Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Молекулярно-эпидемиологический и филогенетический анализ генетической гетерогенности популяций вируса клещевого энцефалита на азиатской территории России

Актуальность проблемы

Клещевой энцефалит (КЭ) является наиболее тяжелой и распространенной природно-очаговой инфекцией на территории России. Несмотря на 60-летний опыт изучения и борьбы с этим заболеванием, разработкой и практическим применением нескольких поколений профилактических вакцин, заболеваемость КЭ в стране неуклонно растет. Особенно неблагоприятно ситуация складывается в азиатской части России. Так, в ряде регионов Сибири за последние 15-20 лет заболеваемость КЭ возросла в десятки раз и продолжает увеличиваться. Осуществляемые на эндемичных территориях программы иммунизации являются крайне недостаточными по охвату населения, подвергающегося риску заражения. В то же время существует проблема эффективности препаратов для вакцинации и экстренной профилактики, которая оценивается специалистами неоднозначно.

В пределах огромного ареала КЭ, простирающегося в Евразии от берегов Тихого океана на востоке до Атлантического - на западе, эпидемиология и клиника болезни различаются и имеют региональные особенности. Известно, что "западный" КЭ отличается сравнительно доброкачественным течением, тогда как "дальневосточный" вариант КЭ часто протекает чрезвычайно тяжело и влечет за собой высокий (до 30 % и более) уровень летальности. КЭ в Сибири также имеет свою специфику и, по тяжести, удельному весу определенных клинических форм занимает промежуточное положение, приближаясь к "западному" варианту. Многие исследователи пытались связать эти различия со свойствами циркулирующих штаммов вируса КЭ, однако прямых доказательств получить не удавалось. Тем более, что до сих пор среди специалистов преобладает мнение о существовании двух основных подтипов вируса, один из которых (западный или центрально-европей-ский подтип) циркулирует на территории Европы, достигая на востоке центральных районов европейской России, другой

- восточный (дальневосточный) доминирует на территории Предуралья, Урала, Сибири и Дальнего Востока. Ясно, что представления о преобладании в районах Урала и Сибири дальневосточного варианта вируса не могут объяснить его значения в этиологии более легкого, по сравнению с Дальним Востоком, течения КЭ на данных территориях. Несмотря на то, что в литературе опубликован ряд работ о существовании нескольких антигенных вариантов вируса КЭ, эти данные нельзя считать абсолютно убедительными, так как они получены на основе различных методических подходов и критериев оценки выявленных различий между вариантами.

Расшифровка первичной структуры генома вируса КЭ (83, 97, 144) явилась выдающимся событием в исследованиях по КЭ и предоставила новые возможности для анализа различных, как фундаментальных, так и прикладных аспектов проблемы. Одним из них является возможность выявления штаммовых особенностей на основе оценки степени гомологии вирусных геномов (или их фрагментов). Анализ, основанный на подобных подходах, безусловно является наиболее объективным, поскольку опирается на "абсолютные" данные структурной характеристики изучаемых вирусов. Существует ряд методических приемов, пригодных для определения степени гомологии участков генома. Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с использованием различных молекулярных зондов является не только высоко специфичным, но и относительно экономичным и быстрым, что позволяет в короткие сроки подвергать исследованию большое число вирусных изолятов. Это имеет большое значение для исследований по молекулярной эпидемиологии - новому направлению в эпидемиологии, вирусологии и микробиологии, изучающему, в том числе, географическое распространение генетических вариантов вирусов и их значение в формировании региональных особенностей проявления тех или иных инфекций. Первые работы по молекулярной эпидемиологии вируса КЭ (39) выявили некоторые новые, ранее неизвестные, черты географической вариабельности вируса КЭ. Эти данные меняют сложившиеся представления о генетических различиях вируса КЭ, основных генетических типах вируса и их географическом распространении. Учитывая большое значение детального понимания генетической структуры региональных природных популяций вируса КЭ, как для анализа фундаментальных вопросов его эволюции в прошлом и в настоящее время, так и решения практических задач, направленных на совершенствование прогноза эпидситуации, диагностики, профилактики и лечения, мы посчитали актуальным изучение молекулярной эпидемиологии вируса КЭ в азиатской части России с применением современных методов молекулярной вирусологии, таких как молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот с различными типами высокоспецифичных зондов.

