Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:НЕЙТРОФИЛЬНЫЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ЛОВУШКИ:МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ, МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

На правах рукописи

САВОЧКИНА Альбина Юрьевна

НЕЙТРОФИЛЬНЫЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ЛОВУШКИ: МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ, МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 С ОЕВ Ш1

Челябинск-2012

005011509

Работа выполнена в научно-исследовательском институте иммунологии и на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант:

член-корреспондент РАМН,

Заслуженный деятель науки РФ, Долгушин Илья Ильич

доктор медицинских наук,

профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ярилин Александр Александрович Смолягин Александр Иванович Аклеев Александр Васильевич

Ведущая организация: Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, г. Екатеринбург

Защита состоится «*$>> февраля 2012 года в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Автореферат разослан <е*^>> января 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Латюшина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Нейтрофильные гранулоциты являются самыми многочисленными из лейкоцитов. Они имеют короткую продолжительность жизни, их количественный гомеостаз в периферической крови постоянно поддерживается притоком из костного мозга. Нейтрофилы играют важную роль в антимикробных реакциях врожденного иммунитета [Nathan С., 2006].

Нейтрофил оснащен богатым набором рецепторов, которые позволяют чутко и дифференцированно реагировать на малейшие изменения окружающей среды [Ковальчук JI.B. и др., 2005; Семенов Б.Ф., Зверев В.В., 2007; Hoffmann J.A. et al., 1999; Hoffmann J.A. et al., 2003]. Подготовленный нейтрофил может оказывать свое действие на объект, вызвавший его активацию, одним из двух способов: во-первых, фагоцитировать и уничтожать его в фаголизосомах, во-вторых, выделять наружу бактерицидные продукты, которые представляют собой содержимое гранул [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001].

Открытие V. Brinkmann и соавт. в 2004 г. нейтрофильных внеклеточных ловушек (HBJ1) и установление их антимикробного эффекта, как важнейшего звена врожденного иммунитета, безусловно, является началом нового этапа в понимании жизненного цикла и функции нейтрофильных гранулоцитов.

Формирование внеклеточных ловушек может осуществляться только активными нейтрофилами. Эффект антимикробных веществ, входящих в состав HBJ1, во внеклеточном пространстве усиливается в структурах HBJ1 [Parseghian М.Н., Luhrs К.А., 2006; Brinkmann V., Zychlinsky А., 2007].

Данные литературы свидетельствуют о том, что новому механизму защиты, осуществляемому нейтрофильными гранулоцитами, уделяется большое внимание [Brinkmann V. et al., 2004; Urban C.F. et al., 2006; Brinkmann V., Zychlinsky A., 2007; Fuchs, T.A. et al., 2007; Steinberg B.E., Grinstein S„ 2007; Neeli I. et al., 2009; Florian H. Pilsczek et al., 2010]. Несмотря на многочисленные исследования в данной области, много вопросов остаются не раскрытыми. До конца не ясны ме-

ханизмы формирования HBJ1, система внутриклеточных взаимодействий при формировании НВЛ, условия внешней и внутренней среды необходимые для образования нейтрофилами внеклеточных ловушек, их эффективность по отношению к различным патогенам,, а также не разработаны доступные и информатированные методы обнаружения НВЛ и их применение в клинической и диагностической практике.

Цель исследования

Изучить механизмы формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек, разработать методы их обнаружения в различных биологических жидкостях в норме и при патологии.

Задачи исследования

1. Сравнить различные способы окраски внеклеточных ловушек, образуемых нейтрофилами, выделенными из периферической крови.

2. Определить оптимальные условия инкубации in vitro для формирования внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови.

3. Изучить влияние различных экзогенных факторов микробной и немикробной природы на процесс образования внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови.

4. Оценить in vitro влияние различных эндогенных факторов (плазма, сыворотка крови, комплемент, специфические иммуноглобулины) на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови.

5. Изучить участие цитоскелета, кальциевых каналов, энергетического обмена и мембраны нейтрофила в процессе образования нейтрофильных внеклеточных ловушек.

6. Разработать метод обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах.

7. Провести сравнительный анализ захвата и киллинга микроорганизмов нейтрофилами в процессе фагоцитоза и образования внеклеточных ловушек, а также определить зависимость эффективности нейтрофильных внеклеточных ловушек от её морфологических характеристик.

8. Оценить информативность предлагаемых методов обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в различных биологических жидкостях в норме и при патологии.

Научная новнзна

В работе определены оптимальные условия инкубирования нейтрофилов для их активации и формирования HBJI in vitro. Установлено, что оптимальное время инкубации составляет 30 минут, а температура - 37°С. Показано, что факторы микробной и немикробной природы: Lactobacterium spp. и Bifidumbacterium spp., Е. coli (штамм М-17), S. aureus, грибы рода Candida, форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА), липополисахарид (ЛПС), пирогенал, вакцина «Солкотриховак», циклоферон, бестим индуцируют образование HBJ1.

Изучено формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами цельной крови, лейкоцитарной взвеси и нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина. Показано, что нейтрофилы цельной крови и лейкоцитарной взвеси в норме не образуют НВЛ не зависимо от концентрации активатора. Определена роль сыворотки, плазмы, комплемента и специфических иммуноглобулинов в формировании внеклеточных ловушек нейтрофилами. Установлено, что аутологичные сыворотка и плазма крови, независимо от присутствия в них специфических иммуноглобулинов и комплемента, оказывают ин-гибирующее действие на внеклеточный выброс ДНК нейтрофилами, выделенными из периферической крови. Комплемент сыворотки морской свинки оказывает стимулирующее дозозависимое действие на секрецию нейтрофильной ДНК. Специфические иммуноглобулины не влияют на формирование НВЛ, в то же время, они усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов.

Определено участие цитоскелета, кальциевых каналов, энергетического обмена и мембраны нейтрофила в процессе формирования НВЛ. Показано, что перечисленные ультраструктуры нейтрофила задействованы в образовании НВЛ.

Разработан способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах. Используя данный способ, впервые изучены морфология и эффективность НВЛ. Установлено, что эффективность НВЛ зависит от ее морфологических характеристик.

Разработаны новые методы определения НВЛ в агарозном геле и на спек-трофатометре.

Впервые проведен сравнительный анализ количества НВЛ в различных биологических жидкостях. Показано, что острый инфекционный процесс стимулирует повышенный выброс нейтрофильной ДНК во внеклеточное пространство.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследования расширяют знания о физиологии нейтрофильных гранулоцитов, их функциональных возможностях, механизмах формирования НВЛ. Разработанный метод изучения образования НВЛ в агарозном геле позволяет моделировать условия существования нейтрофилов в мукозальных секретах.

Полученные данные вносят существенный вклад в понимание роли НВЛ в антимикробных реакциях врожденного иммунитета.

Данные о стимуляции или блокаде образования нейтрофилами внеклеточных ловушек веществами, влияющими на элементы цитоскелета, мембрану нейтрофилов, кальциевые каналы и энергетический обмен, могут быть использованы для поиска новых подходов к фармакологической коррекции защитных реакций, связанных с формированием НВЛ.

Разработанные методы обнаружения НВЛ открывают новые возможности для диагностики различных заболеваний, оценки тяжести течения болезней и эффективности их лечения.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанные методы обнаружения НВЛ в периферической крови и му-козальных секретах могут быть использованы для оценки функционального статуса нейтрофилов и диагностики дефектов врожденного иммунитета.

2. Элементы цитоскелета, кальциевые каналы, энергетический обмен и мембрана нейтрофилов вовлечены в процесс формирования НВЛ.

3. Нейтрофилы чистой фракции, цельной крови и лейкоцитарной взвеси по-разному отвечают образованием НВЛ на стимуляцию различными активаторами. Сыворотка и плазма крови подавляют образование нейтрофи-лами внеклеточных ловушек.

4. Внеклеточный захват и киллинг микроорганизмов, осуществляемый ней-трофильными гранулоцитами, является процессом более эффективным, чем фагоцитоз.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследований внедрены в лабораторную диагностику НИИ иммунологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, в Институт экологии и генетики микроорганизмов УроРАН, г. Пермь и используются в учебном процессе на кафедрах микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на: IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); VIII конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007); национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - междисциплинарные проблемы» (Москва, 2008); объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); конференции, посвященной 10-летию ЮжноУральского научного центра РАМН (Челябинск, 2008); VI Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009); X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009); XIII Всероссийском научном Форуме имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге: Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунокоррекции» (г. Санкт-Петербург, 2009); VII итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2009); И международной научно-практической конференции молодых ученых (Челябинск, 2011); IX Российской конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011).

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 221 страницах текста, иллюстрирована 46 таблицами, 11 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, восьми глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 289 источников, в том числе 112 отечественных и 177 зарубежных.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 34 научных работ, в том числе 26 из перечня изданий, рекомендованных ВАК РФ. Издана монография «Нейтро-фильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов» и

получен патент № 2431836 «Способ выделения нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Для достижения поставленной цели за период с 2007 по 2011 год на базе научно-исследовательского института иммунологии и кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ЧелГМА было проведено обследование 162 практически здоровых женщин. В эту группу вошли здоровые пациентки, возраст которых составил от 18-35 лет. Критериями включения являлись добровольное согласие на обследование, первая фаза менструального цикла и отсутствие приема гормональных препаратов.

В исследование были включены 30 женщин с воспалительными заболеваниями нижнего отдела репродуктивного тракта (острый цервицит, острый вагинит), которые находились на лечении в женской консультации ГКБ № 2 и № 8, а также 13 больных, находившихся в отделении реанимации и интенсивной терапии № 5 ГБУЗ Челябинской областной клинической больницы, с сепсисом, развившимся на фоне гнойной хирургической инфекции. Диагноз выставлялся врачами-специалистами в соответствии с МКБ-10 (1995).

Материалом для исследования нейтрофилов служили периферическая кровь, лейкоцитарная взвесь, чистая фракция нейтрофилов, цервикальная и вагинальная слизь.

Кровь забирали в центрифужную пробирку с 1 мл раствора гепарина (в разведении 10-15 ед. гепарина в 1 мл изотонического раствора хлорида натрия).

Лейкоцитарную взвесь получали из гепаринизированной крови после седиментации эритроцитов, обогащенную лейкоцитами плазму крови (лейкоцитарную взвесь) собирали стерильным наконечником в чистые стерильные пробирки.

Для выделения нейтрофилов 2 мл гепаринизированной крови смешивали с 3 мл стерильного физиологического раствора, полученную смесь наслаивали

на градиент плотности стерильных растворов фиколла-верографина (Pharmacia, Sweden; Spofa, CSSR). Плотность верхнего слоя градиента составляла 1,0751,077, нижнего - 1,093-1,095. Через 40 минут центрифугирования при 1500 об/ мин на границе между градиентами образовывалось кольцо гранулоцитов с чистотой 98-100%, которое отмывали от градиента стерильным физиологическим раствором дважды по 5 минут, после чего клетки доводили до концентрации 5х 106/мл.

