Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Молекулярная природа повреждений онкогена HRAS1 в карциномах молочной железы и легких человека
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 14.00.14
Оглавление диссертации Бабенко, Виктор Иванович :: 1992 :: Санкт-Петербург
СПИСОК СОКРАЩЕНИЯ.
ГЛАВА 1, ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Проиеховдение, локализация и структура онкогена
HRAS1 у человека.
1. 2. Идентификация мутаций б онкогене HRAS1. 1. 3. Выяснение молекулярного механизма активации онкогена HRAS1 в неоплазмах человека.
1. 3.1. Структурные перестройки, амплификации и делеции аллелей.
1.3.2. Точковые мутации - возможный механизм активации протоонкогена.
1.4. ' Использование полимеразной цепной реакции для анализа мутаций в кодирующих последовательностях онкогена
KRAS1.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Опухолевый материал, химические реактивы, ферменты и оборудование.
2. 2. Радиоактивное мечение олигонуклеотидов.
2. 3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - амплификация
ДНК, рестрикционный анализ и электрофорез.
2. 4. Праймер-зависимая амплификация двух участков онкогена HRAS1.
2. 5. Определение первичной нуклеотидной последовательности (ееквенирование) амплифицированной ДНК методом
Максама-Гилберта.
2. 5.1. Злюция фрагментов ДНК из геля путем диффузии в буфер.
- О
2. 5. 2. Химические реакции расщепления ДНК.
2:5. 2.1. Гидролиз ДНК по модифицированным основаниям.
РТТ/шл С; p-jTOVTTWpiTU И AT^VWlTOprafl?
3.1. Рекомбинантные плазмиды рВБ-1 и pBB-2, содержащие последовательности 1 и 2 зкзонов онкогена HRAS1.
3. 2. Выявление точковых мутаций в онкогене HRAS1 в ДНК клеток рака молочной железы (РМЖ).
3. 3. Поиск точковых мутаций в онкогене HRAS1 в ДНК клеток .рака легкого (РЛ), рака толстой кишки (РТК); рака щитовидной железы (РШД) и рака яичника (РЯ).
3. 4. Анализ возможной контаминации образцов ДНЕ. из карциномы молочной железы и других опухолей плазмидами, содержащими мутантный онкоген HRAS1.
Введение диссертации по теме "Онкология", Бабенко, Виктор Иванович, автореферат
Актуальность проблемы. Новейшие данные теоретической и экспериментальной онкологии свидетельствуют о том, что рак у человеке! и животных является молекулярно-генетическим заболеванием*; Cairns J. et al. ,1981,1983; Князев ИТ. и др. ,1986;). Глубинные патогенетические процессы при онкогенезе прежде всего развертываются на уровне геномной ДНК и сводятся в основном к точковым мутациям и некоторым другим типам генетических нарушений - амплмфикацмям, меж- и внутрихромосомным ■ перестройкам, инсерциям, делециям и т. д. (Boveri Т. .Л929; Comings D. Е. , 1973; Сгосе С. М. et aL ,1985,1987; Сейц М. Ф. , Князев П. Г. ,1986). Все эти генетические события (при недостаточности систем естественной репарации, регуляции экспрессии генов и межклеточных взаимодействий) необратимы, что и обуславливает необратимый характер явления малигнизации на уровне генома клетки.
Из этой посылки следует, что решение проблемы превращения нормальных клеток в злокачественные немыслимо без расшифровки указанных молекулярных событий в процессе .канцерогенеза, возможной лишь средствами и методами молекулярной онкологии, генетики и генетической инженерии. V,
Наиболее убедительные экспериментальные данные о роли специфичных точковых мутаций в активации протоонкогенов были получены при сравнительном анализе генов семейства RAS, выявленных при трансфекции опухолевой ДНК нормальных клеток. У разных представителей этой группы генов мутации затрагивают 12-ый или 61-ый кодоны (Tabin С. J. et al. ,1982; Santos Е. et al. , 1983; Taparowsky E. et al.,1983). Мутация в 13, соседнем с 12, кодоне протоонкогена HRAS1 (замена глицина'аспарагином или серином) также приводит к трансформирующей активности этого гена (Fasano (X.et ai. ,1984).
Интересно, что морфология фокусов трансформированных' кле-; ток меняется в зависимости от того, какая аминокислота находится в 12 положении онкобелка р21. Так, валин, лейцин, изо-лейцин и треонин вызывают образование рефрактильных клеток, в то время как замена лизином или глутамином индуцирует более поздно появляющиеся и менее выраженные фокусы. Следовательно, появление любой аминокислоты (за исключением пролина) вместо глицина в 12 положении белка р21 придает ему т ране формирующие свойства. Причем уровень синтеза измененного белка р21 примерно в 5 раз превышает таковой в нормальной клетке .
Исходя из вышеизложенного, в диссертационной работе планировалось изучить частоту присутствия точковых мутаций в "горячих". кодонах онкогена HRAS1 в карциномах молочной железы и легких как в наиболее распространенных неоплазмах у человека, необходимость проведения такого исследования поякпепляется и тем обстоятельством, что в литературных источниках данный вопрос оставался малоизученным, поскольку методы выявления точковых. мутаций (трансфекция, рестрикционный анализ, секвенирова-ние) чрезвычайно сложны технически и дороги.
