Автореферат и диссертация по медицине (14.00.31) на тему:Моделирование и экспериментальная химиотерапия кандидозной инфекции мышей, вызванной интрацеребральным заражением

Г'Г 5 ОД

У 1 >" п /" - -^ 1." -.; '

На правах рукописи

БАКЛАНОВА Ольга Владимировна

Моделирование и экспериментальная химиотерапия кандидозной инфекции мышей, вызванной интрацеребральным

заражением

14.00.31 - химиотерапия и антибиотики

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

йэсква 1995

Работа выполнена в Центре по химии лекарственных средств (Всероссийском научно-исследовательском химико-фармацевтическом

институте)

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Е. К ПАДЕЙСКАЯ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

А. С. АНКИРСКАЯ; доктор медицинских наук С. А. БУРОВА

Ведупш организация: Центральный научно-исследовательский

кожно-венерологический институт Минздравмедпрома РФ

Защита состоится "20" Л/ЯД^сг? 1995 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 084.68.01 в Государственном научном Центре по антибиотикам (ГНЦА) по адресу: 113 105 Москва, ул. Нагатинская, д. За.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНЦА. -Автореферат разослан

"3¿" £U??iff/t$.1995 Г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

С. Ы. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние десятилетия во всех странах мира наблюдается рост заболеваемости поверхностными и глубокими микозами. Особенно расширяется спектр грибковых заболеваний, вызванных условно-патогенными грибами Candida, повысилась их роль и в инфекционной патологии центральной нервной системы (ЦНС). Проблема профилактики и лечения кандидоза ЦНС в настоящее время приобрела исключительно важное значение. Учитывая тенденцию к росту заболеваемости кандидозной инфекцией и кандидозным менингитом, в частности, отсутствие достаточного набора эффективных препаратов для лечения этого заболевания, необходимы поиски новых про-тивокандидозных средств и одновременно важным является разработка оптимальных экспериментальных моделей кандидоза. Это в полной мере относится и к моделированию инфекции с преимущественным поражением ЦНС для углубленного изучения активности антимикотиков и оценки возможности их изучения или применения в клинике при кандидозе ЦНС.

Настоящая работа выполнялась в рамках научно-технической программы ГКНТ СССР 0.43.01 "Изыскать новые лекарственные средства, разработать технологию и освоить промышленное производство новых препаратов и их лекарственных форм" на 1980-1985гг. и 1986-1990гг. и Государственной программы РФ по улучшению лекарственного обеспечения и развития фармацевтической промышленности на 1991-1995гг.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось воспроизведение и изучение кандидозной инфекции мышей с преимущественной локализацией процесса в ткани мозга, а также определение возможности применения разработанной модели в химиотерапевтических опытах.

В связи с этим были намечены следующие задачи:

- изучить особенности течения инфекции, развивающейся после интрацеребрального заражения мышей различными штаммами C.albicans;

- сравнить характер развития инфекции у мышей в зависимости от интрацеребрального или внутривенного заражения;

- разработать критерии оценки развивающегося процесса для создания химиотерапевтической модели;

- оценить на данной модели сравнительную активность антими-котиков, применяющихся в клинике для лечения кандидоза;

- изучить активность новых оригинальных химических соединений, синтезированных в ЦХЛС-ВНИХФИ.

Научная новизна исследования. Настоящая работа является оригинальным исследованием, посвященным изучению канди-дозной инфекции ЦНС в опытах на мышах с целью разработки химиотерапевтической модели. На разработанной модели кандп-дозного энцефаломенингита мышей впервые проведена экспериментальная оценка активности антимикотпков, применяющихся в клинике, в том числе противогрибковых препаратов производных азола - кетоконазола и итраконазола. Впервые на разработанной модели изучена активность новых оригинальных химических соединений—8 синтезированных в ЦХЛС-ВНИХФИ производных пирролохинолина, тиазолидиндиона и азоиндола, показавших активность в отношении С. albicans в опытах in vitro.

Практическое значение работы. Разработана модель кандп-дозной инфекции мышей с преимущественной локализацией в ткани мозга патологического процесса, сходного с таковым по патоморфологическои картине у человека. Это обосновывает использование модели для изучения особенностей течения канди-дозной инфекции с преимущественным поражением ЦНС. Модель позволяет выявить химиотерапевтическую активность соединений, а также различия в степени эффективности антимико-тиков и новых химических веществ в относительно короткие сроки. Модель рекомендуется для углубленного изучения антимикотпков, а также новых химических соединений с целью определения их потенциальной активности при кандидозе ЦНС.

Публикации и апробапия работы. По материалам диссертации опубликованы 8 статей и тезисы двух докладов. Материалы экспериментальных исследований и обзор литературы доложены на конференциях молодых ученых и специалистов ЦХЛС-ВНИХФИ в 1982 и 1986 г.г., на международных симпозиумах "Актуальные вопросы медицинской микологии" и "Микозы и иммунодефициты" (г. Санкт-Петербург, 1987 и 1991г.г.).

Стуктура и объем диссертадии. Диссертационная работа изложена на т страницах и состоит из введения, обзора литературы, включающего 2 главы, 2 глав собственных исследований, заключения п общих выводов.

Материалы диссертации иллюстрированы 37 рисунками и 33 таблицами. Библиография включает 190 работ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Животные. Эксперименты выполнены на 3200 белых беспородных мышах обоего пола массой 17±1,0 г.