Цель и задачи исследования

Целью работы является молекулярно-эпидемиологическая характеристика и филогенетический анализ региональных популяций вируса КЭ на азиатской территории России.

Задачами исследования являются:

1. Формирование панели молекулярных зондов различных типов для анализа генетической вариабельности вируса КЭ методом молекулярной гибридизации.

2. Изучение генетической гетерогенности, типирование и оценка географического распространения генетических вариантов вируса КЭ в азиатской части России на основе гибридизационного анализа.

3. Характеристика вариабельности анализируемых геномных структур в природных популяциях вируса КЭ.

4. Адаптация метода кластерного анализа для характеристики генетических различий штаммов вируса КЭ на базе данных гибридизационных тестов и выявление штаммовых и геновариантных кластеров в региональных вирусных популяциях.

5. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика вируса КЭ в различных регионах азиатской территории России.

6. Реконструкция филогении локальных и региональных популяций вируса КЭ в азиатской части России.

Научная новизна работы

1. Впервые получен и использован для анализа генетической вариабельности вируса КЭ методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот ряд, ранее не описанных синтетических дезоксиолигонуклеотидных зондов.

2. Впервые на репрезентативном материале получены детальные сведения по генетическим отличиям, типированию и географическому распространению генетических вариантов вируса КЭ в различных физико-географических регионах азиатской части России.

3. Впервые для целей генетического типирования и молекулярно-эпидемиологической характеристики вируса КЭ на основе результатов гибри-дизационных тестов адаптирован и применен метод кластерного анализа.

4. Впервые осуществлен филогенетический анализ локальных и региональных популяций вируса КЭ, установлена предположительно наиболее древняя популяция вируса в азиатской части страны.

5. Впервые методами филогенетического и компьютерного анализов результатов гибридизационных тестов показано, что степень генетической дифференциации между восточным и западным вариантами вируса КЭ достигает уровня различий видов-двойников.

Практическая ценность работы

1. Показано, что полученные и использованные в работе новые дезоксиолиго-нуклеотидные зонды могут быть с успехом применены для генетической дифференциации штаммов вируса КЭ.

2. Описанный в работе адаптированный для оценки данных гибридизации вирусных РНК с набором молекулярных зондов кластерный анализ может быть рекомендован как перспективный метод характеристики генетической вариабельности вирусов.

3. В свете полученных в работе данных о выраженной генетической гетерогенности вируса в азиатской части ареала представляется необходимой практическая оценка эффективности коммерческих препаратов для диагностики, профилактики и лечения КЭ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На азиатской территории России отмечен высокий уровень генетической гетерогенности циркулирующих штаммов вируса КЭ.

2. Штаммы, гомологичные дальневосточному прототипному штамму Софьин преимущественно обнаруживаются в регионе "Амуро-Сахалинская страна" и относительно редко встречаются в других частях ареала на территории азиатской России.

3. На территории Западной и Восточной Сибири абсолютно доминируют штаммы, обладающие выраженными генетическими отличиями от дальневосточного вируса Софьин.

4. Штаммы, имеющие родство с западным (центрально-европейским) вариантом вируса КЭ проникают на восток до территории Сибири, составляя в регионе "Алтае-Саянская горная страна" существенную долю региональной вирусной популяции.

5. Адаптированный для характеристики вариабельности вируса КЭ на основе оценки результатов гибридизационных тестов метод кластерного анализа позволил получить информацию о доминирующих генетических вариантах в различных физико-географических регионах, а межпопуляционный анализ -установить степень отличий между популяциями и геновариантами вируса КЭ на уровне видов-двойников.

