Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Некоторые особенности параметров клеточной и внеклеточной ДНК у новорожденных различного гестационного возраста

На правах рукописи

ШЕГУРОВА ДИАНА ИЛЬДАРОВНА

НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПАРАМЕТРОВ КЛЕТОЧНОЙ И ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК У НОВОРОЖДЕННЫХ РАЗЛИЧНОГО ГЕСТАЦИОННОГО ВОЗРАСТА

14.01.08 - педиатрия

48

56792

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 6 ОКТ 2011

Казань-2011

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Защита состоится 14 октября 2011 года в 9 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 208.034.03 при ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 420012, г. Казань, ул.Бутлерова, 49 б.

Автореферат разослан « 14 » сентября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Софронов Валерий Викторович Научный консультант: доктор медицинских наук

Мустафин Ильшат Ганиевич Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Кузнецова Алевтина Васильевна

доктор медицинских наук, доцент Архипова Наталья Николаевна

Ведущая организация: Научный центр здоровья детей РАМН

(г. Москва)

кандидат медицинских наук, доцент

Г.Р.Хасанова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Многие патологические процессы периода новорожденное™ оставляют глубокий след и могут проявиться на любом возрастном этапе всей последующей жизни, несмотря на высокие репаративные возможности организма в раннем постнаталыюм онтогенезе (Н.Н.Володин, 2008; Г.Н.Чистякова, 2005: Е.В.Аронскинд и др., 2004; Е.В.Шниткова и др., 2000; Ю.И.Барашнев, 2001; М.С.МсСогшс а1., 1992). В связи с этим, актуально выявить доманифестный критерий состояния здоровья новорожденного ребенка.

Постоянно мигрирующий лимфоцит, представляя собой центральное звено иммунной системы, её функциональную и морфологическую единицу, способен отражать все происходящие в организме изменения (Р.П.Нарциссов, 1978, 1984). В одноименных структурах клеток различных систем и органов (нервная, иммунная, печень, лёгкие и др.) изменения развиваются стереотипно, и процесс восстановления клеточных структур после прекращения патогенного воздействия не зависит от этиологического фактора (Д.С.Саркисов, 1993).

Известно, что характер адаптационных реакций определяется состоянием нуклеиновых кислот: РНК отвечает за кратковременную адаптацию, а ДНК - за долгосрочную (Д.С.Саркисов, 1987, 1993). Оценка параметров клеточной и внеклеточной ДНК в раннем неонатальном периоде позволит прогнозировать осложнения адаптации новорожденного ребенка в раннем неонатальном периоде.

Работ, посвященных изучению ядерной ДНК лимфоцитов и внеклеточной ДНК в педиатрической науке и практике, к сожалению, крайне мало. Имеются лишь единичные литературные источники, посвященные исследованию ядерной ДНК у новорожденных (Н.Е.Громада, 2008; В.Ю.Талаев, 1997, 1998, 1999; В.В.Софронов, 1999), но информация, содержащаяся в них, разноречива в силу различных методических подходов с использованием рутинных (качественных и полуколичественных) методов определения нуклеиновой кислоты. Данные, представленные в источниках литературы, немногочисленны, нуждаются в дополнениях и систематизации.

Цель исследования. Разработка метода прогнозирования течения периода адаптации на основании результатов изучения особенностей параметров ядерной и внеклеточной ДНК у новорожденных различного гестационного возраста.

Задачи исследования:

В соответствии с основной целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать и сравнить цитофлуометрические характеристики ядерной ДНК лимфоцитов у новорожденных различного гестационного возраста;

2. Исследовать особенности цитофлуометрических характеристик ядерной ДНК лимфоцитов у новорожденных с осложнениями периода адаптации;

3. Определить концентрацию внеклеточной ДНК у новорожденных различного срока гестации с различными клиническими вариантами течения периода адаптации;

4. На основании полученных результатов разработать методы прогнозирования течения периода адаптации новорожденных.

Достоверность полученных результатов. Для получения достоверных результатов проведено достаточное количество исследований. Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью табличного редактора Microsoft Excel 2003, Statistica 6.0. Данные, подчиняющиеся закону нормального распределения, представляли в виде среднего значения и стандартного отклонения. Данные, не подчиняющиеся закону нормального распределения, представляли в виде медианы и крайних значений вариационного ряда. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием параметрических (критерий Стьюдента) и непараметрических критериев (критерии Манна-Уитни, Ван-дер-Вардена и Краскела-Уоллиса, предусмотренные для сравнения ранжированных значений, с поправкой Бонферрони для исключения эффекта множественных сравнений). Для оценки связи между признаками применяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Уровень статистической значимости (р) считался меньше 0,05.

Научная новизна:

Получены новые научные данные о параметрах ядерной и внеклеточной ДНК у новорожденных различного гестационного возраста с различными осложнениями периода адаптации.

Научно доказано клиническое значение роли количества гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов в формировании адаптационных процессов у новорожденных различного гестационного возраста.

Установлены повышенные уровни гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов и концентрации внеклеточной ДНК у новорожденных различного гестационного возраста с различной перинатальной патологией.

С помощью комплексных исследований получены новые данные, которые существенно расширяют возможности раннего прогнозирования осложнений периода адаптации у новорожденных различного гестационного возраста.