Нейтрофилы, выделенные из периферической крови окрашивали с помощью 0,04% раствором акридинового оранжевого. Полученные результаты оценивали в люминесцентном микроскопе, используя при этом фильтры, которые обеспечивают возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длинной волны 520 нм. В суспензии подсчитывали число нейтрофилов с сегментированным ядром, клеток с недифференцированным ядром и нейтрофиль-ных внеклеточных ловушек, которые пересчитывали на 100 клеток. Полученные результаты выражали в процентах.

Инактивацию естественного комплемента проводили путем прогревания плазмы или сыворотки крови на водяной бане при температуре 56°С в течение 30 минут [Мирахмедов У.М., Резникова Л.С., 1975]. Для влияния гетерогенного комплемента использовали сухой комплемент (ФГУП «НПО „Микро-ген"», г. Пермь). Концентрацию препарата подбирали, учитывая нормальные значения активности комплемента в организме человека, в перерасчете на 1 миллилитр клеточной взвеси.

Истощение сыворотки и плазмы по специфическим иммуноглобулинам проводили по методу Маянского А.Н. и соавторов (1982). Для этого использовали кровь лиц с подтвержденным повышенным содержанием антител класса Ig G к С. albicans, которое устанавливалось с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) (Кандида-Ig G-ИФА-БЕСТ, г. Новосибирск-117). К осадку С. albicans (штамм 601) (1х 109клеток/мл) добавляли 0,5 мл свежей сыворотки крови, инкубировали в режиме, исключающем активацию комплемента, при +4°С в течение 30 минут, при этом встряхивая каждые 5 минут [Маянский А.Н. и др.,

и

1982]. Затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут и использовали в опытах как истощенную по специфическим иммуноглобулинам сыворотку, так и опсонизированную С. albicans (штамм 601).

Определенна внеклеточных ловушек, образованных нсйтрофтами, выделенными из периферической крови проводили при инкубации нейтрофилов в физиологическом растворе и с индукторами микробной и немикробной природы. Для активации нейтрофильных гранулоцитов использовали различные концентрации трехкратно отмытой от питательной среды взвеси суточных культур контрольных моноштаммов S. aureus («Cowan 209»), Е. coli (штамм М-17), Lac-tobacterium spp. (препарат "Лактобактерин сухой", фирма "ИмБио", г. Нижний Новгород), Bifidobacterium spp. (препарат "Бифидумбактерин сухой", ЗАО "Экополис", г. Ковров) и С. albicans (штамм 601). По стандарту мутности БАК-10 (ООО "Ормет", г. Екатеринбург) получали концентрацию 1 млрд. микробных тел в 1мл (1х109/мл) [Иммунологические методы..., 1981], затем разводили в 10 и в 100 раз. Таким образом, были получены концентрации бактерий 1х 109/мл, 1х 108/мл и 1х 107/мл. Затем, в зависимости от цели исследования, 1 мл взвеси нейтрофилов, выделенных на двойном градиенте фиколла-верографина и доведенных до концентрации 5х106 клеток/мл, 1 мл цельной гепаринизиро-ванной крови или 1 мл лейковзвеси инкубировали при температуре +37°С в течение 30 минут в присутствии 0,1 мл взвеси микроорганизмов доведенных до определенной концентрации. В качестве активатора немикробного происхождения использовали форбол-миристат ацетат (ФМА) (Fluka, США) в концентрации 7,5 дМ/мл, который относится к группе форболовых эфиров. Для контроля 1 мл взвеси нейтрофилов, выделенных на двойном градиенте фиколла-верографина и доведенных до концентрации 5х10б клеток/мл, 1 мл цельной ге-паринизированной крови или 1 мл лейковзвеси инкубировали в присутствии физиологического раствора, в тех же условиях.

Кроме культур микроорганизмов для эксперементального исследования использовали лекарственные средства: Циклоферон (ООО «НТФФ «ПОЛИ-САН»», г. Санкт-Петербург, Россия), Пирогенал (Филиал «Медгамал» ГУ

НИИЭМ им. Н.ФГамалеи РАМН, г. Москва, Россия), Солкотриховак (Valeant Parmaceuticals Switzerland GmbH, Швейцария), и Бестим (ФГУП ГосНИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА, г. Санкт-Петербург, Россия). Данные препараты использовали в концентрациях, соответствующих разовой терапевтической дозе для человека [Каркищенко Н.Н. и др., 2001], в перерасчете на 1 мл взвеси нейтрофилов, выделенных на двойном градиенте фиколла-верографина.

Оптимальный режим инкубации определяли следующим образом: ней-трофилы, выделенные из периферической крови, активировали взвесью грибов рода Candida albicans (штамм 601), в концентрации 1х108/мл или активатором немикробного происхождения ФМА (Fluka, США) в концентрации 7,5 цМ/мл, при различных температурных режимах: 4°С, 22°С, 37°С и 56°С, в течении 10 мин, 20 мин, 30 мин, 40 мин, и 60 мин. Материал наносили на предметное стекло, высушивали, фиксировали 96 % этиловым спиртом и окрашивали 0,04% раствором акридинового оранжевого.

Для определения участия цитоскелета, кальциевых канатов, энергетического обмена и мембран нейтрофилов в процессе формирования ими внеклеточных ловушек использовали следующие препараты: цитохалазин и колхицин - блокаторы цитоскелета; верапамил - блокатор кальциевых каналов; цикло-гексидин - блокатор синтеза белка; преднизалон - мембраностабилизирующий препарат. Для этого нейтрофилы, выделенные из периферической крови, активировали взвесью ЛПС и добавляли перечисленные препараты: цитохалазин или колхицин («Sigma» США), в концентрации 1 мкг/мл, циклогексимид («Ар-pliChem», Германия), в концентрации 16 мкг/мл [Махрова, Т.В., 2004; Свиридов М.А., 2008], верапамил (Верофарм, г. Белгород, Россия) и преднизолон (Нико-мед, Австрия) в концентрации, соответствующей средней терапевтической дозе [Каркищенко Н.Н. и др., 2001]. При этом использовали несколько контролей: К1 - нейтрофилы инкубированные в присутствии физиологического раствора; К2 - нейтрофилы, активированные ЛПС. Все пробирки инкубировали в одинаковых условиях - при 37°С в течение 30 минут. Материал наносили на пред-

метное стекло, высушивали, фиксировали 96 % этиловым спиртом и окрашивали 0,04 % раствором акридинового оранжевого.

Для определения внеклеточных ловушек в мукозальиых секретах исследовали цервикальную и вагинальную слизь. Забор осуществляли с помощью специальной градуированной пипетки. Полученный секрет в количестве 0,1 мл вносили в 0,9 мл физиологического раствора, а затем полученную суспензию в количестве 0,1 мл смешивали с 0,1 мл сложного красителя, который готовили ex temporo в отдельной пробирке: 1 мл синьки Эванса в концентрации 1:8000 (окрашивает слизь и живые клетки в оранжевый цвет) смешивали с 1 мл красителя Sytox Green в концентрации 1:500 (окрашивает мертвые клетки и внеклеточную ДНК в зеленый цвет), инкубировали в течение 5 минут в темноте. Из окрашенного, нативного материала готовили препарат «раздавленная капля». Учет проводили с помощью люминесцентного микроскопа, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм. При таком способе можно провести количественную оценку жизнеспособности нейтрофилов - погибшие клетки и внеклеточная ДНК окрашиваются в зеленый цвет за счет Sytox Green, а живые клетки и слизь окрашиваются в оранжевый цвет синькой Эванса. Нейтрофилы разделили на 4 группы:

1 группа объединяет жизнеспособные клетки оранжевого цвета;

2 группа включает клетки с зеленым ядром и ярко-оранжевой цитоплазмой (по-видимому, подвергшиеся апоптозу);

3 группа объединяет погибшие клетки зеленого цвета;

4 группа включает в себя свободнолежащие ярко-зеленые волокна, представляющие собой нити ДНК нейтрофила (нейтрофильные ловушки).

Данный способ окраски также позволяет оценить такие показатели, как активность и интенсивность поглощения микроорганизмов неизмененными нейтрофилами, а также показатели захвата микроорганизмов в нейтрофильные ловушки. С этой целью предложено рассчитывать следующие показатели.

Активность фагоцитоза - процент сегментированных нейтрофилов содержащих микроорганизмы в цитоплазме из 100 подсчитанных гранулоцитов.

Активность HBJI - процент нейтрофильных внеклеточных ловушек, захвативших микроорганизмы, из 100 подсчитанных сетеподобных структур.

Фагоцитарное число - среднее количество микроорганизмов, захваченных одним активным неизмененным нейтрофильным гранулоцитом.

Индекс HBJI - среднее количество микроорганизмов, захваченных одной эффективной нейтрофильной внеклеточной ловушкой.

Отличительной особенностью предлагаемого нами метода окраски является возможность определения жизнеспособности не только нейтрофильных гранулоцитов, но и микроорганизмов - активаторов.

При изучении препаратов, активированных различными микроорганизмами и окрашенных данным методом, мы обратили внимание, что не только нейтрофилы имеют разную окраску, но и микроорганизмы: погибшие микроорганизмы окрашиваются в зеленый цвет, а живые микроорганизмы - в ярко-оранжевый цвет за счет избирательного действия Sytox Green и фонового окрашивания синькой Эванса.

Для оценки эффективности и морфологии внеклеточных ловушек нейтрофилы, выделенные из периферической крови, активировали взвесью Candida albicans (штамм 601), затем окрашивали сложным красителем (Sytox Green и синька Эванса) и учитывали жизнеспособность захваченных микроорганизмов в люминесцентном микроскопе. При предложенном нами способе окраски убитые микроорганизмы окрашивались в зеленый цвет, а микроорганизмы, сохранившие свою жизнеспособность - в оранжевый. Мы считали общее число микроорганизмов и среди них - количество живых и количество убитых микроорганизмов. Основываясь на полученных данных, рассчитывали процент эффективности HBJI.

Для определения нейтрофильных внеклеточных ловушек в агарозном геле готовили стекла специальным способом: для этого на обезжиренное стекло наносили 1% раствор нормального агара высокой температуры плавления и низ-

кой температуры плавления. Выделенную на двойном градиенте чистую фракцию нейтрофилов инкубировали при температуре 37°С в течение 30 минут в присутствии активаторов. Препарат помещали на 10 минут на лед, затем в стерильный раствор Хенкса при температуре 37°С на 30 минут. Далее стекла сушили, фиксировали и окрашивали используя флюоресцентный краситель Sytox Green, который наносили на фиксированный препарат. Учет проводили с помощью люминесцентного микроскопа.

Для определения иейтрофильных внеклеточных ловушек на спектрофотометре был использован модифицированный метод Шмидта - Трангаузера для количественного определения ДНК. Количество ДНК перерасчитывают по формуле:

ДНК (мкг/мл) = (Е 270 - Е 29о) / 0,19 х 10,1 = (Е 270 - Е 290) х 53, 158 Статистические методы полученных данных проводили с использованием пакета прикладных компьютерных программ SPSS - 13.0.