Внедрение в практику

Результаты работы внедрены в учебный процесс:

• При чтении лекций для студентов биолого-почвенного факультета Иркутского государственного университета в курсах "Молекулярная вирусология" и "Частная вирусология";

• В циклах тематического усовершенствования врачей-эпидемиологов на кафедре эпидемиологии и инфекционных болезней Иркутского государственного института усовершенствования врачей.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликовано 26 научных статей и тезисов в зарубежных, центральных и региональных изданиях. Основные результаты исследования докладывались или представлялись в виде стендовых докладов на: Международном симпозиуме "100 лет вирусологии" (С.-Петербург, 1992); научно-практической конференции "Организация эпидемиологического надзора за природно-очаговыми инфекциями" (Омск, 1993); Международной научной конференции "Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами" (Иркутск, 1996); научно-практической конференции "Природ-но-очаготвые болезни человека" (Омск, 1996); VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997); VII Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Лозанна, 1997); Всероссийской научно-практической конференции "Природно-очаговые инфекции в России" (Омск, 1998 г.); научной конференций "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" (Новосибирск, 1998).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 155 страницах, включающих 9 рисунков, 35 таблиц и список литературы (161 источник). Диссертационная работа состоит из введения, 7 глав, обсуждения результатов и заключения, выводов и приложений. Главы I и II - литературный обзор, глава III - материалы и методы, главы IV-VII содержат изложение собственных исследований.

ВЫВОДЫ

1. Показана высокая генотипическая гетерогенность вируса клещевого энцефалита в азиатской части России, где с различной степенью частоты встречаемости доминируют штаммы, относящиеся к III геноварианту. Географическая изменчивость по степени эффективности гибридизации носит клинальный характер в ряду смежных популяций, уменьшаясь от максимальной в регионе Амуро-Сахалинская страна до минимальной в регионе Западная Сибирь.

2. Участкам генов (комплементарных соответствующим олигозондам) свойственна различная степень консервативности в популяциях из различных регионов азиатского ареала вируса клещевого энцефалита. Показана наибольшая консервативность во всех популяциях для изученных участков гена структурного белка Е и наименьшая для неструктурного белка NS1.

3. Кластерный анализ, адаптированный для оценки результатов гибридизаци-онных тестов вирусных РНК с набором молекулярных зондов, показал высокую идентификационную и классификационную способность формировать группы родственных штаммов-кластеров и выделять штаммы по их генова-риантным характеристикам в популяциях вируса клещевого энцефалита.

4. Показаны генетические различия региональных популяций вируса клещевого энцефалита в азиатской части ареала. Степень генетической дифференциации между популяциями варьирует в пределах различий от локальных популяций до видов.

5. Посредством филогенетического анализа показано, что в азиатской части ареала вируса КЭ эволюционно наиболее "древней" является популяция из Алтае-Саянской горной страны, а наиболее "молодой" популяция из Амуро-Сахалинской страны.

6. Популяционно-генетический анализ западного и дальневосточного типов вируса клещевого энцефалита выявил степень различий между ними до уровня видов-двойников.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Причинно-следственная связь между внутривидовым генотипическим разнообразием возбудителя инфекции, являющимся, в свою очередь следствием степени изменчивости генофонда его популяции и изменением эпидемиологической ситуации прослеживается на примере многих известных инфекций (грипп, вирусные гепатиты, СПИД и др.). Не являются исключением и арбови-русные инфекции, в том числе и КЭ (32, 64, 65, 87, 94, 105, 114).

Заболеваемость КЭ в Сибири и на Дальнем Востоке в 80-90 годы имеет тенденцию к неуклонному росту, что в немалой степени связано с фактором анs тропогенного воздействия на экологию вируса. Произошел колоссальный рост, иногда в десятки раз за последние 15-20 лет, изменилась структура заболеваемости - 80-90 % заболевших составляют жители городов. Для новой, изменившейся ситуации характерно то, что основное эпидемиологическое значение приобрели антропургические очаги КЭ, в экологии вируса большую роль стали играть несвойственные для природных очагов виды прокормителей клещей, в организме которых вирус размножается и вызывает вирусемию (10, 21, 22, 23, 24, 25, 45, 47, 64, 65, 69, 70, 94, 118). Неблагоприятное развитие эпидемиологической обстановки по КЭ выдвигает на первый план, кроме уже известных подходов, необходимость более детального исследования молекулярных механизмов циркуляции вируса в его природном ареале, изучения фундаментальных основ генетической изменчивости вируса и генетической гетерогенности его популяции.