Научно-практическая значимость работы:

Получены новые знания о процессах апоптоза и пролиферации лимфоцитов периферической крови новорожденных с разными вариантами течения периода ранней неонаталыюй адаптации и разными сроками гестации. Результаты исследования могут быть использованы для понимания процесса формирования и становления адаптационных систем у новорожденных и разработки нового теоретического и методологического подхода к ранней диагностике осложнений неонаталыгого периода.

Установлены значения гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов и концентрации внеклеточной ДНК 22,5 нг/мл для условно здоровых доношенных новорожденных с неосложненным течением периода ранней неонаталыюй адаптации.

Рекомендовано применение показателя процентного содержания лимфоцитов с гиподиплоидным и гиперплоидным количеством ядерной ДНК при оценке зрелости новорожденных.

Доказана прогностическая значимость увеличения содержания гиперплоидных лимфоцитов при наличии гнойно-воспалительных заболеваний у доношенных новорожденных и детей со сроками гестации 32-34 недели и 31 неделя и менее, а также при перинатальном поражении центральной нервной системы у детей со сроком гестации 35-37 недель.

Разработана теоретическая и методологическая база для нового подхода к прогнозированию осложнений раннего неонатального периода на основе анализа параметров клеточной и внеклеточной ДНК у новорожденных детей.

Личный вклад автора в исследование. Приведенные в диссертации данные получены при личном участии автора на всех этапах работы, в том числе автор осуществлял сбор анамнеза, объективное обследование новорожденных детей, проводил забор крови. Изучение состояния популяции лимфоцитов у новорожденных

выполнялось на базе иммунологической лаборатории РЦПБ СПИД. Определение концентрации внеклеточной ДНК проводилось на базе лаборатории нуклеиновых кислот кафедры биохимии Казанского государственного университета. Автором лично проведены анализ, статистическая обработка и интерпретация полученных результатов. Формулирование выводов, рекомендаций, положений, выносимых на защиту, также принадлежит лично автору.

Научные положения, выносимые на защиту:

1. Параметры ядерной ДНК лимфоцитов определяются сроком гестации и наличием перинатальной патологии новорожденных;

2. Параметры внеклеточной ДНК у новорожденных детей определяются гестационным возрастом и наличием перинатальной патологии;

3. Оценка параметров ядерной и внеклеточной ДНК в раннем неонатальном периоде позволяет прогнозировать осложнения периода адаптации у новорожденного ребенка.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на ежегодной научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» Казанского государственного медицинского университета (2008 г.), на V Научно-практической конференции «Педиатрия и детская хирургия в Приволжском федеральном округе» (2008), на конференции «Bioscience 2006 - bioscience for the 21st century», (23 - 27 July, Glasgow, UK, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 3 статьи в центральных изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией. Общий объем публикаций 1.7 у.п.л., в том числе личный вклад автора составляет 0,7 у.п.л.

Реализация результатов работы. Результаты исследования внедрены в практику работы отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных МУЗ «Детская городская больница №1» г. Казани. Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедры пропедевтики детских болезней и факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета, кафедры госпитальной педиатрии с курсами поликлинической педиатрии и ПДО ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 134 страницах машинописного текста, включает 28 рисунков и 23 таблицы; состоит из введения. 5 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, клинико-лабораторная характеристика, результаты специальных собственных исследований, заключение), выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы, включающего 250 ссылок, из которых 146 - на отечественные, 104- на зарубежные работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В качестве объекта исследования использовалась венозная кровь новорожденных детей. Под нашим наблюдением находилось 110 новорожденных детей. Все новорожденные были разделены на 5 групп: Первую группу составили 12 новорожденных с гестационным возрастом 31 неделя и менее, вторую группу - 14 новорожденных с гестационным возрастом 32-34 недели, третью группу - 17 новорожденных с гестационным возрастом 35-37 недель, четвертую группу - 51 новорожденный с гестационным возрастом 38-42 недели с различной перинатальной патологией. Пятую группу (группу сравнения) составили 16 условно здоровых доношенных новорожденных.

Перинатальная патология была представлена следующими заболеваниями: гнойно-воспалительные заболевания, перинатальное поражение центральной нервной системы (в том числе, церебральная ишемия различного генеза и спинальная травма), внутриутробная гипотрофия, пневмопатии, конъюгационная гипербилирубинемия (табл. 1).

Для клинико-анамнестического обследования детей использовалась разработанная нами анкета. При оценке состояния новорожденного применялись методы осмотра, пальпации, перкуссии, аускультации. Наличие внутриутробной гипотрофии и её степени выраженности определялось с помощью оценочной таблицы физического развития новорожденных Б.Н. Ильина (1975) и оценочной таблицы массы тела недоношенного ребенка с учетом его длины по Г.М.Дементьевой (1981).

Таблица 1.

Распределение новорожденных по основному заболеванию.

Перинатальная патология Удельный вес детей в группе, %

I II III IV V

Перинатальное поражение центральной нервной системы 16,7±10,8 28,6±12,1 11,8±7,8 37,3±6,8 0

Пневмопатии 16.7±10.8 35.7±12,8 11.8±7,8 9,8±4,2 0

Гнойно-воспалительные заболевания 66.7±13,6 35.7±12,8 47,1±12.1 23,5±5,9 0

Конъюгационная гипербилирубинемия 0 0 29,4±11,1 29,4±6,4 0

Всем пациентам проводился традиционный комплекс лабораторно-инструментальных исследований, включающий общий анализ крови, биохимический анализ крови, по показаниям ультразвуковое исследование головного мозга и внутренних органов, рентгенография органов грудной клетки и брюшной полости.