Анализ большого числа работ .показывает, что между генетическими повреждениями (в нашем случае между делениями и точковыми мутациями) возможна взаимосвязь (Князев IL Г. и др.,1990а,1991а). К настоящему времени показана утрата специфичного участка ряда хромосом, приводящая к "потере гетерози-готности" опухолевой клеточной популяции по аллелям некоторых онкогенов, расположенных в коротком плече 11 и длинном плече 13 хромосомы. Однако при этом оставалось неясным, при потере целых аллелей присутствуют ли в оставшихся аллелях точковые мутации в специфичных кодонах. В этой связи, в данной работе также планировалось проверить ранее сформулированную гипотезу о неслучайной (направленной) элиминации дикого аллеля онкогена HRAS1 в процессе прогрессии злокачественных признаков карцином молочной железы и легких у человека. В этом случае в оставшихся аллелях онкогена, как предполагалось, должны присутствовать мутации, которые демаскируются при делеции дикого аллеля. Мы полагали, что подобные генетические события в клетке "разнесены" во времени: точковая мутация в одном из аллелей - раннее событие, возможно связанное с инициацией канцерогенеза, а де-леция дикого аллеля - позднее, ассоциированное с прогрессией злокачественных признаков., В диссертационной работе К Ф. Никифоровой (1991) было показано, что делеции аллелей онкогена HRAS1, как правило, выявляются в раках молочных желез, дающих метастазы.
Таким образом, немутантный белок p21~HRASi супрессирует злокачественный фенотип клеток, в случае его утраты (делеции аллеля, возникновения второй мутации или нарушения транскрипции.) остается лишь мутантный вариант онкобелка P21-HRAS1, выполняющий аномальную роль в переносе митогенного сигнала.
Определение точковых мутаций в оставшемся аллеле онкогена HRA5.1 при элиминации одного из его аллелей, позволило бы уета-. повить взаимосвязь между данными генетическими повреждениями и выявить первоочередность одного из них при канцерогенезе.
Кроме того, обнаруженные'мутации в горячих кодонах онкогена HRAS1 с помощью рестрикционного картирования при секвениро-вании могли показать варианты замен нуклеотидов и углубить знания по механизму архивации протоонкогенов.
Следует отметить, что данная работа является частью исследования, проводимого в лаборатории молекулярной генетики научно-исследовательского института онкологии имени Е Е Петрова, по изучению генетических повреждений в онкогенах и выявлению их роли в процессе малигнизации, которое включает в себя ряд направлений, связанных с амплификацией ДНК, различными генетическими перестройками, в том числе делениями аллеЛей онкогенов, и другими преобразованиями в геноме опухолевой клетке при различных локализациях.
Выполнение указанных направлений стало возможным в результате применения новых методик - праймер-зависимой амплификации и прямого секвенирования. Благодаря их использованию, намного упрошдется исследование: исключаются клонирование фрагментов ДНЕ, переклонирование, скрининг рекомбинантных клонов и т.д.
Реализация планируемой работы не только разрешит ряд поставленных теоретических задач, но и прояснит практическую сторону, т. к. открывает (опосредовано через указанные генетические элементы) реальные возможности целенаправленного выявления активации онкогена HRAS1 в минимальном количестве биопсийного материала онкологических больных.
Дель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение молекулярной природы повреждений онкогена HRAS1 в карциномах молочной железы и легких человека.
В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи:
- осуществить широкий скрининг присутствия точковых мутаций в горячих кодонах онкогена HRAS1 в карциномах молочной железы и легких человека, а также для сравнения с другими опухолями - в раках толстой кишки, щитовидной железы и яичника;
- провести анализ наличия мутаций в 12 и 61 кодонах онкогена HRAS1 для проверки гипотезы направленной' утраты дикого аллеля в некоторых образцах ДНК, содержащих один аллель этого гена, и установить взаимосвязь между указанными генетическими повреждениями с выделением первоочередности одного из них;
- определить первичную структуру фрагментов онкогена HRAS1, имеющих точковые мутации, для выяснения характерных вариантов замены нуклеотидов в кодонах, ассоциированных с превращением протоонкогена в онкоген;
- оценить прогностическую значимость делеций и точковых мутаций в аллелях онкогена HRAS1 при развитии карцином молочной железы и легких у человека
Научная новизна исследований. В результате выполнения диссертационной работы впервые решены следующие важные в теоретическом и практическом плане вопросы:
- получены новые плазмиды рВБ-1 и рВБ-2, несущие 12 и 51-ый кодоны онкогена HRAS1, позволяющие проанализировать указанные последовательности;
- определена частота точковых мутаций в горячих кодонах онкогена HRAS1 в карциномах молочной железы (3 гетерозиготы по мутации в 12 кодоне из 57 образцов ДНК) и яичника (1 гетерози-гота по мутации в 12 кодоне из 3 образцов ДНК) (табл. 8):
- отмечено, что делеция одного из аллелей онкогена HRAS1 в исследуемых карциномах не сопровождается демаскированием мутаций в 12, 13 и 61 кодонах протоонкогена HRAS1, следовательно утрата короткого плеча 11 хромосомы в отношении этого онкогена
4 является случайным событием;
- установлен вариант замены нуклеотидов в 12 кодоне, ответственных за активацию онкогена HRAS1, сопровождающейся
• — i — j.1 трансверсией Г - T (ГГЦ -ГТЦ) в ДНК опухолевых клеток карцином 1 молочной яелезы и яичника, что, в свою очередь, приводит к замене в белке p21-HRASl в 12 положении амитнокислоты глицина на валин; ■
- учитывая низкую частоту мутаций в 12 кодоне онкогена HRAS1 в карциноме молочной железы у человека, оценить прогностическую значимость подобного генетического события для развития этого забо-ттевя.ния оказалось не реальным;
- проверены на контаминацию плазмидой pEJ 6,6, мутантной по 12 кодону онкогена HRAS1, 27 гетерозигот с генетическими повреждениями по указещной позиции, в результате - не "загрязненными" оказались 4 пробьГТв-^Ш и 1-РЯ).
Практическое значение. Диссертационная работа в целом представляет собой теоретическое исследование. Полученные результаты имеют важное значение для понимания роли точковых мутаций в канцерогенезе у человека, с одной стороны, а с другой будут способствовать разработке молекулярно-биологических основ определения прогноза, а в будущем, возможно, и диагностики злокачественных новообразований у людей. л о
J.
