Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Молекулярно-генетическая характеристика перестроек генов короткого плеча 17-й хромосомы в некоторых опухолях у человека

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ОНКОЛОГИИ им. проф. Н. Н. ПЕТРОВА

На правах рукописи УДК 575.113.001.3-f-612.014.24 : 610-006

Ч ЕР Н И ЦА ОЛЕГ ИВАНОВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕРЕСТРОЕК ГЕНОВ КОРОТКОГО ПЛЕЧА 17-й ХРОМОСОМЫ В НЕКОТОРЫХ ОПУХОЛЯХ У ЧЕЛОВЕКА

Специальность— 14.00.14 — онкология 03,00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

199 5

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте онкологии им. проф. Н. Н. Петрова РАМН.

Научные руководители:

доктор медицинских наук П. Г. КНЯЗЕВ, чл.-корр. РАМН, проф. К- П. ХАНСОН

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук В. С. ГАЙЦКОХИ, доктор медицинских наук Л. М. БЕРШТЕЙН

Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологиче-ский институт.

Защита диссертации состоится « »........ 1995 г.

в « » часов на заседании специализированного совета НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова (189646, Санкт-Петербург, Песочный-2, Ленинградская ул., 68).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Ведущее научное учреждение:

Автореферат разослан

1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Е. В.ДЕМИН

Актуальность, рзб.ош.

К настоящему времени достигнут значительный прогресс в понимании молекулярных основ канцерогенеза (Сейц И.Ф., Князев П.Г., 19S6; Киселев Ф.Л. и др., 1990; Weinberg R., 19Б9). Проклонировэно большое количество онкогенов, или доминантных раковых генов, активация которыхвызывает злокачественную трансформацию клеток. Также быстрыми темпами продвигается процесс идентификации новых антионкогенов, или рецессивных раковых генов. Одним из методов поиска таких геноо является изучение зон яелеций участков хромосом. Именно таким образом были клонированы антионкогены \VT1, NFI, DCC, APC.

Известно, что потери генетического материала на коротком плече 17-й хромосомы встречаются примерно в половине злокачественных опухолей молочной железы, толстой кишки, легких и др. Также известно, что в области 17р13,1 расположен антионкоген р53. Однако более дистальный участок короткого плеча хромосомы 17 - регион 17р13,3 делецируется чаще, чем ген р53. Многими исследователями было показано, что при делециях 17р13,3 ген р53 оставался неповрежденным. Эти факты наталкивают на мысль о существовании еще одного, а может быть и нескольких супрессорных генов на 17р13.3. Известно немного работ, в которых делеции на 17р 13,3 изучались детально, хотя бы с использованием трех полиморфных маркеров на данную область. Точное картирование делеций хромосомы 17р13,3 позволит облегчить поиск антионкогена, расположенного в данной области. Данные о клиническом значении делеций 17р 13.3 противоречивы.

Также представляет интерес поиск сочетаний повреждений онкогенов и антионкогенов в карциномах молочной железы. В нашей лаборатории уже получены данные об ассоциации делеций 17р с амплификацией онкогена ERBB2 <Knyazev P.G. et al, 1993). Амплификация онкогена INT2 (локус 1 tq 13) также встречается в злокачественных опухолях молочной у человека. Поиск связи этого события с делециями 17р представляется обоснованным и интересным. К тому же литературные данные о частоте и клинической значимости амплификации онкогена INT2 достаточно противоречивы.

. Целью работы является:

- выявление частоты, структуры и клиникопато логического значения делеций короткого плеча 17-й хромосомы в карциномах молочной железы, толстой кишки и легкого;

- изучение амплификации локуса 11р13, его кпюмчгского значения в опухолях данных локализаций, а также комбинаций молекулярио-генетических повреждений.

В связи с этим поставлены следующие задачи:

1. Выявить частоту и структуру делеций на хоротком плече хромосомы 17 в РМЖ. РТК и РЛ.

2. Выявить частоту амплификации локуса 11р13 в данных опухолях.

3. Оценить комбинаторику упомянутых повреждений в опухолях.

4. Изучить клиникспатологическое значение всех выявленных молекулярно-генетических аномалий.

' Научная новизна и практическая значимость полученных результатов. В ходе выполнения диссертационного исследования впервые показано:

- делзции локусов участка хромосомы 17р13,3 связаны с активацией процессов инвазии и метастазирования опухолей легкого и повышенной метастатической активностью опухолей толстой кишки;

- амплификация локуса 11 ч 13 ассоциирована с большим размером опухоли у больных раком молочной железы.

