Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Моноклональные антитела в иммунохимических исследованиях белков и гликопротеинов

-г о, а

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ

На правах рукописи

УДК 577.152.11 Ь

ВАСИЛОВ Раиф Гаяиович

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ИММУНОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ БЕЛКОВ И ГЛИКОПРОТЕИНОВ

14.00.36 — Аллергология и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме доклада

Москва, 1991

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте биотехнологии Министерства медицинской промышленности СССР.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ — академик Р. В. ПЕТРОВ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Г. И. АБЕЛЕВ, член-корреспондент АН СССР,

доктор биологических наук, профессор А. А. ВОРОБЬЕВ, академик АМН СССР, доктор медицинских наук, профессор А. А. ЯРИЛИН, член-корреспондент РАЕН, доктор медицинских наук, профессор

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова АМН СССР

Защита состоится «?-> » 1991 г. в . . часов

на заседании специализированного совета Д0740901 по защите диссертации на, соискание ученой степени доктора наук при Институте иммунологии Минздрава СССР по адресу: г. Москва, Каширское шоссе, д. 24

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инсти--тута иммунологии Минздрава СССР.

Автореферат .разослан « ».....1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

А. В. КОЛОБОВ

обДОГЛьсй--"!

с». 8.3..:азм|

Отдел 1

диссертаций I

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Цель работы.

Научная новизна и практическая значимость.

Апробация работы. Публикации. Структура работы..........1

I. ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ............................ 4

1.1. Бактериородопсин

1.2. Иммуноглобулин Е

1.3. Н-2 антигены

II. ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА АНТИГЕНОВ ГИСТОСОВМЕСТШОСТИ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ

МОНОКЛОНАЛЬННХ АНТИТЕЛ ............................ 22

III. МОНОЮЮНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ БИОСИНТЕЗА БЕЛкОВ И ГЛИКОПРОТЕИНОВ................. 30

IY. ПРИМЕНЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬННХ АНТИТЕЛ ДЛЯ СОЗДАНИЯ СИСТЕМ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ..................... 37

4.1. Тест-системы для определения IgE

4.2. Тест-система для определения теофиллина

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ ................................... 46

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ... 48

ИФА

мкАт

1§Е

ХбО

БАВ

ГКГ

Н-2

НЬА

ГТК

ТМ

КЬН

вэжх

ДСН ПААГ

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

иммуноферментный анализ

моноклональные антитела

иммуноглобулин Е

иммуноглобулин Р

биологически активные вещества

главный комплекс гистосовместимости

главный комплекс гистосовместимости мыши

главный комплекс гистосовместимости человека

гомозиготные типирующие клетки

туникамицин

гемоцианин моллюска фиссуреллы высокоэффективная жидкостная хроматография электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

Актуальность проблемы.- Одним из наиболее важных и перспективных разделов медико-биологической науки является иммунобиотех-нология, возникшая на стыке иммунологии и биотехнологии и связанная , в первую очередь, с разработкой методов получения мкАт к различным биологически активным веществам и изучением биологических и физико-химических основ их взаимодействия, а также разработкой способов применения мкАт в фундаментальных и прикладных исследованиях. Перспективы развития этой области исследований связаны как с практическими аспектами применения мкАт: создание систем иммуноанализа для обнаружения БАВ в биологических жидкостях, иммуносорбентов для выделения БАВ из сложных смесей, нового поколения лекарственных препаратов,- так и с уникальными возможностями применения мкАт для структурного и функционального изучения молекул, клеток и сложных биологических систем. Развитие указанного направления исследований требует разработки научных основ получения и применения мкАт как важной задачи современной иммунологии. Решение этой проблемы позволит перейти при получении мкАт от сугубо эмпирических подходов, основанных на скрининге, к направленному конструированию антиген-связывамцих центров антител с любыми заданными свойствами. Определяющим условием для успешного выполнения этих работ является детальное изучение механизмов взаимодействия антиген-антитело, структуры отдельных антигенных детерминант, а также антигенной структуры молекул в целом. Иными словами, необходима детальная разработка иммунохимии мкАт. Для решения этой задачи нам представлялось целесообразным применить методические подходы, разработанные в классической серологии, к исследованиям, проводимым с помощью мкАт. В качестве объектов исследования были использованы мембранный белок бактериородопсин, антигены гистосовместимости и иммуноглобулины. ~

Исследование антигенной структуры белков ГКГ имеет самостоятельное важное значение в плане выяснения структурных основ полиморфизма - уникальной особенности этих молекул, лежащей в основе их биологических функций. Нами была исследована возможность применения комплекса биохимических и иммунохимических подходов с использованием мкАт для изучения полиморфизма этих молекул.

Моноклональные антитела, являясь уникальным инструментом для структурно-функциональных исследований, сами представляют удобную модель для изучения биосинтеза гликопротеинов, в частности, таких аспектов, как процессинг углеводных цепей, внутриклеточная сборка, транспорт, секреция. Вследствие отсутствия адекватных моделей

подобные исследования проводились ранее в весьма ограниченном объеме . Нам представлялось целесообразным провести эти исследования на гибридомных клеточных линиях, а также трансфектомах. Предлагаемые нами подходы с использованием ингибиторов гликозилирования, ферментов углеводного обмена и ряда оригинальных биохимических методов могут быть распространены на другие системы.

Важнейшей областью применения мкАт является конструирование тест-систем, предназначенных для обнаружения и, количественного определения БАБ в биологических жидкостях. Нам представлялось целесообразным разработать общие подходы к конструированию различных вариантов тест-систем на основе мкАт для определения как биополимеров ( на примере IgE ), так и низкомолекулярных соединений ( теофиллин )■ Эти подходы могут быть использованы при создании диагностикумов других типов.

Цель работы. Настоящая работа посвящена разработке общих методов структурно-функционального изучения белков и гликопротеи-нов с помощью моноклональных антител (антигенная структура, полиморфизм и биосинтез) и создания тест-систем на основе моноклональных антител.

Научвая новизна и практическая значимость. Предложены новые подходы к изучению антигенной структуры и полиморфизма белков и гликопротеинов с использованием моноклональных антител, протеоли-тических фрагментов молекул и синтетических пептидов. Впервые исследована антигенная структура интегрального мембранного белка бактериородопсина и уточнена его топография в мембране. Разработаны подходы для локализации эпитопов антигенов гистосовместимос-ти и изучения их полиморфизма. Проведено широкое изучение биохимического полиморфизма антигенов I класса главного комплекса гис-тосовместимости человека. Проведено исследование биосинтеза и ^Е с использованием ингибиторов гликозилирования, выявлены общие закономерности процессинга иммуноглобулинов у миелом, гибридом и трансфектом.

В ходе работы разработан ряд новых методических приемов, из которых, в первую очередь, следует отметить следующие: показана возможность точной локализации антигенных детерминант с помощью комбинации химической и ферментативной модификации и синтетических пептидов (бактериородопсин, Н-2 антигены); на примере З^Е показана возможность изучения тонкой антигенной специфичности мкАт с помощью протеолиза и-вестерн-блота; на примере НЬА-А,В антигенов показана возможность изучения полиморфизма с помощью мкАт к

мономорфным детерминантам в комбинации с двумерным электрофорезом; показана возможность использования опытов с импульсной меткой в сочетании с ингибиторами гликозилирования для изучения роли гликозилирования в транспорте и секреции IgE в миеломах, гибридо-мах и трансфектомах; разработаны высокоэффективные методы получения антител к коротким пептидам, изучения взаимодействия мкАт с пептидами.

В ходе работы было получено более 30 мкАт к 10 физиологически активным веществам, которые тщательно охарактеризованы по иммуно-химическим и биохимическим параметрам.

Разработаны 6 тест-систем для определения IgE и тест-систе^ для лекарственного мониторинга теофиллина.

Созданные мкАт и тест-системы нашли широкое применение в медико-биологических и клинических исследованиях в нашей стране и за рубежом.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 5-ом Международном иммунологическом конгрессе (Киото, Япония, 1983), на III советско-швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функция" (Ташкент, 1983), на Всесоюзном совещании по генетике соматических клеток (Звенигород, 1983), на 16-ой конференции ФЕБО (Москва, 1984), на IV Всесоюзной межуниверситетской конференции по биологии клетки (Тбилиси, 1985), на Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзимологии (Махачкала, 1986), на 2-ой Всесоюзной конференции по фармакокинетике (Каунас, 1987), на 1-ой и 2-ой Всесоюзных конференциях "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1988; Москва, 1990), на 1-ом Всесоюзном иммунологическом сьезде (Дагомыс, 1989), на республиканской конференции "Иммуноферментный анализ в медицине" (Харьков, 1989), на 6-ом международном конгрессе по быстрым методам иммуноанализа RAMI-90 (Хельсинки,' 1990), на Международном симпозиуме "IgE: регуляция синтеза и клиническая значимость" (Москва, 1990), на годичном собрании Европейской Академии аллергологии и клинической иммунологии (Цюрих, 1991), на Международной конференции "Медицинская биотехнология, иммунизация, СПИД" (Ленинград, 1991).

Публикации, по материалам диссертации опубликовано 65 работ, получены 3 авторских свидетельства.

Структура работы. Материалы работы распределены по главам в следующем порядке. В I главе анализируются подходы к изучению антигенной структуры белков с помощью моноклональных антител. Представлены результаты иммунохимического изучения мембранного фото-рецепторного белка бактериородолсина, антигенов гистосовмесгимос-ти и иммуноглобулина Е. В главе II проводится анализ полиморфизма антигенов гистосовместимости с помощью моноклональных антител. В главе III рассматриваются возможности изучения биосинтеза гликоп-ротеинов на модели моноклональных и рекомбинантных антител. В главе IV суммированы данные- о разработанных иммуноферментных тест-системах.

Основная часть результатов получена в соавторстве с И. X). Втю-риной, Н.П.Даниловой, Е.Я.Смирновой, Э.Н.Цыциковым, В.В.Юровским. Вклад других соавторов отражен в публикациях по теме диссертации. Всем коллегам автор приносит благодарность за участие в совместных работах.

I. Изучевие автнгенвой структуры белков с помощью моноклональных антител

Методы применения антисывороток в иммунохимических исследованиях разрабатывались на протяжении десятилетий,' начиная с классических работ Ландштейнера. Появление моноклональных антител (Ке-лер и Мильштейн,1975) поставило принципиально новые проблемы как к определению понятия специфичности антител, так и к методологии их применения, вызвав необходимость разработки иммунохимии мкАт. С одной стороны, в силу своей природы, связанной, в частности, с однородностью антиген-связывающих центров, мкАт являются уникальными структурными зондами. С другой - в настоящее время имеется лишь ограниченная информация о действительной специфичности мкАт; ситуация осложняется данными о возможной полиспецифичкости анти-генсвязывающих центров, что было предсказано ранее ТаImage (1956). Опыт применения мкАт; а также различных способов их получения, в частности, с использованием систем иммунизации in vitro и трансгенных животных, заставляет пересмотреть традиционные представления об антигенности и иммуногенности белков, в частности, об антигенной структуре белков.

Традиционное представление о наличии весьма ограниченного количества антигенных детерминант (эпитопов) на поверхности молекулы белка (Atassi, 1972) представляется в настоящее время неточным. В то же время спорной представляется и другая крайняя точка

зрения, согласно которой вся поверхность молекулы белка представляет сплошную антигенную детерминанту (Sercarz,1983). Исходя из определения антигенной детерминанты как особого структурного участка молекулы, обладающего повышенной способностью образовывать комплексы с антигенсвязывающим центром антитела, по-видимому, необходимо, во-первых, рассматривать вопрос об антигенных детерминантах в неразрывной связи с антигенсвязывающими центрами, во-вторых, допускать возможность образования неограниченного количества комбинаций антигенная детерминанта-антигенсвязывающий центр при критическом значении параметров взаимодействия, определяемых свойствами как антигена, так и антитела.