Заключение диссертационного исследования на тему "Молекулярная природа повреждений онкогена HRAS1 в карциномах молочной железы и легких человека"
выводы
1. Получены 2 новые плазмиды: рЕБ-1, рВБ-2, несущие последовательности 1, 2 зкзонов, соответственно, содержаще 12, 61-ый'кодоны онкогена HRAS1, пригодные для анализа мутаций и метилирования указанных экзонов гена в ДНК нормальных, а также опухолевых .клеток человека.
2. Осуществлен поиск точковых мутаций в 12 кодоне онкогена HRAS1 в 57 образцах ДНК клеток карцином молочной железы, 39 -легкого, 3 - толстой кишки, 3 - щитовидной железы и 3 - яичника. Гетерозиготные точковые мутации в указанном кодоне онкогена выявлены в 3 случаях рака молочной железы, что соответствует 5,3%, и в 1 - рака яичника.
Q г» 19 уплоур {ГТТП ппп^пот-^гоиа НРДСЧ р о гтрр ~ La^Jliji . jiJ, i. ^ J. -tJ-.y - - — v—' - - ~ - —" -t ^'-iLi i iJ . —— -J- J—- • .у v паратах ДНК клеток рака молочной железы и 1 - рака яичника сопровождалась трансверсией Г - Т, что свидетельствует о его превращении в онкоген. Это, в свою очередь,- приводит к изменению в онкобелке р21 аминокислоты глицина на валин.
4. По данным амплификации ДНК in vitro, а также рестрикци-онного картирования и прямого секвенирования точковые мутации в 13 и 61 кодонах онкогена HRAS1 в изученных карциномах (50 образцах молочной железы, в 42 - легкого, в 3 - толстой кишки, в 3 - щитовидной железы и в 3 - яичника) не обнаружены.
5. Точковые мутации в 12, 13, и 61 кодонах онкогена HRAS1 не являются обязательным событием для злокачественной трансформации клеток эпителия молочной железы и легких у человека.
6. Элиминация одного из аллелей онкогена HRAS1 в ДНК клеток' карцином молочной железы и легких у человека не сопровождается демаскированием мутаций в 12, 13 или 61 кодонах протоонкогена HRASi, следовательно указанное генетическое событие не ассоциировано с механизмом его превращения в онкоген, а также прогрессией опухолевых признаков.
7. Учитывая низкую частоту мутаций в горячих кодонах онкогена HRAS1 в ДНК опухолевых клеток карцином молочной железы у человека, оценить прогностическую и диагностическую значимость подобного генетического повреждения для развития этих неоплазм не представляется возможным. Y X
Выражаю сердечную признательность научным руководителям работы: д. м. н. IL Г. Князеву и д. м. н. Е. И. Шварцу, а также чл. -кор. АМН РФ проф. К. П. Хансону за ценные советы и критические замечания при обсуждении результатов; коллегам, по отделу молекулярной онкологии; д. б. н. В. А. Ланцову, О. К. Кабоеву, А. Е Алексееву и А. А. Гольцову (ЛИЯФ им. В. Е Константинова АН РФ,
ОМРБ) т/хг-о; за M"i методическую помощь в отдельных экспериментах; Е А.
Берлину и О. В. илуталову - за синтез праймеров для ЩР.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные в настоящее время так теоретические, так.и экспериментальные данные однозначно свидетельствуют о том, что при канцерогенезе происходят изменения в ДНК клетки и, в первую очередь, в протоонкогенах и супрессорных генах (см. Обзор литературы). Эти изменения сопровождаются на уровне генома в виде амплификации, различных генетических перестроек, делеций и точковых мутаций указанных генов.
Из перечисленных нарушений генома,, особенный интерес представляют точковые мутации в протоонкогенах, приводящие к превращению их -в онкогены и, соответственно^ к появлению белков с новыми функциональными свойствами, которые нарушают различные клеточные и внеклеточные взаимодействия, способствуя злокачественно й трансформации.
Исходя из этих посылок, была запланирована настоящая работа, реализация которой могла ответить на ряд нерешенных вопросов, а именно: о частоте точковых мутаций в горячих кодонах онкогена HRAS1 в образцах ДНК неоплазм различных локализаций, в том числе пробах, содержащих один аллель указанного гена; о характере вариантов замен нуклеотидов в кодонах, ассоциированных с превращением протоонкогена в онкоген; и, наконец, об оценке прогностической значимости делеций и точковых мутаций в аллелях онкогена HRAS1 в развитии карцином молочной железы и легких у человека.
Располагая банком геномной ДНК РМЖ, РЛ и других локализаций с делениями одного из аллелей онкогена HRAS1, нам представлялась возможность проверить оставшийся аллель этого гена на присутствие в кем мутации.
- 107
Как- следствие из вышеуказанного, важно было определить: нет ли между описываемыми повреждениями (делениями и мутациями) взаимосвязи? Если таковая имелась, то логично было попытаться установить последовательность генетических событий.
Выявленные точковые мутации в онкогене HRAS1 ДНК исследуемых карцином могли стать основанием для проведения нуклеотид-ного анализа тех образцов, в которых с помощью рестрикционного картирования удалось бы обнаружить эти мутации. Определение первичной последовательности прояснило бы характер замен нуклеотидов в горячих кодонах онкогена.
В начальной стадии исследования, из-за невозможности провести анализ онкогена HRAS1 в геномной ДНК опухолевой клетки по поиску мутаций (см. раздел 3.1), были сконструированы плазмиды рВБ-1 и рВВ-2, несущие 1 и 2-ой экзоны с 12 и 61 кодона-ми, позволяющею исследовать указанное генетическое повреждение. Однако - к тому времени был разработан и внедрен новый.' метод - полимеразной цепной реакции, с помощью которого -намного упрощалась работа (см. Обзор литературы) по клонированию и секвенированию конкретных участков генов.