Накопленные генетические изменения в генофондах каждой популяции в первую очередь служат адаптационным целям, придавая популяциям экологическую пластичность и эпидемиологическую значимость, а во-вторых, посредством естественного отбора предопределяют эволюционную направленность популяции вирусов. Получение адекватной информации о генетической изменчивости вирусов стало возможным благодаря прогрессу методов молекулярной биологии и биотехнологии и их внедрения в вирусологию (40, 44, 63, 114).

Одним из таких передовых методов стал метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (МГНК) с использованием молекулярных зондов(38, 45, 84, 88, 112, 113). Этот метод является важным инструментом исследования степени генетической изменчивости вирусов (17, 26, 37, 41, 42, 43, 46, 50) и в настоящей работе он в полной мере показал свою способность идентифицировать штаммы на разных уровнях генетического типирования. Результаты гиб-ридизационных тестов послужили тем исходным материалам, при обработке которого методами математического анализа и компьютерного моделирования получена новая информация о степени различий геномных структур в популяциях штаммов, степени межштаммовых различий в отдельных популяциях, степени межпопуляционных различий в пределах азиатского ареала ВКЭ. На базе этих данных также реконструированы правдоподобные модели филогении исследуемых популяций ВКЭ.

Как видно из представленных результатов, метод МГНК с рекомбинант-ным плазмидным зондом рТВЕ 51.1, при различных температурных и химических условиях реакции гибридизации, позволяет специфически различать штаммы в популяциях. Те штаммы, которые гибридизируются с кДНК зондом только при нормальных условиях (65° С, Н20), являются наименее родственными штамму Софьин. Когда реакция гибридизации проходит при умеренно-жестких условиях (60° С, 50 % ФА), происходит специфическое разделение штаммов, т. е. гибридизуются с кДНК зондом те штаммы, которые относительно близки к штамму Софьин. Третий уровень родства соответствует тем штаммам, которые реагируют с кДНК зондом при жестких условиях реакции (65° С, 50 % ФА), и соответственно являются Софьин-подобными по своей генетической структуре.

Данные гибридизационных тестов с 118 штаммами из пяти исследуемых популяций, показывают, что число штаммов, прореагировавших с кДНК зондом при стандартных условиях равно 100 %. При умеренно-жестких условиях в реакцию гибридизации вступило 20 штаммов (16.9 %), а при жестких условиях только 16 штаммов (13.6 %). Причем, здесь наибольшую специфическую реактивность проявили штаммы из популяции Амуро-Сахалинская страна (АСС). Из 21 изолята при 60° С, с 50 % ФА реагировало 10 штаммов (47.6 %), а при 65° С, с 50% FA прореагировало 8 штаммов (38.1 %). Минимальную специфическую реактивность показали изоляты из регионов Горная страна Прибайкалья и Забайкалья (ГСПЗ) и Алтае-Саянская горная страна (АСГС) по 5.3 % гибридизовавшихся штаммов соответственно при двух режимах гибридизации (умеренно-жестких и жестких). Таким образом, для определения внутрипопуляционных и межпопуляционных различий по штаммовым генетическим структурам, удобным и чувствительным "инструментом" является гибридизационный анализ с кДНК зондами при разных температурных режимах реакции.

Наиболее значимую информацию о внутрипопуляционном разнообразии штаммов в генофондах популяции ВКЭ дает гибридизационный анализ с использованием дезоксиологионуклеотидных зондов. Для изучения степени штаммовой вариабельности в региональных популяциях ВКЭ, рассмотрено специфическое действие 17 олигонуклеотидных зондов, причем 15 олигозондов были комплементарны геному маркерного штамма Софьин, а 2 штамму Най-дорф. Для более полной и наглядной оценки степени консервативности геномных участков, комплементарных соответствующим олигозондам, построены графические схемы (диаграммы) частот встречаемости этих участков. На этих диаграммах, уровни частот встречаемости геномных участков, выраженные через соответствующие им комплементарные олигозонды, колеблются от 0 до 100 %. Построенная градационная шкала разделена на 4 зоны - вариабельную (частота встречаемости от 0 до 25.0%), умеренно-вариабельную (от 25.1 до 50.0%), умеренно-консервативную (от 50.1 до 15.0%) и консервативную (от 75.1 до 100%).