Методы создания рекомбинантных антител ( Gregory, 1988 ) вообще снимают принципиальные ограничения обусловленные явлением иммуногенности на возможность конструирования антигенсвязывающих центров, взаимодействующих с любыми участками структуры молекулы белка. В то же время, мкАт, полученные с помощью традиционных методов иммунизации, могут иметь важное преимущество для выявления антигенных детерминант, играющих важную роль в осуществлении биологических функций молекул.

В связи с вышеизложенным, представляются важными исследования антигенной структуры белков и их антигенных детерминант с применением мкАт. Наряду с выяснением особенностей мкАт в качестве структурных зондов, эти исследования могут дать дополнительную информацию о структурных основах функционирования молекул белков.

Среди возможных обьектов исследования мы использовали молекулы бактериородопсина, Н-2 антигенов и иммуноглобулина Е. Предполагалось, что применение мкАт позволит получить новые данные о структуре и функциях указанных молекул, являющихся важными объектами исследований в молекулярной биологии и иммунологии. В каждом случае были использованы по 2 независимых метода исследования антигенной структуры молекул, адаптированные нами для мкАт Стабл.1).

1.1. Бактериородопсин

Бактериородопсин - интегральный мембранный белок бактерии H.halobium - играет важную роль в энергетике этих организмов, являясь фотоиндуцируемым протонным насосом. Благодаря установлении полной аминокислотной последовательности и принципов пространственной организации полипептидной цепи он является удобным объектом для изучения антигенной структуры мембранных белков. Установ-

Табл.1. Метода модификации белков, использованные при

изучении их антигенной структуры с помощью мкА.т

Обьект исследования Метод

фрагмента^ с помощью протеолиза химическая и энзиматачес-кая модифиация синтетические пептиды

Бактериородопсин ♦ * -

Н-2 антигены - ♦

IgE -

Табл.2, взаимодействие мкАт с фрагментами бактериородопсина

мкАт Связывание мкАт с различными антигенами Область полипептидноя цепи бактериородопсина. содержащая антигенную детерминанту

ПМ ВО Bi С2 BrCN BrCN ВгВгСИ Br^N Br_ÇN Br^N . BNPS BrCN СтП" -11

ID2GI + + + + - + --- - - - 1 20 <Glu—Met

Н5Е5 + + ++ -"- - 33 и Glu -Met

AuHj + +--- - +■ - + - ist ISI Phe -M«»

ID2R1 + +- -- -+--■+ + iso 20» Leu —Met

н5г3 + + -- -- +-- + - + HO 209 Leu -Met

ПМ - пурпурная мембрана, БО - днлипидированный бактериородопсин, В1, В2, С2, BrCN-1, ВгСН-2, BrCN-6, BrCN-7/ BrCM-9, BrCN-11, BNPS-скатол -Фрагменты молекулы бактериородопсина (см.рис.1).

ление топографии бактериородопсина в мембране является необходимым этапом на пути к выяснению механизма функционирования этого белка..

Для изучения антигенной структуры и антигенных детерминант БР нами была получена панель мкАт, взаимодействующих как с нативным (встроенным в мембрану) функционально активным БР, так и с денатурированным (делипидированным) белком. Было установлено, что указанные мкАт распознают в качестве антигенных детерминант линейные участки аминокислотной последовательности молекулы БР. Это позволило провести углубленное изучение антигенной структуры БР и с высокой точностью локализовать антигенные детерминанты. Были использованы 3 методических подхода: 1) исследование взаимодействия мкАт с набором индивидуальных пептидов, перекрывающих всю последовательность молекулы; 2) исследование взаимодействия мкАт с фрагментами молекулы, подвергнутыми направленной сайт-специфической химической и энзиматической модификации; 3) исследование взаимодействия мкАт с набором фрагментов молекулы, полученных путем ступенчатой деградации по Эдману исходного фрагмента, содержащего антигенную детерминанту*. Оценка взаимодействия проводилась с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), который в данном случае являлся полуколичественным и достаточно чувствительным методом для выявления принципиальных особенностей взаимодействия антиген-антитело.

На первом этапе исследования было установлено приблизительное расположение антигенных детерминант, распознаваемых мкАт Ю2в1,Н5Е5, А14НЗ, Ю21и,Н5ГЗ, вдоль полипептидной цепи БР. Для этого было исследовано взаимодействие каждого мкАт с набором из 13 индивидуальных протеолитических фрагментов БР (табл.2). В трех случаях (мкАт А14НЗ,Ю21и и ЮТЗ) благодаря наличию перекрывающихся фрагментов БР области расположения антигенных детерминант были локализованы с большой степенью точности (рис.1).

* фрагменты БР, а также его производные, были получены в группах, руководимых д.х.н.Н.Г.Абдулаевым и д.х.н.В.И.Цетлиным (ИБХ АН СССР)

Bl

71

166

B2

C2

190

231

248

BNPS-1

20

33

66 72

116

146

|BrCN2 BrCN 1| BrCN10| BrCNl krCNdl

BrCNS |BrCN7 ■ 3rCN9|

21

32

119

164 203

20

IDSQ,

33

66

168 1B3 ISO 209

He Es

A,4H3IDaR ,;HS F3

Рис.1. Локализация антигенных детерминант БР с помощью перекрывающихся фрагментов.10261, Н5Е5, А14НЗ,

и Н5РЗ - мкАт -области полипептидной цепи, в пределах которых локализованы антигенные детерминанты.

Н.Б

IOIRI

IM ■•> IIF IM tat iis IH II; IM IH MO

AI.HI

.Рис.2. влияние последовательного "отщеплЕНия амянокнслотных остатков от Фрагментов БР на взаимодействие с мкАт. 'Отщепление производилось с помощью ступенчатой деградации по Эдману фрагментов БР. (А) взаимодействие мкАт H5F3 и ID2R1 с укороченными фрагментами BNPS-1 (Lea lS0-Gly231); (В) взаимодействие мкАт А14НЗ с укороченными фрагментами В2 (Phel56-Gly231)'. По вертикали ука-эано взаимодействие мкАт с укороченными Фрагментами после отщепления определенных аминокислотных остатков (иэмерение проводилось методом ИФА)j по горизонтали указана аминокислотная последовательность фрагментов.

На следующем этапе было исследовано влияние селективной модификации определенных участков молекулы БР на взаимодействие с мкАт. Было установлено, что модификация остатков Asp и Glu (с помощью этилендиамина в присутствии водорастворимого карбодиимида) приводит к ингибированию взаимодействия БР с мкАт Н5Е5 и ID2R1, не влияя при этом на взаимодействие других мкАт. В совокупности с предварительными данными о расположении антигенных детерминант вдоль полипептидной цепи, полученными в опытах с протеолитически-ми фрагментами, и данными по аминокислотной последовательности БР, это позволило сделать вывод о том, что в состав антигенных детерминант, распознаваемых мкАт Н5Е5 и ID2R1, входят остатки Asp36 и/или Asp38 и Glul94 и/или G1U204, соответственно.

Для выявления функционально важных аминокислотных остатков, входящих в состав антигенных детерминант, распознаваемых мкАт H5F3, ID2R1 и А14НЗ, успешным оказался разработанный нами оригинальный подход, заключавшийся в следующем. Пептид, в границах которого находилась антигенная детерминанта, подвергался обработке ферментом с последовательным отщеплением по одному аминокислотному остатку. Набор укороченных пептидов исследовался на взаимодействие с мкАт (рис.2). С помощью этого подхода удалось установить, что остаток Glul94 входит в состав антигенной детерминанты, распознаваемой мкАт ID2R1, а остаток Phel56 входит в состав антигенной детерминанты, распознаваемой мкАт А14НЗ.

Таким образом, в результате изучения взаимодействия мкАт с фрагментами БР были определены участки полипептидной цепи, в пределах которых расположены антигенные детерминанты, распознаваемые каждым мкАт; последующий анализ взаимодействия мкАт с модифицированными производными БР и его фрагментами позволил установить границы антигенных детерминант и выявить входящие в их состав функционально важные аминокислотные остатки (рис.3).

Данные по локализации антигенных детерминант БР позволили внести уточнение в схему пространственного расположения этой молекулы в мембране. Ранее было установлено, что полипептидная цепь БР несколько раз пронизывает мембрану, при этом отдельные ее части экспонированы из мембраны. Для более точного определения укладки полипептидной цепи необходимо было выявить границы экспонированных участков. Нами было установлено, что все исследованные в данной работе мкАт взаимодействуют с мембранами галофильных бактерий, содержащих БР в нативной форме. Следовательно, антигенные

1 28 33

--ВЩЯ!

200

156 163 194 207 248

1

1В1

щ

йш3 Юав,

Авр^/АзрИрье42

Н6Е5 АлцН5

РИе,68С1и,в*

Ю2П1 Нбр3

Рис.3. Точная локализация антигенных детерминант на полипептидноЯ цепи БР. Заштрихованные участки полипептидной цепи - антигенные детерминанты, вертикально жирные полосы -аминокислотные остатки, входящие в состав антигенной детерминанты. Ю2а1, В5Е5, А14НЗ, Ю2Н1 а Н5ГЗ - моиоклональныэ антитела.

£нс.4. локализация антигенных детерминант и топография БР, выявленная с помощью мкАт. н>2в1, Н5Е5» А14Н36 ИЬ?5, 1021*1 - мкАт; А:зр, функционально важные аминокислотные остатка» К - антигенные участки ВР, выявленные ранее (К1тига еъ а!.,1982).

детерминанты, расположение которых вдоль полипептидной цепи было детально исследовано нами выше, экспонированы на поверхности мембраны. В соответствии с этим заключением, нами была предложена модель укладки полипептидной цепи БР в мембране (рис.4). Эта модель была использована в дальнейших структурно-функциональных исследованиях молекулы БР.

Методология применения мкАт, разработанная нами для иммунохи-мического изучения БР, можег быть широко использована и для других объектов. Особый интерес она представляет для изучения пространственной организации мембранных белков, выявления участков полипептидной цепи, экспонированных из мембраны. Эта методология в последующем была успешно апробирована еще на ряде обьектов, таких как зрительный родопсин, Ыа,К-АТРаЕе и др. Эта методология является наиболее исчерпывающей и информативной для изучения структуры индивидуальных антигенных детерминант, позволяя в ряде случаев даже идентифицировать входящие в их состав аминокислотные остатки. Основным ограничением указанного подхода является его высокая трудоемкость, связанная с применением методов классической белковой химии. В этой связи представляет интерес разработка альтернативных подходов иммунохимического изучения белков с помощью мкАт, отличающихся сравнительной простотой и высокой информативностью. Такая методология была разработана нами при изучении молекулы ^Е и Н-2 антигена.

1.2. Иммуноглобулин Е

Иммуноглобулин Е - представитель семейства иммуноглобулинов, играющий ключевую роль в ряде аллергических заболеваний, защите организма от паразитарных инвазий. После открытия этой молекулы в 1967 году значительные усилия были направлены на выяснение структурно-функциональных аспектов молекулы 1бЕ, механизмов регуляции ее синтеза. Эти работы приобрели особое значение в последние годы, с одной стороны, в связи с ростом числа аллергических заболеваний, с другой - в связи с появлением возможности направленного воздействия на систему 1§Е с целью ее регуляции и тем самым разработки подходов для лечения аллергических заболеваний. Важное значение при этом имеет изучение антигенной структуры молекулы ^Е. Это связано, в частности, с появившимися в последнее

—тМ

Рис.5. Кластеры антигенных детерминант молекулы 1дЕ человека, выявленные с помощью мкАт методом конкурентного ингибирования. 1д£/11-1 - ХдЕ/11-5 - мкАт.