Полученные данные были обработаны методами дескриптивной статистики и представлены в виде средней арифметической и её стандартной ошибки (М±т). О достоверности межгрупповых различий судили с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни, Вальда-Вольфовица и Колмогорова-Смирнова. Проверка статистических гипотез осуществлялась при критическом уровне значимости Р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ На первом этапе исследования была отработана методика определения внеклеточных ловушек, образованных нейтрофилами, выделенными из периферической крови. Для этого был проведен сравнительный анализ различных способов окраски нейтрофилов чистой фракции для определения HBJ1. Были изучены фиксированные и нативные препараты чистой фракции нейтрофильных гранулоцитов, которые предварительно инкубировали в физиологическом растворе или с добавлением индуктора, затем окрашивали различными красителями: акридиновым оранжевым, Sytox Green, по Романовскому - Гимзе и проводили подсчет, учитывая

все морфологические формы нейтрофилов: нейтрофилы с неизмененной морфологией, нейтрофилы с недифферинцированным ядром и НВЛ (табл. 1).

Таблица 1

Процентное содержание различных морфологических форм нейтрофилов при выбранных способах окраски

Способ окраски, вид микроскопии Морфологические формы нейтрофилов (%)

Нейтрофилы с сегментированным ядром Нейтрофилы с недифференцированным ядром Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Акридиновый оранжевый, фиксированный препарат, люминесцентный микроскоп, п = 25 69,7 ± 1,31 23,2 ± 1,02 7,1 ±0,46

Sytox Green, фиксированный препарат, люминесцентный микроскоп, п = 20 68,7 ± 1,21 23,6 ± 1,19 7,6 ± 0,62

Романовский-Гимзе, фиксированный препарат, световой микроскоп, п = 20 70,5 ± 1,14 22,8 ± 1,2 7,4 ± 0,48

Акридиновый оранжевый, нативный препарат, люминесцентный микроскоп, п = 25 67,4 ± 1,31 24,7 ± 1,18 7,8 ±0,28

Анализ полученных данных показал, что для нейтрофилов чистой фракции все описанные методы окраски могут быть использованы для определения НВЛ.

После отработки методов окрашивания НВЛ в чистой фракции нейтрофилов, были проведены исследования с целью определения оптимальных условий культивирования нейтрофилов для выявления НВЛ. Для этого оценивали влияние температуры, длительности культивирования и различных индукторов на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами (табл. 2, 3,4).

Содержание внеклеточных ловушек, образованных нентрофиламн, выделенными из периферической кровн при различном температурном

режиме, (п = 15)

Группы Температура, °С

4 22 37 56

Нейтрофилы + физ. раствор 2,05±1,12 7,20±0,90* 8,70±0,83* 28,00±2,8*'**'*"*

Нейтрофилы + ФМА 5,60±0,78 13,7±1,6* 22,20±0,90*'" 27,40±0,80*'"*'*"

Нейтрофилы + Candida albicans (штамм 601) 7,40±1,02 9,10±0,81 25,00±1,02*'**

Примечание: р < 0,05, * - отличие 4°С от 22°С, 37°С, 56°С; ** - отличие 22°С от 37°С, 56°С;***-отличие 37°С, 56°С.

Таблица 3

Содержание внеклеточных ловушек, образованных нейтрофилами, выделенными из периферическом крови в зависимости от времени инкубации, (п = 15)

Группы В земя инкубации, минуты

10 20 30 40 60

Нейтрофилы + физ. раствор 3,2±0,5 4,9±0,35 8,6±0,9*'" 5,8±0,4*'*"/#

Нейтрофилы + ФМА 5,6±0,7 15,3±1,3* 22,4±2,0*'" 17,0±1,4 V *

Нейтрофилы + Candida albicans (штамм 601) 5,4±0,4 17,2±0,8 25,0±1,0*'" 26,8±1Д*'" 18,0±1,0*' *т

Примечание: р < 0,05; * — отличие 10 мин. от 20 мин., 30 мин., 40 мин., 60 мин.; ** - отличие 20 мин. от 30 мин., 40 мин., 60 мин.; *** - отличие 30 мин. от 40 мин. 60 мин.; # - отличие 40 мин. от 60 мин.

При анализе полученных данных было установлено, что процесс формирования НВЛ является температурозависимым. В диапазоне от 4 до 56°С через 30 минут инкубации регистрируется закономерное увеличение частоты НВЛ в зависимости от повышения температуры. Минимальный выброс хроматина регистрируется при температуре 4° С. Наибольшее количество внеклеточных ловушек, образованных нейтрофилами, было обнаружено при инкубации их в физиологическом растворе и с выбранными индукторами при температуре 56°С. Достоверные отличия данного показателя, установлены при температуре 37°С.

Помимо температуры на образование внеклеточных ловушек влияет время инкубации нейтрофилов с индуктором. Нами были выбраны следующие временные интервалы - 10 мин, 20 мин, 30 мин, 40 мин, 60 мин (табл. 3).

При анализе полученных данных установлено, что максимальное число НВЛ образуется через 30 и 40 мин., независимо от индуктора. При более длительной инкубации (60 мин.) число НВЛ значимо снижалось в сравнении со сроком инкубации 30 и 40 мин. Вероятно, это связано с разрушением НВЛ под действием ферментов, содержащихся в гранулах нейтрофилов.

Для того чтобы оценить влияние бактерий на формирование НВЛ были использованы культуры бактерий, обычно заселяющие слизистые оболочки человека непатогенные - Lactobacterium spp. и Bifidumbacterium spp., условно-патогенные грам-отрицательные - Е. coli (штамм М-17), грам-положительные -S. aureus и грибы рода Candida. В качестве активатора немикробного происхождения - форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА). Помимо этого было оценено влияние на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами чистой фракции различных лекарственных средств, обладающих иммуномодулирующими свойствами (пирогенал, вакцина «Солкотриховак», циклоферон, бестим).

Полученные результаты представлены в табл. 4.

Анализ результатов показал, что все выбранные нами индукторы активируют нейтрофилы и индуцируют экструзию ДНК во внеклеточное пространство. Наиболее сильным из всех выбранных нами активаторов является Candida albicans (штамм 601).

Сравнительный анализ процентного содержания различных морфологических форм нейтрофилов, выделенных из периферической крови, при активации их различными индукторами, (п = 15)

Группы Морфологические формы нейтрофилов, (%)

Нейтрофилы с сегментированным ядром Нейтрофилы с недифференцированным ядром Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Нейтрофнлы + физ. раствор 73,6 ± 0,93 20,0 ± 0,89 6,4 ± 0,68

Нейтрофнлы + Е. coli (штамм М-17) 67,6 ± 1,72* 17,6 ± 1,3* 14,8 ± 1,2*

Нейтрофнлы + Lac-tobacterium SPP- 62,8 ± 2,24* 20,8 ± 1,7 16,4 ± 1,7*

Нейтрофнлы + Bifidobacterium spp. 65,9 ±0,94* 19,2 ±0,55 14,9 ±0,62*

Нейтрофнлы + S. aureus (штамм 209) 68,1 ± 1,12* 18,40 ±0,77* 13,4 ±0,72*

Нейтрофнлы + Candida albicans (штамм 601) 57,1 ± 1,2* 17,90 ± 0,92* 25,00±1,02*

Нейтрофнлы + ФМА J 58,1 ± 1,4* 19,60 ±0,76 22,2 ± 1,9*

Нейтрофнлы + Пиро-генал 54,4 ±1,9* 21,1 ±0,90 24,5 ± 1,66

Нейтрофнлы + вакцина «С олкотрнхо-вак» 50,6±1,8* 26,2±1,9* 23,3±1,4*

Нейтрофнлы + Цнк-лоферон 51,0 ±1,73* 26,1 ± 1,4* 22,5 ± 1,7*

Нейтрофнлы + Бес-тим 60,2 ± 1,39* 18,60 ±0,74 21,20± 1,82*

Примечание: р < 0,05; * - отличие контроля от выбранных индукторов.

Вероятно, это связано с особенностями строения клеточной стенки грибов, основой которой являются микрофибриллы, построенные из полисахаридов, главными из которых являются глюканы, маннаны и хитин [Маянский А.Н., 2006]. На поверхности нейтрофилов существует большое количество разнообразных рецепторов, в том числе манозные к мананам, дектин-1, лектин-подобный рецептор - для Р-глкжанов [Bianchi М. et al., 2009; Yost С.С. et al., 2009].

Влияние цитохалазина, колхицина, верапамила, циклогексимида н предшполона на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови, (п = 15)

Группы Морфологические формы нейтрофилов, %

Нейтрофилы с сегментированным ядром Нейтрофилы с недифференцированным ядром Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Контроль К1 Нейтрофилы +физ. раствор 64,33 ± 0,75 27,83 ± 1,01 7,67 ± 0,57

К2 Нейтрофилы + ЛПС 48,80±5,75** 23,40±3,34** 27,80±5,93**

Нейтрофилы + ЛПС + ЦХ 77,20±4,91* 17,20±5,01* 5,40±2,52*

Нейтрофилы + ЛПС+ колхицин 75,60±5,41* 19,80±5,42* 4,6±1,08*

Опыт Нейтрофилы + ЛПС + верапамил 84,20±5,88* 13,40±4,40* 2,40±1,60*

Нейтрофилы + ЛПС + ЦГ 71,40±9,78* 15,40±3,80* 13,20±6,22*

Нейтрофилы + ЛПС + преднизолон 86,00±4,34* 11,00±2,83* 3,00±1,79*

Примечание: р < 0,05; * - отличие опыта от Kl, К2; ** - отличие К1 от К2.

Для более полного понимания механизмов формирования HBJI было изучено участие цитоскелета, кальциевых каналов, синтеза белка и мембран в данном процессе. Изменение формы клеток почти всегда предполагает участие цитоскелета. Функции нейтрофилов, такие как адгезия, миграция, фагоцитоз, невозможны без участия актинового цитоскелета [Yan М et al., 2007]. Микротрубочки играют важную роль в транспорте клеточных органелл, включая лизосо-мы и гранулы, слиянии органелл с мембранами [Tapper Н et al., 2002]. В связи с этим, представляло интерес определить роль цитоскелета в процессе формиро-

вания HBJI. Для этого нейтрофилы, выделенные из периферической крови, инкубировали с цитохалазином (ЦХ), являющимся ингибитором актиновых фи-ламентов или колхицином, который связывается с внутриклеточным белком тубулином в нейтрофилах, нарушая образование и функции микротрубочек. Для определения участия кальциевых каналов в процессе формирования HBJI использовали верапамил - блокатор кальциевых каналов. Чтобы оценить роль энергетических процессов в формировании НВЛ использовали циклогексимид (ЦГ) - блокатор синтеза белка [Махрова Т.В., 2004; Свиридов М.А., 2008], а для выявления участия мембран в процессе формирования НВЛ использовали преднизолон, который обладает стабилизирующим действием на мембраны [Kawasaki S. et al., 1998; Wallwork В. et al., 2002] (табл. 5).