Кроме того, получен ряд новых данных:

- показана высокая частота потерь гетерозиготности всех изученных локусов самой дистальной области короткого плеча хромосомы 17 в неоплазмах молочной железы {\iiZ22 - 42%, УМИ37,3 - 40%, 144Со - 38% случаев), толстой кишки (\UZ22 - 53%, УЫН37,3 - 54%, 14406 - 57%), в немелкоклеточных раках легкого (УЫг22 - 41%, УШ37,3 - 41%, 14406 -45%) у человека;

- показана низкая частота делеций проксимального участка короткого плеча 17-й хромосомы в опухолях у человека (молочная железа - 16%, легкое -21%, толстая кишка - 13%);

- показана тенденция к корреляции между амплификацией локуса 11 я 13 и низким уровнем дифференцировки опухолевых клеток (р<0,2).

Диссертационная работа имеет научно-теоретический характер. Ее практическая значимость заключается в следующем.

Данные о клиническом значении амплификации локуса 11 ч 13 в карциномах молочной железы позволяют разработать окспресс-метод для уточнения прогноза заболевания. Для этих целей с успехом может применяться количественная полимеразная цепная реакция, материалом для

У

которой может служить пункционный биоптат опухо/»' Для карцином толстой кишки и легкого оценка Статуса локуса 17р13 3 мокет дать информацию о потенциальной возможности злокачественной опухоли к инвазии и метастазированию. что оченв важно для тактики ведения больного практическим врачом.

^Прс5а11ИЯ_.._рабо1и. . Основные положения диссертации были представлены на "1-й Совместной Онкологической Конференции Молдова-Румыния" 7-9 июня 1993, Кишинев.- Conferinia bilaterala de oncotogie. Moldova-Romania.- Chisinau. - Editura "Oncologia' - 1993,- P. 62-65; "XVI Международном Раковом Конгрессе" 30 октября-5 ноября 1994, Ныо Дели, Индия - XVI International Cancer Congress, Oral & Posters.- 1994,- PSB36-14,- P.376.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 97 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, результатов исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 4 рисунками. Библиографический указатель включает 181 публикацию на русском и английском языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве материала исследования использовались хирургически удаленные участки тканей опухолей. Для контроля использовали макроскопически неизмененные ткани по краю резекции того же органа, а также периферическую кровь от этих же больных. Всего материал для исследования получен от 153 пациентов, в том числе: 80 образцов рака молочной железы; 40 - рака толстой кишки; 38 - рака легкого.

Выделение ДНК проводили, используя метод, описанный Т. Мата^э е( а!. (1982). Также применяли более простой метод очистки нуклеиновых кислот. После лизиса к препаратам добавляли №С1 до концентрации 1,5 М и равный объем хлороформа, встряхивали в течение 30 минут и центрифугировали (МиПепЬасЬ Я. е1 а1., 1989). Затем, независимо от применяемой модификации метода, к супернатанту добавляли 2 объема этанола, после чего нити ДНК "выкручивали" из раствора при помощи быстрого вращения стеклянной палочки. Нити ДНК тщательно отмывали в

70% этаноле (2-3 смены) и растворяли в минимальном объеме 1-х ТЕ буфера (10 мМ трис-HCi. pH 7.5; 1 тМ ЭДТА> (Maniatis T. е\ al.. 1982) и хранили при 4'С.

10 мкг ДНК обрабатывали соответствующей ондонуклеазой рестрикции ("Фермент", Вильнюс; "Биопол",'Москва), затем фрагменты ДНК элеггрофоретически разделяли в 0,8-1% геле агарозы ("Pharmacia". Швеция) и переносили на нейлоновые мембраны "Hybond-N", rAmersham", Англия; "Хио-Капур", Таллин) (Е. Southernet ai, 1975).

В работе использовались следующие зонды: анонимные маркеры на короткое плечо 17-й хромосомы EW301 ( 17р11,2, л о кус D17S53), JCZÎS.2 (17р13,3, лакус D17S5), YNH37.3 ¡17р!3.3, локус D17S2S), 144D6 (17р13,3. локус D17S34) - предоставлены АТСС, США; YNZ22 (17р13.3 локус D17S5) - предоставлен R.White, США; 0,9 т.п.н. Sacl-Sac! фрагмент онкогена INT2 (плазмида SS6, предоставлена С. Dickson. Англия): 0 7 т.п.н. BamHI-EcoRI фрагмент онкогена ERBB-2 (пг.азмяда регЬЕ-2. "Aniersham", Великобритания); полная копия онкогена HRAS-1 (пяазмида pHRAS-Th-3 предоставлена П.Г. Князевым, НИИ онкологии им. H.H. Петрова, С.Петербург). Для контроля эквивалентности количества нуклеиновых кислот фильтры с ДНК перегибридизовывали с 1,6 т.п.н. Hindül-EcoR! фрагментом онкогена RAF-1 (*Amersham\ Великобритания).