мую-3

92 66

~ЗГ

-45-

1

Л

К

-

—

--

12 345 6 78

Рис.6. Вестерн-блот анализ фрагментов молекулы 1дЕ, образованных в результате трипсинового гидролиза, с помощью мкАт.

время данными о том, что антитела к различным участкам поверхности молекулы IgE могут выполнять либо стимулирующую, либо ингиби-рующую роль в развитии аллергических заболеваний (de Week,1990). В то же время, данные об антигенной структуре молекулы IgE в настоящее время весьма ограничены. Считалось, что молекула IgE человека имеет 3 антигенные детерминанты (D0.D1, D2), различающиеся по своей термостабильности и расположенные в области С2,СЗ доменов (Bennich Н.1971).Исследования иммуноглобулинов Е крысы и мыши привели к заключению, что количество эпитопов молекулы IgE у этих животных значительно больше (Beniyash М.,1988; Burt D.,1986). Для выяснения вопроса о количестве и локализации антигенных детерминант молекулы IgE человека мы провели иммунохимическое изучение этой молекулы с помощь» мкАт, протеолигических фрагментов и синтетических пептидов IgE.

Для проведения исследования нами была получена панель из 10 мкАт к IgE человека (серия IgE/11); наиболее интенсивно для изучения антигенной структуры IgE были использованы мкАт IgE/11-l -IgE/11-5. Было установлено, что эти мкАт одинаково эффективно (Ксв.=10'10) взаимодействуют со всеми исследованными образцами молекулы IgE: миеломными IgE (Yu,ND,PS), сывороточным IgE и ре-комбинантным IgE; следовательно, указанные мкАт распознают общие изотипспецифические детерминанты молекулы IgE человека. Методами конкурентного ингибирования было установлено, что антигенные детерминанты, распознаваемые мкАт IgE/11-l, с одной стороны, и IgE/11-2 - IgE/11-5, с другой, могут быть обьединены в два независимых кластера (рис.5). Было установлено также, что все эти антигенные детерминанты сохраняются при денатурации молекулы IgE в жестких условиях, т.е. могут быть отнесены к антигенным детерминантам линейного типа.

С целью более детального изучения антигенной структуры молекулы IgE человека нами был разработан и применен следующий подход . Молекула IgE подвергалась гидролизу с помощью различных про-теолитических ферментов (папаин, пепсин, трипсин); образующиеся фрагменты подвергались анализу с помощью метода Вестерн-блот, причем для проявления отпечатков использовались указанные мкАт. Идентификация фрагментов молекулы IgE осуществлялась, по молекулярной массе, а также с помощью антител с известной специфичностью.

Табл.3. Взаимодействие мкАт серии ХдЕ/11 с протеолитическимн фрагментами молекулы 1дЕ

фрагменты молекулы

АГ детерминанты е-иели

мкАТ 1дЕ/11

1 2 3 4 5 6

АТ *

легким целям

поли-клональ-ные антитело

|дЕ

Гс-папаин ГаЬ-папаин Рс'-папаин Гс'-трипсин Р(аЬ)2 пепс

01, 02, Оо 01, 02

Оо

01 0.1 01

+ + 4- + + + ++++++

--+ - +.+

_ _+ - + +

+ + + +

+ + + + +

Табл.4. взаимодействие мкАт серии 1дВ/11 и антисывороток с синтетическими пептидами-фрагментами 1дЕ , •

пептид антитела ^^ П1 331-347 П2 362-381 пз 498-511 П4 517-526 |дЕ

Поликлональные + + + + +

анти 1дЕ анти П1 + - - - +

анти П2 литы Пл + + - + +

иН1г1 И«/ анти П4 — — "1" + +

Моноклональные — — — +

1дЕ/11-1 — - +

1дЕ/11 -1 - +

|дЕ/11-3

1дЕ/11 -4 _ +

' 1дЕ/11-5

iL

fL

Полиа-IgE Le 27

PS-ljE-BGS rCH 2-4

IgE/lJ-l IgB/11-3 leE/U—« 1гЕ/11-5

ШЖ ps i{E г CD ген 3-4

CD IjErCll «-4

CD rcn 4

рис.7.

Взаимодействие мкАт с клонированной Фрагментами молекулы таг поли a-lgE - антисыворотка к IgE; Le27, IT, 11-1»

?iü4; ii-5 - MKAri'PS-IgE-BGG - молекула IgE, конгю-гиоованная с бычьим гаммаглобулином? PS-IgE - миеломный м™гСН 1-4. ген 2-4, ген 3-4, гСН 4 - клонированные Фра-г^ты IgE, содержащие соответствующие домены, данные представлены д-ром de Weck (Берн, Швейцария).

i г 1

—S-

Vh

? «w!

s s

-s—

, се2

-s—s-

Cf3

C€4

fvL

CL

lgt/11-2

IgE/l 1-3

V/11-5

IgE/l 1-6

lgE/11—4

lgE/11-1

Рис.8. Расположение антигенных детерминант, распознаваемых мкАт IgE/l1, на молекуле IgE.

Анализ фрагментов, полученных с помощью трипсина, показал, что каждое из пяти мкАт выявляет в иммуноблоттинге свой индивидуальный набор полос (рис.6). Следовательно, все 5 мкАт различаются по тонкой антигенной специфичности и выявляют разные антигенные детерминанты молекулы IgE.

Для локализации антигенных детерминант по доменам молекулы IgE наиболее информативным оказалось использование папаина для расщепления молекулы IgE, приводящее к образованию легко идентифицируемых фрагментов молекулы. С помощью иммуноблотинга установлено, что антигенные детерминанты, распознаваемые мкАт IgE/11-З, -5, -6, расположены в области Cs2 домена; детерминанта, распознаваемая мкАт IgE/11-2 - в области С£1 - Се2 доменов; детерминанты, распознаваемые мкАт IgE/11-l и -4 , расположены, вероятно, в области С{3 - Се4 доменов. Эти результаты были подтверждены при изучении взаимодействия мкАт с пепсиновыми фрагментами молекулы IgE. Результаты изучения взаимодействия мкАт с фрагментами молекулы IgE обобщены в табл.3.

В настоящее время значительные возможности для изучения структурных основ антигенности белков открываются в связи с применением методов молекулярной биологии, позволяющих получать фрагменты молекул белков для иммунохимического изучения. В лаборатории д-ра de Weck (Берн,Швейцария) с помощью методов генетической инженерии были получены фрагменты молекулы IgE человека, содержащие домены С51-Сл4, Сг2-Сб4, Ce3-Cfi4, Се4 и исследовано их взаимодействие с мкАт серии IgE/11 (рис.7).

Результаты проведенных исследований полностью коррелируют с данными о доменной локализации антигенных детерминант, распознаваемых мкАт серии IgE/'l1, полученными нами с применением протео-литических фрагментов молекулы IgE. Полученные данные по топографии антигенных детерминант молекулы IgE человека, распознаваемых мкАт IgE/11, обобщены на рис.8.

С целью более точной идентификации структуры антигенных детерминант, расположенных в области Cg3 - Cg4 доменов нами был использован подход, предложенный Лернером (1983) для конструирования вакцин и заключающийся в получении синтетических пептидов, имитирующих определенные участки аминокислотной последовательное-

ти молекулы белка. Для выбора предполагаемых антигенных детерминант нами были использованы классические подходы анализа структуры белка: расчеты гидрофильности, амфипатичности и^-изгибов. Были использованы также сравнительные экспериментальные данные по антигенным детерминантам IgE крысы ( Burt D.,1986). В результате было выбрано 11 участков полипептидной цепи, предположительно включающих антигенные детерминанты и имеющих размеры от 12 до 20 аминокислотных остатков. Четыре соответствующих пептида были синтезированы ( пептиды П1-П4 с последовательностями 331-347, 362-381, 98-511, 517-536, соответственно) и было исследовано взаимодействие этих пептидов с мкАт серии IgE/11, а также с антисыворотками, полученными к указанным пептидам. Результаты исследования представлены в табл.4.

Установлено, что поликлональные анти-IgE антитела взаимодействуют с исследованными пептидами; аналогично, поликлональные антитела, полученные к каждому индивидуальному пептиду, также взаимодействуют с интактной молекулой IgE. Это свидетельствует о том, что все 4 пептида содержат антигенные детерминанты молекулы IgE. В то же время, мкАт IgE/11-l и -4 (а также остальные мкАт серии IgE/11) не взаимодействуют с синтетическими пептидами П1 - П4, т.е. антигенные детерминанты, распознаваемые указанными мкАт, не содержатся в пределах синтезированных последовательностей молекулы IgE. Для точной идентификации этих антигенных детерминант необходимо проведение дальнейших исследований, в частности, с использованием дополнительных фрагментов молекулы IgE.

Полученные нами данные позволяют также сделать вывод о том, что молекулы IgE человека в области С^2-Св4 доменов содержит не менее 10 антигенных детерминант. Для более точного определения количества эпитопов необходимы дальнейшие исследования молекулы IgE.

1.3. н-2 антягевы

Антигены 1 класса главного комплекса гистосовместимости (Н-2 К,Р,Ь антигены мыши, НЬА-А,В,С антигены человека) представляют собой высокополиморфные трансмембранные гликопротеины, играющие важную роль в межклеточных взаимодействиях в иммунной системе. Ключевая особенность этих молекул, лежащая в основе их функций.

связана с наличием у них так называемых аллоантигенных детерминант - особых антигенных структур, обусловливающих внутривидовые отличия или индивидуальную специфичность обьектов. Благодаря успехам молекулярной биологии в настоящее время установлена структура ряда антигенов гистосовместимости человека и лабораторных животных, выявлены основные механизмы в генерации полиморфизма. Однако, в настоящее время имеются лишь ограниченные экспериментальные данные об антигенной структуре этих молекул, в частности, о структуре самих аллоантигенных детерминант.

В данной части работы мы предприняли попытку выработать подход для изучения структуры аллоантигенных детерминант антигенов гистосовместимости I класса с использованием аллоспецифических мкАт и синтетических пептидов. Возможности для проведения этой работы определяются наличием мкАт к различным аллельным вариантам Н-2К,Б антигенов, а также обширными данными по аминокислотной и нуклеотидной последовательности самих антигенов. В то же время, вследствие отсутствия достаточного набора мкАт к полиморфным детерминантам НЬА-А,В,С антигенов, возможности проведения аналогичного исследования с этими антигенами в настоящее время ограничены. Альтернативный подход к изучению полиморфизма НЬА-А,В,С антигенов с использованием ксеногенных мкАт к мономорфным детерминантам представлен в следующем разделе.

На первом этапе исследования были разработаны методы выделения фрагментов Н-20 антигенов с помощью ограниченного папаинового гидролиза. Для выделения были использованы иммуносорбенты, приготовленные на основе мкАт к Н-20 антигенам. Выделенные антигены были охарактеризованы с помощью биохимических,иммунохимических и клеточно-иммунологических методов. Было установлено, что папаино-вые фрагменты Я-2И антигенов, содержащие домены 1,2 и 3, сохраняют аллоантигенные детерминанты и могут быть использованы для структурно-функционального изучения Н-2 антигенов.