Ври анализе мутаций- в 12 кодоне онкогена HRAS1 в карциномах молочной железы и яичника человека удалось выявить ряд нуклеотидных замен. Их оказалось немного: из 57 РШ в 3 случаях один из аллелей содержал мутацию (гетерозигота по мутации в 12 кодоне), а из 3 РЯ - 1 гетерозигота (по аналогичной позиции). Секвенирование по методу Максама-Гилберта подтвердило, присутствие мутаций в ДНК неоплазий, сопровождающихся заменой нуклеотидов в 12 кодоне Г - Т. В протбонкогене 12-ый кодон ГГЦ превращался в ГТЦ. Это, в свою очередь,, должно приводить к изменению аминокислотного белка р21, а именно: замене глицина на
- 108 валин. При этом следует отметить, что выявленные варианты замен нуклеотидов в онкогене HRAS1 во всех случаях одинаковы. Кроме того, все они присутствуют в одной цени ДНК, т.е. гете-розиготы по точковым мутациям.
Результаты проведенных экспериментов показали отсутствие в 15 образцах ДНК опухолей, указанных выше локализаций;' с элиминациями аллелей, точковых.мутаций в 12 и 61 кодонах онкогена HRAS1. По этой причине оказалось невозможным установить взаимосвязь между делециями и мутациями и определить первоочередность возникновения одного из этих нарушений.
Анализ по обнаружению точковых мутаций при гидролизе амп-лифицированных фрагментов ДНК рака легкого и карцином толстой кишки и щитовидной железы, содержащих по отдельности 12 и 61-ый кодоны онкогена HRAS1, зндонуклеазами рестрикции, а также определением первичной структуры этих последовательностей замена нуклеотидов не обнаружена.
В онкогене HRAS1.РМЖ, РД и других опухолях мутации в 13 кодоне не обнаружены. тт ттягп г-т> о гЗ итЛСЯ^ТЬ"* т т О 'Л гп ^ 7" Г^ ТА П * Ггп п m тэ тх -гт г./^ГФС* Т ТТ.-ТТЛ Р '1 V iff*, TTOUCi
J ± DLDCbJl ZlsiK^ruJ iU -ii-k!w J. U 1 J J. L- Л. i-ilj 1 Uoi-Sii'iJri -D -i. i-v- Au^wiiv онкогена HRAS1 в РМЖ, оценить их прогностическую значимость для развития карцином молочной железы и легких у человека не представляется возможным.
Таким образом, изучение молекулярной природы повреждений протоонкогена HRAS1 в .карциномах молдочной железы и легких у человека с использованием современных, методов амплификации ДНК in vitro, а также секвенирования показало, что деления одного из аллелей этого гена не демаскирует в оставшемся аллеле активирующей 'мутации в 12, 13 или 61 кодонах. Низкая •частота точковых мутаций в одном из аллелей онкогена HRAS1 встречается
- 109 лишь в 12 кодоке и сопровождается трансверсией Г - Т, приводящей к серьезным функциональным изменениям белка p21-RAS. Однообразие вариантов замен нуклеотидов в 12 кодоне онкогена HRAS1 в РШ позволяет утверждать, с известкой долей осторожности, о воздействии на геном клеток-мишеней одного инициирующего агента
Список использованной литературы по медицине, диссертация 1992 года, Бабенко, Виктор Иванович
1. Альтштейн А, Д. Онкогены опухолеродных вирусов. Журн. Всесоюзн. хим. общества им. Менделеева, 1973, т. 18, с. 630-638.
2. Бутенко 3, А. Молекулярные механизмы лейкомогенеза, Механизмы лейкозогенеза, 1975, с, 5-29.
3. Забаровский Е. Р. Онкогены ретровирусов и их клеточные протоонкогены. Моле к. биология, 1985, т. 19,1 с. 9-35.
4. Киселев Ф. Л. , Татосян А. Г, , Гудков А, В, и др. Молекулярные механизмы вирусного и невирусного канцерогенеза, Итоги науки и техники: Вирусология. М. , 1983, N10, с, 169,
5. Киселев Ф. JL , Павлиш О, А. , Татосян А, Г. Молекулярные основы канцерогенеза у человека. М. , 1990, с. 5-6,
6. Князев П. Г., Шефер Р. , Виллике К. , Плужникова Г. Ф. , Серова 0. М., Федоров С. Е , Сейц И. Ф. Активация протоонкогенов из семейства RAS и МУС в карциноме молочной железы и нейробласто-ме человека, Mb лек, биология, 1986, N5, с. 1236-1243.
7. Князев Е Г., Серова О. М. , Бабенко В. И. и др. Молекулярная природа повреждений онкогена HRAS1 в карциномах молочнойжелезы: трансверсия G -Т в 12 кодоне одного аллеля при делецииодругого аллеля, ьиорганическая химия, 1990а, т,16, N3, с, 4191. А9 О
8. Князев И Г, , Серова О, М,, Никифорова И, Ф. , Плужникова
9. Локтионов А. С. , Холлстейн М. и др. Активация онкогена HA-RAS в опухолях, индуцированных у мышей трансплацентарным воздействием 7,12-диметилбенз(а)антрацена. Вопросы онкологии, 1991, т. 37, N3, с. 297-303.
10. Напалков Е Е , Анисимов В, Е , Князев Е Г. , Лихачев А. £ Современные представления о механизмах канцерогенеза. ■ЕНИИШ: серия экспериментальной онкологии. М. , 1987, с. 84.
11. Никифорова II Ф. Распределение аллелей онкогена HRAS1 и их перестройки в карциномах у человека. Кандид, диссертация, JL , 1991.