Исследование популяций лимфоцитов проводилось с помощью метода проточной цитофлуориметрии с использованием пропидиума йодида (метод I.Nicoletti, 1991).

Концентрацию- внеклеточной ДНК в депротеинизированных образцах плазмы крови (по методике Т. Маниатиса, 1984) определяли спектрофлуоримётрическим методом с использованием интеркалирующего красителя Hoechst 33342 («Sigma», Германия) на люминесцентном спектрофотометре MPF-4 («Hitachi», Япония).

Все исследования проводились после получения информированного согласия матери ребенка.

Результаты собственных специальных исследований и их обсуждение

Процентное количество гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов в зависимости от срока гестации.

В группе сравнения, куда входят доношенные новорожденные без клинико-лабораторных признаков осложнений периода адаптации, содержание гиподиплоидных лимфоцитов составило 2Д±0,4% (57,8±11,2 кдеток/нл), гиперплоидных лимфоцитов 1,7±0.5% (57,9±19.2 клеток/нл).

Установлена нелинейная зависимость количества определенной популяции лимфоцитов от гестационного возраста (рис. 1).

I И III IV V

Рисунок 1. Процентное содержание гиподиплоидных (темные столбики) и гиперплоидных (светлые столбики) лимфоцитов в периферической крови новорожденных различного гестационного возраста: по оси X - группы новорожденных, по оси У - содержание лимфоцитов (%).

Во II, III и IV группах новорожденных по сравнению со средними показателями содержания гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов у детей группы сравнения отмечается достоверное повышение среднего процентного и абсолютного количества гиподиплоидных лимфоцитов в периферической крови. Достоверно (р<0,01) максимальное количество лимфоцитов с гиподиплоидным содержанием ядерной ДНК наблюдались у новорожденных с гестационным возрастом 35-37 недель- 9,1±0,8% (259,0±47.1 клеток/нл). У доношенных новорожденных с лабораторно-клиническими признаками осложнений периода адаптации апоптотических лимфоцитов больше примерно в 2,5 раза по сравнению с условно здоровыми новорожденными (р<0,01).

Максимальное количество гиперплоидных лимфоцитов отмечается у новорожденных с гестационным возрастом 31 неделя и менее, что, возможно, указывает на интенсивное протекание процессов деления, пролиферации, лимфоцитов, а, следовательно, и других клеток организма. У новорожденных с гестационным возрастом 35-37 недель, наоборот, зафиксировано минимальное процентное и абсолютное содержание лимфоцитов с повышенным количеством ядерной ДНК (р<0.01).

Нелинейная зависимость содержания гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов от сроков гестации может служить отражением изменений интенсивности процессов апоптоза и пролиферации в различные периоды внутриутробного созревания плода: активность аполтоза постепенно нарастает с 28 недель гестации, достигая максимальных значений в период 35-37 недель, после чего, к моменту рождения, постепенно снижается, а интенсивность процессов пролиферации с максимумом в 31 недели и менее снижается к 35-37 неделям гестации и нарастает к моменту рождения.

Процентное_количество гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов в

зависимости от степени внутриутробной гипотрофии. Установлено, что при любой степени внутриутробной гипотрофии с увеличением срока гестации до 35-37 недель наблюдается достоверное (р<0,01) увеличение процентного количества лимфоцитов с гиподиплоидным содержанием ядерной ДНК до максимального уровня. При дальнейшем увеличении срока гестации до 38 недель и более количество гиподиплоидных клеток снижается (рис. 2).

■ Легкая □ Среднетяж. ШТяжелая ШГруппа сравнения

Рисунок 2. Процентное количество гиподиплоидных лимфоцитов в периферической крови новорожденных различного гестационного возраста в зависимости от степени внутриутробной гипотрофии: по оси X - группы новорожденных, по оси У - количество гиподиплоидных лимфоцитов (%).

Для доношенных новорожденных с внутриутробной гипотрофией средней степени тяжести характерно повышение процентного содержания гиподиплоидных лимфоцитов в периферической крови до значений, соответствующих гестационному возрасту 35-37 недель, при внутриутробной гипотрофии тяжелой степени -понижение показателя до значений, соответствующих гестационному возрасту 31 недели и ниже.

У новорожденных с гестационным возрастом 31 неделя и менее и 32-34 недели с увеличением степени выраженности внутриутробной гипотрофии отмечается уменьшение процентного количества лимфоцитов с гиподиплоидным набором ядерной ДНК. Минимальное значение среднего содержания гиподиплоидных лимфоцитов в периферической крови наблюдается в группе новорожденных со сроком гестации 31 неделя и менее при наличии внутриутробной гипотрофии III степени (1,0±0,7%; р<0,01).

Содержание гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов в зависимости от основной перинатальной патологии.