На следующем этапе работы нами был проведен анализ аминокислотной последовательности Н-2 антигенов в пределах доменов 1 - 3 и выявлены участки максимального полиморфизма. Затем эти участки были дополнительно проанализированы, как описано выше в случае 1йЕ, для выявления потенциальных антигенных детерминант. В результате нами были определены 3 участка аминокислотной последова-

10 ' 50 ' 90 130 ' 170 " 210 250* N

Рве.9. Анализ аминокислотной последовательности Н-2 антигенов с целью выбора аллоантигенных детерминант, а) Вариабельность (V) отдельных аминокислотных остатков тяжелой цепи антигенов, рассчитанная по формуле Ву и Кабата (1970); б) Вероятность (Р-Ь) образования тетрапеп-тидных -изгибов в молекуле Н-2БЬ," рассчитанная по методу Чоу и Фасмана (1978); в) Профиль гидрофильвости (Н) молекулы Н-20Ь,' рассчитанный по методу Хоппа и Вудса (1981), N - номер аминокислотного остатка.

гельносги Н-20Ъ антигена, предположительно содержащие аллоанти-генные детерминанты: 64-69, 95-100, 150-158 (рис. 9). Эти фрагменты были синтезированы (пептиды П1,П2 и ПЗ, соответственно), и затем проведено исследование их взаимодействия с мкАт к Н-2ПЬ антигену. Были получены также антисыворотки к пептидам П1-3 и исследовано их взаимодействие с выделенными Н-2 антигенами и с лимфоцитами мышей разных гаплотипов. Результаты исследования суммированы в табл.5:

Установлено, что антисыворотки к пептидам П1 и П2 специфически взаимодействуют с клетками мышей гаплотипа Ь и не взаимодействуют с клетками гаплотипов с! и к. Пептид П2 вызывает образование аллоантисывороток при иммунизации мышей линии ВАЬВ/с. Приведенные данные позволили предположить, что пептиды П1 и П2 могут имитировать аллотипические детерминанты Н-20Ь антигена.

Для проверки этого предположения было исследовано взаимодействие пептидов П1 - ПЗ с набором аллогенных мкАт, специфичных к молекуле Н-20Ъ и полученных путем иммунизации мышей различных гаплотипов. Полученные данные свидетельствуют о том, что из 8 исследованных мкАт одно (Н141-51) обладает специфическим сродством к пептиду П1, три мкАт (Н141-29, Н141-31 и Н141-45) - сродством к пептиду П2, а четыре мкАт не взаимодействуют с указанными пептидами. Все эти мкАт направлены против Н-20 антигена и, по-видимому, распознают на поверхности этой молекулы участки 64-69 и 95-100, соответственно. Связывание мкАт с пептидом ПЗ не превышало существенно связывания нормальной мышиной сыворотки, что свидетельствует об отсутствии специфического взаимодействия исследованных антител с данным фрагментом молекулы Н-20. Количественная оценка взаимодействия мкАт Н141-29 и Н141-31 с пептидом П2 показала, что величина Ка для мкАт Н141-29 (1,3х107 М 1) лишь на порядок меньше взаимодействия мкАт с антигенами гистосовместимости. Это свидетельствует в пользу того, что пространственная структура антигенной детерминанты, распознаваемой мкАт.Н141-29 в молекуле Н-20, и пептида П2 в растворе гомологичны друг другу.

Таким образом, с помощью описанного в данном разделе подхода обнаружены 2 участка молекулы Н-20Ь, распознаваемых мкАт и выполняющих функции аллоантигенных детерминант. Данный подход, вероятно, может быть применен также для изучения антигенной структуры и идентификации аллоантигенных детерминант других антигенов гистосовместимости I класса.

Табл.5. Взаимодействие мкАт и антисывороток

с синтетическими пептидами - Фрагментами Н-20Ь антигена.

^—_ Пептид ^^ (послвлово-—^тельность; мкАт или ^^ антисыворотка ^^ , П1 х (64-69) , П2 „ (95-100) (150-^58) Н-20Ь оитигм

Н1 41-51 + - — +

Н1 41-44 - — +

Н1 41-11 —■ + — +

Н1 42-45 - — — +

Н1 42-23 - — - +

Н1 41-31 — + - +

Н1 41-29 - + - +

Н1 41-30 — - +

антаП1 + — - +

сити П2 + — +

снти ПЗ — — + +

1.4. Заключение

В данной части работы была проанализирована методология применения мкАт для изучения антигенной структуры белков и выявления антигенных детерминант - участков структуры молекулы белка, взаимодействующих с антителами и выполняющих определенную функциональную роль. Применение мкАт позволяет проводить идентификацию антигенных детерминант о невиданной ранее точностью, в ряде случаев, вплоть до отдельных аминокислотных остатков. В зависимости от поставленной задачи и специфики объекта исследования возможно применение различных по эффективности методов анализа. Наиболее исчерпывающие данные по структуре антигенных детерминант могут быть получены с помощью методов белковой химии СВР) и с использованием синтетических пептидов (Н-2 антигены). Однако эти методы являются весьма трудоемкими и требуют значительных материальных затрат. Во многих случаях необходимо приблизительно определить область локализации антигенных детерминант, установить их количество, а также провести сравнение тонкой антигенной специфичности мкАт. В этих случаях оптимальным представляется метод, разработанный и примененный нами при изучении молекулы 1еЕ человека, основанный на комбинации ферментативного гидролиза и Вестерн-блот анализа. Дополнительным преимуществом этого подхода является минимальный расход исследуемого образца. Следует также отметить значительную перспективу применения методов генетической инженерии в работах по изучению антигенных детерминант с помощью мкАт.

II- Изучение биохимического полиморфизма антигенов гистосовмествмости человека с помощью мкАт

Полиморфизм антигенов гистосовместимости был обнаружен и тщательно исследован с помощью серологических и клеточных методов. В последние годы значительные успехи достигнуты в изучении генетических основ полиморфизма антигенов ГКГ, в частности, структуры

генов и молекулярной организации ГКГ. В то же время, по-прежнему открытыми остаются вопросы, связанные со структурными основами полиморфизма, ответ на которые может быть получен только путем непосредственного изучения антигенной структуры самих продуктов ГКГ.

Выше был рассмотрен вопрос, связанный с изучением аллоанти-генных (полиморфных) детерминант Н-2 антигенов I класса. К сожалению, подобный подход не применим для изучения полиморфизма НЬА антигенов, поскольку подавляющее большинство ксеногенных мкАт к НЬА антигенам направлены не к полиморфным, а к мономорфным детерминантам, т.е. детерминантам, общим для целого ряда антигенов ГКГ, независимо от их аллоантигенной специфичности. Это исключает возможность прямого применения таких мкАт в качестве типирующих реагентов для выявления иммунохимического (серологического) полиморфизма. В то же время, указанные мкАт могут быть использованы в качестве универсальных реагентов для выделения НЬА антигенов для последующего структурно-функционального изучения. В этом разделе мы исследовали возможность применения мкАт к мономорфным детерминантам НЬА антигенов для изучения биохимического полиморфизма этих молекул.

В работе были использованы мкАт иб/32, направленные против мономорфной конформационной детерминанты НЬА антигенов I класса, ¿.р2т , взаимодействующие с мономорфной легкой цепью НЬА антигенов ( 2-микроглобулином) и мкАт НС10, направленные против мономорфной антигенной детерминанты -цепи НЬА антигенов (Сгитр1;ог>, 1978; Р1ое§Ь, 1985). Была использована следующая схема эксперимента. Первоначально проводилось биосинтетическое мечение клеток (лимфоциты периферической крови, предварительно стимулированные митогеном, или гомозиготные типирующие клетки - ГТК, полученные путем трансформации лимфоцитов периферической крови вирусом Эпштейн-Барр) с помощью 35Б метионина, затем клетки лизирова-лись с помощью неионного детергента МР40, НЬА антигены I класса выделялись из клеточного экстракта с помощью иммунопреципитации с использованием указанных выше мкАт, затем иммунопреципитат подвергался анализу с помощью двумерного электрофореза и последующей авторадиографии. Были подобраны условия, при которых иммунопреци-питация приводила к практически гомогенным НЬА антигенам I класса (рис.10).

асКп *

в^т

Рис.10. Двумерный электрофорез антигенов

гистосовместимости I класса человека, полученных методом иммунопреципитации с помощью мкАт. Стрелкой указан актин, являющийся основным сопутствующим белком.

На первом этапе работы были подвергнуты исследованию 7 ГТК с гаплотипами Al-B8-Cvi7 и AI -B8-Cw" бланк" (обозначенных далее А1-В8). Результаты двумерного гель-электорофореза иммунопреципи-татов, Полученных с помощью мкАт W6/32 свидетельствуют, что все 7 индивидов дают одинаковый набор пятен на электрофореграммах (рис.11).Было установлено, что мкАт W6/32 и анти/S2-микроглобулин выделяли практически одни и те HLA антигены I класса из клеточного экстракта (рис.12); на основании этого было сделано заключение о возможности использования мкАт wö/32 в качестве универсальных реагентов для выделения HLA антигенов I класса. Значительное количество пятен, наблюдаемых на представленных электрофореграммах обусловлено наличием продуктов различных генов с различными биохимическими характеристиками, т.е. продуктов генов HLA-A,B,C и возможно других генов I класса. Каждый HLA-A.B антиген при изоэ-лектрофокусировании предстает в виде нескольких пятен (от одного до четырех), вследствие гетерогенности в содержании сиаловых кислот (от 0 до 3 остатков сиаловых кислот на молекулу). Анализ им-мунопреципитата, полученного с помощью W6/32 из клеток, меченых в присутствии туникамицина (ТМ) - ингибитора N-гликозилирования, выявляет два новых пятна, соответствующих негликозилированным формам основных серий пятен, т.е. HLA-A1 и HLA-B8 антигенам (рис.11). Поскольку негликозилированные антигены дают лишь одно единственное пятно вместо серии пятен, был сделан вывод о том, что наблюдаемая при изоэлектрофокусировании гетерогенность HLA антигенов обусловлена главным образом гетерогенностью углеводных цепей. Обработка иммунопреципитатов нейраминидазой приводит к единственному пятну для каждой специфичности HLA-A.B антигенов, что подтверждает вывод о роли сиаловых кислот в их гетерогенности.

Далее была исследована возможность применения описанного подхода для идентификации специфичностей HLA антигенов X класса. На рис.13 представлены результаты анализа семи ГТК, несущих HLA-B7 антиген. Все они имеют общий набор пятен, идентифицируемых как В7 антиген. Методом исключения остальные пятна были идентифицированы как биохимический профиль соответствующих антигенов А-локуса, как указано на схеме. Аналогичным образом были проанализированы остальные наборы ГТК. Идентификация пятен по HLA-A.B специфичностям осуществлялась с учетом того обстоятельства, что каждая ГТК имеет общую специфичность по крайней мере еще с одной ГТК. Таким образом, открывается возможность для биохимического типирования HLA

Рис.11. Двумерный электрофорез антигенов I класса,

синтезированных в присутствие или отсутствие ТМ, выделенных из клеток 7 индивидов, идентичных по НЬА-А,В,ЭИ•

Рис.12. А. Сравнение мкАт 1*6/32 и анти-Вг-микроглобулин в качестве реагентов, пригодных для выделения антигенов I класса человека.

В. Сравнение РИМ (митогена лаконоса) и РНА (фито-1 гемагглютинина) в качестве митогенов, используемых для стимуляции клеток перед выделением НЬА антигенов с помощью иммунопреципитации.

антигенов I класса на основе анализа характерного профиля пятен, выявляемых для каждого антигена в результате анализа иммунопреци-питата с помощью двумерного электрофореза. Полученное соотнесение специфичностей НЬА-А,В антигенов находится в полном соответствии с результатами серологического типирования.

Было установлено, что разработанный метод позволяет проводить различие между субтипами антигенов, неразличимых с помощью серологического типирования; исследование, проведенное нами для НЬА-В27 антигена, позволило четко идентифицировать К и И субтипы, различимые ранее только с помощью клеточного типирования.