Выделение препарата ДНКплазмчаы из E.coli (штамм H81Q1) осуществляли по модифицированному методу Maniatis T. et ai. (ÎS82).

Мечение специфических зондов осуществляли в реакции ник-трансляции или в реакции со "статистической затразкой" путем встраивания "горячих" нуклеотидов, несущих а альфа положении радиоактивную фосфатную группу 32Р. Для проведения реакции пользовались набором, предлагаемым фирмой . "Amersham" (Великобритания) или "Фермент" (Вильнюс).

Меченую ДНК денатурировали в кипящей водяной бане в течение 5 мин, быстро охлаждали и сразу использовали для гибридизации с образцами ДНК, иммобилизованными на фильтрах. Предварительно нейлоновые фильтры с фиксированной на них ДНК предгибридизовали в течение 2 часов при 42'С в растворе, содеращим 50% формамид; 5-х SSC; 0,1% SDS; 0,05% поливинилгшрролидон; 0,05% фикол; 0,05% БСА; 100 м кг/мл дрожжевой тРНК. Зате;л этот раствор заменяли гибридизационным, содержащим наряду со всеми перечисленными компонентами раствора для предгибридизации специфический зонд,

€

меченный 32Р. Гибридизацию ДНК на фильтрах в em при 42'С в течение 1624 часов.

По завершении гибридизации фильтры промывали при 42'С 8 трех сменах раствора N'1 (I-* SSC: 0.1% SOS) и в трех сменах раствора N'2 {0.1-х SSC; 0,1% SDS). Затем проводили 5-минутную отмывку в последнем растворе при 65'С. Отмытые фильтры высушивали и экспонировали на рентгеновской пленке в кассетах с усиливающими экранами при -70'С в течение 3-21 суток (Laskey L.A., Mills A.D.. 1977).Интенсивность гибридизации определяли денситометрически по степени затемнения рентгеновской пленки, а та юсе визуальным сравнительным анализом.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась по методу Хи-квадрат.

РЕЗУЛЬТАТЫ (1 ОБСУЖДЕНИЕ

В работе использовались пять анонимных зондов на четыре локуса короткого плеча 17-й хромосомы: EW301, YNZ22/JCZ16.2. YNH37.3, 144D6 {см. рис. 1).

В раках мелочной железы (РМЖ) делении EW301 обнаружены в 3 из 19 информативных образцов (1S%), YNZ22 - в 22 из 53 (42%). YNH37.3 - а 9 из 22 (40%), 144D6 - в 21 из 56 (38%).

ДелеЦии локуса D17S58 (EW301) встретились несколько реже по отношению к данным других исследователей (20-30%) (Devilee Р. et al, 1989).

Локусы региона 17р13,3 делецировались с частотой, сравнимой с литературными данными. Как уже отмечалось, эти данные весьма гетерогенны. Например делении YNZ22 в ДНК от больных раком молочной железы составляли от 34% (Kirchweger R. et al, 1994) до 61% (Devilee Р. et al, 1989). Нетипичной в нашем исследовании оказалась структура делеций. Обычно максимальное количество потерь гетерозиготности (ЛГ) выявляет зонд 144D6. Например, в работе Thorlacius S. et al (1993) данный зонд делецировался в 61% случаев, зонд YNH37.3 - а 52%, зонд YNZ22 -только в 37% случаев. Аналогичная закономерность прослеживается в работе Devilee Р. et al (1989). Однако, есть примеры работ, где проксимальные локусы 17р13,3 делецируются чаще дистальных

Рисунок 1. Схема короткого плеча 17-й хромосомы.

Бас (сМ)

Ю--

2»-

30-

40--

ТЕЬ

133

15,1

11,2

1о(П!

Й34 --

55

Я126

Ш вбб

|РОЬЯ2 вЗ!