12. Плужникова Г. Ф,, Серова О. Ы , Князев Е Г. и др. Совместная амплификация онкогенов с-туе и е-На-газ в клетках рака молочной и щитовидной желез человека. Зкспер. онкология, 1987, N2, с. 15-17.
13. Сейц Л Ф. , Князев Е Г. , Федоров С. Е Онкогены. Происхождение, распространение, структура и функции в канцерогенезе, Вопросы онкологии, 1982, N10, с. 95-114,
14. Оейц И. Ф. , Князев П. Г. Молекулярная онкология, Л: Медицина, 1986, с. 351-359.
15. Серова О. М. Амплификация и экспрессия в опухолях человека нуклеотидных последовательностей, родственных онкогену МУС. Кандид, диссертация, JL , 1987.
16. Albino A., Le Strange R. , 01 iff A. et al. Transforming RAS genes from human melanoma: a manifestation of tumor heterogenecity // Nature. 1984.- v. 308. - p. 69-72.
17. Almoguera C. , Shibata D. et al. Most human carcinomas of the exocrine pancreasfcontain mutant c-K-ras genes /7 Cell.i Q.QR v Я Я - г« Я л. О-ь^Аacuuj v л uus у.'» u-i».'
18. Balmain А. , Ramsden М. , Bowden G. et al. Activation of the mouse cellular Harvey-ras gene in chemically induced benign skin papillomas // Nature. 1984.- v. 307. - p. 658-661.
19. Barbaeid M Oncogenes and human cancer: cause ' or consequence? // Carcinogenesis. 1986.- v. 7. - p. 1037-1042.
20. Barbae id M Ras genes // Annu. Rev. Biochem. 1987. -v. 56. - p. 779-827. .
21. Bar-Sagi D. , and Feramisco j. R. Microinjection of the ras oncogene protein on PCI2 cells induces morphological differentiation // Cell. 1985.- v. 42. - p. 841-848.
22. Beckner С. K. , Hatton S. , Shih T, Y. The ras oncogene product is not a regulatory component of adenylate cyclase // Nature. 1985.- v. 317. - p. 71-72.
23. Bell j. The polymerase chain reaction // Immunology Today. 1989. - v. 10. - p. 351-355.ог? t^-i t ь.л c'<v"1-.r-4г-чгчс- / /cr*'.i a n\ "1 ооо — я t о v-ч с4п„ по iл клоним j * iVia u Aiwwtriic?& / jub rtifU i dusw* v, о* ги,i л сi 1U
24. Bishop J. M. Retroviruses and cancer genes // Adv. Cancer Res. 1982a. - v. 37. - p, 1-32.
25. Bishop j. M. Cellular oncogenes and retroviruses .// Anna. Rev, Bi ochem. 1983,- v, 52, - p, 301-354.
26. Blair D. C. , Oskarsson M. , Wood I. G. et al. Activation of transforming potential of a normal cell sequence a molecular model for oncogenesis // Science. 1981.- v. 212.-p. 941-943.
27. Bos' j. L. , Verlan-de Vries M. , Marshall C. j. et al. . Ahuman gastric carcinoma contains a single mutated and an amplified normal allele of the Ki-ras oncogene // Nucleic Acids Res. 1985.- v. 14. - p. 1209-1217.
28. Bos j. L. , Fearon E. R. , Hamilton S. R. et al. Prevalence of ras mutations in human colorectal cancers // Mature, -10Я7 v - n oqo9Q7
29. Bos- j. L. The ras gene family and human carcinogenesis .// Mutat. Res. 1988. - v. 195. - p. 255-271.
30. Bos J. L. .Ras oncogenes in human cancer: a review // Cancer Reseafcch. 1989. - v. 49. - p. 4682-4689.
31. Boveri T. The origin of malignant tumors // Baltimore. 1929.
32. Capon D/j. , Chen E. Y. , LeVinson A, D. et al. Complete nucleotide sequence of the t.24 human bladder carcinoma oncogene and its normal homologue // Nature. 1983a. - v. 302.-p. 33-37.
33. Chang E. H. , Furth ME., Scolnick E. M. et al. Tumorogenic transformation of mammalian cells induced by a normal human gene homologous to the oncogene of Harvey murine sarcoma virus // Nature. 1982. - v. 297. - p. 479-483.
34. Chard in P. , Travitian A. The rol gene: a new ras related gene isolated by the use a synthetic probe .// EMBO j. 1986.- v. 5. - p. 2203-2207.
35. Coben j. B. « and Levinson A. D. A point mutation in the last intron responsible for increased expression and transforming activity of the с-Ha-ras oncogene // Nature.-1988.- v. 334. p. 119-124.
36. Comings D. E. A general theory of carcinogenesis // Proa Nat. Acad. Sci. USA. 1973.- v. 70. - p. 3324-3328.
37. Creagan R.P., Ruddle F. H. // Cytogenet, Cell Genet. -1975. v. 14. - p. 282-286.
38. Croce 0. R, Klein G. Chromosome translocations and human cancer // Sci. Am. 1985. - v. 250. - p. 44-62,
39. Croce С. M. Rote of chromosome translocations, in human neoplasia/7 Cell. 1987.- v. 49. - p. 155-156.
40. Прг П T k'-rnnr T ^ fW-srv^ p. мi л -i J 4 4 i ii UliU'ii i 1 л wU 4 t.*« iVi»
41. Ellis R. W. , DeFeo D. , Maryak J. M. et al. Dual evolutionary origin for the rat. genetic sequences of Harvey murine sarcoma virus // j. Virol. 1980.- v. 34. - p. 408-420.