Анализируя степень изменчивости геномных участков в популяциях штаммов ВКЭ через уровни частот встречаемости, комплементарных им олиго-зондов, отметим, что спектр разнообразия уровней этих частот для каждой популяции имеет свой индивидуальный рисунок. Для популяции штаммов из региона АСС характерна следующая картина. В "вариабельную" зону вошел только один олигозонд (Х2), а участков генов, комплементарных олигозондам N2 и N3 в этой популяции штаммов вообще не оказалось. "Умеренно-вариабельной" зоне соответствуют четыре олигозонда (S2, Р5, Р10, Ml). Самой насыщенной зоной по количеству олигозондов" является "умеренно-консервативная" - 7 олигозондов (S3, Р2, Р31, Р131, М2, МЗ, М4). Наиболее часто встречаемыми участками геномов оказались участки, комплементарные олигозондам S5, S4, и S1, и они соответственно входят в консервативную зону. Таким образом, основное количество олигозондов (10) приходится на две зоны "умеренно- консервативную" и "консервативную". Впоследствии, подобная же неравномерность частот встречаемости геномных участков проявляется при определении эффективности гибридизации набора олигозондов со штаммами у из локальных популяции. Здесь, по степени наибольшей эффективности гибридизации выделяются две локальные популяции штаммов из двух административных районов - Хабаровского края (71.8 %) и Сахалинской области (66.7 %). Крайне низкую гибридизационную эффективность проявили штаммы двух локальных популяции, также из двух районов Приморского края (39.2 %) и Амурской области (39.7 %). Столь высокая контрастность проявления эффективности гибридизации в данном регионе характеризует генофонд этой популяции штаммов как высоко гетерогенный.

Практически обратная картина гибридизационных частот представлена в популяции штаммов из региона ГСПЗ. Здесь 11 олигозондов находятся в пределах "вариабельной" (S3, S2, Р5, Р10, Р31, Р131, Х2, N2, N3) и "умеренно-вариабельной" зон (Р2, Ml). В "вариабельную" зону входит 9 олигозондов, что свидетельствует о качественном и количественном отличии штаммов данной популяции от популяций штаммов из региона АСС. Это отличие сохраняется и при определении эффективности гибридизации штаммов данной популяции, выделенных в двух административных районах, особенно выражена низкая степень эффективности гибридизации (39.9 и 36.8 % соответственно).

Довольно низкая гибридизационная активность характерна для штаммов из популяций СС. Здесь также доминируют штаммы с большим набором вариабельных геномных участков, комплементарных соответствующим олигозондам, которые расположены в "вариабельной" (S2, Р5, Р10, Х2, N2, N3) и "умерено-вариабельной" (S4, S3, Р2, Р131, Ml, М4) зонах. Столь же низка степень эффективности гибридизации штаммов этой популяции (39.2 %) с олигозондами, комплементарными геному штамма Софьин. Это подчеркивает, с одной стороны, их далекое родство с маркерным штаммом, а с другой их высокую потенциальную возможность проявлять вариабельные качества.

В популяции из региона АСГС доминируют также штаммы, у которых участки геномов, комплементарные олигозондам (S2, Р5, Р10, Х2) и (S3, SI, Р2, Р31, Р131, N2, N3) попадают в вариабельную и умеренно-вариабельную зоны соответственно. Такое смещение частот в умеренно-вариабельную зону и наличие 4 олигозондов (S5, S4, М2, М4) в "консервативной" зоне резко выделяет эту популяцию штаммов от всех остальных "клещевых" популяции. Контрастная гетерогенность наблюдается и по эффективности гибридизации олигозондов со штаммами. В Алтайском крае выделяются штаммы с довольно высокой степенью эффективности гибридизации с олигозондами (55.9 %) а в Красноярском крае эта степень низка и составляет всего 32.1 %. По форме контрастности эта популяция подобна популяции из региона АСС.