МУШ

8121

561

$125

ЯШ

Э71

Б29

Апопутош ргоЬ«

- »404

-

-Е\*504

- Е\Л"502

- МСГ35Д -Р53

Г10,5

Е\\301

СЕ\

(Kirchweger R. et at, 1S94). В нашем же исследовании see зонды на 17р13,3 выявляли примерно одинаковую частоту потерь гетерозиготности в РМЖ.

В 60% случаев РМЖ наблюдались делении всех трех изученных локусов 17р13,3. Однако встречались различные комбинации потери гетерозиготности данных локусов. когда в одном образце при делеции одного или двух локусов оставшиеся оставались гетерозиготными. Интересно, что случаи, где делеции YNZ22 сочетались с гетерозиготным состоянием YNH37.3 и 144D6 наблюдались на ранних стадиях развития опухолей.

Таким образом, делеции 17р в РМЖ- встречались примерно в половине случаев.

В колоректальных раках делеции EW301 выявлены в 13%. YNZ22 - 8 53%. YNH37.3 - в 54%, 144D6 - в 57% случаев. Частота ПГ локуса D17S58 (EW301) сравнима с литературными данными (Baker S.J. et at, 1989). • Частота делеции маркеров области 17р13,3 оказалась несколько ниже по отношению к данным других исследований. В раках толстой кишки (РТК) данный регион делецируется в среднем в 60-70% опухолей (Baker S.J. et al. 1989: Lino H. et al. 1994; Vogelstein В, et at, 1989). Делеции локусоз 17р13,3 встречались, как и в РМЖ, с одинаковой частотой.

Во вс°х немелкоклеточных раках легкого (РЛ) делении на 17р выявились со следующей частотой: EW301 - 21%, YNZ22 - 41%. YNH37.3 -41%. 144D6 - 45%. В аденокарциномах делеции 17р выявились нечасто {0%, 14%. 20%, 17% соответственно), а то время гак в плоскоклеточных раках легкого существенно чаще - (23%. 48%, 46%, 52%). Зги данные согласуются с данными, полученными в других лабораториях (Tsuchiya Е. et al, 1992). В опухолях легкого . как в РМЖ и РТК, локусы 17р13,3 делецировались примерно с одинаковой частотой.

опушпей-

Делеции 17р13,3 выявились достаточно часто в РМЖ, однако нам не удалось обнаружить связь этих делений ни с одной клинической характеристикой опухолей (таб. 1). Тот факт, что делеции не зависят от стадии заболевания говорит о том. что это довольно раннее событие в развитии опухоли. Это подтверждает данные других исследователей, которые находили ПГ на коротком плече 17-й хромосомы даже в карциномах in situ (Radford D.M. et al, 1993). Интересная ситуация сложилась

с анализом делеций 17р в группах больных с вовлеченными в опухолевый процесс регионарными лимфоузлами и с интакткыми лимфоузлами. ТакИа К. е{ а1 (1992), используя зонд УN222, обнаружили связь делеций этого зонда с метастазами в регионарные лимфоузлы. Несколько позже в нашей лаборатории были получены обратные результаты (Клуагеу Р.Э. е1 а), 1993): потери гетерозигсгности \HZ22 коррелировали с отсутствием регионарных лимфогенных метастазов. Большинство же исследователей не находило никакой зависимости в этом аспекте (ОечЛее Р. Ы а!, 1989; Со1гэ С. е! а), 1990; Сгорр С.Б. е{ а!, 1990). В настоящей работе обнаружились тенденции к тому, что среди больных с метастазами в лимфоузлы делеции УН222 встретились несколько реже (36%) по отношению к больным без метастазов (45%), э с самой прителомернсй пробой, 14406, наоборот: из 21 препарата ДНК от больных с вовлеченными лимфоузлами 11 имели делеции 14406 (52%), в то же время из 35 препаратов от больных без метастазов 10 имели делеции этого локуса (28%), р<0,1. Таким образом, возможно, мы имеем дело с различными генами, в пределах региона 13,3. Один из них может относиться к классу генов, усиливающих метастатический потенциал опухолей, а другой - быть его ингибитором.

При немелкоклеточных раках легкого изучались такие клинические параметры как наличие метастазов в регионарные лимфоузлы, размер опухоли, инвазивность опухоли, выживаемость больных. Мы обнаружили ассоциацию между делециями УN222 и наличием лимфогенных метастазов опухоли. Для двух других зондов такая связь не подтвердилась статистически, но наблюдалась тенденция к ней (см. таб.2). Интересным оказалось наблюдение, что ПГ двух прителомерных зондов .17р13,3 связаны с высокой инвазивностью опухоли. Другие авторы также находили подобные закономерности (ТвисМуа Е. е! а), 1992; МагсЬеШ А. е1 а1, 1993).