42. Ellis R. W. , DeFeo D. , Shin I. Y. et al. The p21 ras genes of Harvey and Kirsten sarcoma viruses originate from divergent members of a family of normal vertebrate genes // Nature. 1981. - v, 292. - p. 506-510,
43. Eva A. Aaronson S. A. Frequent activation of c-ki-ras a transforming gene in fibrosarcomas induced by methylcholantrene // Science.- 1983. v. 200. - p. 995-996.
44. Fasano 0. , Birnbaum D. , Edlund L. et al. // Molec. Cell, Biol, 1984,- v, 4. - p. 1695-1705.
45. Feinberg A. P. } Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes ras genes of the same human cancer from their normal counterparts // Nature. 1983. - v. 301. - p. 89-92.
46. Feinberg A, P. , Vogelstein В., Droller M. j. et al. Mutation affecting the 12th amino acid of the с-Ha-ras oncogene product occurs infrequently in, human cancer // Science. 1983a. - v. 220. - p. 1175-1177.
47. Feramisco j. R. , Clark R. , Wong G. et al. Transient, reversion of ras oncogene induced cell transformation by- 118 antibodies specific for amino acid 12 of ras protein // Nature. 1985. - v. 314. - p. 639-642.
48. Fujita j. , Srivastava S. K. , Kraus M. H. et al. Frequency of molecular alterations affecting ras protooncogenes in human urinary tract tumors // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985.- v. 82. - p. 3849-3853.
49. Gazdar A. F., Carney D.N. , and Minna j. D. The biology of non-small cell lung cancer // Semin. Oncol. 1983.- v. 10. -p. 3-19.
50. Gibbs V. B. , Ellis R. W. , Scolnik E. M. Aytophosphorу 1 ation. of v-Ha-ras p21 is modulated by amino acid residue 12 // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984.- v. 81. - p. 2674-2678.
51. Gilbert F. Chromosomal aberrations and oncogenes // Nature. 1983. - v. 303. - p. 475.
52. Goldfarb M. , "Shimisu K. , Perucho M. et al. Isolation and preliminary characterisation of a human transforming gene from T24 bladder carcinoma ceils // Nature. 1982. - v. 296. -p. 404-409.
53. Goubin G. , Goldman D. « Nice j. et al. Molecular cloning and nucleotide sequence of a transforming gene detected by transfection of chicken B-cell lymphoma DNA // Nature. 1983.- v. 302. - p. 314-319.
54. Greenhalgh D. A. , Kinsella A. R. с-Ha-ras not c-Ki-ras activation in three colon tumour cell lines // Carcinogenesis. 1985. - v. 6. - p. 1533-1535.
55. Grunewald K. , Lyons j. et al. High frequency of Ki-ras codon 12 mutations in pancreatic adenocarcinomas // j. Cancer.-1989.- v. 43. p. 1037-1041.
56. Hall A. , Marshall C. , Spurr N. et al. Identification- 119 of transforming: genes in two human sarcoma cell lines as a'new member of the ras gene family located on chromosome 1 // Mature/- 19-83. v. 303. - p. 396-400.
57. Hall A. The ras gene family // In Oxford Surveys on EuKaryotio Genes, ed. MacLean M. Oxford Univ. Press. 1984. -v. 1, - p. 111-114.
58. Hunter T. The" proteins of oncogenes // Sci. Am. -1984. v. 251.- p. 60-69.
59. Kasid A., Lippman RE;, Parageorge A.G. et al. Transfeotion of v-Ha-ras DMA into MCF-7 human breast cancer ceils bypasses dependence on estrogen for tumorigenicity // Science. 1985.- v. 228. - p. 725-728.
60. Kohl M. E. , Geo С. E. , Alt F. W. Activated expression of the N-myc gene in human neuroblastoma and related tитоге // Science. 1984.- v. 226. - p.'1335-1337.
61. Kosbor D. , Crou С. M. Amplification of the c-myc oncogene on one of five human breast carcinoma cell lines // Cancer Res.- 1984.-- v. 44. p. 438-441.
62. Kozma S. C. ,Bogaard M. E. , Buser K. et al. The human c-Kirsten ras gene is activated by a novel mutation in codon 13 in the breast carcinoma cell line MDA-MB231 // Mucleic Acid Res. 1987. - v. 15. - p. 5963-5971,
63. Kraus M. H. , Yuasa Y. , Aaronson S. A position 12- 120 activated Ha-ras oncogene in ail HS578t mammary carcinosarcoma cells but not normal mammary cells of the same patient // p-rnfv-4 wat о-н нча 1 qp;4 - v я1 - rj р>яяя
64. TO Hi— tiisr'i' i ПЛ Ы Л M p.
65. Til m x, O, j L-'i ivlri.! L-iJiU if, -Н» , u-uij ivl. t? ai.
66. Unique allelic restriction fragments of the human Ha-ras locus in leukocyte and tumor DNAs of cancer patients // Nature. -1985. v. 313. - p. 369-374.
67. Krontiris I. G. , Di-Martino N. A. ,' Colb M. et al. Human rectriction fragment length polymorphism and cancer risk assesment // j. Cell. Biochem. - 1986,- v. 30. - p. 319-329.
68. Land H. , Parada L., Weinberg R. A. lumorigemc conversion of primary embryo fibroblasts requires at least two cooperating oncogenes // Nature.- 1983.- v. 304. p. 596-602.
69. Land H. , Chen A, C, , Morgenstern j, P. et al. Behavior of myc and ras oncogenes in transformation of rat embriof i Kj^hl // Х&О ПлЗ 1 D-i г-%1 -i ПОЯ ir P. •iQ-l^-'iOOC.x iLu ОШаэю .•' / iVi-'-L, rfii ljxQI. iduu. V, p. xs±t iiiivu.
70. Larie M. A. , Sainten A. , Cooper G. M. Stage specific transforming genes of human and mouse B-and T-lymphocyte neoplasms-//'Cell.- 1982. v. 28. - p. 873-880.