Результаты, полученные в данной части работы с помощью мкАт иб/32 и 20-гельэлектрофореза в качестве аналитического метода, позволили установить ряд биохимических параметров НЬА-А,В антигенов, необходимых для изучения их полиморфизма. Была исследована большая часть НЬА аллелей европейской популяции, что открывает возможность для их биохимического типирования. Следует отметить, что ранее аналогичный подход был применен только для изучения би-охимическго полиморфизма Н-2 антигенов, однако при этом были использованы аллоантисыворотки. Примененные нами методы основаны на использовании мкАт и не зависят от аллоантисывороток против отдельных аллелей НЬА антигенов. Такие аллоантисыворотки, как правило, имеют низкие титры, что затрудняет проведение биохимических исследований с их помощью. С другой стороны, мкАт к полиморфным детерминантам, описанные к настоящему времени, охватывают лишь незначительную часть специфичностей НЬА-А,В антигенов. Поэтому разработанный нами подход, заключающийся в использовании мономор-фных анти-НЬА-А,В мкАт, является в настоящее время наиболее оптимальным способом биохимического типирования НЬА антигенов I класса. Следует отметить, что в ряде случаев этот способ типирования обладает более высокой точностью и позволяет проводить различие между вариантами НЬА антигенов, неразличимыми с помощью серологических методов с использованием типирующих антисывороток.

С целью создания скринингового метода биохимического типирования НЬА антигенов нами был также разработан подход, исключающий трудоемкую стадию иммунопреципитации и использование радиоактивной метки. Метод основан на использовании мкАт к белкам ГКГ для визуализации зон, полученных при анализе клеточного экстракта с помощью двумерного электрофореза или изоэлектрофокусирования.

*

А В 7 А 24

• > *о " ° К 9 • • о о О X . 1° р '•> V. 1

В В7 АЗ

• • С * о о 3 # . ° о° • • «о | • ; Г !" ; 'В7 А 23 о о С? ф А а

- • • в О О о В . • Г ?

О В7 АЗ

0 о о о оа а а о о ^ • В7 АЗ

°п 8 "о * * - О О ° ^

Е В7 АЗ

о ° .о / • . о о и » " О; , , ; о !

Р 1 У ! Й7 А 23

Рис.13. Анализ с помощью двумерного Электрофореза антигенов I класса, выделенных из НЬА-В7 ГТК. Слева представлены результаты авторадиографии. Справа приведена интерпретация полученных данных.

- за' -

Анализ ряда клеточных линиий и лимфоцитов периферической человека с использованием мкАт НС10 показал принципиальную мощность применения данного подхода для быстрого и точного ления полиморфизма HLA антигенов I класса.

III. Моноклоналыше антитела как модель для изучения биосинтеза белков и гликопротеннов

В предыдущих разделах были рассмотрены вопросы, связанные с применением мкАт в качестве инструментов для структурно-функционального исследования биополимеров. Следует, однако, отметить, что сами мкАт, будучи представителем важнейшего класса молекул иммунной системы, являются чрезвычайно удобными объектами структурно-функциональных исследований гликопротеинов, особенно тех аспектов, проведение которых затруднительно в случае природных иммуноглобулинов. Это связано не только с возможностью получения гомогенных мкАт практически в неограниченных количествах, но и с доступностью самих клеток-продуцентов, что дает возможность применения в этих исследованиях широкого арсенала современных методов молекулярной и клеточной биологии.

В данном разделе работы мы провели изучение ряда аспектов биосинтеза IgD мыши с использованием гибридомной клеточной линии и IgE человека с использованием трансфектомы. Интерес представляли особенности гликозилирования этих молекул и роль их углеводных частей в сборке, внутриклеточном транспорте и секреции, взаимосвязь мембранных и секретируемых форм, особенности биосинтеза в случае трансфектом. Выбор молекул IgD и IgE в качестве обьектов исследования определялся, с одной стороны, уникальной ролью этих молекул в иммунной системе, с другой - крайней скудостью сведений о них, вследствие их малой доступности.

На первом этапе работы было проведено исследование биосинтеза мкАт класса IgD с использованием мышиной гибридомы В1-8 (Rajewsky,1980). Особый акцент был сделан на детальное изучение биосинтеза мембранной и секретируемой форм и на выяснение кинетики синтеза и деталей процессинга олигосахаридов.

Для изучения этих вопросов были использованы эксперименты с импульсной меткой (ИМ,pulse-chase) и ингибиторы гликозилирования туникамицин (ТМ) и 2-дезоксиглюкоза (ДГ). мкАт выделялись из клеточного экстракта или культуральной жидкости методом иммунопреци-

крови воз-выяв-

тм

240 0 1С) 2030 601200 020'ЗО'б01202401

Н

Рис.14. Изучение биосинтеза клетками В1-86 с помощью метода импульсной метки при наличии и в отсутствие ТМ. Указано время отбора проб. Н - тяжелая цепь, X. - легкая цепь, - положение мембранной формы 1д0.

+ ТМ

о' зо' во' ^за ео^

БС Э С5 С 5 С5 С 5С

Н

Рис.15. Изучение биосинтеза 1дЭ с помощью метода импульсной метки: сравнение цитоплазмати-ческой (С) и секретируемой (э) форм 1дЭ. Н - тяжелая цепь, Ь - легкая цепь, - положение мембранной Формы 1дЭ.

365? 1

питации и подвергались анализу с помощью высокоразрешающего электрофореза в градиентном полиакриламидном геле в присутствии ДСН и последующей авторадиографии.Одновременно проводилось сравнительное изучение биосинтеза мкАт класса ^М, продуцируемого исходной родительской гибридомой В1-8уч, а также, в ряде случаев, изучение отдельных аспектов гликозилирования Н-2К,0 антигенов, присутствующих в обеих .клеточных линиях.

Выла выявлена обширная гетерогенность среди цитоплазматичес-ких предшественников характеризующаяся наличием минимум 4

полос, различающихся по Мв на 1500-3000 Д, причем наблюдалось снижение Мв каждого из предшественников в ходе эксперимента (рис.14). При проведении эксперимента в присутствии ТМ наблюдались только две формы с неизменными Мв. Был сделан вывод о том, что наблюдаемая в отсутствие ТЫ гетерогенность, по крайней мере отчасти, связана с Ы-гликозилированием, причем снижение Мв предшественников, по-видимому, связано с процессингом богатых маннозой олигосахаридных цепей, присоединяемых к гликопротеинам котрансляционно (тримминг). Полосы, выявляемые в присутствии ТМ, относятся, по-видимому, к негликозилированным секретируемой и мембранной формам.

Сравнение цигоплазматических предшественников и молекул, выделенных из культуральной жидкости, выявило значительное различие в Мв (примерно на 6000 Д) этих двух форм в отсутствие ТМ (рис.15). Это увеличение Мв происходит непосредственно перед секрецией и, по-видимому, обусловлено присоединением так называемых терминальных углеводов, в частности, И-ацетилглюкозамина, галактозы и сиаловых кислот. Такое увеличение Мв не наблюдается в обработанных ТМ клетках, где основной секретируемый продукт комиг-рирует с основным цитоплазматическим предшественником. Из представленных данных следует, что секреция начинается через 20-30 минут после начала биосинтеза, независимо от наличия или отсутствия ТМ. Таким образом, Л-гликозилирование не влияет ни на саму секрецию ни на ее скорость.

В присутствии ТМ количество цитоплазматического предшественника с меньшим Мв уменьшается во времени (снижение интенсивности), в то время как с большим Мв не меняется. Следовательно, предшественник с меньшим Мв соответствует секретируемой форме а с большим - мембранной форме остающейся связанной с

клетками в течение длительного времени и имеющей более длительный

период полураспада. В опытах, проведенных в отсутствие ТМ, не удается выявить зрелую форму мембранного З^Р; по-видимому, это связано, с одной стороны, с незначительным количеством мембранного по сравнению с секретируемым , с другой - с весьма диффузным проявлением зрелой формы в использованных нами условиях гель-электрофореза.

С целью дальнейшего изучения гликозилирования различных форм

была использована обработка цитоплазматических предшественников эндогликозидазой Н (Эндо Н) и нейраминидазой. Обработка ЭндоН приводит к снижению Мв всех предшественников, за исключением минорной фракции с высоким Мв, появляющейся на заключительных стадиях биосинтеза; обработка нейраминидазой приводила к противоположному результату. Поскольку специфичность действия этих ферментов хорошо изучена, нами был сделан вывод о том, что в процессе биосинтеза происходит созревание цитоплазматических предшественников от форм, чувствительных к действию Эндо Н, т.е. форм, содержащих богатые маннозой олигосахариды, к формам, резистентным к действию Эндо Н, т.е. к формам, содержащим олигосахариды комплексного типа, чувствительные к действию нейраминидазы. Это превращение происходит непосредственно перед секрецией, что объясняет наличие лишь незначительного количества зрелой внутри клеток. Обработка нейраминидазой показала, что секретируемая форма резистентна к действию Эндо Н и чувствительна к действию нейраминидазы.

Было установлено, что секретируемая в присутствии ТМ,

по-прежнему обладает определенной гетерогенностью. Эта гетерогенность значительно снижается после обработки нейраминидазой , что указывает на ее обусловленность наличием сиаловых кислот. Поскольку ТМ ингибирует Ы-гликозилирование, гетерогенность в этом случае может быть обусловлена наличием О-гликозилирования. Ранее 0-гликозилирование было показано среди иммуноглобулинов только для и человека.

В целях сравнения был исследован также процесс биосинтеза ^М в родительской гибридомной клеточной линии В1-8Было установлено, что полученные данные совпадают с особенностями биосинтеза ^М, описанными в литературе и в общих чертах установленных нами для ТМ не ингибирует секрецию В процессе биосинтеза

происходит тримминг богатых маннозой олигосахаридных цепей, к которым непосредственно перед секрецией присоединяются терминальные

сахара. Принципиальное отличие биосинтеза ^М и заключается в степени гликозилирования и влиянии на него ингибиторов . ТЫ полностью устраняет гетерогенность в то время как гетерогенность ХйО сохраняется. 2-дезоксиглюкоза, ингибирующая самые начальные стадии гликозилирования по Ы-гликозидным связям, в случае ^М приводит к появлению дискретного набора полос (5), соответствующих формам ^М, содержащим различные количества Ы-углеводных цепей. В случае 100 тот же ингибитор приводит к широкой диффузной области. Полученные данные говорят в пользу существования значительных различий в механизмах гликозилирования 1йМ и в частности указывают на наличие О-углеводных цепей в молекуле

Для того, чтобы получить подтверждение того, что наблюдаемое различие в биосинтезе и ^М связано с самими молекулами, а не является следствием различий в продуцирующих их клетках В1-85 и В1-8^ (например, различие в наборах ферментов гликозилирования), был исследован биосинтез Н-2 К,О антигенов, являющихся общими для обеих клеточных линий. Выделение Н-2 антигенов из экстрактов клеток В1-81 и В1-8^4, меченых 35-Б метионином, осуществлялось с помощью смеси мкАт к Н-2 антигенам, описанных выше (раздел 1.3). Было установлено, что биосинтез Н-2 К,Б антигенов происходит одинаково в обеих клеточных линиях и совпадает в основных чертах с данными из литературы. Как и в случае и ^М, наблюдается

тримминг внутриклеточных предшественников Н-2 антигенов и присоединение терминальных Сахаров непосредственно перед экспрессией молекул на клеточной поверхности. 3-Н галактоза включается только в зрелые формы молекулы, причем это присоединение отсутствует в случае клеток, предобработанных ТМ в течение 6 часов (после истощения пула предшественников). Таким образом, выявленное различие в биосинтезе и не связано с различиями в клеточных линиях В1-8&и В1-Е}ци обусловлено особенностями самих этих молекул.