Установлено, что данные вещества блокируют формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови. На основании этого можно заключить, что микротрубочки, кальциевые каналы, энергетические процессы и мембрана участвуют в процессе формирования НВЛ.

Механизм образования НВЛ до сих пор остается неясным, неизвестно когда происходят изменения цитоскелета при формировании НВЛ, каких внутриклеточных сигналов требует гистоновая деиминация приводящая к изменениям цитоскелета [Neeli I. et al., 2009]. Можно предположить, что функция актиновых сетей в клетке может заключаться в том, чтобы выталкивать собственный хроматин через бреши в цитоплазматической мембране для формирования НВЛ.

Блокада кальциевых каналов приводит к снижению уровня внутриклеточного кальция, что, в свою очередь, нарушает процесс цитруллирования [Cuthbert G.L. et al., 2004; Proost P. et al., 2008; Remijsen Q. et al., 2011], за счет ингибирование PAD4, активация которого невозможна без участия кальция [Asaga H. et al., 2001; Suzuki A. et al., 2004; Chang X. et al., 2005; Mastronardi F.G. et al., 2006; Anzilotti C. et al., 2010]. Необходимо отметить, что гистоновая цитруллинация является необходимым, но не единственным условием для формирования НВЛ [Neeli I. et al., 2008; Wang Y. et al., 2009].

Установлено, что преднизалон блокирует образование внеклеточных ловушек нейтрофилами. По-видимому, мембраностабилизирующее действие преднизолона на нейтрофил делает его невосприимчивым к внешним сигналам, а процесс формирования HBJI может реализовываться только активными ней-трофильными гранулоцитами [Brinkmann V. et al., 2004].

На основании полученных нами результатов и имеющихся на сегодняшний день данных литературы [Brinkmann V. et al., 2004; Neeli I. et al., 2008; Wang Y. et al., 2009; Remijsen Q. et al., 2011] возможный механизм образования HBJI может выглядеть следующим образом.

Процесс формирования НВЛ начинается с активации нейтрофила. Индукторы, в часности - трипептид формилметионил-лейцил-фенил-аланин (ФМЛФ), запускает НАФД-оксидазу, которая является клеточным мембрано-связанным мультимолекулярным ферментным комплексом, локализующимся на плазматической мембране и в некоторых органеллах. В тоже время, происходит активация протеинкиназы С (РКС), которая участвует в передаче широкого набора внешних сигналов. Это способствует образованию активных форм кислорода (АФК), которые, в свою очередь, индуцируют нейтрофильную эластазу и пеп-тидил-аргинин-деиминазу - 4 (РАД-4), являющихся необходимыми для реализации цитруллинации, приводящей к деконденсации хроматина.

При индукции нейтрофилов активируется также другая сигнальная система - фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K) / серин-треонин киназа (АКТ) / серии треониновая протеинкиназа, мишень для рапамицина (mTOR), отвечающая за синтез белка, функцию микротрубочек и аутофагию, которые участвуют в дезинтеграции и разрыве мембраны.

Все перечисленные звенья занимают очень важное место в процессе формирования внеклеточных ловушек нейтрофилами и нарушение одного из этих звеньев блокирует образование НВЛ.

Нейтрофильные гранулоциты, содержащиеся в крови, тканях и на поверхности слизистых оболочек могут обладать не одинаковыми свойствами и отвечать по-разному на действие различных индукторов. Изначально была и с-

следована способность образовывать ловушки у нейтрофилов цельной крови без предварительного их выделения на градиенте плотности фиколла-верографина (табл. б).

Установлено, что нейтрофилы, содержащиеся в цельной крови, не образуют НВЛ после активации их всеми исследуемыми индукторами. Было предположено, что при работе с цельной кровью концентрация микроорганизмов (1х108клеток/мл), которая обычно используется для активации клеток, предварительно выделенных из периферической крови, могла быть недостаточной для индукции нейтрофилов, содержащихся в цельной крови.

Таблица б

Оценка формирования внеклеточных ловушек нентрофнлами цельной крови, при активации их различными микроорганизмами, (п = 15)

Группы Морфологические формы нейтрофилов, %

Нейтрофилы с сегментированным ядром Нейтрофилы с недифференцированным ядром Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Цельная кровь + физ. раствор 85,2±1,38 8,68±0,83 5,9±1,02

Цельная кровь + Е. coli (штамм М-17) 84,49±1,6 9,02±0,81 6,38±0,7

Цельная кровь + Lactobacterium spp. 83,8±1,41 8,8±0,92 7,51 ±1,43

Цельная кровь + Bifidobacterium spp 83,92±0,9 9,42±0,6 7,2±0,63

Цельная кровь + S. aureus (штамм 209) 85,2±1,6 8,8±0,7 6,0±1,12

Цельная кровь + С. albicans (штамм 601) 82,1±1,32 9,03±0,84 6,51±0,72

В связи с этим была изучена зависимость «доза-эффект», где в качестве активатора использовали С. albicans в концентрациях: 1х107/мл, 1х108/мл и 1х 109/мл (табл. 7).

Установлено, что при увеличении количество микроорганизмов число ловушек, образующихся нейтрофилами цельной гепаринизированной крови, было таким же низким, как у неактивированных нейтрофилов и достоверно не отли-

чалось ни в одной пробе, независимо от концентрации С. albicans. На основании полученных данных, можно сделать вывод, что нейтрофилы цельной крови в норме не образуют внеклеточные ловушки.

Таблица 7

Оценка формирования внеклеточных ловушек нейтрофилами цельной крови, при активации их С. albicans в различных концентрациях,

(п = 15)

Группы Морфологические формы нейт рофилов, %

Нейтрофилы с сегментированным ядром Нейтрофилы с недифференцированным ядром Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Цельная кровь + физ. раствор 85,2±1,38 8,68±0,83 5,9±1,02

Цельная кровь + С.albicans, 1х107/мл 82,2±0,9 10,9±0,48 6,9±0,61

Цельная кровь + С.albicans, 1х108/мл 82,1±1,32 9,03±0,84 6,51 ±0,72

Цельная кровь + C.albicans, 1х109/мл 85,0±1,72 9,1 ±0,93 5,9±0,69

Учитывая результаты нашего исследования, было высказано предположение, что в цельной крови содержатся факторы, ингибирующие образование НВЛ. Для конкретизации факторов, содержащихся в цельной крови, ингиби-рующих формирование НВЛ, было проведено несколько серий экспериментов. Для исключения влияния на этот процесс эритроцитов, были проведены исследования с лейкоцитарной взвесью (табл. 8).

Установлено, что седиментация эритроцитов не влияет на образование НВЛ. Следовательно, ингибирующие факторы крови имеют гуморальную природу.

Оценка формирования внеклеточных ловушек нейтрофилами лейкоцитарной взвеси, при активации их С. albicans в различных концентрациях, (п = 15)

Группы Морфологические формы нейтрофилов, %

Нейтрофилы с сегментированным ядром Нейтрофилы с недифференцированным ядром Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Лейкоцитарная взвесь + физ. раствор 82,4±0,91 11,8±0,89 5,8±0,48

Лейкоцитарная взвесь + С.albicans, 1х107/мл 81,8±1,29 12,09±1,22 6,2±0,73

Лейкоцитарная взвесь + С.albicans, 1х108/мл. 82,1±1,44 11,7±1,61 6,2±0,64

Лейкоцитарная взвесь + С.albicans, 1х109/мл 81,9±1,76 11,8±1,71 6,3±0,6б

Учитывая важную роль комплемента и иммуноглобулинов в регуляции фагоцитирующей функции нейтрофилов [Азов H.A., Маянский А.Н., 1985; Гомберг М.А. и др., 2000; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Hussain L.F. et al., 1995; Reid M.F., 1995], важно было оценить влияние сыворотки, плазмы крови, а также комплемента и специфических иммуноглобулинов на формирование нейтрофилами внеклеточных ловушек (табл. 9).

Установлено, что аутологичные сыворотка и плазма крови in vitro оказывают стабилизирующее действие на нейтрофилы и способны блокировать формирование ими внеклеточных ловушек, даже при добавлении индуктора. Ауто-логичный комплемент не оказывает существенного влияния на процесс формирования НВЛ. Аутологичная сыворотка и плазма крови, независимо от присутствия в них специфических иммуноглобулинов, блокируют секрецию ДНК во внеклеточное пространство нейтрофилами, выделенными из периферической крови.

Оценка влияния аутологичных сыворотки, плазмы крови, комплемента и

специфических иммуноглобулинов на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови, (п = 15)

Морфологические формы исйтпосЬнлпп. %

Группы Нейтрофилы с сегментированным ядром Нейтрофилы с недифференцированным ядром Нейтрофильные внеклеточные ло-

Контроль К1 Нейтрофилы +физ. раствор 61,9± 1,31 24,81 ± 1,19 7,2 ±0,18

К2 Нейтрофилы + С, albicans 51,7 ± 1,72 24,08 ± 1,31 26,29 ± 1,41

КЗ Нейтрофилы + сыворотка крови 70,08 ± 0,69 22,71 ±0,76 7,21 ±0,89

К4 Нейтрофилы +плазма крови 76,01 ± 1,25 16,02 ±0,71 7,82 ±0,81

Опыт Нейтрофилы + С. albicans + сыворотка крови 68,07 ± 0,91** 24,20 ± 1,12 6,8 ± 0,42**

Нейтрофилы + С. albicans + плазма крови 72,04 ± 1,93** 22,06 ± 1,58# 5,91 ±0,77**

Нейтрофилы + С. albicans + сыворотка крови, прогретая при56°С 67,01 ± 1,44** 25,23 ±0,81 7,78 ± 0,68**

Неитрофилы + С. albicans + плазма крови, прогретая при 56°С 74,47 ±0,47** 21,02 ±0,68# 4,57 ±0,37**

Нейтрофилы + С. albicans + сыворотка крови, истощенная по специфЛ^а 69,2 ± 1,38** 24,01 ±0,78 (К4*) 6,9 ±0,81**

Нейтрофилы + С. albicans + плазма крови, истощенная по cnemnJUgG 65,7 ±2,49** 27,00 ± 2,41# 7,3 ±0,71**

Примечание: р < 0,05; * -от КЗ; # - отличие опыта от К4.

отличие опыта от KI ; »* - отличие опыта от К2; *** - отличие опыта

Гетерологичный комплемент усиливает выброс нейтрофильной ДНК во внеклеточное пространство, декомплементация сыворотки морской свинки приводит к ослаблению этого действия (табл. 10).