71. Lee W. H. , Murphree A. L, , Benedict W. F. Expression and amplification of the N-myc gene in primary retinoblastoma // Nature, 1984. - v. 309, - p. 458-460.
72. Lidereau R. , Eacot C., Theillet C. et al. High frequency of rare alleles of the human с-Ha-ras protooncogene in breast cancer patients // j. Nat, Cancer Inst. 1986. - v. 77. -p. 697-701.
73. Lowe D. G. , Capon D. J. , Del wart E. et al. Structure ofo,the numan and murine R-ras genes, novel genes closely releted to ras protein oncogenes // Cell. 1987,- v. 48. - p. 137-146.
74. Mai on P. R. , Yisvanathan К. V. , Ponder R A. et al. Oncogene and bladder cancer // Br. J. Urol.- 1985.- v. 57. p. 664667.
75. Marshall 0. j. Functions of ras oncogenes // Nature. -1984.- v. 310. p. 448-449.
76. Marshal 1 C. j. Human oncogenes // In: R.Weiss, N. Teich, H. Varmus, j. Coffin (Eds), RNA Tumor Viruses, second edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. 1985,-no. 4, - p. 487-558.
77. Marshall C. j. The ras gene family /7 In: Oncogenes and Growth Control, ed. KahnP. , Graf T.: Springer-Verlag. 1986.-p. 192-199.
78. Murray M. j. , Cunningham J. M. , Parada L. F. et al, The HL-60 transforming sequence: a ras oncogene coexisting with altered my с genes in .hematopoietic tumors // Cell, 1983, -v. 33. - p. 749-757.
79. Neubauer A. , Shannon K, , Liu E. Mutations of the ras proto-oncogenes in childhood monosomy 7 // Blood, 1991,-v, 77, - p. 594-598,
80. Newbold R. F, ,0verell R, W. Fibroblast immortality is a prerequisite for transformation by Ej с-Ha-ras oncogene // Nature. 1983.- v. 304. - p. 648-651.j. ic-ic
81. Newmark P. The ras mat ass of cancer genes // Nat-игё. -1983. v. 305. - p. 470-471.
82. Parada L.F. , Tabin C.J. , Shin C. et. al. Human EJ bladder carcinoma oncogene is homologue of Harvey sarcoma virus ras gene // Nature. 1982. - v. 297. - p. 474-478.
83. Pawson T. Growth factors, oncogenes, and breast, cancer // In: A. H. G. Paterson and А. V/. Lees (eds). Fundamental Problems in Breast. Cancer. 1,987.- p. 155-171.
84. Pulciani S. , Santos E. , Long L. K. et al. Ras gene amplification and malignant transformation // Mol. Cell Biol.-1985. v. 5. - p. 2836-2841.
85. Quintan ill a M. , Brown K. , Ramsden M. et al. Carcinogen-specifiс mutation and amplification of Ha-ras during mouse skin carcinogenesis // Nature. 1986.- v. 322. -p. 78-80.
86. Rochlitz C. F. , Scott G. K. , Dodson j. M. et al. Incidence of activating ras oncogene mutations associated with primary and metastatic human breast cancer // Cancer Res. -1989.- v. 49. p. 357-360.
87. Rodenhuis S. et al. Mutational activation of the K-ras oncogene: a possible pathogenetic factor in adenocarcinoma of the lung // N. Eng. j. Med. 1987.- v. 317.-p. 929-935.
88. Rodenhuis S. , Slebos R. J. C. , Boot A. j. M. et al. K-ras oncogene activation in adenocarcinoma of the lung: incidence and possible clinical significance // Cancer Res.- 1988. -v. 48, p. 5738-5741. .
89. Rowley j. D. Human oncogene locations and chromosome aberrations // Nature, 1983. - v, 301, - p, 290-291,
90. Ruiey E. H. Adenovirus early region E1A enables viral and cellular transforming genes to transform primary ceils in culture // Nature, 1983. - v, 304, - p, 602-606,
91. Saiki R, , Scharf S. , Faloona F. et al. Enzymatic amplification of B-globin genomic sequence and restriction site analysis- for diagnos' is of sickle cell anemia // Science. 1985.- v. 230. - p. 1350-1354.
92. Saiki R. K. , Bugavan T. L. , Horn G. T. et al. Analysis of enzymatically amplified B-globin gene and HLA-DQL DNA with allele-specifiс oligonucleotide probes // Mature.- 1986.-v. 324. p. 163-166.
93. Saiki R. K. , Self and D. H. , Stoffel S. et al. Primer-directed enzymatic amplification .of DNA with a1. J. (Сthermostable DNA ' polymerase /7 Science,- 1988.- v. 239. -p. 487-500.
94. Santos E. , Tronick S. R. , Aaronson S. et al. T24 human bladder carcinoma oncogene is an activated form of the normal human homologue of BALB and Harvey-MSV transforming genes // Nature. 1982. - v. 298. - p. 343-347.
95. Santos E. , Reddy E. , Pulciani S. et al. /7 Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1983.- v. 80. - p. 4679-4683.
96. Santos E. , Martin-Zanca D. , Reddy E. P. et. al.1. Ql
97. Malignent activation of a K-ras oncogene in lung carcinoma but not in normal tussue of the same patient /7 Science.- 1984.-v. 223. p. 661-664.
98. Schwab M. , Alitalo K. ,Varmus H. E. et al. A second oncogene (c-Ki-ras) is amplified, overexpressed and located within karyotypic abnormalities in mouse adenocortical tumor cells // Nature. 1983.- v. 303. - p. 497-501.'
99. Sekiya T. , Fushimi N. , Hori H. et al. Molecular cloning and the total nucleotide sequence of the human c-Ha-ras-1 gene activated in melanoma from Japanese patient // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1984.- v. 81. p. 4771-4775.