При изучении РТК обнаружилась корреляция между делециями всех трех локусов 17р13,3 и наличием метастазов в лимфоузлы (таб. 3). Однако

Таблица i .Jlsnr2iinit_LiDJiwwiii«9rKi!e параметры

■ Еака^олаинслжапеаы.

^nw.M.IWnrk ! ПЯрЯМ^ТрЫ Делеции ло»усов

рзкз :.:zr.y"r.z-:: железы Cn*iO()i у v 170П YNH37.3 144 CS

Возраст болоныл

< 50 лет 2/12 5/17 4/3 9/13

> 50 лет 1/7 17/38 5/14 12/38

Лимфзти' ¡еские узлы

вовлечены ■ 2/3 8/22 4/9 11/21#

не вовлечены 1/10 14/31 5/13 10/35

Размер опухоли

< 2cm 1/8 10/23 4/10 9/24

> 2cm 2/11 12/30 5/12 12/32

Уровень

дифференцировки

клеток опууоли

высокий 0/3 1/5 1/3 1/5

средний 2/13 20/44 7/16 19/47

НИ1КИЙ 1 /Я 1/4 1/Я 1/4

. Rnprn ,..1/19 ...... .......... 9/??, ?Vif5

# - p<0,1 x/y. x - количество делоций в данной группе у - количество обралцоа данной группы

Таблица 2. Делеши 17р и клинические параметры рака легкого

Клинические параметры Делеции локусав

рака легкого EW301 YNZ22 YNK37.3 144D6

Метастазы в лимфоузлы

имеются 3/13 10/16* 9/16 # 9/15#

не имеются 2/11 3/16 3/13 5/16

Размер опухоли

>5ст 2/7 4/11 4/10 5/11

<5ст 3/17 9/21 8/19 9/20

Инвазия

+ 4/14 10/18Я 10/16* 11/17* -

- 1/10 3/14 2/13 3/14

Выживаемость

умерло 2/3 # 3/3 # 3/3 # 3/3 #

живы 3/21 10/29 9/26 11/28

Всего 5/24 13/32. 12/29 14/31

" - р<0,05 х/у: х - количество делеций в данной группе # - р<0,2 у - количество образцов данной группы

it

Таблица 3.

вэхалааошалшт

Клинические параметры ряп-я тплгтпй тлпии Делении локусов ПЛПГИ УЫНЯ7Я 144 Г)Я

Метастазы в лимфоузлы имеются не тлеются 2/8 1/16 11/14* 6/18 9/1 Г 6/17 11/12* 6/18

Размер опухоли >6сгп <6ст 1/6 2/18 5/11 12/21 5/7 10/21 5/7 12/22

Инвазия + 2/17 1/7 . 12/22 5/10 10/18 5/10 11/20 6/10

Рецидивы 1/6# 2/18 З/б 14/26 2/6 13/22 2/6 15/24

Всего 3/24 17/32 15/23 17/30

* - р<0,05 х/у: х - количество делеций в данной группе /

# - р<0,2 у - количество образцов данной группу

не обнаружено связи делеций 17р13,3 с инзазивностью опухолей. " • В настоящее время ухе охарактеризованы некоторые гены.продукты которых принимают непосредственное участие в процессах развития метастазов. Как известно, метастазирование злокачественной опухоли -процесс многостадийный. Во-первых, клетка должна отсоединиться от первичной опухоли, инаазироеагь эхстрацеллюлярный матрикс, попасть в лимфатический и/или кровеносный сосуд и в конечном итоге, задерживаясь-в органе-мишени, образовать там метастаическую колонию Каждый из этих этапов опосредуют белки с определенными функциями. Это прежде всего молекулы адгезии, которые опосредуют как межклеточные взаимодействия, так и взаимодействия между клетками и матриксом. Белок кадгерин обеспечивает межклеточные взаимодействия, и при нарушении его функции и/или уменьшении количества инвазивно-метастатический потенциал опухоли растет. Другая группа .адгезивных молекул - интегрины, наоборот, способствуют процессам инвазии, опосредуя контакт клеток с магриксом. Далее в процесс включаются ферменты протеолиза межклеточного вещества, которые большей частью относятся к метгллопротеазам. Они

П ■

способствуют выходу клеток в сосудистое русло. 'Недавно были открыты ингибиторы металлопротеаз - пептиды семейства TiMP. 8 опытах эти белки препятствуют процессам инвазии опухолевых клеток (StetlerStevenson W.G. et al. 1993). Таким образом, мы сталкиваемся с целой системой, которая функционирует в процессах физиологического развития тканей и органов (ангиогенез).