Таблица 10

Оценка формирования внеклеточных ловушек нейтрофнламн, выделенными из периферической крови, при влиянии гетерогенного комплемента, (п = 15)

Группы Морфологические формы нейтрофилов, (%) Опыт Контроль

Нейтрофилы + комплемент, прогретый при 56°С Нейтрофилы + физ. раствор Нейтрофилы + комплемент 400 МЕ/мл

Нейтрофилы с сегментированным ядром 42,1 ± 1,21* 61,9± 1,31 6,4 ±0,91**

Нейтрофилы с недифференцированным ядром 29,3 ± 1,49* 24,81 ± 1,19 19,5 ±1,68**

Нейтрофильные внеклеточные ловушки 28,6 ± 1,58* 7,2 ±0,18 74,1 ± 1,87**

Примечание: р < 0,05; * - отличие опыта от контроля; ** - отличие контролен между собой.

Это позволяет предполагать, что усиливающий эффект сыворотки морской свинки в этих опытах может быть связан не только с действием белков системы комплемента, но и с эффектом любого гетерогенного белка.

При проведении сравнительного анализа способности нейтрофильных гранулоцитов к фагоцитозу С. albicans (штамм 601) - контрольного образца и С. albicans (штамм 601), предварительно опсонизированной специфическими IgG (табл. II), установлено, что контрольный образец С. albicans (штамм 601) и оп-сонизированная Candida albicans (штамм 601) по-разному фагоцитируются ней-трофилами. В пробах с опсонизированной Candida albicans (штамм 601) было отмечено значительное увеличение всех показателей фагоцитарной функции нейтрофилов. Таким образом, специфические иммуноглобулины не обладают

опсоническим действием на формирование НВЛ, в то же время, очевидно стимулирующее влияние опсонинов на фагоцитарную активность нейтрофилов.

Таблица 11

Оценка влияния опсонизированной С. albicans и контрольного образца С. albicans (штамм 601) на способность к фагоцитозу нейтрофилов, выделенных из периферической крови, (п = 15)

Показатели фагоцитоза Вид микроорганизма

Контрольный образец С. albicans Опсонизированная С. albicans

Активность фагоцитоза (%) 46,05 ± 0,98 75,91± 2,76*

Интенсивность фагоцитоза (У.е.) 0,98 ± 0,06 4,18 ± 0,24*

Фагоцитарное число (У.е.) 2,22 ± 0,08 5,58 ± 0,21*

Примечание: р < 0,05; * - отличие контрольный от опсонизированного образца Candida albicans (штамм 601).

По-видимому, присутствие в крови ингибиторов образования НВЛ имеет огромный биологический смысл - образование нейтрофильных внеклеточных ловушек не должно происходить в кровяном русле, поскольку может привести к окклюзии мелких сосудов хлопьями ДНК. Это не противоречит данным других исследователей, которые не регистрировали повышение формирования НВЛ в печеночных синусах, за исключением случая выраженной эндотоксемии [Clark S.R. et al., 2007].

Нейтрофилы из периферической крови мигрируют в ткани и в секреты слизистых оболочек, где и осуществляют свои основные функции. Образование НВЛ - это механизм защиты, работающий в тканях и на поверхности слизистых оболочек. Скорее всего, формирование внеклеточных ловушек является одним из важных механизмов участия нейтрофила в противоинфекционной защите именно слизистых оболочек [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001].

На сегодняшний день не разработаны методы определения НВЛ в муко-зальных секретах. Технические приемы, используемые для детекции ловушек, образованных нейтрофилами крови не могут быть применены при работе с сек-

ретами слизистых оболочек. Главное препятствие заключается в том, что существующие методы не позволяют дифференцировать нейтрофильную ДНК от слизи.

В связи с вышеизложенным, возникла необходимость разработки метода обнаружения НВЛ в секретах слизистых оболочек. Сущность предлагаемого нами способа окраски заключается в одновременном использовании двух красителей: селективного красителя Sytox Green [Invitrogen, США] для окрашивания внеклеточных волокон ДНК и ядер погибших клеток и синьки Эванса для фонового окрашивания нативного препарата (живые клетки и слизь). При этом можно провести количественную оценку жизнеспособности нейтрофилов, так как при данном способе клетки окрашиваются дифференцированно - погибшие клетки и внеклеточная ДНК - в зеленый цвет за счет Sytox Green, а живые клетки и слизь - в оранжевый цвет синькой Эванса.

Разработанный нами метод окраски позволяет оценить все морфологические формы нейтрофильных гранулоцитов, идентифицировать НВЛ от слизи, которая присутствует в мукозальных секретах, а также определить не только количество захваченных микроорганизмов неизмененными нейтрофилами и НВЛ, но и эффективность их киллинга.

Установлено, что активность НВЛ достоверно выше активности фагоцитоза, а среднее количество микроорганизмов, попавших в нейтрофильную внеклеточную ловушку, значительно превышает количество микробов, захваченных активным нейтрофилом с неизмененной морфологией. При оценке жизнеспособности С. albicans (штамм 601), захваченных нейтрофильными грануло-цитами и НВЛ, установлено, что внеклеточный киллинг микроорганизмов значительно выше, чем фагоцитоз.

Таким образом, разработанный метод расширяет возможности изучения функционального статуса нейтрофильных гранулоцитов, как одного из главных звеньев врожденного иммунитета, и позволяет сравнить эффективность внутриклеточного и внеклеточного механизма уничтожения патогенов нейтрофилами.

В ходе нашего исследования по изучению НВЛ были использованы микроскопические методы их обнаружения. Наше внимание привлек тот факт, что НВЛ могут иметь различную морфологию. Представляло интерес исследовать взаимосвязь между эффективностью НВЛ и ее морфологическими характеристиками. Для уточнения этого вопроса при оценке морфологии НВЛ с помощью программы Видеотест - Морфология 5.1. (г. Санкт-Петербург), учитывали следующие параметры: площадь, периметр, длину, ширину, средний размер, оптическую плотность, изрезанность, а также определяли эффективность НВЛ. Основываясь на этих данных, был рассчитан «средний» процент эффективности НВЛ, т.е. показатель, характеризующий способность НВЛ инактивировать С. albicans, который составил 68,94%. Условно мы разделили НВЛ на высокоэффективные, в которых погибало более 70% из захваченных микроорганизмов, и менее эффективные, которые инактивировали меньше 70% от общего числа поглощенных С. albicans. На основании проведенных исследований была установлена зависимость эффективности ловушек от морфологических показателей НВЛ (табл. 12).

Таблица 12

Сравнительный анализ морфологических показателей нейтрофильной внеклеточной ловушки, в зависимости от ее эффективности

Показатели Нейтрофильные внеклеточные ловушки

Высокоэффективные НВЛ (п= 130) Менее эффективные НВЛ (п = 70)

Площадь, цш*цш 136,42±18,86 140,65±27,51

Периметр, цт 58,35±3,26 100,41±6,77*

Длина, цт 18,85±1,15 29,98±2,14*

Ширина, цт 13,00±0,88 13,35±2,12

Средний размер, цт 15,93 ±0,82 21,67±1,01*

Оптическая плотность, у.е. 0,42±0,06* 0,27±0,01

Изрезанность, у.е. 0,13±0,02 0,27±0,04*

Примечание: р < 0,05; *- отличие высокоэффективных от менее эффективных НВЛ.

Из таблицы следует, что при увеличении размера и изрезанное™, а также уменьшении оптической плотности НВЛ, ее эффективность снижается.

Таким образом, проведенные нами исследования свидетельствуют о том, что внеклеточный механизм уничтожения микроорганизмов с помощью внеклеточных ДНК-овых сетей является функцией не только альтернативной фагоцитозу, но и более эффективной.

Следующей задачей нашей работы была клиническая апробация методов обнаружения НВЛ, разработанных на экспериментальных моделях.

Одну из таких клинических групп составили пациенты с с сепсисом, развившимся на фоне гнойной хирургической инфекции.

НВЛ определяли не в популяции нейтрофилов, предварительно выделенных из периферической крови, а в нефракционированной цельной крови.

Полученные данные свидетельствуют о том, что при сепсисе, в отличие от здоровых пациентов, в крови обнаруживается значительное количество НВЛ (табл. 13).

Таблица 13

Содержание различных морфологических форм нейтрофилов в периферической крови в норме и при патологии, (М ± т)

Морфологические формы нейтрофилов, % Группы

Здоровые п= 10 Больные сепсисом п = 13

Нейтрофилы с сегмен-тоядерным ядром 92,60 ±0,81 56,40 ± 2,29*

Нейтрофилы с недифференцированным ядром 5,00 ±0,71 19,0 ± 1,0*

Нейтрофильные внеклеточные ловушки 2,40 ±0,51 24,60 ± 1,51*

Примечание: р<0,05; * - отличие группы здоровых от группы больных сепсисом.

Эти данные согласуются с результатами, полученными другими авторами у больных с септическим артритом и полиорганной недостаточностью [Margraf S. et al„ 2008; Lögters Т. et al„ 2009].

Важно было оценить эффективность разработанного нами метода обнаружения НВЛ в мукозальных секретах при воспалительных процессах. Среди воспалительных заболеваний репродуктивного тракта женщин наиболее часто

встречающейся формой является цервицит [Русакевич П.С., 2000; Серов В.Н., Прилепская Л.А., 2000].

Многочисленные исследования [Ларсен Б., 1988; Медведев Б.И., Долгушина В.Ф., 1993; Дергачева Т.Н. и др., 1999; Кира Е.Ф., 2001; Гольцфарб В.М., 2005; Андреева Ю.С., 2005; Батурина И.Л., 2010; Орнер И.Ю., 2010] по изучению механизмов антимикробной резистентности слизистых оболочек показывают, что именно нарушения в локальном иммунном комплексе этих барьерных тканей во многом предопределяют исходы воспалительного процесса, а возникающие при этом взаимосвязанные нарушения мукозального иммунитета способствуют рецидивирующему течению и хронизации воспалительного процесса [Кононов A.B., 1999; Смольникова Л.А., 1999; Сахарова В.В., 2000; Новиков А.И., 2002].

Полученные в работах В.Ф. Долгушиной (1991) и Л.Ф. Телешевой (2000) данные, во многом вносят ясность в понимание взаимосвязи факторов системного и местного иммунитета при воспалительных заболеваниях гениталий. Проведенные исследования свидетельствуют о присутствии в цервикальной и вагинальной слизи женщин с генитальной инфекцией иммуноглобулинов, ци-токинов, компонентов комплемента, лизоцима, реактантов острой фазы, а также функционально активных нейтрофильных гранулоцитов.

В связи с вышеизложенным, интересно было оценить помимо фагоцитарной функции, способность к образованию НВЛ у нейтрофильных гранулоцитов мукозальных секретов.

Было установлено, что воспаление нижнего отдела гениталий приводит к повышенному выделению хроматина нейтрофильными гранулоцитами секретов слизистых оболочек репродуктивного тракта женщин. Эти результаты подтверждают данные других авторов об образовании внеклеточных ловушек ней-трофилами мукозальных секретов. В частности, в мокроте у больных с муко-висцидозом содержится большое количество внеклеточных сетей [Lee W.L., Grinstein S. et al., 2004; Wartha F et al., 2007]. Терапия ингаляционными препа-

ратами, содержащим ДНК-азу, уменьшает симптомы муковисцидоза и улучшает легочную функции [Fuchs HJ. et al., 1994].