На следующем этапе работы был исследован биосинтез иммуноглобулина Е человека с использованием трансфектомы ЛИ/е, продуцирующей рекомбинантное мкАт человек/мышь класса ^Е человека (ЫеиЬе^ег, 1984), и методических подходов, описанных выше. Наряду с изучением общих закономерностей биосинтеза Е, а также особенностей трансфектомы как обьекта исследования, особый интерес в данном случае был вызван наличием противоречивых данных о влиянии

ТМ на секрецию молекулы IgE. Так, по данным 1кедап)а Б. (1985), ТМ не ингибирует секреции человека клеточной линией Ц266; в то же время по данным вгапа^ О. (1986) ингибирование гликозилирова-ния мыши с помощью ТМ полностью блокирует секрецию этой молекула клетками мышиной гибридомы. Использование в качестве модели трансфектомы, полученной путем трансфекции гена рекомбинантного ^Е человека в мышиную миеломную клеточную линию, позволило разрешить упомянутую выше дискуссию о влиянии ТМ на секрецию 1&Е и установить, с чем связано это влияние: с отличительными особенностями структуры молекулы ^Е человека и мыши или с особенностями метаболизма соответствующих клеток-продуцентов.

Было установлено, что внутриклеточный пул предшественников молекулы ^Е, выделенный из клеточного лизата, занимает широкую диффузную область с мол.массой 80-86 кД. Молекула ^Е, выделенная из супернатанта, также гетерогенна и представлена на электрофо-реграмме компонентами с мол.массой 85-90 кД. Внесение в среду инкубации ТМ резко снижает гетерогенность молекулы ^Е: как из клеточного лизата, так и из супернатанта выделяется одна гомогенная форма молекулы, представленная на электрофореграмме дискретной полосой с мол.массой 65 кД. Следовательно, гетерогенность молекулы ^Е, выделенной из клеточного экстракта и из супернатанта, выявляемая при анализе с помощью ДСН-ПААГ электрофореза, обусловлена М-гликозилированием; эта гетерогенность устраняется при инги-бировании биосинтеза с помощью ТМ. Следует отметить, что в отличие от IgD, в данном случае полностью отсутствует мембранная форма молекулы.

В опытах с импульсной меткой был установлено, что секреция молекулы ^Е начинается спустя 30 минут после инициации трансляции и достигает максимума спустя 120 минут. Присутствие ТМ не оказывает влияния ни на начало секреции, ни на ее кинетику. Таким образом, туникамицин, полностью ингибируя гликозилирование молекулы ^Е, не блокирует других этапов биосинтеза (сборка, внутриклеточный транспорт) и не препятствует секреции молекулы.

Полученные результаты, в сочетании с приведенными выше данными 1ке^ата (1985) и Огапа^ (1986), позволяют сделать вывод о том, что влияние ТМ на секрецию молекулы 1йЕ определяется не клеточной линией-продуцентом, а особенностями структуры самой моле-

кулы 1§Е (мыши или человека), конкретно - ее константной областью, участвующей в процессинге.

С помощью гликозидаз Эндо Н и нейраминидазы была исследована структура внутриклеточных предшественников молекулы ^Е. Было установлено, что обработка 1йЕ, выделенного из супернатанта, с помощью ЭндоН не приводила к изменению кажущейся мол.массы в ДСН-ПААГ электрофорезе, в то время как в лизате большая часть пула ^Е подвергалась гидролизу и при этом происходило снижение мол.массы до 60-62 кД. Это может являться следствием гидролиза богатых маннозой олигосахаридов предшественников молекулы ^Е во внутриклеточном пуле. Обработка нейраминидазой молекулы ^Е из супернатанта, в отличие от воздействия Эндо Н, приводила к снижению мол.массы у части пула молекул с 85-87 до 80-82 кД,-т.е.до положения внутриклеточных предшественников. Преобладающая часть выделенного из клеточного лизата, нечувствительна к действию нейраминидазы и, следовательно, не содержит концевых остатков сиаловых кислот.

Полученные данные свидетельствуют о том, что процесс биосинтеза рекомбинантной молекулы ^Е человек/мышь в трансфектоме Л1/е происходит по механизму, описанному выше для мкАт класса и

а также ранее для ряда других иммуноглобулинов мыши и человека. Наблюдаемые различия и особенности процесса биосинтеза и секреции различных видов иммуноглобулинов (а также других гликоп-ротеинов) связаны, по-видимому, скорее с аминокислотной последовательностью полипептидных цепей гликопротеинов, чем с физиологическими особенностями клеток-продуцентов.

Результаты, представленные в данном разделе, указывают на значительные возможности, предоставляемые мкАт и их продуцентами в качестве моделей для структурно-функционального изучения гликопротеинов, в том числе, механизма их биосинтеза. Эти работы, в частности, имеют важное значение для поиска новых фармакологически активных соединений, участвующих в избирательной регуляции (ингибирующих) отдельных этапов процессинга гликопротеинов; именно среди этого класса соединений обнаружены в последнее время наиболее перспективные препараты для лечения вирусных заболеваний.

IV. Применение мкАт для создания систем количественного нммунохимического анализа биологически активных веществ

Важнейшим направлением применения мкАт в медико-биологических исследованиях является создание тест-систем для определения БАВ. Преимущество применения мкАт вместо поликлональных антисывороток при этом связано как с технологическими аспектами, такими как возможность получения практически в неограниченных количествах стандартных гомогенных препаратов, так и с уникальными иммунохи-мическими свойствами мкАт, в первую очередь, их специфичностью, подробно рассмотренной в предыдущих разделах. В то же время, высокая специфичность мкАт предъявляет особые требования к их подбору для конструирования конкретных тест-систем. В ряде случаев эта проблема решается уже на стадии получения мкАт путем создания специальных систем скрининга мкАт, имитирующих условия конкретных тест-систем, в других случаях - путем тщательного подбора комби-аций мкАт или применением вместо индивидуальных мкАт специально подобранных смесей мкАт. Значительные перспективы в этой связи открывает применение генно-инженерных подходов для направленного изменения тонкой антигенной специфичности и аффинности мкАт. Такие работы в настоящее время широко разворачиваются за рубежом. В нашей лаборатории, начиная с 1985 г..проводится целенаправленная работа по получению мкАт для конструирования различых тест-систем, в первую очередь для медицинского применения. Были получены мкАт к 10 БАВ (табл.6). Ниже представлены результаты исследований по разработке тест-систем на основе мкАт для определения IgE -для диагностики аллергических заболеваний, и теофиллина - для проведения лекарственного мониторинга при лечении астмы.

4.1. Тест-системы для определения IgE

Как уже отмечалось выше, определение IgE имеет важное значение в диагностике аллергических заболеваний. Повышение общего уровня IgE у новорожденных является показателем предрасположенности к аллергическим заболеваниям, у взрослых позволяет установить диагноз атопического синдрома. Определение аллерген-специфических IgE необходимо для профилактики и лечения аллергических заболеваний. В последние годы, в связи с ростом числа аллергичес-

Табл.б. моноклональные антитела к биологически активным веществам.

БАВ Количество гибридом Область применения

| Иммуноглобулины] Igt lgC4 10 1 3 2 2 7 2 3 1 Иммунология Аллергология Иммунология Онкология Нейробиология Эндокринология Лекарственный мониторинг

i Клеточные структуры]

CD23 антиген Глиольный фибриллярный кислый белок Нейро<риламенты iJTopMOHtiJ Тиротропин (TSH) Хорионичэский . гонадотропин ^НСО;

^ Лекарственные вещества]

Теофиллин Ч'енЬбарбитал Лигоксин

Табл.7. Иммунохимические тест-системы на основе мкАт для определения уровня общего IgE

Назвони» Т«С1-СИСТ«МЫ мкЛт сарии tsE/H Диапазон измеряемых концентраций (MC/мл) Твердая фаза Стадийность, эбщоя прдол-жмтельность анализа Назначение

1дЕ-ИФА 3.5 25-100 планшеты одно стадия 1.5 н. Клиническая аллергология и иммунология

1дЕ-И<РА-2 1.4 o-too плоншеты одна стадия 1.5 ч. Клиническое аллергология и иммунология е леднотрии

|дЕ-ИЧ>А-3 1.4 0-100 0-1000 шорики одна стадий 1.5 ч. 1.0 Ч Клиническая аллергология и иммунология

1дЕ-И9А-Н 1.4 2-0.1нг планшеты Три Сталин 3.0 ч. 8 практике ноучиых исследований

АЛСКРИН—IgE 3.5 а 25-100 мембраны одна столик 2,<Гч. Клиническая аллергология и иммунология

А/1КСРИН-1дЕ-2 3.5 а 25-100 мембраны одна стадий 5 мин Клиническая аллергология и иммунология

ких заболеваний, проблема их диагностики приобретает особую остроту. Именно этим обстоятельством обусловлено то, что первыми коммерческими тест-системами на основе мкАт, появившимися на Западе, были тест-системы для определения 1йЕ. В нашей стране такие тест-системы отсутствовали до последнего времени. В настоящее время нами разработан целый ряд таких тест-систем (табл. 7 ) и начато их коммерческое производство на советско-швейцарском СГГДИАплюс" .

Ключевым этапом работы по созданию тест-систем для определения 1бЕ явился отбор мкАт и подбор их комбинаций. Система скрининга мкАт была сконструирована таким образом, чтобы отобрать мкАт, пригодные для конструирования ИФА систем иммунометрического (сэндвич) типа. Жесткие требования предъявлялись к специфичности мкАт: панель антигенов для проверки и отбора мкАт включала, дополнительно к ряду миеломных и поликлональных ^Е, также полный набор иммуноглобулинов других изотипов. В результате были отобраны 10 мкАт, пригодных по специфичности и аффинности для конструирования тест-систем.

С целью подбора комбинаций мкАт было проведено исследование, в ходе которого каждое из мкАт было использовано как в качестве сенсибилизирующего, так и проявляющего агента. Было установлено, что различные комбинации мкАт приводят к тест-системам с различными аналитическими параметрами, в первую очередь, по чувствительности и диапазону концентраций определяемого аналита. Следует отметить, что в ряде случаев одна и та же пара мкАт образует различные тест-системы в зависимости от положения мкАт: сенсибилизирующего или проявляющего. Результаты исследования по анализу комбинаций мкАт ^Е11/1 - ]^Е11/5 представлены в табл. 8.

На основе подобранных комбинаций мкАт были сконструированы различные варианты тест-систем (табл. 7 ), предназначенные для определения в различных диапазонах концентраций и с использованием различного инструментального оснащения. Ниже приводится краткое описание наиболее важных вариантов тест-систем.

Тест-система для определения ^Е в диапазоне 25-1000 мЕ/мл. Использована комбинация мкАт 1йЕ11/3 - 1йЕ11/5. Быстрый (продолжительность анализа 1 час) одностадийный вариант тест-системы, предназначенный для клинического применения в аллергологии. В ка-

Табл.8, варианты тест-системы для определения 1дЕ

с использованием различных комбинаций моно-клональных антител.

Сенсибилизирующие Проявляющие мкАт

мхЛт

Щ -есть езсимсд еЯстаив I I -огсутствн* тест-системы ■ -тест-систеыа • диапазон« ¿в 100 МЕ/мл -тест-система е диапазоне ло 25 МЕ/мл

честве твердой фазы использованы планшеты для иммуноанализа. Имеет хорошую корреляцию с наборами фирмы Pharmacia (88%) и Toyobo (95%).