Вариабельная" зона в популяции штаммов из региона ЗС представлена большим набором олигозондов. Все 9 олигозондов (S2, Р2, Р5, Р10, Р131, Х2, Ml, N2, N3) характеризуются очень низкой гибридизационной активностью от 5.3 до 15.5 %. В "умеренно-вариабельной" зоне расположены только два олиго-зонда (S3, Р31). Эффективность гибридизации штаммов данной популяции по

Новосибирской области равна 33.9 %, а по Омской области 44.1 %. Доминирование в генофонде популяции штаммов с очень низкими консервативными качествами подчеркивает, с одной стороны важность географического фактора изоляции, а с другой стороны это свидетельствует о том, что в популяции столь высокий потенциал генотипического разнообразия формировался за относительно длительный эволюционный период.

Интересная взаимосвязь прослеживается между степенью гибридизацион-ной эффективности штаммов и географическим местом выделения популяций. Эта зависимость носит клинальный характер и изменяется с уменьшением степени эффективности от восточного (АСС) к западному (ЗС) направлению. Такое направленное изменение генетических свойств популяции, скорее всего, закономерно, так как ВКЭ является континентальным видом и во многом его существование зависит от климатических факторов (температуры, влажности, освещенности и др.), а эти факторы, как известно, в континентальных областях суши изменяются закономерно и направленно (71). Поэтому клинальный характер изменчивости по признаку эффективности взаимодействия РНК штаммов с олигозон-дами в различных популяциях есть прямой показатель довольно ощутимого опосредованного влияния на генотип вируса абиотического фактора.

Анализ результатов геновариантного разнообразия в исследуемых выборках штаммов ВКЭ, дает полную картину их структурной гетерогенности, выявляя степень доминирования того или иного геноварианта в той или иной популяции. Рассматриваемые популяции поливариантны в разной степени. Структура геновариантного разнообразия в азиатском ареале ВКЭ показывает ведущую, базовую роль в популяциях штаммов III геноварианта. Геноварианты I и VI во всей выборке (118 изолятов), являются крайне выраженными вариантами спектра генотипического разнообразия штаммов, долевой состав которых подчеркивает многоуровневый принцип развития и формирования популяционных образований в азиатском ареале данного возбудителя. Проведен популяцион-ный анализ консервативности геномных структур штаммов ВКЭ. Главным результатом этого анализа явилось то, что в разных популяциях была выявлена различная степень консервативности геномных структур. Самыми консервативными геномными участками в популяциях, после участка гена, комплементарного олигозонду S5, по мере убывания, являются участки, комплементарные олигозондам М4 (76.0 %), МЗ (73.0 %), М2 (69.0 %), S1 (68.0 %), S4 (66.0 %). Эти значения соответствуют консервативной и умеренно-консервативной зонам. В "умеренно-вариабельной" зоне находятся олигозонды - Ml (44.5 %), Р2 (40.5 %), Р31 (40.0 %), S3 (32.9 %), Р131 (31.0 %), а в "вариабельной" - зонды S2 (19.0 %), Р10 (15.0 %), Р5 (13.0 %), Х2 (12.0 %) и N2 и N3 (по 5.5 %).

Не менее значима информация о степени изменчивости участков генов в популяциях из различных географических регионов. Проводя сравнение среди пяти популяций по степени консервативности участков генов, комплементарных соответствующим олигозондам, отметим вариабельную картину по всем участкам (кроме S5). Налицо четкая картина географической изменчивости, присущая отдельным участкам генов, причем, для каждого участка гена характерен свой рисунок уровней консервативности во всех популяциях, т.е. для разных популяций один и тот же участок генома имеет разную адаптивную ценность. Подобная способность участков генов, даже кодирующих структурные белки, изменяться в таких широких пределах, возможно находится не только в опосредованной зависимости от абиотических факторов географического пространства, но и от прямых воздействий биотических и генетических факторов среды. Как показал Э. Майр (71), к числу хорошо известных классов условий среды - абиотических и биотических, добавляется третий класс - генетическое условие среды. Генетическая среда данного гена включает не только генетический фон данной особи, на котором этот ген временно помещается, но также весь генофонд локальной популяции, в котором он встречается. На протяжении длительного времени эволюционная судьба этого гена будет зависеть от того, сколь хорошо он взаимодействует и коадаптирован с другими генами данного генофонда.