Полученные результаты позволяют утверждать, что разработанные нами методы доступны и просты в исполнении и могут быть использованы для более полной оценки функционального статуса нейтрофильных гранулоцитов в клинической лабораторной диагностике.

В работе также представлены результаты разработки новых методов обнаружения HBJ1: в агарозном геле и на спектрофотометре. Для метода обнаружения HBJI в агарозном геле мы преследовали цель создать для нейтрофилов, выделенных из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, условия приближенные к среде слизистых оболочек. В геле хрупкие и быстро разрушающиеся структуры HBJI способны сохраняться длительное время. Разработанный способ обнаружения HBJI в агарозном геле имеет существенные преимущества перед другими методами, так как образованные внеклеточные ловушки нейтрофилами, выделенными из периферической крови и помещенными в гель агарозы, сохраняются в течение всего времени исследования, в то время как в растворе происходит разрушение HBJI под действием содержимого гранул нейтрофила. Это позволяет более полно оценить кинетику процесса формирования внеклеточных сетей нейтрофильными гранулоцитами.

Нами был разработан также аппаратный метод индикации нейтрофильной ДНК в цельной периферической крови с использованием спектрофотометра. Анализ полученных данных показал, что количество внеклеточной ДНК, которое определяли в периферической крови у больных сепсисом, в два раза превышает ее уровень у здоровых пациентов, при этом, данные о количестве внеклеточной ДНК, полученные на спектрофотометре, совпадают с результатами микроскопического учета числа HBJI. После доработки этот метод можно будет использовать для определения НВЛ в клинической практике.

Таким образом, образование нейтрофильных внеклеточных ловушек -является важной функцией нейтрофилов, которая наряду с эндоцитозом во многом определяет эффективность антимикробных реакций этих клеток. Обна-

ружение НВЛ в различных биологических жидкостях организма с помощью разработанных методов может позволить более полно оценить состояние врожденного иммунитета, и открывает перспективы для диагностики различных патологических состояний и тяжести их течения.

ВЫВОДЫ

1. Методы окраски по Романовскому-Гимзе, акридиновым оранжевым и с помощью Sytox green позволяют определить внеклеточные ДНК-ловушки, образованные нейтрофилами периферической крови.

2. Оптимальным режимом инкубации нейтрофилов, выделенных из периферической крови, для формирования внеклеточных ловушек является температура-37°С и время -30 мин.

3. Экзогенные факторы микробной природы (Lactobacterium spp.; Bifidum-bacterium spp.; Escherichia coli (штамм М-17); Staphylococcus aureus; Candida albicans (штамм 601)), факторы немикробной природы (форбол-миристат-ацетат) и иммунологические препараты (пирогенал, вакцина «Солкотриховак», циклоферон, бестим) индуцируют формирование in vitro внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови. Наиболее сильным индуктором нейтрофильных внеклеточных ловушек из исследуемых микроорганизмов являются Candida albicans (штамм 601).

4. В периферической крови здоровых людей имеются гуморальные факторы, подавляющие образование нейтрофилами внеклеточных ловушек. Аутологичная плазма и сыворотка крови, истощенные по антителам и инактивированные при температуре 56°С, сохраняют свойства подавлять формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек. Аутологичные эритроциты, комплемент и иммуноглобулины существенно не влияют на процесс образования нейтрофильных внеклеточных ловушек.

5. Инкубация нейтрофилов с блокаторами цитоскелета (цитохалазином и колхицином), кальциевых каналов (верапамилом), синтеза белка (цикло-гексидином) и с мембраностабилизирующим препаратом (преднизолон) подавляет формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек.

6. Одновременное использование двух красителей (синьки Эванса и Sytox green) позволяет идентифицировать нейтрофильные внеклеточные ловушки в мукозальных секретах, дифференцировать ДНК нейтрофилов от слизи, а также учитывать активность, эффективность фагоцитоза и внеклеточного захвата микроорганизмов нейтрофнльными ловушками.

7. Разработанный метод определения нейтрофильных внеклеточных ловушек в агарозном геле, позволяет длительно сохранять хрупкие волокна нейтрофильной ДНК, а спектрофотометрический метод дает возможность оптимизировать и упростить учет результатов исследования.

8. Формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек является эффективным защитным механизмом. Количество микроорганизмов, захваченных и убитых нейтрофильной внеклеточной ловушкой превосходит аналогичные показатели при фагоцитозе. Эффективность нейтрофильных внеклеточных ловушек зависит от их размера, оптической плотности и изрезанности.

9. Разработанные методы обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек могут быть использованы в клинической практике для оценки функционального статуса нейтрофилов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение внеклеточных ловушек, образованных нейтрофилами, выделенными из периферической крови, рекомендуется использовать для оценки функционального статуса нейтрофильных гранулоцитов пациентов.

2. Окрашивание препаратов нейтрофилов периферической крови можно проводить любым из перечисленных красителей - азур-эозином, акридиновым оранжевым и Sytox green.

3. Для оценки эффективности фагоцитоза и нейтрофильных внеклеточных ловушек рекомендуется использовать два красителя - синьку Эванса и Sytox green, что позволяет определить морфологию и жизнеспособность клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Долгушин, И.И. Нейтрофилы регулируют формирование микробиоценоза слизистых оболочек/ И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, Е.А. Мезенцева, АЛО. Савочкина, Е.В. Плеханова, М.А. Свиридов, М.В Пе-шикова // Медицинская иммунология. - 2006. - Т. 8, № 2-3. - С. 135136.

2. Телешева, Л.Ф. Некоторые показатели иммунной системы у женщин с пороками развития плода / Л.Ф. Телешева, Никушкина К.В., Блинов А.Ю., Савочкина А.Ю., Тупиков В.А., Мезенцева Е.А. // Материалы конференции, посвященной 25-летию ЦНИЛ ЧелГМА "Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека". — Челябинск, 2006. — С. 144 - 146.

3. Савочкина, А.Ю. Сравнительный анализ уровня пероксидазы нейтрофилов периферической крови и цервикальной слизи / А.Ю. Савочкина, Ю.С. Андреева, Е.В. Плеханова // Материалы IX съезда всероссийского науч.-практ. о-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: в 3-х т. - М.: Санэпидмедиа, 2007. - Т. 2. - С. 129.

4. Долгушин, И.И. Влияние нейтрофилов и продуктов их секреции на факторы, участвующие в формировании колонизационной резистентности / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, М.А. Свиридов, А.Ю. Савочкина, Е.А. Мезенцева, Е.В. Плеханова, А.И. Скороходов, В.В.

Иванов, Л.Ф. Телсшсва, С.И. Марачев, Д.Н. Матвеева, В.А.Тупнков // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2-3. - С. 133-134.

5. Долгушин, If.lt. Нейтрофнльные гранулоцнты слизистых оболочек / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, Е.А. Мезенцева, Е.В. Плеханова, АЛО. Савочкнна, М.А. Свиридов, Д.Н. Матвеева // Российский иммунологический журнал. -2008. - Т. 2 (11), JV« 2-3.- С. 246.

6. Долгушин, И.И. Определение роли представителей флоры генитального тракта здоровых женщин в индукции апоптоза нейтрофилов / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, Е.В. Плеханова, А.Ю.Савочкина // Российско-чешский медицинский форум: сб. науч. тр. - Челябинск, 2008. - С. 53-55.

7. Долгушин, И.И. Формирование микробиоценоза слизистых оболочек контролируется нейтрофиламн / И.И. Долгушин, Ю.С.Андреева, М. А. Свиридов, Е.А. Мезенцева, АЛО. Савочкина // Российский аллер-гологический журнал. - 2008. - №1, прил. 1. - С. 94-95.

8. Долгушин, И.И. Нейтрофнльные ловушки / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А. И. Рыжкова, Е.А. Мезенцева, Е.В. Плеханова, АЛО. Савочкнна, М.А. Свиридов, Д.Н. Матвеева, А.Н. Скороходов // Российский иммунологический журнал.-2008.- Т.2(11), №2-3. -С. 127.

9. Савочкина, АЛО. Иммунологические показатели в диагностике воспалительных заболеваний репродуктивного тракта женщин / А.Ю. Савочкина, Ю.С. Андреева, И.И. Долгушин, Л.Ф. Телешева, Е.А. Мезенцева, К.В. Никушкина, О.С. Абрамовских, Е.В. Плеханова, М.А. Свиридов, С.И. Марачев, А.И. Рыжкова // Вестник новых медицинских технологии. - 2009. - № 1. - С. 77-79.

Ю.Андреева, Ю.С. Грибы рода Candida стимулируют образование ней-трофильных внеклеточных ловушек / Ю.С. Андреева, И.И. Долгушин, АЛО. Савочкнна, А.И. Рыжкова // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, № 4-5. - С. 301.

11.Савочкина, А.Ю. Использование иммунологических показателей в дифференциальной диагностике хронических воспалительных забо-

леваний репродуктивного тракта женщин / A.IO. Савочкина, IO.C. Андреева, Л.Ф. Телешева, С.И. Марачев, В.Ф. Долгушина // Вестник Уральской академической науки. - 2009. -№ 2/1. - С. 292-293.

12.Савочкина, А.Ю. Методы определения и биологическая роль ней-трофильных ловушек / А.Ю. Савочкина, Ю.С. Андреева, И.И. Долгушин // Вестник Уральской академической науки. - 2009. -№ 2/1. -С. 335-336.

13.Андреева, Ю.С. Солкотриховак стимулирует образование нейтро-фильных внеклеточных ловушек / Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина, И.И. Долгушин // Вестник Уральской академической науки. - 2009. -№ 2/1. -С. 196-197.

14.Андреева, Ю.С. Нейтрофильные внеклеточные ловушки образуются in vitro под действием циклоферона / Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина, И.И. Долгушин, А.И. Рыжкова // Вестник Уральской академической науки. - 2009. -№ 2/1. - С. 14-15.

15.Долгушин, И.И. Влияние вакцины Солкотриховак на образование нентрофильных внеклеточных ловушек / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А.И. Рыжкова, А.Ю. Савочкина, Е.А. Мезенцева, К.В. Никуш-кина, О.С. Абрамовских, С.И. Марачев, Д.Н. Матвеева // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2009. - № 4. - С. 53-55.

16.Мезенцева, Е.А. Влияние непатогенных и условно-патогенных представителей нормофлоры слизистых оболочек на секрецию нейтрофи-ламн антимикробных продуктов и цитокинов / Е.А. Мезенцева, Ю.С. Андреева, И.И. Долгушин, А.Ю. Савочкина, К.В. Ннкушкнна, О.С. Абрамовских, Е.В. Плеханова, М.А. Свиридов, С.И. Марачев, А.И. Рыжкова // Вестник новых медицинских технологий. - 2009. - Т. XVI, № 2. - С. 16-17.

