Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Нестабильность хромосомы 6 при плоскоклеточном раке шейки матки



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

им. Н. Н. БЛОХИНА

На правах рукописи АТТАЛЕБ МОХАММЕД

НЕСТАБИЛЬНОСТЬ ХРОМОСОМЫ 6 ПРИ ПЛОСКОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ШЕЙКИ МАТКИ

(Онкология - 14.00.14)

•л

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук МАЗУРБНКО Н.Н.

Москва 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр

Список основных сокращений...................................................................................5

Введение......................................................................................................................6

Глава 1. Обзор литературы. Молекулярно-генетические аспекты

патогенеза рака шейки матки.............................................................................8

1.1. Роль вирусов папиллом (HPV) в патогенезе рака шейки матки....................8

1.2. Микросателлиты, как способ исследования нестабильности

генома ...........................................................................................................................15

i .3. Потеря гетерозиготности (LOH) при раке шейки матки................................23

Глава 2. Материалы и методы...............................................................................33

Список использованных растворов...........................................................................33

2.1 .Клинические материалы.........................................................................................35

2.2. Выделение ДНК из опухоли шейки матки и нормальных тканей.................35

2.3. Тестирование клинических материалов на присутствие

ДНК HPV 16 н 18 типов.............................................................................................36

2.4. Определение потери гетерозиготности ДНК из опухолей

шейки матки..................................................................................................................38

2.4.1. Условия проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР).............38

2.4.2. Электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле...,............................40

2.5.Выявление продуктов амплификации путем гибридизации с радиоактивно-меченным олигонуклеотидом (СА)ц.........................................................40

2.5.1. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации в денатурирующем полиахриламидном геяе.......................................................40

2.52. Перенос ДНК на нейлоновую мембрану................................................41

2.5.3. Получение меченого микросателлитного зонда...................................41

2.5.4. Гибридизация ДНК, иммобилизованной на мембранах......................42

2.6. Выявление продуктов амплификации методом серебрения.,.........................43

2.7. Анализ ДНК в препаратах рака шейки матки, подвергнутых микродиссекции,............................................................................................................. 44

2.7.1 .Выделение ДНК из отдельных участков опухолей

и ей к и матки.................................................................................................................... 44

2.7.2 Определение потери гетерозиготности в ДНК из отдельных участков опухолей шейки матки...............................................................................44

Глава 3. Результаты...................................................................................................47

3.1. Определение типа НРУ в опухолях шейки матки методом ПНР...................47

ПЛ. Использование универсальных праймеров.......,.................................... 47

3,12. Использование тнпоспецифических праймеров.,...,., ,,,.,........,.,..,..,,,,,54

' .2. Анализ аллельной нестабильности хромосомы 6 в опухолях

шейки матки....................................................................................................................58

3.2..1. Выбор оптимального метода детекции потери

гетерозиготности..........................................................................................................60

3.2..2, Результаты исследования короткого плеча хромосомы 6.................66

3.2..3, Результаты исследования длинного плеча хромосомы 6..................70

3.3, Выявление возможной корреляции между аллельной нестабильности

и клиническими параметрами опухоли................................................................... 73

3.4. Анализ микросателлитной нестабильности в опухолях

шейки матки....................................................................................................................79

Я.5. Исследование аллельной нестабильности в препаратах рака

шейки матки с помощью микродиссекции...............................................................8!

3.5.1. Анализ частоты LOH в различных участках опухолей ¡иейкн матки, подвергнутых микродиссекции.........................................................81

Я.5.2. Клональные и субклональные аллельные делеции

хромосомы 6....................................................................................................................85

Глава 4. Обсуждение результатов........................................................................90

Глава 5. Выводы ..........................................................................................................96

Глава 6. Список литературы...................................................................................99

Список основных сокращений

HPV (human papilloma virus) - вирус папиллом человека.

LOH (loss of heterozygosity) - потеря гетерозиготности

MIN (microsatellite instability) - микросателлитная нестабильность.

MRS (mismatch repair system) - система репарации ДНК.

ПЦР - полимеразная цепная реакция.