Однако, в клетках злокачественных опухолей эта система под

воздействием мутаций либо самих генов, кодирующих эти пептиды, либо регуляторных элементов таких генов становится несбаллансированной. что и приводит к метастатическому фенотипу.

Учитывая результаты настоящей и предыдущей работ нашей лаборатории, а также литературные данные, можно предположить наличие одного или целого кластера генов, продукты которых отвечают за инвазию и формирование метастазов опухоли на коротком плече 17-й хромосомы в области 13,3. И скорее всего данные гены кодируют продукты, негативно регулирующие процессы инвазии клеток (ингибиторы металлопротеаз, молекулы межклеточной адгезии).

Итак, делеции 17р 13.3 могут служить маркером инвазивности и метастатического потенциала опухолей толстой кишки и легкого, что оченьважно знать для планирования лечения и уточнения прогноза заболевания.

З^АтпмФикатшззкхсаЛ.Ш 13 вяпухопжулепоиека-

Амплификация локуса î 1 q 13 выявлена в 13% РМЖ. 10% Р/1 и не выявлена в РТК.

Наши данные по частоте амплификации локуса 11q13 в карциномах молочной железы не противоречат литературным данным (Tsuda Т.Е. et al, 1989с). В нашем исследовании не выявлено связи амплификации данного локуса со стадией заболевания, что говорит о том, что это событие -довольно раннее в опухолевой прогрессии. Многие авторы указывают на ассоциацию амплификации локуса 11q13 с наличием эстрогенных и прогестероновых рецепторов. В нашей работе такой связи выявить не

удалось, возможно отчасти из-за того, что мы имели данные по рецепторам

И

только о 15 больных. Единственная достоверная корреляция была обнаружена между амплификацией данного локуса и большим размером опухолей (р<0,05). Также наблюдалась некоторая тенденция к ассоциации данного молекулярно-генетического повреждения с низким уровнем дифференцировки опухолевых клеток (таб. 4).

Известно, 470 сам онкоген INT2, несмотря на амплификацию, довольно редко экспрессируется в клетках опухолей молочной железы. Очевидно, вклад в канцерогенез в этом случае осуществляют другие, входящие в амплификон и располагающиеся по соседству, онкогены. Для некоторых генов, входящих в амплификон, очень вероятна трансформирующая активность. Сейчас неясно какие конкретно гены амплификона играют роль в развитии РМЖ. Наиболее вероятным канд!1датсм является ген PRAD1, суперзкспрессию которого часто находят в клетках РМЖ. Ген PRAD1 кодирует белок циклин Д1. который, связываясь с циклин-зазисимыми киназами, инициирует каскад фосфорилирования белков. Это, в свою очередь, является ключевым моментом в инициации клеточного цикла (Buckley M.F. et at. 1S93). Таким образом, амплификация локуса 11q13 может служить маркером пролиферативной активности опухолевых клеток. Для более точных выводов очень важно изучить в клетках РМЖ структуру амплификона 11q13, а также степень экспрессии генов, входящих в амплификон .Тем не менее статус онкогена INT2 корректно рассматривать как. маркер амплификации соседних генов и, в ;зможно, как маркер пролиферативной активности злокачественных клеток при РМЖ.

Таблица 4 аглшФгжзи'-изо&.са 11а1 '1>д.кли^ь-гсм!« перзи^тры рала '■1СЛ?ч1:!£?Ги>"елезы

Клинические плрэметры Л о кус 11413 связь

олкз мелочной хег.езы амплификация/вссго

Зозоаст больных

< 50 лет 3/24 (12,5 ";) ьет

> 50 лет 7/54(12 Э-.о)

Лимфатические узлы

вовлечены 5/36(14%) нет

не вовлечены 5/42(12%!

