НМФА, реакция молекулярной

гибридизации нуклеиновых кислот).................................................152

4.1. Оптимизация культивирования

вируса Эбола......................................................................................153

4.2. Получение концентрированного

и очищенного вируса Эбола..............................................................154

4.3. Получение антисыворотки к вирусу Эбола...............................156

4.4. Разработка иммуноферментной тест-системы

для определения антител к вирусу Эбола.......................................157

4.5. Определение оптимальной концентрации

вирусного антигена для сенсибилизации твердой фазы................158

4.6. Отработка системы учета и

интерпретации полученных результатов..........................................160

4.7. Оценка специфичности и чувствительности тест-системы.......................................................................................161

4.8. Разработка иммуноферментной тест-системы

для выявления антигена вируса Эбола............................................163

4.9. Оценка возможности использования тест-систем

для экспресс диагностики лихорадки Эбола....................................166

4.10. Непрямой иммунофлуоресцентный анализ

(НМФА) для определения антител к вирусу Эбола.........................170

4.11. НМФА для определения антигена вируса Эбола...................172

4.12. Определение геномной РНК вируса Эбола

в сыворотке экспериментально зараженных приматов

методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот..........173

Глава V. Разработка методов специфической и неспецифической коррекции развития эндогенного

шока при лихорадке Эбола...............................................................175

4

5.1. Разработка и изучение гетерологичных иммуноглобулиновых препаратов для экстренной профилактики и иммунотерапии лихорадки Эбола........................175

5.2. Изучение возможности вакцинопрофилактики

лихорадки Эбола................................................................................191

5.3. Исследование возможности коррекции развития эндогенного шока антивирусными

препаратами и методами экстренной терапии................................204

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................206

ВЫВОДЫ............................................................................................216

Список использованной литературы................................................219

Список используемых сокращений.

АЛАТ - аланинаминотрансфераза АСАТ - аспартатаминотрансфераза АГ - антиген

адВЗ - вирус Эбола, адаптированный к морским свинкам АОЗ - антиоксидантная защита АТ - антитело

БОЕ - бляшкообразующая единица БОЕ-Е - бурстобразующая единица эритроидных предшественников

БСА - бычий сывороточный альбумин ВГЛ - вирусные геморрагические лихорадки ВКЖ - вируссодержащая культуральная жидкость ВОВ - вирус осповакцины

ВОВ\/Р24 - ВОВ со встроенным геном белка \/Р24 ВЭ - вирус Эбола

ГЛЭ - геморрагическая лихорадка Эбола

ДВС - диссеминированное внутрисосудистое свертывание

дВЭ - дикий (исходный) штамм ВЭ

ИК - иммунные комплексы

инВЭ - инактивированный вирус Эбола

ИФА - иммуноферментный анализ

К - отрицательный контрольный реагент

К+ - положительный контрольный реагент

КК - культура клеток

КОЕ-ГМ - колониеобразующие единицы гранулоцитарно-макрофагальных предшественников

КРС - крупного рогатого скота (сыворотка) МДА - малоновый диальдегид мин - минут

мкг - микрограмм МЭТ - меркаптоэтанол

НМФА - непрямой метод флюоресцирующих антител

об/мин - оборотов в минуту

ООВИ - особо опасные вирусные инфекции

ООЕ - оспообразующая единица

ОП - оптическая плотность

Опкрит - оптическая плотность критическая

ОФД - ортофенилендиамин

ОЦК - объем циркулирующей крови

ПА - пролиферативная активность

ПААГ полиакриламидный гель

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

ПДФ - продукты деградации фибрина и фибриногена

ПМЯЛ - полиморфно-ядерные лейкоциты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПТИ - протромбиновый индекс

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ПФС - показатель фагоцитарной способности

РН - реакция нейтрализации

РСК - реакция связывания комплемента

СПЖ - средняя продолжительность жизни

сут - сутки

ФИТЦ - флюоресцеинизотиоцианат натрия ФНО - фактор некроза опухолей ФС - фагоцитарная способность ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор ФСБ-Т - фосфатно-солевой буферный раствор с добавлением твина-20

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

ЦФБ- цитратно-фосфатный буферный раствор

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЭП - этаноловая проба

1дв - иммуноглобулины класса С

БОЗ - додецил сульфат натрия

ТМЕ - трис-НС!, №С1, ЭДТА-буферный раствор

Введение

Актуальность проблемы:

Вирусные геморрагические лихорадки (ВГЛ) вызывают тяжелые заболевания человека и представляют значительную угрозу здоровью населения многих регионов мира. Возбудителями этих заболеваний,

объединенных из-за сходства клинических проявлений в группу

Р

геморагических лихорадок, являются РНК-содержащие вирусы, принадлежащие к 4 различным семействам: Тодаутйае (Р1аумпс1ае), Bunyaviridae, АгепауИс1ае, РПоуИс1ае [Ниддтв и.УУ. е1 а1., 1996]. Представитель последнего, вирус Эбола (ВЭ), еще недавно знакомый только узкому кругу специалистов, сегодня широко известен благодаря средствам массовой информации, остро отреагировавшим на высокую контагиозность и летальность вызываемой им болезни во время эпидемической вспышки в Заире в 1995 году.