17.Долгушин, И.И. Бактерии стимулируют образование нейтрофильных внеклеточных ловушек: материалы X Международного конгресса «Со-

временные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармаколо-гии» / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина // Казань. - 2009. - С. 282.

18.Рыжкова, А.И. Влияние различных концентраций препарата «Солкотри-ховак» на образование нейтрофильных внеклеточных ловушек / А.И. Рыжкова, И.И. Долгушин, Ю.С. Шишкова, А.Ю. Савочкина // Материалы VII итоговой науч.-практ. конф. молодых ученых ЧелГМА. - Челябинск, 2009.-С. 115-117.

19.Рыжкова, А.И. Образование нейтрофильных внеклеточных ловушек в чистой фракции нейтрофилов и в цельной крови под влиянием грибов рода Candida / А.И. Рыжкова, Ю.С. Шишкова, А.Ю. Савочкина // Материалы VII итоговой науч.-практ. конф. молодых ученых ЧелГМА. - Челябинск, 2009.-С. 117-120.

Ю.Долгушин, И.И. Нейтрофнльные ловушки: методы определения, биологическая роль / И.И. Долгушин, Ю.С.Андреева, А.Ю. Савочкина, А.И. Рыжкова, В.А. Маркова, H.A. Васильева // Медицинская наука и образование Урала. - 2009. - № 3. - С. 10-12.

21.Шишкова, Ю.С. Влияние препарата «Пирогенал» на образование нейтрофильных внеклеточных ловушек / Ю.С. Шишкова, А.Ю. Савочкина, А.И. Рыжкова, Е.А. Мезенцева // Медицинская наука и образование Урала. - 2009. - № 3. - С. 23-25.

22.Долгушин, И.И. Методы обнаружения нейтрофильных ловушек / И.И. Долгушин, Ю.С.Шншкова, А.Ю. Савочкина // Аллергология и иммунология. - 2009. - Том 10, № 3. - С. 458-462.

23.Долгушин, И.И. Методы оценки функционального статуса нейтрофилов / И.И. Долгушин, Ю.С.Шишкова, А.Ю. Савочкина, Л.Ф. Телешева, В.Ф. Долгушина // Челябинск: Изд-во «Челябинская государственная медицинская академия», 2009. - 106 с.

24.Савочкина, А.Ю. Сравнительный анализ внутри- и внеклеточного захвата нейтрофилами периферической крови Candida albicans в за-

внсимости от опсонизации специфическими антителами 1ц С / А.Ю. Савочкина, И.И. Долгушин, А.И. Рыжкова, Ю.С. Шишкова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2010. - №2/1 (29). - С.30-31.

25.Долгушин, И.И. Влияние плазмы и сыворотки на формирование ней-трофильных внеклеточных ловушек / И.И. Долгушин, А.И. Рыжкова,

A.Ю. Савочкнна, Ю.С. Шишкова, М.А. Свиридов, К.В. Никушкина, Т.Г. Бондаренко // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2010. - №2/1 (29). - С.68-69.

26.Долгушин, И.И. Технологии определения и роль нейтрофильных внеклеточных ловушек в антимикробной защите / И.И. Долгушин, Ю.С. Шишкова, А.Ю. Савочкина, А.И. Рыжкова, И.В. Курносенко,

B.П. Евтушенко // Вестник РАМН. - 2010. - № 4. - С. 26 - 30.

27.Долгушин, И.И. Влияние вакцины «солкотриховак» на неспецифические факторы защиты репродуктивного тракта женщин / И.И. Долгушин, А.И. Рыжкова, А.Ю. Савочкина // Российский иммунологический журнал. - 2010. - Т.4 (13), № 4. -С. 431-432.

28.Бондаренко, Т.Г. Влияние эстрадиола на способность нейтрофилов к образованию внеклеточных ловушек / Т.Г. Бондаренко, А.Ю. Савочкина, Ю.С. Шишкова, Пегушина И.В. // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - №2/1 (35). - С.14-15.

29.Маркова, В.А. Формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами слюны у здоровых женщин / В.А. Маркова, И.И. Долгушин, А.Ю. Савочкина, Ю.С. Шишкова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - №2/1 (35). - С.44-45.

30.Бондаренко, Т.Г. Влияние эстрадиола на способность нейтрофилов и моноцитов к образованию внеклеточных ловушек / Т.Г. Бондаренко, А.Ю. Савочкина, Ю.С. Шишкова // Материалы II Международной (IX итоговой) научно-практической конференции молодых ученых. - 2011. - С. 2224.

31.Долгушин, И.И. Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов / И.И. Долгушин, Ю.С.Андреева, А.Ю. Савочкина - М.: Издательство РАМН, 2009. - 208 с.

32.Пат. № 2431836 Рос. Федерация Способ выделения нентрофильных гранулоцитов из периферической крови / И.И. Долгушин, А.И. Рыжкова, АЛО. Савочкина, Ю.С.Андреева (Российская Федерация). - № 2010105891; заявл. 18.02.2010; опубл. 20.10.2011, Бюл. № 29.-5с.

33.Маркова, В.А. Формирование внеклеточных ловушек активированными и неактнвированнымн нейтрофилами слюны у здоровых женщин в I и II фазу менструального цикла / В.А. Маркова, А.Ю. Савочкина, И.В. Пегушина, Ю.С. Шишкова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - №4/1 (38). - С.141.

34.Смирнова, Т.Г. Образование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови, под влиянием эстриола / Т.Г. Смирнова, А.Ю. Савочкина, И.И. Долгушин, Ю.С. Шишкова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. -№4/1 (38). - С.153-153.

35.Савочкина А.Ю. Оценка эффективности нентрофильных внеклеточных ловушек / АЛО. Савочкина, И.И. Долгушин, Ю.С. Шишкова, Т.Г. Смирнова, В.А. Маркова, О.Б. Прокопьева // Известия высших учебных заведений. - 2011. - №3. - С. 106-109.

СПИСОК, ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ В АВТОРЕФЕРАТЕ

АФК активные формы кислорода

БПИ (BPI) бактерицидный/индуцированный протеин

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЛ (IL) интерлейкин

ИФН (IFN) интерферон

ЛПС липополисахарид

ММР-9 матричная металлопротеиназа-9

НАДФ (NADPH) никотинамидадениндинуклеотидфосфат

НАДФ-оксидаза никотинамидадениндинуклеотидфосфат-

НВЛ (NET) зависимая оксидаза

нейтрофильная внеклеточная ловушка

НК нуклеиновая кислота

РАИЛ рецепторный антагонист интерлейкина - 1

РНК рибонуклеиновая кислота

ФМА форбол-12-миристат-13-ацетат

ФНО-а фактор некроза опухоли альфа

ЦХ цитохалазин

цг циклогексимид

Са++ кальций

С. albicans Candida albicans

E.coli Escherichia coli

н2о2 перекись водорода

Ig иммуноглобулин

IgG иммуноглобулин G

S.aureus Staphylococcus aureus

SPP- species

TLR То11-пдобный рецептор

На правах рукописи

САВОЧКИНА Альбина Юрьевна

НЕЙТРОФИЛЬНЫЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ЛОВУШКИ: МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ, МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Челябинск-2012

Подписано в печать 10.01.2012 г. Отпечатано в типографии ПРИНТМЕД 12.01.2012 г. Формат 60x84 V,6. Гарнитура Times New Roman Суг. Бумага офсетная. Печать на ризографе. Объем 2 усл. п.л. Тираж 100 экз.

Актуальность проблемы

В 2004 году учеными, работающими под руководством Артуро Зихлински Института Макса Планка по изучению биологии инфекции, была открыта новая функция нейтрофильных гранулоцитов - внеклеточный захват патогенов, путем формирования ими внеклеточных ловушек, представляющими собой нити ДНК с адсорбированными на них антимикробными факторами гранул нейтрофилов [Brinkmann V. et al., 2004]. Процесс формирования нейтрофилами внеклеточных ловушек является функцией альтернативной фагоцитозу, а возможно и более эффективной [Долгушин И.И. и др., 2009]. Механизм антимикробной защиты, осуществляющийся нейтрофилами, путем образования внеклеточных сетей был назван термином «NETosis» [Steinberg В.Е., Grinstein S., 2007].

Внеклеточные ловушки могут образовывать только активные нейтрофилы [Fuchs, Т.A. et al., 2007; Medina Е., 2009]. Формирование HBJI может происходить двумя способами: литическим и везикулярным. При литическом варианте нейтрофил притерпевает морфологические изменения. В нем образуются многочисленные вакуоли, теряется характерная дольчатая форма ядер, затем ядерная мембрана разрушается и хроматин занимает всю клетку. Гранулы растворяются и компоненты будущей ловушки распределяются по всему объему, клетка сокращается до тех пор, пока ее мембрана не лопнет, нейтрофил погибает, а высокоактивная смесь выбрасывается наружу [Brinkmann V., 2004; Martinelli S., 2004; Fuchs, T.A. et al., 2007]. Для логического пути формирования HBJI необходимы активные формы кислорода [Brinkmann V., Zychlinsky А., 2007; Wang Y. et al., 2009].

Везикулярный механизм образования HBJ1 является кислороднезависимым, при этом нейтрофилы сохраняют свою жизнеспособность [Florian H. Pilsczek et al., 2010]. При этом варианте образование HBJI начинается с блеббинга. Образуется пространство между внешней и внутренней ядерной мембранами, которое ДНК с дальнейшим формированием везикул. Везикулы, окруженные ядерной мембраной, перемещаются, в межклеточное пространство, без разрушения плазматической мембраны. За пределами клетки, мембраны везикул разрываются, высвобождая хроматин. Этот сценарий разворачивается в течение нескольких минут после стимуляции нейтрофила. Если действие активатора продолжается, запускаются механизмы литического образования ловушек. На сегодняшний день имеются фундаментальные исследования по изучению механизмов формирования HBJI, однако окончательно процесс выделения хроматина во внеклеточное пространство не расшифрован.

Попав в ловушки, микроорганизмы погибают под влиянием бактерицидных веществ, входящих в состав HBJI [Urban C.F. et al., 2006; Wartha F. et al., 2007]. Однако некоторые бактерии способны выживать в НВЛ [Sumby P. et al., 2005; Buchanan J.T. et al., 2006; Wartha F. et al., 2007; Carlin A.F. et al., 2009]. HB Л формируются в крови и в мукозальных секретах при различных инфекционных, неинфекционных или аутоиммунных заболеваниях [Redman C.W., Sargent I.L., 2005; Gupta A.K. et al., 2007; Zhong X.-Y. et al., 2007; Baker V.S. et al., 2008; Margraf S. et al., 2008; Neeli I. et al., 2008]. Также в последние годы показано, что значительная часть гранулоцитов мигрирует на поверхность слизистых оболочек, где они и реализуют свои основные функции [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001].