Тест-система для определения IgE в диапазоне 0 - 100 мЕ/мл. Вариант тест-системы, специально предназначенный для педиатрического применения. Использована комбинация мкАт IgEll/1 - IgEll/4. Реализован в планшетном варианте. Корреляция результатов измерения концентрации IgE с помощью данной тест-системы и набора фирмы Behring (ФРГ) составляет 90% (рис. 15 ).

Тест-система для определения IgE в диапазоне 0 - 1000 мЕ/мл. Универсальный вариант тест-системы, предназначенный для клинико-диагностических лабораторий. Использована комбинация мкАт IgEll/1 - IgEll/4. В качестве твердой фазы использованы полистироловые шарики. Коэффициент корреляции с наборами фирмы Pharmacia составляет 95,7% (рис. 15 ).

Тест-система для определения IgE в диапазоне 100 пг - 2 нг/мл. Специальный вариант тест-системы, предназначенный для научно-исследовательских целей, в частности, для изучения синтеза IgE in vitro. Один из вариантов этой тест-системы был реализован с использованием метода усиленной люминесценции.

Мембранные варианты тест-систем для полуколичественного определения уровня общего IgE. Тест-системы данного типа представляются наиболее перспективными для широкого медицинского применения в условиях нашей страны, поскольку позволяют проводить быструю оценку содержания IgE и не требуют инструментального обеспечения. В нашей лаборатории были разработаны несколько вариантов таких тест-систем, а также оборудование, необходимое для их изготовления . Тест-система АЛСКРИН-IgE основана на использовании в качестве твердой фазы нитроцеллюлозной мембраны, фиксированной на полужесткой пластмассовой основе; мкАт против IgE (IgE/11-4 или IgE/11-5) иммобилизовывались на мембране в виде линий; полученные индикаторные полоски инкубировались с исследуемыми сыворотками, затем с проявляющими мкАт (IgE/11-l или IgE/11-З), коньюгирован-ными с ферментом, затем с субстратом, после чего результаты реакции оценивались визуально по цветной индикаторной шкале в значениях больших или меньших 25, 120, 500 и 1000 МЕ/мл . Тест-система АЛСКРИН-2-IgE основана на использовании методов тонкослойной хроматографии и сухой химии. Преимущество данной тест-системы по

а

JgE, W/ml

Enzygnosl-IgE Behring monoclonal

б

0 303 4C0 600 КЮ xxo IjE, IU/ml Pharmacia IgE EiA

Рис.15. Корреляция тест-систем для определения IgE с коммерческими наборами зарубежных Фирм.

а) IgB педиатрический на планшетах -ßnzygnost-IgE (Behring, ФРГ)

б) lgE-£IA (на шариках) -

IgE EIA (Pharmacia, Швеция)

сравнении с АЛСКРИН-IgE заключается в большей простоте проведения анализа и экспрессности (продолжительность анализа 5 минут). Сравнительное определение уровня IgE в сыворотке крови с помощью наборов АЛСКРИН-IgE, АЛСКРИН-2-IgE и "IgE-EIA" фирмы Pharmacia показало полное совпадение значений содержания иммуноглобулинов.

Нами были разработаны также тест-системы для определения ал-лергенспецифических IgE-антител. Первоначально было установлено, что мкАт серии IgE/11 пригодны для выявления аллергенспецифичес-ких IgE и практически не уступают поликлональным антисывороткам, используемым в наборах RAST фирмы Pharmacia.

Наилучшие результаты были получены с мкАт IgE/11-l; использование смесей мкАт не приводило к принципиально новым характеристикам тест-системы. Для определения аллергенспецифических IgE антител оптимальными представляются мембранные варианты тест-систем. Разработанная нами тест-система ДЛСКРИН-IgE-AT не уступает по аналитическим характеристикам мембранным тест-системам, производимым фирмами CMG (Швейцария), Quidel (США). Сравнительное исследование специфических IgE антител к пыльцевым аллергенам у 267 больных с помощью наборов AJICKPHH-IgE-AT и Phadezym-RAST (Pharmacia, Швеция) выявило, что по отношению к кожным пробам тест-система ЛЛСКРИН-IgE-AT обладает более высокой клинической чувствительностью и точностью.

4.2. Тест-система: для определения теофиллина

Одной из важнейших областей применения иммуноанализа является лекарственный мониторинг - определение концентрации лекарственного вещества в крови пациента с целью подбора оптимальных терапевтических доз. За рубежом такие тест-системы широко внедряются в клиническую практику начиная с 80-х годов; в нашей стране тест-системы для лекарственного мониторинга до последнего времени не разрабатывались и не производились.

Особенностью тест-систем для лекарственного мониторинга являются повышенные требования к их специфичности; при этом критическим фактором является возможность дискриминации между лекарственным веществом и его метаболитами, образующимися в организме. мкАт в силу их высокой специфичности предоставляют уникальные возмож-

ности для создания тест-систем для лекарственного мониторинга. Следует, однако, отметить, что получение мкАт к лекарственным веществам, как и в целом к низкомолекулярным соединениям, являющимся гаптенами, имеет свои особенности. В частности, это связано с необходимостью синтеза искусственных антигенов на основе исследуемых гаптенов и иммуногенных белков-носителей, специфическими процедурами иммунизации животных и скрининга мкАт.

В нашей лаборатории проводится работа по созданию тест-систем на основе мкАт для количественного иммунохимического определения лекарственных соединений, представляющих ряд важнейших фармакоте-рапевтических групп: теофиллина - препарата для лечения астмы, дигоксина - кардиотропного препарата, фенобарбитала - препарата из группы психотропных. К каждому из этих соединений получены мкАт и проводится работа по конструированию соответствующих тест-систем. Данное направление исследований проиллюстрировано ниже на примере тест-системы для определения теофиллина.

Теофиллин - (1,3-диметилксантин) - один из наиболее эффективных препаратов для лечения и профилактики бронхиальной астмы. Терапевтический интервал его концентраций в крови составляет 10 -20 мкг/мл, однако даже при незначительном превышении этих значений могут наблюдаться токсические явления; индивидуальные же особенности его метаболизм приводят к тому, что у разных больных, получивших одну и ту же дозу препарата, концентрации в крови могут различаться в несколько раз. Это делает необходимым контроль за содержанием теофиллина в крови больных и требует индивидуального подбора доз для каждого пациента.

Для измерения концентрации теофиллина нами была разработана иммуноферментная тест-система на основе мкАт.

Для получения мкАт к теофиллину были синтезированы два конь-югата теофиллин-белок. Коныогат теофиллин-KLH, содержащий -N=N-связь между молекулой KLH и положением 8 молекулы теофиллина, был использован для иммунизации животных.• Для скрининга гибридом был использован коньюгат, в котором молекула теофиллина была присоединена по 8 положению к молекуле BSA с помощью связи -NH-(CH2)5-NH~. Применение этих коньгатов с различными белками-носителями и различными типами связи позволило отобрать мкАт, направленные против молекулы теофиллина. Были получены три линии гибридом, продуцирующие мкАт к теофиллину, с константами связывания 10x9 - 2x10x10 1/mol. С помощью конкурентного иммуноанализа

Табл.10, специфичность мкАт к теофиллину.

Соединение «жАт

2СЗ 2С10 109

Теофнллнв (1,3-диметил-ксантии) 100 100 100

Мочевая кислота 0.0001 0.0001 0.0001

Кеонтин 0,0001 0.0001 0.0001

Гипоксантин. 0.0001 0.0001 0.0001

1-М9ТИЛМОЧЗООЯ кислота 10 0.0001 80

3-мвтилксантим 0.002 0.0001 8

1,3-диметилмочевая кислота 7 500 4000

Кафеин . V1,3,7—триметилксонтин; 0.001 100 2

262218 14-Ю-

62

I 8 12 16 20 24 28

Рис,-16 Сравнение иммуноферментного метола анализа теофиллина и метола ВЭЖХ. По оси абсцисс - концентрация теофиллина, измеренная иммуноферментным методом, мкг/млг по оси ординат - концентрация теофиллина» измеренная методом ВЭЖХ, мкг/мл.

была исследована тонкая антигенная специфичность мкАт по отношению к аналогам и метаболитам теофиллина (табл. 10). Установлено, что мкАт 2вЗ высокоспецифично к теофиллину, причем метильная группа в положении 1 молекулы ксантина является критической для взаимодействия с мкАт 2йЗ. МкАт 2С10 взаимодействует как с тео-филлином, так и с кафеином и 1,3-диметилмочевой кислотой, однако не взаимодействует с 1-метилмочевой кислотой и 3-метилксантином. Следовательно, для взаимодействия с данным мкАт критическим является наличие одновременно 1- и 3- метильных групп. Специфичность мкАт 1С9 связана с наличием С8 -карбоксильной группы, поскольку это мкАт взаимодействует с 1,3-диметилмочевой кислотой в 40 раз более эффективно, чем с теофиллином.

Для конструирования тест-системы были использованы мкАт 2СЗ. Твердая фаза (планшеты или полисгироловые шарики) были сенсибилизированы с помощью мкАт, и измерение, концентрации теофиллина в образце проводилось методом конкурентного ингибирования с использованием теофиллина, коньюгированного с пероксидазой. На рис. 16. представлены сравнительные данные по измерению концентрации теофиллина с помощью разработанной нами тест-системы и методом ВЭЯХ. Из представленных данных следует, что разработанная тест-система может быть использована в клинической практике для лекарственного мониторинга теофиллина.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ:

1. Разработаны методические подходы н изучению антигенной структуры белков с помощью ыоноклональных антител. Исследована антигенная структура мембранного белка бактериородопсина, позволившая уточнить его расположение в мембране. Изучены эпитопы ряда антигенов гистосовместимости и иммуноглобулина Е человека, важные для понимания структурно-функциональных особенностей этих молекул и создания биореагентов для иммунохимического анализа.

1 2. С помощью мкАт к мономорфным детерминантам НЬА-А,В,С антигенов разработаны методические подходы и проведено изучение биохимического полиморфизма антигенов I класса главного комплекса гистосовместимости человека. Полученная впервые "библиотека отпечатков" НЬА-А,В молекул позволяет проводить биохимическое типиро--

вание этих антигенов и выявление новых субтипов. Комбинация 20- и Ю- электрофореза и иммуноблоттинга позволяет проводить скринин-говый анализ полиморфизма антигенов ГКГ в лабораторных условиях.

3. С использованием гибридом и трансфектомы впервые исследованы закономерности биосинтеза моноклоналышх З^Е и З^Р антител. Показано, что мкАт являются удобной моделью для изучения биосинтеза гликопротеинов, в частности, вопросов, связанных с гликози-лированием.

4. Получено 34 линий гибридом, продуцирующих мкАт к 10 БАВ. Разработаны методические подходы для применения этих мкАт в качестве иммунореагентов для структурно-функционального изучения соответствующих молекул и конструирования тест-систем.

5. Разработаны 6 вариантов тест-систем на основе мкАт для определения IgE в биологических жидкостях организма, которые находятся на различных этапах внедрения в производство в качестве медицинских диагностикумов. Указанные тест-системы являются первыми отечественными биотехнологическими диагностикумами для количественного иммунохимического анализа.

6. Разработана тест-система на основе мкАт для количественного определения теофиллина в биологических жидкостях, являющаяся первым отечественным иммунодиагностикумом для лекарственного мониторинга .

По материалам диссертации опубликовано 65 работ. Ниже приводится список публикаций, в которых отражены основные результаты исследований ( в скобках указаны соавторы ).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Analysis of Human class I antigens by two-dimensional gel-electrophoresis. - Immunogenetics, 1983, v.17, p. 333 -356 (Hahn A., Molders H, Rood J., Breuning H., Ploegh H.)