Действительно, геморрагическая лихорадка Эбола сравнительно недавно заявившее о себе тяжелое заболевание, входящее в обойму геморрагических лихорадок и характеризующееся высокой (до 88%) летальностью. Этиологический агент лихорадки по морфологическим, генетическим и антигенным признакам отнесен к семейству филовирусов (РПоу!пс!ае), прототипным для которого является ранее изолированный вирус Марбург. Заболевание характеризуется тяжелым течением с развитием геморрагического синдрома, глобальным нарушением деятельности печени, почек и других внутренних органов. Высокая контагиозность осложняет деятельность медицинского персонала. Более того, часть вспышек этого заболевания, имевших место на африканском континенте, начиналась как внутрибольничная инфекция после хирургического вмешательства у больных лихорадкой Эбола с ошибочно поставленным диагнозом.

Вспышки лихорадки Эбола были впервые зарегистрированы на юге Судана и на севере Заира в июне-ноябре 1976 года. Заболевание и вызывающий его вирус получили название по наименованию реки в Заире (Эбола), в районе деревни Ямбуку, где во время вспышки 1976 года был выделен первый штамм возбудителя [Jonhson К.М., et al., 1977]. В последующие годы в центральноафриканском регионе наблюдался ряд спорадических и эпидемических вспышек лихорадки Эбола [Feldmann Н., etal., 1996а].

В 1989, 1992 и 1996 гг имел место завоз эболаподобного вируса в США и Италию с приматами с Филиппин [Centers..., 1989]. Вирус был впервые зарегистрирован во время вспышки геморрагической болезни в карантинном обезьяньем питомнике в г.Рестон (США) в период прохождения карантина группой обезьян, поступившей из Юго-Восточной Азии (Филиппины). Несмотря на то, что возбудитель был высоколетален для обезьян, никто из обслуживающего персонала питомника, контактировавший с больными животными, не заболел, хотя антитела к возбудителю у части персонала были выявлены. Возбудитель получил название вирус Рестон по наименованию места выделения.

В связи с исключительно высоким уровнем летальности лихорадки Эбола, высокой контагиозностью, способностью вызывать тяжелые эпидемии, актуальными задачами, стоящими перед современной медициной, являются создание средств диагностики, специфической профилактики и лечения этого тяжелого вирусного заболевания. В последние годы, в связи с расширением связей с африканскими государствами и повышением миграционных тенденций у населения эта проблема приобретает особое значение. Однако, предпринимавшиеся попытки не дали заметного успеха. Очевидно, что реализация этих задач затруднена слабой

изученностью биологии возбудителя и патогенеза как этой инфекции, так и геморрагических вирусных лихорадок в целом.

Комитет экспертов ВОЗ в своем докладе [Вирусные геморрагические лихорадки, 1986] обозначил необходимыми следующие научные исследования:

а) определить механизм, приводящий к диатезу при каждой из вирусных геморрагических лихорадок;

б) установить роль иммунной системы в патогенезе каждой из этих болезней;

в) определить механизмы ведущие к шоку, почечной недостаточности и неврологическим расстройствам, наблюдаемым при некоторых вирусных геморрагических лихорадках.

Патогенез лихорадки Эбола сложен и затрагивает жизнедеятельность многих органов. Несмотря на многолетнее изучение патогенетических особенностей инфекции, не существует единого мнения о том, что является пусковым механизмом развития столь быстропрогрессирующего заболевания. Авторы соответствующего раздела Fields virology констатируют, что механизм патофизиологических изменений, которые делают филовирусные инфекции столь смертоносными, остаются непонятыми [Peters C.J., et al., 1996]. Ряд авторов считает важнейшим фактором патогенеза массивную вирусную инфекцию клеток важнейших внутренних органов. Другие связывают разрушительность филовирусных инфекций с инфекцией эндотелиальных клеток, что приводит к нарушению проницаемости сосудов и активации факторов свертывания, провоцирующих развитие синдрома

диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром) [Fisher-Hoch S.P., et al., 1985, Verstraete M., 1978]. Проведенные различными авторами исследования показывают также задействованность в патологическом процессе макрофагов, как

9

первичных резервуаров вируса в организме. Поражение этих клеток, секретирующих большое число цитокинов и других медиаторов, возможно приводит к нарушению синтеза этих веществ, что, в свою очередь, меняет цитокиновый фон организма, обусловливая развитие ряда патологических процессов [Feldmann. Н., et al., 1996Ь]. В последнее время становится популярной версия молекулярной мимикрии, провоцирующей иммуносуппрессию [Volchkov V.E., et al., 1992] или аутоиммунную агрессию [Tilson M.D., 1996].

Литературные данные о патофизиологических изменениях при лихорадке Эбола, в том числе экспериментальной, крайне малы, исследования проводили, в основном, на высоковосприимчивых к этому возбудителю приматах с использованием больших заражающих доз [Jaax N.K., et al., 1996, Fisher-Hock S.P., et al., 1992a, Jahrling P.В., et al, 1996a, Johnson E., et al, 1995]. Таким образом механизмы развития патологических изменений при данном заболевании остаются слабо изученными и требуют специальных исследований.

Известно, что некоторые животные (например, кролики) невосприимчивы к ВЭ и при инокулировании в