На рисунке 3 видно, что наиболее интенсивно процессы апоптоза протекают при наличии конъюгационной гипербилирубинемии у доношенных новорожденных и новорожденных со сроком гестации 35-37 недель. При этом варианте осложнения периода адаптации наблюдается достоверно наибольшее количество гиподиплоидных лимфоцитов (максимум зафиксирован у детей со сроком гестации 35-37 недель -11,8±1,5%, или 424,2±113,8 клеток/нл; р<0,01). Наименьшее же содержание исследуемых клеток мы зафиксировали при пневмопатиях у доношенных новорожденных (1,3±0,4%, или 30,2±10,2 клеток/нл; р<0,01) и при гнойно-воспалительных заболеваниях у детей со сроком гестации 31 неделя и менее (1,3±0,3%. или 47,4±11,5 клеток/нл: р<0,01). При наличии пневмопатий или гнойно-воспалительных заболеваний процентное содержание лимфоцитов с гиподиплоидным набором ядерной ДНК достоверно повышается с увеличением гестационного возраста, достигая максимального уровня в 35-37 недель, а потом, ближе к моменту рождения, резко снижается. При перинатальном поражении центральной нервной системы количество гиподиплоидных лимфоцитов достигает максимального уровня уже в 32-34 недели гестации (8,1±2.3%, р<0,05), а потом постепенно снижается.

Абсолютное количество апоптотических лимфоцитов в группе доношенных новорожденных с перинатальным поражением ЦНС (138,9±32,9 клеток/нл) достоверно (р<0,05) выше, чем у здоровых новорожденных (57,8± 11,2 клеток/нл). При пневмопатиях этот параметр имеет достоверно (р<0.01) максимальное значение (164,9±28,6 клеток/нл) у новорожденных со сроком гестации 32-34 недели.

При гнойно-воспалительных заболеваниях самое большое абсолютное количество апоптотических лимфоцитов (231,9±42,1 клеток/нл; р<0,01) зафиксировано у детей с гестационным возрастом 35-37 недель.

Отношение шансов возникновения перинатальной патологии у новорожденных с уровнем гиподиплоидных лимфоцитов > 4% по сравнению с новорожденными, у которых процентное количество гиподиплоидных лимфоцитов менее 4%, составляет 5,6 : 1.

12 10 8 6 4 2 О

Рисунок 3. Процентное количество гиподиплоидных лимфоцитов в периферической крови новорожденных в зависимости от гестационного возраста и основной перинатальной патологии: по оси X - исследуемые группы новорожденных, по оси У - количество гиподиплоидных лимфоцитов (%).

■ ППЦНС □ Пневмопатии ШГВЗ СЭКГБ И Контроль

□ 4,7

08,7

У всех недоношенных новорожденных (I, II, III группы) при любом осложнении течения периода адаптации процентное количество гиперплоидных лимфоцитов

возрастает по сравнению с количеством этих клеток у условно здоровых доношенных новорожденных (табл. 2). В I и II группах новорожденных уровень гиперллоидных лимфоцитов резко повышен у детей с гнойно-воспалительными заболеваниями (максимальный уровень зафиксирован у новорожденных со сроком гестации 32-34 недели - 18,3±1,8%; р<0,01). У детей со сроком гестации 35-37 недель самое большое содержание пролиферирующих лимфоцитов отмечалось у детей с перинатальным поражением центральной нервной системы (5,8±0,8%, р<0,05).

Таблица 2.

Сравнение процентного содержания гиперплоидных лимфоцитов в периферической крови новорожденных различного гестационного возраста в _зависимости от основной перинатальной патологии. _

Изучаемый параметр I 11 III IV V Р

1 2 3 4 5 6 7

Перинатальное поражение центральной нервной системы 3,4±0,3 2,1±0,2 5,8±0,8 1,5±0,2 1.7±0,5 Р2-б<0.05 Р4-б<0,01

Пневмопатии 3,4±0,5 2,2±0,4 3,4±0,6 0,9±0,2 1,7±0,5 Р2-б<0.05 Р4-б<0,05

Гнойно-воспалительные заболевания 9,0±1,1 18,3±1,8 5,0±0,9 4,2±0,7 1,7±0,5 Р2-б<0,01 Рз-б<0,01 Р4-б<0,01 Р5-б<0.05

р - достоверность различий с показателями группы сравнения.

У новорожденных с уровнем процентного содержания гиперплоидных лимфоцитов 3,4% и более шансы на благоприятный исход больше в 2,3 раза, чем у новорожденных с содержанием гиперплоидных лимфоцитов менее 3,4%.

Концентрация внеклеточной ДНК. В группе относительно здоровых доношенных новорожденных концентрация внеклеточной ДНК варьировала в пределах от 9,2 до 55,5 нг/мл со средним значением 22,5 нг/мл.

При исследовании концентрации внеклеточной ДНК плазмы крови у недоношенных новорожденных детей в зависимости от гестационного возраста максимальный уровень концентрации внеклеточной ДНК (68,7 нг/мл) был выявлен у детей со сроком гестации 32-34 недели (р<0.05 по сравнению с условно здоровыми доношенными новорожденными; табл. 3).

Таблица 3.

Уровни концентрации внеклеточной ДНК в исследуемых группах новорожденных

(нг/мл).

Изучаемый параметр I II III IV V

1 2 3 4 5 6

Концентрация внеклеточной ДНК, нг/мл, Ме 44,5 68,7 45,4 53,7 22,5

Из-за широкого варьирования индивидуальных показателей концентрации внеклеточной ДНК достоверных различий в концентрации внеклеточной ДНК в зависимости от перинатальной патологии внутри исследуемых групп обнаружить не удалось (табл. 4).

Таблица 4.