Рецепторы

ЕР + 2/3 (25%) нет

ЕВ - 2/7 (28%)

РЯ + 1/4 (25%) нет

РН - 3/1427%)

Размер спухсли

< 2ст 1/34 (3%) р<0,05

> 2ст 9/44 (20%)

У розень ДиО ^ерен!жировки

клеток опухоли

высокий 0/5 (0%) р<0.2

средний 8/69(12%)

низкий 2/4 <50%'*

Вгрго 10/7ЯПЗ%)

4^<фтир0взшрмелетй 17с13Л,

С появлением полиморфных маркеров различных участков хромосом стало возможно оценивать потери генетического материала при развитии злокачественных, опухолей с довольно четкой локализацией этих делеций в геноме. Практически во всех локализациях и типах злокачественных опухолей встречаются делеции на коротком плече 17-й хромосомы. ■ Известно, что на участке 17р13,1 (см. рис.1) находится антионкоген р53, который очень часто повреждается в опухолях. Однако для этого гена более типичны мутации. Дистапьный участок 17-й хромосомы привлек внимание исследователей, так как во-первых, делеции 17р13,3 происходят чаще делеций р53 и во-вторых, во многих случаях делеций 17р!3,3 ген р53 оказывался нормальным.

В нашей работе регион 17р13,3 исследовался тремя полиморфными зондами: ХН122, УМН37,3 и 14406. Делеции всех этих локусов встретились довольно часто в опухолях исследуемых локализаций. Причем только в РМЖ не выявилась сцепленность этого события с клиническими параметрами. 8 Р/1 и РТК делеции 17р13,3 ассоциировались с инвазивным и метастатическим потенциалом опухолей. Соответственно, в

данном регионе должны содержаться гены, продукты которых оказывают негативное влияние на эти характеристики опухолевого процесса в РЛ и РТК. Неясно, входит ли в область делеций антионкоген р53. В этом плане полезной бы оказалась работа по выявлению аномалий данного гена в ДНК опухолей, где были'обнаружены делении 17р13,3. Зонд Е\М301 обычно не выявлял потери гетерозиготности в тех образцах, где обнаруживались делеции 17р13. Это значит, что в большей части препаратов ДНК сохранялся проксимальный участок короткого плеча 17-й хромосомы. К тому же при рассмотрении структуры делеций на 17р отмечалось, что довольно часто они были небольшими, захватывая один или два локуса данного региона при сохранном третьем. Итак, в пользу локализации на 17р13.3 одного или нескольких антионкогенов говорит сумма литературных и полученных в данной работе данных:

1. Делеции 17р13,3 встречаются чаще делеций гена р53.

2. Делеции 17р13,3 не всегда сопровождаются делециями р53. и в данных случаях отсутствуют точковые мутации гена р53.

3. Делеции 17р13,3 часто ассоциируются с неблагоприятными клиническими параметрами опухолей.

Вполне возможно, что в области 17р13,3 может локализоваться не один, а несколько антионкогенов, поскольку различные зонды области 17р13,3 выявляют потери гетерозиготности в некоторых образцах несочетанно. Следует также отметить, что между локусами. картируемыми зондами на 17р13,3. расстояние довольно большое (несколько миллионов пар оснований), и . следовательно, здесь могут располагаться целые кластеры генов.

В предыдущей работе нашей лаборатории (Кпуагеу Р.С. е1 а1. 1993) была найдена корреляция между делециями 17р и амплификацией онкогена РВВВ2. В настоящем исследовании была предпринята попытка обнаружить ассоциацию делеций 17р с амплификацией онкогена 1ЫТ2 (113). Такой связи обнаружено не было.

ВЫВОДЫ

1. Делеции локусов региона 17р13,3 встречаются довольно часто в неоплазмах молочной железы (УЫг22 - 42%, УЫН37,3 - 40%, 14406 - 38% случаев), толстой кишки (УЫ122 - 53%, УШ'37,3 - 54%, 14406 - 57%), в немелкоклеточных раках легкого (УЫЛ22 - 41%, УЫН37,3 - 41%, 14406 -45%).

/в

2. В ад ено карциномах легкого делеции данных локусоо встречаются редко (YNZ22 - 14%, YNH37.3 - 20%, 144D6 - !7%) по сравнению с плоскоклеточными раками легкого (YNZ22 - 48%. YNH37.3 - 46%, 144D6 -52%).

3. Делеции всех локусов региона 17р13,3 ассоциированы с увеличением инвазивного и метастатического потенциала рака легкого (р<0,05) и метастатического потенциала рака толстой кишки (р<0,05).

4. Потери гетерозиготности локуса D17S58 (проба EW301) в злокачественных опухолях указанных локализаций втречаются редко (молочная железа - 16%, легкое - 21%, толстая кишка - 13%).