2. Biosynthesis of murine IgD: heterogenety of glycosylation - Eur.J.Immunolgy, 1982, v. 12, p. 804-813 (H.Ploegh )

3. Effects of the glucosidase inhibitors nojirimycin and doxy-nojirimycin on the biosynthesis of membrane and secreted glycoproteins. - The EMBO Journal, 1983, v. 2, p. 823-832 (Peyrieras H., Bause E., Legler G., Claesson L., Peterson P.,

Ploegh H.)

4. Novel method of detection of Fc-receptors and its use in screening hybridomas against Fc-receptors. - Abstracts of 5 Int. Congress Immunol.,1983, Kyoto.

5. Использование мононлональных антител для изучения структуры и функции мембранных белков. - В сб.: Материалы III Советско-швейцарского симпозиума " Биологические мембраны. Структура и функция" Ташкент, 1983. ( Втюрина И.Ю., Руденко Н.В., Трифонов В.Д., Юровский В.В.)

6. Моноклональные антитела против бактериального и зрительного родопсинов. В сб.: Материалы II Всесоюзного совещания по генетике соматических клеток в культуре, Звенигород, 1983, с. 16

( Втюрина И.Ю. )

7. Иммунохимическое изучение бактериородопсина с помощью монокло-нальных антител,- Биол. мембраны, 1984, т. 1, с. 1161-1169.

С Втюрина И.Ю., Курятов А.Б., Киселев А.В..Хорошилова Н.И., Овечкина Г.В., Абдулаев Н.Г., Цетлин В.И. )

8. Применение моноклональных антител для выделения и характеристики антигенов гистосовместимости мыши. — Биол. мембраны, 1984, т. 1, с. 814-822, ( Юровский В.В.)

9. Структура генов и молекулярная организация главного комплекса гистосовместимости,- Итоги науки и техники, 1988, т.25, с.62-93 (Стукачева Е.А.)

10. The antigenic structure and topography of bacteriorhodopsin in purple membranes as determined by interaction with monoclonal antibodies. - FEBS Letts. 1985, 179, p. 343-349

( Ovchinnikov Yu.A., Abdulaev N.G., Vturina I.Yu., Kuryatov A.В., Kiselev A.V. )

11. Искусственные пептидные и углеводные антигены. Иммобилизация гаптенов и адъюванга (МДП ) на полиакриламиде. - Биоорган, химия, 1986, т. 12, с. 100-105 ( Бовин Н.В., Юровский В.В. Сафонова Н.Г., Хорлин А.Я.)

12. Синтез и иммунохимическое изучение антигенной детерминанты Н-2Д молекулы главного комплекса гистосовместимости мыши. -Биоорган, химия, 1986, т.12, с. 89-99 С Юровский В.В., Сафонова Н.Г., Хайдуков С.В., Демин В.В.)

13. Биотин-авидиновая система в иммуноферментном анализе - В сб.: Материалы Всесоюзного симпозиума по медицинской энзимологии, Махачкала, 1986, с. 123-124 ( Рабинков А.Г. )

14. Методы иммуноанализа лекарственных веществ: современное состояние и перспективы - В сб.: Материалы 2 Всесоюзной конференции по фармакокинетике "Фармакокинетические исследования при создании и применении лекарственных средств" г. Каунас, 1987, с. 13-14 ( Вайсберг Е.Ф., Данилова Н.П )

15. Способ получения конъюгированного антигена теофиллин-белко-вый носитель.- Авторское свидетельство N 1591986

( Данилова Н.П., Бекман Н.И.)

16. Способ определения теофиллина в сыворотке крови.- Авторское свидетельство N 1573427 (Данилова Н.П., Бекман Н.И.)

17. Моноклональные антитела к иммуноглобулину Е человека -

- Биотехнология, 1988, т. 4, N 3, с. 357-359. ( Цыциков Э.Н., Втюрина И.Ю., Галанина O.E., Смирнова Е.Я., Юрин Б.Л., Стефани Д.В.).

18. Моноклональные антитела к фенобарбиталу. - Мат.

1 Всесоюзной конф. "Современные направления создания медицинских диагностикумов". Москва 1988 г. с. 16. ( Данилова Н.П., Асташкина Е.Е.)

19. Моноклональные антитела к теофиллину - Мат. 1 Всесоюзной конф." "Современные направления создания медицинских диагностикумов"

с. 15. Москва 1988 г. ( Данилова Н.П.).

20. Тест-система на основе моноклональных антител для определения уровня общего IgG4 в биологических жидкостях человека. -Мат. 1 Всесоюзной конф." Современные направления создания медицинских диагностикумов" с. 8 . Москва 1988 г. ( Втюрина И.Ю. , Левай К.А.)

21. Изучение CD23 антигена ( FcR II ) B-лимфоцитов человека с помощью моноклональных антител - Мат. 1 Всесоюзной конф." "Современные направления создания медицинских диагностикумов" с. 146 . Москва 1988 г. ( Втюрина И.Ю. )

22. Изучение антигенной структуры IgE человека с помощью моноклональных антител серии IgE/11 и протеолитических фрагментов молекулы IgE.- Мат. 1 съезда иммунологов.

г. Сочи, 1989 .т.1, с. 295. ( Смирнова Е.Я.)

23. Твердофазный иммуноферментный метод определения теофиллина.

- Хим.-фарм. журн. 1989, N. 7, с. 871-875. ( Данилова Н.П., Бекман Н.И., Шустова Л.В..)

24. Количественное определение стефарина твердофазным имму-ноферментным методом в культуре растительной клетки ^

- Хим.-фарм. журн. 1990, N. 1, с: 156-158. ( Луцкова С.Н., Фадеева И.И., Мирошников А.И.)

25. Одностадийный иммуноферментный метод количественного определения IgE человека с использованием моноклональных антител

- Иммунология, 1989, N. 1, с. 77-81. ( Юрин Б.Л., Цыциков Э.Н., Сердюк O.A., Порошина Ю.А., Феденко Е.С.)

26. Иммуноферментная тест-система на основе моноклональных антител для определения общего уровня иммуноглобулина Е у детей и подростков. - БЭБиМ, 1989, т.6, с. 722-724. (Сердюк O.A., Цыциков Э.Н..)

27. Высокочувствительный двухцентровый метод определения IgE человека в биологических жидкостях с использованием авидин-био-тиновой системы. - Иммунология , 1989, N 2, с. 70-73.

( Юрин Б.Л., Цыциков Э.Н.)

28. Модуляция протеинкиназой электрочувствительности клеточных мембран.-Биол.мембраны, 1989, т.6, N 3, с.309-317 (Васильев A.A., Цыциков Э.Н., Райхман Л.М.)

29. Использование моноклональных антител к IgE человека для определения аллергенспецифического IgE в сыворотке крови.

- Я.И.Э.И., 1990, т.7, с. 93-97. ( Смирнова Е.Я., Сердюк O.A., Лебедин Ю.С. )

30. Препаративное выделение IgE человека методом аффинной хроматографии с использованием моноклональных антител - В сб.: "Биотехнология - медицине и народному хозяйству"- сб.трудов ВНИИ Биотехнологии 1990 т.1, с.7-10. ( Сердюк О.А., Смирнова Е.Я., Лебедин Ю.С.)

31. ДОТ-иммуноферментный анализ для определения концентрации IgE в сыворотке крови человека - В сб.:"Биотехнология - медицине и народному хозяйству", сб. трудов ВНИИ Биотехнологии 1990 т.1, с.5-7 ( Юрин Б.Л., Смирнова Е.Я.)

32. Application of the membrane-based linear ELISA to the diagnosis of allergy. - Abstracts of б International Congress on Rapid Methods and Automation in Microbiology and Immunology. Helsinki. 1990, p.184. ( Vlasov G.S., Smirnova E.Ya, Serdyuk 0.A..Tsitsikov E.N., Petrova E.N. )

33. Электростимулируемое слияние клеток в гибридомной технологии.- Биотехнология, 1990, т.6, N 4, с.20-23 (Васильев А.А., Цыциков Э.Н., Уразманов Р.И., Райхман Л. М. )

34. Study of biosynthesis of human IgE using transfectoma cell line JW. - Abstracts of International Symposium on Allergy and Clinical Immunology "Regulation and Clinical Significance of IgE", Moscow, 1990, p.65. ( Smirnova E. Ya.)

35. Immunoglobulin E: Antigenic structure, biosynthesis and regulation.- Abstracts of International Symposium on Allergy and Clinical Immunology "Regulation and Clinical Significance of IgE", Moscow, 1990, p.3. (Tsitsicov E.N., Smirnova E.Ya.)

36. Large beads EIA for total IgE determination in two ranges -

- Abstracts of International Symposium on Allergy and Clinical Immunology "Regulation and Clinical Significance of IgE", Moscow, 1990, p.63. ( Sergeeva A.Yu, Serdyuk O.A. )

37. New simple method of allergen-specific IgE detection -

- Abstracts of International Symposium on Allergy and Clinical Immunology "Regulation and Clinical Significance of IgE", Moscow, 1990, p.53. ( Pivnjuk V.I., Tsitsikov E.N. )

38. Cloning of gene of the human low-affinity IgE receptor (FceRII)CD23 ) - Abstracts of International Symposium on Allergy and Clinical Immunology "Regulation and Clinical Significance of IgE", Moscow, 1990, p.58. ( Tsitsikov E.N., Pivnjuk V.I., Tchelidze L.K., Marzen E.O.)

39. IgE synthesis in vitro by human peripheral blood mononuclear cells induced by recombinant interleukin-4 time and dose dependence - Abstracts of International Symposium on Allergy and Clinical Immunology "Regulation and Clinical Significance of IgE", Moscow, 1990, p.69. ( Tsitsicov E.N., Lebedin Yu.S.)

40. Test-strips allergen-specific IgE Enzyme immunoassay. - Abstracts of International Symposium on Allergy and Clinical Immunology "Regulation and Clinical Significance of IgE", Moscow, 1990, p.70. ( Vlasov G.S..Serdjuk O.A..Smirnova E.Ya., Ali-Abdalla S..Kanchurina N.A..Lebedin Yu.S.,Danilycheva I.V., Sudovtsov V.E., Larin V.T.)

41. IgE apheresis in treatment of atopic asthma - Abstracts of International Symposium on Allergy and Clinical Immunology "Regulation and Clinical Significance of IgE", Moscow, 1990, p.12. ( Chuchalin A.G., Lebedin Yu.S., Raudla L.A., Petrova E.N., Tatarsky A.R. ).

42. Analysis of human major histocompatibility complex antigens electrophoretic methods with subsequent irwnunoblotting -

- Biomedical science, 1990 , 1, p. 384-390 ( Serdyuk O.A )

43. An ultrasensitive immunoassay for human IgE measerement

in cell-culture supernatant.- Immunol.Letters, 1990, 2< 283-284 (Tsitsikov E.)

44. Production and characterization of anti-theophylline monoclt antibodies suitable for immunoassay. - Immunol.Letters, 199: 28, 79-84 (Danilova N.P.)

45. IL—4 induced in vitro IgE synthesis by human PBMC: relation cell proliferation and phenotype. - Abstracts of European A' demy of Allergology and Clinical Immunology, Zurich, 1991 ^ Schweizerische Medizinische Wochenschrift, 1991, Suppl.40/I] p.31 (Tsitsikov E., Lebedin Yu., Pivnjuk V. , Chukanov S., Tchelidze L.)

46. Dipstick-based line ELISA for determination of total and al] gen-specific serum IgE. - Schweizerische Medizinische Wochei schrift, 1991, Suppl.40/11, p.73 (Vlasov A., Smirnova E., Serdjuk 0., Lebedin Yu.)