Уровни концентрации внеклеточной ДНК (нг/мл, Ме) в плазме крови новорожденных детей с различными сроками гестации в зависимости от вида

перинатальной патологии.

Основная перинатальная патология I II III IV V

1 2 3 4 5 6

Перинатальное поражение центральной нервной системы 42,0 65,5 62.0 56,5 22,5

Пневмопатии 54.3 81,1 47.1 66,0 22,5

Гнойно-воспалительные заболевания 50,5 80,9 36.5 44,2 22,5

Внутриутробная гипотрофия 17,5 91.1 37.3 49,9 22,5

У новорожденных детей с гестационным возрастом 31 неделя и менее максимальные концентрации внеклеточной ДНК (54,3 нг/мл) отмечены при пневмопатиях.

У новорожденных с гестационным возрастом 32-34 недели значения медиан концентраций внеклеточной ДНК при осложнениях периода адаптации в неонатальном периоде наибольшие по сравнению с детьми других групп. Максимальное значение (91,1 нг/мл) зафиксировано при наличии внутриутробной гипотрофии.

В группе новорожденных с гестационным возрастом 35-37 недель максимальная концентрация ДНК плазмы крови (62 нг/мл) наблюдалась при наличии перинатального поражения центральной нервной системы.

В группе доношенных новорожденных с перинатальной патологией уровень внеклеточной ДНК при всех видах осложнений периода адаптации был выше, чем у детей группы сравнения. Значения концентраций внеклеточной ДНК колеблются примерно от 35 до 66 нг/мл. Максимальное значение отмечается у детей с пневмопатиями - 66,0 нг/мл.

По результатам второго этапа исследования можно особо выделить группу новорожденных с гестационным возрастом 32-34 недели. Концентрация внеклеточной ДНК в этом возрасте была максимальной.

С целью исследования взаимосвязи между концентрацией внеклеточной ДНК и содержанием гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов в периферической крови новорожденных был проведен корреляционный анализ между парными признаками - внеклеточная ДНК и процентное количество гиподиплоидных клеток (г,); внеклеточная ДНК и процентное количество гиперплоидных клеток (г2) (табл. 5).

Таблица 5.

Взаимосвязь концентрации внеклеточной ДНК в плазме крови с количеством гиподиплоидных (Г[) и гиперплоидных лимфоцитов (г2) в периферической крови

^\Срок гестации Коэф>^. корреляций-^ I II III IV Р

1 ^ 2 3 4 5 6

Г| 0,82 0,69 0,54 0,37 Р2<0,01 Р3<0,05 Р4<0,05

Г2 0,08 0,71 0,57 0,40 Р3<0,01 Р4<0.05 Р,<0,05

У доношенных новорожденных изменение концентрации внеклеточной ДНК не связано с количеством апоптотических лимфоцитов, но достоверно коррелирует с количеством гиперплоидных лимфоцитов, что указывает на возможность происхождения внеклеточной ДНК из пролиферирующих лимфоцитов. У новорожденных детей с гестационным возрастом 35-37 и 32-34 недели наблюдалась прямо пропорциональная зависимость концентрации внеклеточной ДНК от содержания пролиферирующих и апоптотических клеток, а у новорожденных с

гестационным возрастом 31 неделя и менее выявлена взаимосвязь концентрации внеклеточной ДНК только с апоптотическими клетками.

Полученные результаты свидетельствуют о происхождении внеклеточной ДНК, а именно, что внеклеточная ДНК в кровотоке недоношенных новорожденных детей может происходить из апоптотических лимфоцитов, а у доношенных - из лролиферирующих.

Выявленная однонаправленность реакций при различных заболеваниях в зависимости от степени возрастной патологии отражает наличие этиологического фактора, общего для исследованных заболеваний. Рассмотрение каждого заболевания в отдельности позволило предположить, что общим этиологическим фактором для всех исследованных типов перинатальной патологии является гипоксия, приводящая к усилению апоптоза клеток (М. 81ау1коуа, 1989) с дальнейшим развитием какого-либо варианта осложнения периода адаптации у новорожденного ребенка в зависимости от гестационного возраста.

Таким образом, клеточная (ядерная) и внеклеточная (плазменная) ДНК отражают морфофункциональное состояние лимфоцитов и непосредственно участвуют в патогенезе различных клинических вариантов осложнений периода адаптации. Параметры нуклеиновых кислот могут считаться одними из критериев для оценки состояния адаптации новорожденных различного гестационного возраста, что позволяет врачу прогнозировать течение неонатального периода в клинической практике.

17

ВЫВОДЫ

1. В группе условно здоровых новорожденных детей показатели содержания гиподиплоидных лимфоцитов составляют 2,1±0,4%, или 57,8±11,2 клеток/нл, гиперплоидных лимфоцитов - 1,7±0.5%, или 57,9±19,2 клеток/нл, концентрации внеклеточной ДНК 22,5 нг/мл (от 9,2 до 55.5 нг/мл)

2. У новорожденных с гестационным возрастом 31 неделя и менее преобладают гиперплоидные лимфоциты (2,3±0,4%, или 89,2±19,0 кл/нл). С увеличением гестационного возраста уровень гиперплоидных лимфоцитов снижается, достигая минимальных значений к 35-37 неделям гестации (1,2±0,3%. или 22,2±4,0 кл/нл), а содержание гиподиплоидных лимфоцитов к 35-37 неделям гестации возрастает до максимума (9,0±0,8%, или 259,0±47,1 кл/нл).