5. Делеции на 17р - события ранние в развитии опухолей, поскольку не ассоциированы со стадией развития опухоли.

6. Локус 11q13 амппифицируется нечасто в опухолях молочной железы (13%) и легкого (10%) и не амппифицируется в опухолях толстой кишки.

7. Амплификация локуса 11q13 - событие относительно раннеев развитии опухолей молочной железы, так как не ассоциируется со стадией

заболевания.

8. .Амплификация локуса 11 q 13 может служить маркером пролиферативной активности клеток рака молочной железы, поскольку связана с размером опухоли (р<0,5) и имеет тенденцию к корреляции с низким уровнем дифференцировки клеток опухоли (р<0,2).

9. Нет взаимосвязи между делециями 17р и амплификацией онкогена INT2.

Выражаю сердечную признательность руководителям

диссертационной работы д.м.н. Петру Григорьевичу Князеву и чп.-корр. РАМН, проф. Кайдо Пауловичу Хансону за постоянное внимание к работе. Приношу глубокую благодарность за огромную помощь в выполнении работы своим друзьям и коллегам к.м.н. Имянитову E.H., к.б.н. Того A.B., Лауру О.Ю., Чебуркину Ю.В., к.м.н. Лыщеву A.A., Вишняковой С.И., Рикуновой Л.В., к.б.н. Никифоровой И.Ф. Выражаю глубокую благодарность также проф. Семиглазову В.Ф., проф. Барчуку A.C., д.м.н. Симонову H.H.. к.м.н. Ивановой O.A., д.м.н. Лемехову В.Г., к.м.н. Гуляеву A.B. за предоставление опухолевого материала, к.м.н. Цырлиной Е.В., Пиха

A.B. за предоставление данных о содержании стероидных рецепторов в карциномах молочной железы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Имянитов E.H., Черница О.И. Структурно-функциональное состояние онкогенов ERBB-2, HRAS-1, C-MYC. антионкогенов р53, RB1 и делеции хромосомы 17 в опухолях молочной железы. - Эксперим. онкол. -1991. -13.-N'6.-С. 44-51.

2. Князев П.Г., Имянитов E.H., Черница О.И., Никифорова И.Ф., Бабенка В.И., Брудерляйн С., Плутапоо O.S., Кузьмин А.И., Кабоев O.K., Берлин Ю.А., Шварц Е.И., Шваб М. Комплексная характеристика повреждений онкогенов HER-2/ERBB-2, HER-1/ERBB-1, HRAS-1, C-MYC и антионкогенов р53, RB1, а также делеций локусов хромосомы 17 в карциномах толстой кишки. - Мол. биол. - 1992. - 26. - С. 1134-1147.

3. Имянитов E.H.. Никифорова И.Ф., Черница О И., Бабенко

B.И..Соколов С.И., Максимишина М.Г., Князев П.Г. Характер повреждений структуры онкогенов HRAS-1, C-MYC, ERBB-1 (HER-1). ERBB-2 (HER-2/NEU). антионкогенов RB-1, р53, а также делеций некоторых локусов хромосомы 17 в немелкоклеточных раках легкого у человека. -Эксперим. онкол. - 1S93. - 15. - Ы'1. - С. 50-55.

4. Knyazev P.G., Imyanitov E.N.. Chernitsa О.I., Nikiforova I.F., Plutalov О. V., Berlin Y A Loss of heterozygosity at chromosome 17p is associated with HER-2 amplification and lack of nodal involvement in breast cancer. - Int. J. Cancer. - 1993. - 53. - P. 11 -16.

5. О.И. Черница, E.H. Имянитов, A.B. Того, В.А. Шуткин, П.Г. Князев. Характер повреждений некоторых онкогенов и антионкогенов в немелкоклеточных раках легкого у человека. - Тез. докл. '1-й Совместной Онкологической Конференции Молдова-Румыния" 7-9 июня 1993, Кишинев.- Conferinta bilaterala de oncologie. Moldova -Romania.- Chisinau. Editura "Oncología" - 1993.- P. 62-65.

6. Имянитов E.H., Черница О.И., Никифорова И.Ф., Серова О.M., Соколов С.И., Лаур O.A., Того A.B., Князев П.Г. Амплификация онкогенов ERBB-2 (HER-2/NEU), ERBB-1 (HER-1) и C-MYC часто сочетается с делецией короткого плеча хромосомы 17 в карциномах у человека. - Мол. биол,-1993,- 27,- N'4-0.888-894.

а