Учитывая биологическую роль и диагностическую значимость НВЛ при различных патологических состояниях, необходимо разработать методы их выявления. Описанные в литературе методы обнаружения НВЛ являются трудоемкими в своем исполнении и требуют наличия специального оборудования [Brinkmann V., 2004], поэтому их сложно использовать в клинической практике. Существуют единичные работы, направленные на разработку простых и доступных для клинической лабораторной диагностики методов определения НВЛ [Долгушин И.И., Андреева Ю.С., 2008], позволяющие оценить не только количественно, но и качественно это явление в чистой фракции нейтрофильных гранулоцитов. Однако этот метод невозможно использовать для обнаружения НВЛ в мукозальных секретах, а также с помощью него нельзя установить эффективность НВЛ. Для этого требуется разработка новых способов определения НВЛ, которые можно будет использовать для более полного анализа функционального статуса нейтрофилов.

На сегодняшний день не разработаны простые и информативные методы определения НВЛ в мукозальных секретах, и до конца не определена роль НВЛ в реализации реакций врожденного иммунитета.

Кроме того, для фундаментальной науки клинической иммунологии важно знать механизмы формирования НВЛ и роль их в различных патологических процессах для коррекции нарушений иммунного статуса и назначения патогенетически обоснованной терапии.

Это позволило сформулировать цель и задачи настоящей работы.

Цель работы

Изучить механизмы формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек, разработать методы их обнаружения в различных биологических жидкостях в норме и при патологии.

Задачи исследования

1. Сравнить различные способы окраски внеклеточных ловушек, образованных нейтрофилами, выделенными из периферической крови.

2. Определить оптимальные условия инкубации in vitro для формирования внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови.

3. Изучить влияние различных экзогенных факторов микробной и немикробной природы на процесс образования внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови.

4. Оценить in vitro влияние различных эндогенных факторов (плазма крови, сыворотка крови, комплемент, специфические иммуноглобулины) на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови.

5. Изучить участие цитоскелета, кальциевых каналов, синтеза белка и мембраны нейтрофила в процессе образования нейтрофильных внеклеточных ловушек.

6. Разработать метод обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах.

7. Провести сравнительный анализ захвата и киллинга микроорганизмов нейтрофилами в процессе фагоцитоза и образования внеклеточных ловушек, а также определить зависимость эффективности нейтрофильных внеклеточных ловушек от её морфологических характеристик.

8. Оценить информативность предлагаемых методов обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в различных биологических жидкостях в норме и при патологии.

Научная новизна

В работе определены оптимальные условия инкубирования нейтрофилов для их активации и формирования HBJ1 in vitro. Установлено, что оптимальное время инкубации составляет 30 минут, а температура 37°С. Показано, что факторы микробной и немикробной природы: Lactobacterium spp. и Bifidumbacterium spp., Е. coli (штамм М-17), S. aureus, грибы рода Candida, форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА), липополисахарид (ЛПС), пирогенал, вакцина «Солкотриховак», циклоферон, бестим индуцируют образование НВЛ.

Изучено формирование НВЛ после активации нейтрофилов цельной крови, лейкоцитарной взвеси и нейтрофилов, выделенных на двойном градиенте фиколла-верографина. Показано, что нейтрофилы цельной крови и лейкоцитарной взвеси в норме не образуют НВЛ не зависимо от концентрации активатора. Определена роль сыворотки, плазмы, комплемента и специфических иммуноглобулинов в формировании внеклеточных ловушек нейтрофилами. Установлено, что аутологичные сыворотка и плазма крови, независимо от присутствия в них специфических иммуноглобулинов и комплемента, оказывают ингибирующее действие на внеклеточный выброс ДНК нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина. Комплемент сыворотки морской свинки оказывает стимулирующее дозозависимое действие на секрецию нейтрофильной ДНК, при этом действие чужеродного белка на изучаемое явление учтено. Специфические иммуноглобулины не влияют на формирование НВЛ, в то же время, они усиливают фагоцитарную активность нейтрофилов.

Определено участие цитоскелета, кальциевых каналов, синтеза белка и мембраны нейтрофила в процессе формирования НВЛ. Показано, что перечисленные ультраструктуры нейтрофила задействованы в образовании НВЛ.

Разработан способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах (Долгушин И.И., Андреева Ю.С., Савочкина А.Ю. Приоритетная справка от 26.01.2009г. Заявка на изобретение № 2009102579). Используя данный способ, впервые изучены морфология и эффективность НВЛ. Установлено, что эффективность НВЛ зависит от ее морфологических характеристик.

Разработаны новые методы определения НВЛ в агарозном геле и на спектрофатометре.

Впервые проведен сравнительный анализ количества НВЛ в различных биологических жидкостях. Показано, что острый инфекционный процесс стимулирует повышенный выброс нейтрофильной ДНК во внеклеточное пространство.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследования расширяют знания о физиологии нейтрофильных гранулоцитов, их функциональных возможностях, механизмах формирования НВЛ. Разработанный метод изучения образования НВЛ в агарозном геле позволяет моделировать условия существования нейтрофилов в мукозальных секретах.

Полученные знания вносят значительный вклад в понимание роли НВЛ в системе иммунной защиты организма, регуляторных механизмов, связи с другими иммунологическими процессами и влияния на другие органы и системы всего организма, а также для получения более полной картины иммунного статуса больного.

Данные о стимуляции или блокаде образования нейтрофилами внеклеточных ловушек веществами, оказывающими влияние на элементы цитоскелета и мембран нейтрофилов, кальциевые каналы и синтез белка, могут быть использованы для поиска новых подходов к фармакологической коррекции защитных иммунологических реакций, связанных с формированием НВЛ.

Разработанные методы обнаружения НВЛ открывают возможности изучения значения НВЛ для диагностики различных заболеваний, оценки тяжести течения болезней и эффективности лечения.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследований внедрены в лабораторную диагностику НИИ иммунологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, в Институт экологии и генетики микроорганизмов УроРАН, г. Пермь и используются в учебном процессе на кафедрах микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия»

Минздравсоцразвития России.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанные новые методы обнаружения НВЛ в периферической крови и мукозальных секретах, могут быть использованы в клинической лабораторной диагностики и для экспериментального моделирования процессов образования НВЛ: метод обнаружения НВЛ в мукозальных секретах с применением двойного окрашивания для оценки жизнеспособности клеток; аппаратный метод определения внеклеточной ДНК в периферической крови с помощью спектрофотометра; метод обнаружения внеклеточных ловушек в агарозном геле, образованных нейтрофиламн, выделенных из периферической крови.

2. Элементы цитоскелета, кальциевые каналы, синтез белка и мембрана нейтрофилов вовлечены в процесс формирования НВЛ.

3. Нейтрофилы чистой фракции, цельной крови и лейкоцитарной взвеси по-разному отвечают на стимуляцию их различными активаторами, с целью формирования НВЛ. Сыворотка и плазма крови блокируют образование нейтрофилами внеклеточных ловушек.

4. Внеклеточный захват и киллинг микроорганизмов, осуществляемый нейтрофильными гранулоцитами, является процессом более эффективным, чем фагоцитоз.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); VIII конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007); на национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - междисциплинарные проблемы» (Москва, 2008); на объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); на конференции, посвященной 10-летию ЮжноУральского научного центра РАМН (Челябинск, 2008), на VI Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009), на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009), на XIII Всероссийском научном Форуме имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге: Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунокоррекции» (г. Санкт-Петербург, 2009), на VII итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2009); на II международной научно-практической конференции молодых ученых (Челябинск, 2011), на IX Российской конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011).

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 222 страницах текста, иллюстрирована 46 таблицами, 11 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, восьми глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 289 источников, в том числе 112 отечественных и 177 зарубежных.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 35 научных работ, в том числе 26 из перечня изданий, рекомендованных ВАК РФ. Получен патент «Способ выделения нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови». Издана монография «Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов».

ВЫВОДЫ

1. Методы окраски по Романовскому-Гимзе, акридиновым оранжевым и с помощью Sytox green позволяют определить внеклеточные ДНК-ловушки, образованные нейтрофилами, выделенными из периферической крови.

2. Оптимальным режимом инкубации нейтрофилов, выделенных из периферической крови, для формирования внеклеточных ловушек, является температура - 37°С и время - 30 мин.

3. Экзогенные-- факторы микробной—природы (Lactobacterium spp.; Bifidumbacterium spp.; E. coli (штамм М-17); S. aureus; С. albicans (штамм 601)), факторы немикробной природы (форбол-миристат-ацетат) и иммунологические препараты различной природы (пирогенал, вакцина «Солкотриховак», циклоферон, бестим) индуцируют формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови. Наиболее сильным индуктором нейтрофильных внеклеточных ловушек являются С. albicans (штамм 601).

4. В периферической крови здоровых людей имеются факторы, подавляющие образование нейтрофилами внеклеточных ловушек. Аутологичная плазма и сыворотка крови, истощенные по антителам и инактивированные при температуре 56°С, сохраняют свойства подавлять формирование HBJI. Аутологичные эритроциты, комплемент и иммуноглобулины существенно не влияют на процесс образования нейтрофильных внеклеточных ловушек:

5. Инкубация нейтрофилов с блокаторами цитоскелета (цитохалазином и колхицином), кальциевых каналов (верапамилом), синтеза белка (циклогексидином) и с мембраностабилизирующим препаратом (преднизолон) подавляет формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек.

6. Одновременное использование двух красителей (синьки Эванса и Sytox green) позволяет идентифицировать нейтрофильные внеклеточные ловушки в мукозальных секретах, дифференцировать ДНК нейтрофилов от слизи, а также учитывать активность, эффективность фагоцитоза и внеклеточный захват микроорганизмов нейтрофильными ловушками.

7. Разработанный метод определения нейтрофильных внеклеточных ловушек в агарозном геле, позволяет длительно сохранять хрупкие волокна нейтрофильной ДНК, а спектрофотометрический метод дает возможность оптимизировать и упростить ~ учет результатов исследования.

8. Формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек является защитным механизмом. Количество микроорганизмов, захваченных и убитых нейтрофильной внеклеточной ловушкой превосходит аналогичные показатели при фагоцитозе. Эффективность нейтрофильных внеклеточных ловушек зависит от их размера, оптической плотности и изрезанности.

9. Разработанные методы обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек могут быть использованы в клинической практике для оценки функционального статуса нейтрофилов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение внеклеточных ловушек, образованных нейтрофилами, выделенными из периферической крови, рекомендуется использовать для оценки функционального статуса нейтрофильных гранулоцитов.

2. Окрашивание препаратов нейтрофилов периферической крови можно проводить любым из перичисленных красителей - азур-эозином, акридиновым оранжевым и Sytox green.

3. Для оценки эффективности фагоцитоза и нейтрофильных внеклеточных ловушек рекомендуется использовать два красителя -синьку -Эванса-и-Sytox-green, что позволяет определить морфологию и жизнеспособность клеток.