3. При наличии клинико-лабораторных признаков осложнений периода адаптации в раннем неонатальном периоде наблюдается однонаправленная динамика изменения уровня гиподиплоидных лимфоцитов в сторону увеличения независимо от вида перинатальной патологии. У новорожденных с гнойно-воспалительными заболеваниями отмечаются максимальные значения гиперплоидных лимфоцитов у детей с гестационным возрастом 31 неделя и менее - 2,8±0,4%, у детей с гестационным возрастом 32-34 недели - 5,3±1,3%; у доношенных новорожденных - 4,2±0,7%. В группе новорожденных с гестационным возрастом 35-37 недель максимальное значение гиперплоидных лимфоцитов установлено при перинатальном поражении ЦНС - 5,8±0,8%.

4. У новорожденных с клиническими проявлениями срыва адаптации в раннем неонатальном периоде независимо от гестационного возраста наблюдается статистически значимое повышение концентрации внеклеточной ДНК. Наиболее значимые отличия от группы сравнения регистрировались у новорожденных с гестационным возрастом 31 неделя и менее при пневмопатии- 54,3 нг/мл. у недоношенных с гестационным возрастом 32-34 недели при внутриутробной гипотрофии - 91,1 нг/мл, у новорожденных с гестационным возрастом 35-37 недель при наличии перинатального поражения центральной нервной системы - 62 нг/мл, у доношенных детей при пневмопатиях - 66 нг/мл.

5. У новорожденных с уровнем процентного содержания гиподиплоидных лимфоцитов 4% и более риск возникновения перинатальной патологии выше в 5.6 раз, чем у новорожденных с уровнем процентного содержания гиподиплоидных лимфоцитов менее 4%. У новорожденных с уровнем процентного содержания гиперплоидных лимфоцитов 3,4% и более шансы на благоприятный исход больше в 2,3 раза, чем у новорожденных с содержанием гиперплоидных лимфоцитов менее 3,4%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Предлагается для прогнозирования течения периода ранней неонатальной адаптации определение показателя процентного содержания лимфоцитов со сниженным количеством ядерной ДНК. При уровне гиподиплоидных лимфоцитов 4% и более новожденного ребенка следует отнести к группе риска по возникновению перинатальной патологии (пневмопатии, гнойно-воспалительных заболеваний, перинатального поражения центральной нервной системы, конъюгационной гипербилирубинемии)

2. Для прогнозирования исхода возникшего срыва адаптации у новорожденного ребенка предлагается определение показателя процентного количества лимфоцитов с повышенным содержанием ядерной ДНК. Детей с показателем менее 3,4% рекомендуется выделять в группу риска по неблагоприятному исходу (инвалидизация, летальный исход).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Relationship between Cell-free DNA and Antibodies against DNA in Bloodstream of Newborns / N.O.Tuaeva. V.V.Sofronov, V.A.Emikeeva, D.M.Mustafina, D.I.Shegurova // Bioscience 2006 - bioscience for the 21st century. July. - SECC. - Glasgow, UK, 2006. - P.94.

2. Изменение содержания ядерной и внеклеточной ДНК у новорождённых с клиническими проявлениями нарушения адаптации в раннем неонатальном периоде / В.В.Софронов, Н.О.Туаева, В.Г.Винтер, В.А.Емикеева, Д.И.Шегурова, Е.В.Маврина // Вопросы современной педиатрии. - 2006. - т 5.- №6. - С. 28-31

3. Шегурова Д.И. Количественная оценка ДНК лимфоцитов у новорожденных групп риска методом проточной цитофлуометрии / Д.И.Шегурова, В.В.Софронов //Казанский медицинский журнал. -2006. -т.87, приложение. - С. 151

4. Характеристика ядерной и внеклеточной ДНК у новорожденных в зависимости от гестационного возраста / В.В.Софронов, Н.О.Туаева,

B.Г.Винтер, В.А.Емикеева, Д.И.Шегурова // Российский педиатрический жу рнал. - 2006. - №6. - С.13-15

5. Шегурова Д.И. Процентное содержание гиподиплоидных лимфоцитов в периферической крови детей новорожденного периода с различным весом при рождении / Д.И.Шегурова, В.В.Софронов, Д.И.Марапов // Сборник материалов XI конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 58 февраля 2007.-С.766

6. Шегурова Д.И. Изучение содержания лимфоцитов с гиподиплоидным набором ДНК у новорожденных детей в зависимости от веса при рождении / Д.И.Шегурова // Сборник тезисов XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». Казань. 25-26 апреля 2007. -

C. 167

7. Хасанов A.A. Использование методов профилактики врожденных пороков развития плода / А.А.Хасанов, Д.И.Марапов, Д.И.Шегурова // Казанский медицинский журнал. — 2007. — Том 88, №4 . — С. 331-335

8. Шегурова Д.И. Взаимосвязь концентрации внеклеточной ДНК и состоянием популяции лимфоцитов в периферической крови у детей раннего неонатального периода / Д.И.Шегурова, В.В.Софронов // Сборник материалов XII Конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии. Москва. — 2008.-С. 385