ПДРФ:(RFLP - restriction fragment length polymorphism) - полиморфизм длины

реетрикционных фрагментов. ОРС - открытая рамка считивания

HLA (human leukocyte antigen)- лейкоцитарный антиген человека МНС (major histocompatibility complex)- гены основного комплекса гистосовместимости

Введение.

Paie шейки матки занимает второе место после рака молочной железы по частоте заболеваний (500 ООО новых случаев в год) и смертности (300000 в год) от рака у женщин и поэтому является одной из наиболее актуальных проблем здравоохранения (Parkin et al., 1993; Бюллетень ВОЗ, 1996). Однако, благодаря успехам, достигнутым за последние 15-20 лет в изучении его этиологии и патогенеза, наметились реальные подходы к сокращению заболеваемости и смертности. Эти связано с тем, что твердо установлена этиологическая роль вирусов группы папиллом в возникновении рака шейки матки ( zur Hausen, 1996). Более того, именно рак шейки матки стал первой формой рака, для которой разрабатывается система мер по предотвращению заболевания путем аакцинопрофилактики.

Накоплено большое количество данных, свидетельствующих в пользу этиологической связи рака шейки матки с вирусами папиллом, а именно персистенция их ДНК в предзлокачественных поражениях шейки матки и в тканях карцином, интеграция вирусного генома в клеточную ДНК, экспрессия вирусных генов, доказан трансформирующий потенциал вирусных онкогенов в экспериментах in vitro.

Тем не менее многие вопросы возникновения и прогрессии заболевания остаются невыясненными. Длительный латентный период инфекции, продолжающийся обычно 10-20 лет, тот факт, что лишь у небольшого числа инфицированных латентная инфекция приводит к развитию рака, моноклональность опухолей, содержащих интегрированные вирусные последовательности, дает основания предполагать, что инфекция вирусом папиллом является необходимой, но не достаточной в развитии злокачественного

новообразования. Это указывает на существование дополнительных генетических факторов, среди которых наиболее вероятна инактивация генов-супресеоров на разных этапах многостадийного процесса, приводящих к инвазивному раку.

Анализ потери гетерозиготности в специфических хромосомных локусах, содержащих микросателлитные повторы, является одним из эффективных методов локализации генов-супресеоров в опухолях человека.

Цель настоящей работы состояла в детальном анализе потери гетерозиготности хромосомы 6 при плоскоклеточном раке шейки матки для выявления участков возможной локализации потенциальных генов-супрессоров опухоли. Хромосома 6 является одной из наименее стабильных хромосом при различных неоплазиях, однако имеется ограниченная информация об использовании микросателлитных маркеров для ее изучения при опухолях шейки ааткн.

В результате проведенного исследования с использованием 24 микросателлитных маркеров, показано что для плоскоклеточного рака шейки матки, содержащего геном HPV, характерна высокая частота аллельных делеций а определенных локусах хромосомы 6, в частности, в районе локализации генов основного комплекса гнстосовместимости МНС (6р22-21.3) и в нескольких локусах на длинном плече хромосомы 6. Использование микродиссекции опухолей в сочетании с высокочувствительным определением LOH позволило обнаружить клональные и субклональные аллельные делеции, на основании чего определены локусы хромосомы 6, являющиеся наиболее вероятными местами локализации генов-супрессоров. Подтверждено , что микросателлитная нестабильность, проявляющаяся в результате нарушения генов системы репарации ДНК, не является характерной для рака шейки матки.

Глава 1. Обзор литературы. Молекулярночгенетические аспекты патогенеза рака шейки матки.

1.1. Роль вирусов папиллом (HPV) в патогенезе рака шейки матки.

Впервые предположение о том, что вирусы папилом человека (HPV) могут являться этиологической причиной рака шейки матки было высказано X. цур Хаузеном (zur Hausen H., 1976), и в течение последующего периода эта область вирусологии и онкологии стремительно развивалась. С одной стороны, накапливались многочисленные факты в пользу этой гипотезы, приведшие к тому, что в настоящее время этиологическая роль HPV при этой форме рака не вызывает сомнений. Это окончательно зафиксировано в Бюллетене Всемирной Организации Здравоохранения (Бюлл.ВОЗ, 1996). С другой стороны, достигнут большой прогресс не только в исследованиях вирусов этой группы, но и механизмов превращения нормальной клетки в опухолевую под действием этих вирусов.