100. Shimisu K. , Birnbaum D., Ruley MA. et al. Structure of the Ki-ras of the human lung carcinoma cell line Celu-1 // Nature. 1983. - v. 304. - p. 497-500.
101. SI anion D. , Shimotohno K. , Cline M. et al. Identification of the putative transforming protein of the human T-cell leukemia viruses HTLV-1 and HTLV-II // Science.-1984.- v. 226. p. 61-65.
102. Slamon D. j. , deKernion j. B. , Verma J. M. et al. Expression of cellular oncogenes in human malignancies ././ Science. 1984a. - v. 224. - p. 256-262.
103. Spandidos D. A., Vilkie N. M. ifolignant transformationof early passage rodent cells by a single mutated human oncogene /V Nature. 1984.- v. 310. - p. 469-475.
104. Stacey D. V. , Kung H. F. Transformation of NLH 3T3 cells by microinjection of Ha-ras p21 protein // Nature. -1984. v. 310. - p. 508-511.
105. Stark G. R. , Wahl G. M // Ann. Rev, Biochem. 1984.- v. 53. - p. 447-491.
106. Steenvoorden А. С. M. , Janssen j. W. G. et al. RAS mutations in Hodgkin's disease // Leukemia (Baltimore). 1988.- v.1. С * ~ p л LJ **" oS w! *
107. Stehelin D. , Varmus H., Vogt P. K. DMA related to the transforming gene(s) of avian sarcoma viruses is present invv^y^yvy^ 1 н .^y--. пк? a / / klor \ \y--£j — 'i qr.;! a — 9кп -1 r;sf"* -i r;j0
108. J iUA jiiCS-j. i-tr¥ j. La-A д Lri4J-i J iW-l-Lii ч?* j. s V « LUw'i p. ± ; W J- /
109. Sukumar S. , • Notario V. , Martin-Zanca D, et al. Induction of mammary carcinomas in rats by nitrosomethylurea involves malignant activation of Ha-ras-1 locus by single point, mutation // Nature. 1983.- v. 306. - p. 658-661.
110. Sukumar S. , Carney W. , and Barbae id M. Independent molecular pathways in initiation and loss of hormone responsiveness of breast carcinomas // Science (wash. DC).1988. v. 240. - p. 524-526.
111. Sutherland B. , Bennet P. Transformation of humancells by DNA transfections // Cancer. Kes. 1984.p. f-> i iw / / л.-.
112. Tabin C. j. , Bradley S. M. , Bargmann С. I. et Nature. 1982.- v. 300. - p. 143-149.
113. Tada M. , Omata M. , and Ohto M. Analysis of ras gene .mutations in human hepatic malignant, tumors by polymerase chain reaction and direct sequencing // Cane. Res. 1990. -v. 50. - p. 1121-1124.
114. Taparowsky E. , Evard Y. , Fasano 0. et al. Activation of T24 bladder carcinoma transforming gene is linked to asingle amino acid change // Nature. 1982. - v. 300. - p. 762-765.
115. Taparowsky E. , Shimisu K. , Goldfarb M, et al. //
116. Пл1 1 -1 QOO ». Г 0.-1 P.Q-i UviJ., J. Zj V.
117. Taya Y. , Hosogoi K. , Hirohashi S. et al. A novel combination of Ki-ras and myc amplification accompanied by point mutational activation of Ki-ras in human lung cancer // EMBO j. 1984.- v. 3. - p. 2943-2946.
118. Theillet C. f Lidereau R. , Escot C. et al. Frequent loss of a Ha-ras allele correlates with agressive primary breast carcinoma // Cancer Res.-1986. v. 46. - p. 4776-4781.
119. Their S. L. , Osoier D. G., Flint, j. et al. Harashyper-variable alleles in myedisplasia // Nature. 1986.- v. 321.-p. 84-85.
120. Topal M. D, DNA repair, oncogenes and carcinogenesis/ {"^o"*"4'"4 •» ^Л'^й^йс ^ с —■ ч Q&Q — <""> — АП-i —••• w'b-sri j. X A wi b-> -i i—-4 J. t' V д tJ л ./* Z3 L wл
121. Vonsden K. , Marshall C. Three different activated газ genes in mouse tumors: evidence for oncogene activation during progression of mouse lymphoma // EMBO j. 1984.- v. 3. - p. 913917.al. //
122. Vosberg Н-Р. The polymerase chain reaction anmproved method for the analysis of nucleic acids // Hum. Genet. 1989.-v. 83. - p. 1-15.
123. Walter IvL , Clark S. G. , Levinson A. D. The oncogenic activation of human p21 ras by novel mechanism /7 Science.-1986. v. 233. - p. 649-552.
124. Weinberg R. A. Oncogenes of spontaneous and chemically induced tumors // Adv. Cancer Res. 1982.- v. 36. - p. 149-163. . ,
125. Weinberg R. A. A molecular basis of cancer //' Sci. Am.-1983. v. 248. - p. 126-142.
126. White T. j, , Arnheim N, , and Erlich H, A. The polymerase chain reaction // Tig.- 1989,- v, 5. p. 185-189.
127. Willumsen В. M. , Christensen A. , Hubbert N. L. et al. The p21 ras C-terminus is required for transformation and membrane association // Nature. 1984.- v. 310, - p, 583-586,
128. Wong C, , Douwling С, E. , Saiki R. K. et al. Characterization of B-thalassaemic mutations using direct genomic seque-nsing of amplified single copy DNA // Nature. 198?'.- v. 330.-p. 384-386. "
129. Yamamoto F. ,Perucho E Activation of a human c-Ki-ras oncogene //' Nucl. Acid Res, 1984, - v." 12. - p. 8873-8886.
130. Yuasa Y. Sri vastava S. K. , Dunn C, Y, et al. Acquisi