9. Шегурова Д.И. Определение процентного количества гиподиплоидных лимфоцитов у детей в раннем неонатапьном периоде в зависимости от срока гестации / Д.И.Шегурова // Сборник тезисов XIII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине», Казань, 23-24 апреля 2008. - С. 131-132

10. Шегурова Д.И. Содержание гиподиплоидных клеток у новорожденных при асфиксии / Д.И.Шегурова, В.В.Софронов, Н.А.Абрамзон// Сборник материалов XIII Конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии, Москва. - 2009. - С. 453

11. Шегурова Д.И. Изменение показателей апоптоза у новорожденных с задержкой внутриутробного развития / Д.И.Шегурова, В.В.Софронов, И.Г.Мустафин, С.А.Любин // Сборник материалов XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине» 29-30 апреля 2009. Приложение к журналу «Городское здравоохранение». - Казань. - 2009. - С. 102

12. Шегурова Д.И. Особенности количественного содержания гиподиплоидных лимфоцитов у новорожденных, находящихся на лечении в реанимационном отделении / Д.И.Шегурова. В.В.Софронов, С.А.Любин, И.Г.Мустафин // Сборник материалов Пятого Российского конгресса "Педиатрическая анестезиология и интенсивная терапия". - Тверь: ООО "Издательство "Триада". - 2009. - С. 230

Список сокращений:

ВУГ - внутриутробная гипотрофия ГВЗ - гнойно-воспалительные заболевания ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота КГБ - конъюгационная гипербилирубинемия П/п - пневмопатии

ППДНС - перинатальное поражение центральной нервной системы

Актуальность темы.

Многие патологические процессы периода новорожденное™ оставляют глубокий; след и могут проявиться на любом возрастном этапе всей последующей жизни, несмотря на высокие репаративные возможности организма в раннем постнатальном онтогенезе (Н.Н.Володин, 2008; Г.Н.Чистякова, 2005; Е.В.Аронскинд и др., 2004; Н.П:Шабалов, 2004; Ю.И.Барашнев, 2001; Е.В.Шниткова и др., 2000; М.С.МсСогшс с1а1, 1992). Воздействие патогенных факторов связано с патологией и осложнениями беременности и обусловливает, в свою очередь, неудовлетворительное клиническое состояние, новорожденных детей. Неблагоприятное течение беременности отрицательно влияет на развитие плода, обусловливает быструю, истощаемость . и неадекватность реакции адаптации в неонатальном периоде (В.В.Деревцов, 2010; Н.Н.Володин, 2008; Н.О.Туаева, 2007; Н.П.Шабалов, 2004):

В связи с этим, актуально определить наиболее раннее звено в цепи патологических событий, приводящих к серьезным осложнениям течения неонатального периода, которое могло бы явиться доманифестным критерием состояния здоровья новорожденного ребенка.

Известно, что характер адаптационных реакций определяется состоянием нуклеиновых кислота: РНК отвечает за кратковременную адаптацию, а ДНК - за долгосрочную (Д.С.Саркисов, 1987, 1993). С учётом -данного-положения~оценка~параметров клеточной и внеклеточной ДНК позволяет разработать методы долговременного прогнозирования исходов срыва адаптации у новорожденного ребенка в раннем неонатальном периоде.

Работ, посвященных изучению ядерной ДНК лимфоцитов и внеклеточной ДНК в педиатрической науке и практике, к сожалению, крайне мало. Имеются лишь единичные литературные источники, посвященные исследованию ядерной ДНК у новорожденных (В.Ю.Талаев, 1997, 1998, 1999; В.В.Софронов, 1999; Н.Е.Громада, 2008). Но информация, содержащаяся в них, разноречива в силу различных методических подходов с использованием рутинных (качественных и полуколичественных) методов определения нуклеиновой кислоты. Данные, представленные в источниках литературы, немногочисленны, нуждаются в дополнениях и систематизации.

Научная новизна.

Получены новые научные данные о параметрах ядерной и внеклеточной у новорожденных различного гестационного возраста с различными осложнениями периода адаптации.

Научно доказано клиническое значение роли количества гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов в формировании адаптационных процессов у новорожденных различного гестационного возраста.

Установлены повышенные уровни гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов и концентрации внеклеточной ДНК у новорожденных различного гестационного возраста с различной перинатальной патологией.

С помощью комплексных исследований получены новые данные, которые существенно расширяют возможности раннего прогнозирования осложнений—периода адаптации у новорожденных различного гестационного возраста.

Объект исследования.

Дети в возрасте 0-28 суток жизни

Предмет исследования.

Кровь новорожденных детей

Методы исследования.

• Клинические (сбор анамнеза, осмотр, перкуссия, аускультация);

• параклинические (общий анализ крови, биохимический анализ крови, УЗИ головного мозга и органов брюшной полости, рентгенография);

• специальные методы исследования (метод проточной цитофлуометрии с использованием пропидиума йодида, флуоресцентная спектрофотометрия с использованием флуоресцентного зонда Hoechst);

• статистические (корреляционный анализ, метод регрессии, описательной статистики, параметрический анализ, математический анализ с использованием нескольких статистических критериев — Краскела-Уоллиса, Манна-Уитни и Ван-дер-Вардена).

Цель работы.

Разработка метода прогнозирования течения периода ранней неонатальной адаптации у новорожденных различного гестационного возраста на основании результатов изучения особенностей параметров ядерной и внеклеточной ДНК.

Задачи исследования.