В настоящее время в результате накопления большого количества эпидемиологических и экспериментальных данных, рак шейки матки представляет собой уникальную модель вирусного канцерогенеза, для которой:

- доказана ассоциация неоплазии с инфекцией HPV,

- определены основные факторы риска и пути передачи инфекции,

- охарактеризованы трансформирующие вирусные гены и возможные механизмы их действия,

- идентифицированы некоторые клеточные гены, нарушение функций которых, создает необходимые условия для реализации вирусными онкогенами их трансформирующего потенциала, а именно к стимуляции клеточной пролиферации с последующим развитием инвазивного, метастазирующего новообразования (zur Hausen, Rosi 1995).

Открытие новых типов HPV продолжается и известно около 100 типов вирусов папиллом, которые чаще всего ассоциированы либо с поражением кожи, либо слизистых оболочек человека (de Villiers, 1994). Наиболее серьезные данные о связи HPV с канцерогенезом у человека получены при исследовании опухолей шейки матки. Однако, предполагают, чта и другие аногениталъные раки, яемеланомный рак кожи и 20% случаев рака ротовой полости этиологически связаны с вирусами папиллом ( zur Hausen , 1996).

Пионерские исследования группы Х.цур Хаузена (Gissmann, zur Hausen, 1980; Gissmann et al, 1982; Durst et al.,1983; Boshart et al.,1984) убедительно показали, что как миниум 2 типа вирусов HPV 16 и 18 типов (так называемые "HPV высокого риска") выявляются при раках шейки матки, в то время как при доброкачественных поражениях были обнаружены в основном HPV 6 и 11 типов ("HPV низкого риска"). В дальнейших исследованиях еще несколько типов HPV ( умеренного риска") было обнаружено как при раках шейки матки, так и при других злокачественных поражениях аногенитальной области как у женщин, так и у мужчин (HPV типы 31, 33,35, 39,45, 51,52, 56, 58, 59, 66, 70).

Инфекция HPV для плоскоклеточного и слизистого эпителия является перснстентной и вызывает усиленную пролиферацию зараженных клеток. Для достижения этого эффекта вирус должен инфицировать базальные клетки, поскольку только эта группа клеток в эпителии способна к размножению. Эти клетки продуцируют все остальные клетки вышележащих слоев, которые в процессе днфференцнровки теряют способность к размножению и отслаиваются от поверхности. Использование высокочувствительных методов анализа позволяет выявить ДНК HPV различных типов в более чем 90% опухолей шейки иатзсн (Gissman et al., 1987; Evander et al., 1992; Van den Brule 1993; Kurz et al., 1993;

Sherman et ai, 1994), что является важным аргументом в пользу того, что присутствие вирусного генетического материала является необходимым фактором для превращения нормальных клеток в опухолевые.

Эпидемиологические, морфологические и иммунологические исследования позволили установить , что в преобладающем большинстве случаев инфекция HPV, передаваемая половым путем, является транзиентной и не выявляется через 1-2 года . Предполагают, что необходимым этапом в патогенезе рака шейки матки является персистентная инфекция вирусов папилломы высокого риска с лтельной активной экспрессией вирусных трансформирующих белков (Schiffinan, 1994).

Вирусный геном в зараженных клетках может персистировать как в ■шисомальной, так и в интегрированной формах ( Durst et at.,1985), и первые данные свидетельствовали о том, что на ранних стадиях опухолевого процесса в дисплазиях (интраэпителиальных неоплазиях, CIN ) эписомальная форма является превалирующей, в то время как в инвазивных раках основная масса вирусной ДНК интегрирована в клеточный геном (Chook et ai., 1987). Однако, в то время как в культурах опухолевых клеток в подавляющем большинстве случаев вирусная ДНК интегрирована в клеточный геном, в первичных опухолях (где выявляется высокая гетерогенность клеточной популяции) возможно выявление обоих типов персистенции вирусной ДНК (Samoytova Е. et ai. 1995). В какой степени интеграция является определяющим фактором для поддержания опухолевого статуса клетки, может быть выяснено при анализе типов РНК, считываемых с интегрированного и эписомального вирусного геномов.

Возможные механизмы трансформирующего действия вирусных онкогенов.