Представленные выше результаты дают право считать изменчивость геномных участков, отражением действия всех трех факторов среды (генетического, биотического и абиотического) на генофонды популяций ВКЭ. Отбором в популяциях фиксируются те геномные участки и гены, которые для данной популяции имеют приспособительную ценность во временном и пространственном измерении. Варьирующее влияние всех трех факторов среды на геномные структуры штаммов создали всю палитру форм генотипов в генофондах популяций. Именно эта изменчивость геномных структур, выявленная на первом уровне популяционного анализа, является основой генетической гетерогенности штаммов в популяциях, которая определяется на втором уровне.

Второй уровень популяционного анализа- штаммовая гетерогенность популяций ВКЭ исследован посредством обработки результатов гибридизацион-ных тестов методом кластерного анализа. Проведено молекулярно-эпидемиологическое исследование пяти региональных популяций с целью определения степени штаммовой генетической гетерогенности популяций ВКЭ путем выявления родственных групп штаммов-кластеров. Далее, созданные компьютерным моделированием схемы внутрикластерных и межкластерных взаимоотношений в виде филогенетических деревьев дают возможность трактовать их как с классификационной, так и с эволюционной точек зрения.

Суммируя результаты кластерного анализа внутрипопуляционных генетических различий штаммов из различных регионов азиатского ареала ВКЭ, отметим несколько важных особенностей, которые выделились в ходе исследования. Во-первых, было выявлено, что всем популяциям присуща различная степень генотипической изменчивости составляющих их штаммов. Эта изменчивость штаммов внутри популяции статистически достоверна. Во-вторых, внут-рипопуляционная генетическая гетерогенность штаммов в форме кластерных образований и геновариантных соотношений в различной степени индивидуальна для каждой популяции. В третьих, для всех популяций характерна иерар-хичная структура кластерных построений. Кластеры по степени родства и сложности структуры делятся на субкластеры и кластеры, в состав которых входит несколько субкластеров. В четвертых, кластерный анализ показал, что близким по генотипу штаммам характерен разобщенный тип циркуляции внутри региона данной популяции, т. е. мозаичный тип распространения. В пятых, было выявлено, что наиболее эпидемиологически значимым геновариантом в популяциях является III генетический вариант. Для штаммов этого геноварианта характерна высокая экологическая и адаптационная пластичность, они более мобильны - практически циркулируют во всех рассматриваемых регионах азиатского ареала ВКЭ.

Как видим, исследуемые популяции штаммов ВКЭ являются сложно организованными, генетически полиморфными структурами, для которых характерны основные признаки биосистем- иерархичность организации элементов, структурная дискретность, без которой было бы невозможно различие биосистем, функциональная непрерывность, т. е. вариабельность количественных параметров в пределах одной и той же дискретности. А как известно, системам с такими признаками характерна устойчивость в экологической среде, которая повышается с увеличением сложности и разнообразия структурно-функциональной организации системы, а также большая адаптивная лабильность в постоянно меняющихся условиях обитания (71, 105).

Третьим уровнем популяционного анализа является уровень межпопуля-ционных различий. Предложенный М. Неем подход к определению степени генетических сходств и различий между популяциями используется давно и уже получено огромное количество фактов, подтверждающих его эффективность в исследованиях с ДНК-геномными организмами (1, 4, 36, 75, 77, 89, 90, 144, 145). В данной работе этот метод использован применительно к РНК-геномным вирусам, и это оправдано тем, что он позволяет выявлять межпопуляционные различия по частотам встречаемости геномных участков, комплементарных соответствующим олигозондам. Преимущество этого подхода еще и в том, что используются результаты гибридизационных тестов, получаемых экспрессметодом (МГНК), который позволяет быстро обрабатывать большой объем исследуемого материала. Он приспособлен для последующего введения данных по новым участкам генов, что повышает статистическую достоверность полученных результатов. Алгоритм математических расчетов прост и поддается компьютерной обработке, при этом полученные результаты используются не только для определения степени генетических различий между популяциями, но и для реконструкции правдоподобных схем филогении.