1. Исследовать и сравнить цитофлуометрические характеристики ядерной ДНК лимфоцитов у новорожденных различного гестационного возраста;

2. Исследовать особенности цитофлуометрических характеристик ядерной ДНК лимфоцитов у новорожденных с осложнениями периода адаптации;

3. Определить концентрацию внеклеточной ДНК у новорожденных различного срока гестации с различными клиническими вариантами течения периода ранней неонатальной адаптации;

4. На основании полученных результатов разработать методы прогнозирования течения периода ранней неонатальной адаптации новорожденных.

Научные положения, выносимые на защиту.

1. Параметры ядерной ДНК лимфоцитов определяются сроком гестации и наличием перинатальной патологии новорожденных;

2. Параметры внеклеточной ДНК у новорожденных детей определяются гестационным возрастом и наличием перинатальной патологии;

3. Оценка параметров ядерной и внеклеточной ДНК в раннем неонатальном периоде позволяют прогнозировать осложнения периода адаптации у новорожденного ребенка.

Научно-практическая значимость.

1. Получены новые знания о процессах апоптоза и пролиферации лимфоцитов периферической крови новорожденных с различными вариантами течения периода ранней адаптации и различными сроками гестации. Результаты исследования могут быть использованы для понимания процесса формирования и становления адаптационных систем у новорожденных и разработки нового теоретического и методологического подхода к раннему прогнозированию осложнений неонатального периода.

2—Установлены значения гиподиплоидных й гиперплоидных лимфоцитов и концентрации внеклеточной ДНК для условно здоровых доношенных новорожденных с неосложненным течением периода ранней неонатальной адаптации.

3. Рекомендовано применение показателя процентного содержания лимфоцитов с гиподиплоидным и гиперплоидным количеством ядерной ДНК при оценке зрелости новорожденных.

4. Доказана прогностическая значимость увеличения содержания гиперплоидных лимфоцитов при наличии гнойно-воспалительных заболеваний у доношенных новорожденных и детей со сроками гестации 32-34 недели и 31 неделя и менее, а также при перинатальном поражении центральной нервной системы у детей со сроком гестации 35-37 недель.

5. Разработана теоретическая и методологическая база для нового подхода в прогнозировании осложнений раннего неонатального периода на основе анализа параметров клеточной и внеклеточной ДНК у новорожденных детей.

Область применения результатов.

Результаты работы в дальнейшем могут быть использованы в учебном процессе медицинских ВУЗов и в практической медицине (педиатрии, в частности, неонатологии) для оценки состояния новорожденных и прогнозирования осложнений периода ранней неонатальной адаптации, а также прогнозирования развития осложнений в раннем детском возрасте, в том числе неврологических, иммунных, эндокринных.

Список публикаций

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 9 тезисов и 3 статьи в центральных изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией. Общий объем публикаций 1,7 у.п.л., в том числе личный вклад автора составляет 0,7 у.п.л.

Апробация и внедрение результатов

Основные результаты исследований докладывались на ежегодной научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» Казанского государственного медицинского университета- (2008 г.), на V

Научно-практической конференции «Педиатрия и детская хирургия в Приволжском федеральном округе» (2008), «Bioscience 2006 - bioscience for the 21st century», (23 - 27 July, Glasgow, UK, 2006).

Результаты исследования внедрены в практику работы отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных МУЗ «Детская городская больница №1» г. Казани. Материалы диссертации используются в учебном процессе кафедры пропедевтики детских болезней и факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета, кафедры госпитальной педиатрии с курсами поликлинической педиатрии и ПДО ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Структура и объем диссертации

ВЫВОДЫ

1. В группе условно здоровых новорожденных детей установлены нормативы содержания гиподиплоидных лимфоцитов - 2,1 ±0,4%, или 57,8± 11,2 клеток/нл, гиперплоидных лимфоцитов. — 1,7±0,5%, или 57,9±19,2 клеток/нл, концентрации внеклеточной ДНК 22,5 нг/мл (от 9,2 до 55,5 нг/мл).

2. У новорожденных с гестационным возрастом 31 неделя и менее преобладают гиперплоидные лимфоциты (2,3±0,4%, или 89,2± 19,0 кл/нл); С увеличением; гестационного возраста уровень гиперплоидных лимфоцитов снижается, достигая минимальных значений к 35-37 неделям гестации (1,2±0,3%, или 22,2±4,0 кл/нл), а содержание гиподиплоидных лимфоцитов к 35-37 неделям гестации возрастает до максимума (9,0±0,8%, или 259,0±47,1 кл/нл).

3. При наличии клинико-лабораторных признаков осложнений периода адаптации в раннем неонаталыюм периоде , наблюдается однонаправленная динамика изменения уровня гиподиплоидных лимфоцитов в сторону увеличения независимо от вида перинатальной патологии. Максимальные значения гиперплоидных лимфоцитов у новорожденных с гестационным возрастом менее 35 недель и у доношенных новорожденных отмечаются при гнойно-воспалительных заболеваниях; в группе новорожденных, с гестационным возрастом 35-37 недель — при перинатальном поражении ЦНС.

4. У новорожденных с клиническими проявлениями срыва адаптации в раннем неонатальном периоде независимо от гестационного возраста наблюдается статистически значимое повышение концентрации внеклеточной ДНК. Наиболее значимые отличия от группы