В настоящее аремя можно считать установленным, что основными ¡трансформирующими генами вирусов папиллом человека высокого риска являются гены Е6 и Е7, поскольку: 1) гены Е6 и Е7 обладают трансформирующим потенциалом m vitro. 2) трансфицированные этими генами клетки способны индуцировать опухоли у бестимусных мышей 3) ингибирование экспрессии генов Е6/Е7 вызывает в клетках реверсию трасформированного фенотипа.

Ген Е6.

Одной из главных мишеней действия продукта гена Е6 является белок р53. Ген р53 является хранителем генома и наиболее часто мутированным геном-су прессором известным сегодня. В модельных системах сохранение функции р53 в опухолевых клетках ведет либо к блоку клеточного цикла, либо к апоптозу. Это связано с тем, что белок р53 является модулятором транскрипции и специфически взаимодействует с ДНК ( Haffiier and Oren , 1995), в частности он способен трансактивировать такие важные гены как p21 WAF1, который является ингибитором циклин-зависимых киназ ( El-Deiry et al., 1993) и bax, участвующий в апоптозе клеток (Migashit et al. 1995). Ген р53 активируется при обработке клеток ДНК - повреждающими агентами н в условиях гипоксии ( Kastan. et al., 1992; Fritsche al., 1993). Мутантный вариант гена p53, регулярно выявляемый во многих опухолях, не способен к осуществлению функций, описанных выше, и, кроме того, в некоторых опухолях происходит инактивация гена при локализации продукта в цитоплазме ( Moll etal., 1995).

Установлено, что белок Е6 HPV "высокого риска" (но не HPV "низкого риска") способен взаимодействовать с р53 в системах in vitro (Habbert et ai. 1992). При этом белок Е6 взаимодействует с ядром ДНК-связывающего домена р53 и его С-концом, что приводит к протеолизу р53 за счет системы убиквитина (Scheffher et al., 1990). Причем, недавно показано, что E6.-HPV16 вызывает деградацию р53 как дикого типа, так и мутантного (Prabhu et al., 1998).

Кроме того, что взаимодействие р53 с белком Еб HPV может вызывать деградацию р53, Е6 ингибирует такие функции дикого типа р53, как транскрипционная активация и транскрипционная репрессия, т.е. процессы, которые являются определяющими в выполнении р53 супрессорных функций. В дополнение к этому показано, что Е6 увеличивает уровень мутагенеза и ! е нет и ческой нестабильности (White et al., 1994). Поскольку в подавляющем большинстве случаев рака шейки матки (в отличие от многих других опухолей человека) отсутствуют мутации в гене р53 (Heiland et al., 1993), можно предполагать, что индуцируемая Е6 деградация р53 оказывает воздействие, аналогичное по результату соматическим мутациям, т.е. вызывает потерю р53 регулируемой транскрипции и ингибирование нормального клеточного ответа на повреждения ДНК.

В 1997 году был открыт новый член семейства р53- ген р73 на хромосоме 1р36, в локусе, делецируемом во многих опухолях ( Kadhar et al., 1997). Ген р73 кодирует белок на 60% гомологичный белку р53 в ДНК- связывающем домене, на 25% идентичный ему в N-концевом трансактивирующем домене и имеющий сходство с р53 в С-концевом олигомеризующем домене. Установлено, что при суперпродукции одна из сплайсинговых форм р73 ( p73ß) может активировать р53- регулируемые промоторы и вызывать апоптоз в р53 -дефектных опухолях.

Однако оказалось, что белок р?3р не разрушается системой убиквитина в HPV-E6 трансформированных клетках, так как Е6 не взаимодействует с р'73. Татсим образом, рИр в отличие от р53 подавляет рост и индуцирует апоптоз HPV Е6-экспресснруемых опухолевых клеток ( Marin et al., 1998; Prabhu et ai., 1998).

Кроме основного свойства белка Е6 взаимодействовать с р53, этот белок обладает ещё рядом свойств, которые могут вносить вклад в процесс трансформации и которые независимы от р53. К их числу относятся активация гетерологичных промоторов (Desaintes et al. 1992), уменьшение апоптоза (Pan and Опер 1995), активация теломеразы, ферментативного РНК-белкового комплекса, иоддерживающего размер т