Таким образом, полученные результаты дают информацию, как об уровнях генетических различий и сходств между популяциями в географическом масштабе ареала ВКЭ, так и о правдоподобном их происхождении во временном, эволюционном измерении. Было выявлено, что степень межпопуляционных расхождений варьировала в широких пределах - от уровня различий между локальными популяциями до уровня различий между морфологически отдельными видами. Генетическая гетерогенность была более выражена внутри каждой популяции, чем между региональными популяциями. Значения генетических сходств I и генетических дистанций D достаточно убедительно свидетельствуют о существовании внутри каждой региональной популяции отдельных локальных групп, занимающих свою определенную территорию и генетически различающихся между собой в широком диапазоне. То есть, региональные популяций генетически не однородны, они состоят из нескольких локальных популяций, находящихся во взаимном родстве на разных стадиях эволюционной дивергенции.

По значениям генетических сходств между локальными популяциями рассчитаны средние показатели для каждой региональной популяции и они различны. Наиболее близкородственными являются локальные популяции из региона АСС - 1=0.818, D=0.205, а наиболее дальнеродственными - локальные популяции из региона АСГС - 1=0.440, D=0.821. Среди пяти региональных популяций генетически наиболее близки друг другу популяции из регионов АСС и СС, ГСПЗ и ЗС. Обособленно стоит популяция из региона АСГС. Она с популяциями из регионов АСС и СС за период независимой эволюции разошлась до уровня различий видов двойников и это различие статистически достоверно. В среднем, по отношению к остальной группе из 4 региональных популяций, популяция из региона АСГС по показателям генетических сходств и различий находится на уровне становления вида -1=0.700, D=0.355.

Интересен также факт четкого генетического различия между условными группами штаммов, распределенными по 4-м геновариантам соответствующих маркерных штаммов (дальневосточного - штамм-Софьин; восточно-сибирского - штамм-178-79; урало-сибирского - штамм Лесопарк-11; западного - штамм Найдорф). По полученным данным, штаммы западного геноварианта отличаются от штаммов 3 азиатских геновариантов на уровне видов-двойников. Этот факт может рассматриваться как довод в пользу концепции В.И. Вотякова (15) о видовом различии между двумя типами ВКЭ - восточным и западным. Внутри группа из 3 азиатских геновариантов с разной степенью родства дифференцируются на локальные популяции. Различия между западным и восточным ге-новариантами сложились за длительный эволюционный период раздельного развития в разных хозяевах и на различных географических территориях евроазиатского материка. Географическая и экологическая изоляция наложила на генетический базис вирусных популяции эковидовую направленность, что предопределило их расхождение до уровня различных видов.

Межпопуляционный анализ генетических различий в азиатском ареале ВКЭ выявил возможность возникновения первых природных очагов ВКЭ на территории регионов АСГС и ЗС. На это указывают выявленные факты клинальной изменчивости данных по эффективности гибридизации РНК штаммов с олигозон-дами. Клинальность присуща также консервативным свойствам генов в ряду смежных популяции, начиная с максимальной консервативности в регионе АСС и кончая минимальной в регионах АСГС и ЗС. Четкое различие наблюдается между центральными (АСГС, ЗС) и периферической (АСС) популяциями и по эволюционному фактору. Результаты определения эволюционного возраста так

113 же показали, что среди "клещевых" популяции самой "древней" является популяция из региона АСГС, а самой "молодой" популяция из региона АСС.

Как указывалось выше, анализ генетической дифференциации между популяциями дает возможность реконструировать правдоподобные схемы их филогении. По полученным результатам генетических дистанций были созданы, как внутрипопуляционные (на уровне локальных популяций), так и межпопу-ляционные (на уровне региональных популяций) филогенетические схемы. Были определены популяции, которые в эволюционном отношении возникли на разных стадиях филогенеза. Филогенетический анализ локальных популяций показал неравномерность развития в них эволюционных процессов. Среди региональных популяций, как было отмечено, самой "древней" оказалась популяция из региона АСГС, а самой "молодой" из региона АСС.

Подводя итог выполненной работе, отметим, что молекулярно-эпидемио-логический анализ популяций ВКЭ выявил их генетическую гетерогенность, как в географическом, так и в эволюционном измерении. Выявленная на азиатской территории России межпопуляционная дифференциация до уровня видовых различий характеризует природу ВКЭ, как неоднородную совокупность вирусов с различной степенью генетического родства и филогении.