Штаммы С.albicans. В работе использованы 9 штаммов С.albicans (2 музейных п 7 клинических).

Инфицирование мышей в мозг. Взвесь суточной агаровой культуры в физиологическом растворе вводили в мозг по описанной методике (М.Н.Лебедева и Д.М.Гольдфарб,1944). Область заражения - около средней линии черепа на 2-3 мм выше глазницы.

Развитие инфекционного процесса оценивали по следующим критериям:

а. Визуальное наблюдение за животными. Отмечали выживаемость и суммарную продолжительность жизни животных при наблюдении до 25-30 суток.

б. Высеваемость С.albicans из организма мышей изучали через 4 часа, 1 сутки, 3, 6, 8, 9 и 10 суток после интрацереб-рального заражения. Посевы на среде Сабуро инкубировали при 37° С в течение 48-72 часов. Результаты высеваемости оценивали по числу мышей, у которых выделена С. albicans (проанализирован материал от 100 животных).

в. Патоморфологическое исследование мозга и внутренних огранов мышей, зараженных в мозг музейным штаммом №1 и клиническим штаммом №1755. Изучение морфологических изменений проведено на 126 животных в динамике на протяжении 10 суток после заражения, у отдельных выживших мышей - на 30-е сутки. Ткани фиксировали в 10%-ном растворе формалина с последующим обезвоживанием и заливкой в парафин. Гистологические срезы головного мозга и внутренних органов окрашивали гематоксилин-эозином. У части животных проводили окраску материала ШИК-методом с докраской гематоксилином.

Для сравнения особенностей течения инфекции мышей, развивающейся после введения грибов Candida в мозг, с развитием инфекционного процесса после заражения в вену проведены опыты на 400 мышах; инфицирующую дозу (ИД) вводили внутривенно в объеме 0,2 мл.

Лекарственные препараты и химические соединения. В хи-миотерапевтических опытах использованы следующие антими-котики: 1) выпускающиеся в России нистатин-субстанция, мико-гептин-таблетки по 50 мг (50 тыс. ЕД), амфотерицин В - порошок для инъекций во флаконах по 50 мг (50 тыс. ЕД) и амфог-люкамин-таблетки по 100 тыс. ЕД; 2) кетоконазол (низорал) -субстанция и таблетки по 0,2 г, итраконазол-субстанция фирмы Janssen Pharmacentica, Бельгия; 3) 5-фторцитозин (анкотил) -таблетки по 0,5 г фирмы Hoffman-La Roche,Швейцария.

Изучена активность 8 оригинальных соединений из различных химических рядов, синтезированных в ЦХЛС-ВНИХФИ и показавших активность в опытах in vitro в отношении С.albicans в пределах минимальной подавляющей концентрации (МПК) < 32 мкг/мл.

Химиотерапевтические опыты проведены на мышах, зараженных в мозг клиническим штаммом С.albicans №1775 в дозе 4хЮ7К0Е, вызывающей гибель 90-100% на 10-12 сутки после заражения. При сравнении активности препаратов (кетоконазола и итраконазола) на модели генерализованного кандидоза мышей ИД составила 5хЮвКОЕ. Животных (60 мышей) заражали в хвостовую вену в объеме 0,2мл; гибель нелеченных контрольных животных наблюдалась в те же сроки, что и в опытах с интраце-ребральным заражением.

Препараты и химические соединения вводили мышам внутрь в крахмальном геле в объеме 0,5 мл через час после заражения. Амфотерицин В вводили также под кожу в области загривка в 5% -ном растворе глюкозы. Лечение проводили 1 и 2 раза в день в течение 5 или 10 дней. Длительность наблюдения -30 суток.

Эффективность лечения оценивали по показателям выживаемости и суммарной продолжительности жизни животных на 10-е и 30-е сутки (в опыте с микогептином - и на 60-е сутки), высеваемости С. albicans из организма мышей и результатам

морфологического исследования мозга и внутренних органов леченных животных в сравнении с контролем.

Высеваемость С. albicans из организма мышей изучали через 5, 10 и 30 суток после заражения (в опыте с микогептином и на 60-е сутки). Инфицированный материал от 340 животных засевали на среду Сабуро и инкубировали при 37° С в течение 72 часов. Результаты оценивали по числу мышей, из организма которых выделена С. albicans. Для количественного определения обсемененности мозга грибами С.albicans после 5-дневного лечения антимпкотикамп разведенную в 100 раз физиологическим раствором суспензию мозга засевали на чашки с агаризованной средой Сабуро, инкубировали 72 часа и подсчитывали число выросших колоний или оценивали рост С. albicans в баллах.

Оценку морфологических изменений, развивающихся в тканях мозга, почек и сердца, проводили в условных единицах по разработанной 4-х балльной системе (в зависимости от характера патологического процесса п вегетации гриба), описанной в соответствующем разделе работы.

Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методикам, указанным в диссертации.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработка модели капдидозпой инфекции мышей при иптрацеребральпом заражении

Изучение особенностей течения инфекции мышей при ин-траперебральном заражении грибами С. albicans. При заражении мышей в мозг летальными дозами клинических штаммов С.albicans развивалась кандидозная инфекция, характеризующаяся неврологической симптоматикой у большинства животных и их гибелью, в основном, через 5-15 суток после заражения в зависимости от штамма и величины ИД. Однако принципиальных различий в степени вирулентности семи клинических штаммов С.albicans не было отмечено. Их вирулентность не зависела так же и от источника выделения возбудителя. Музейный штамм №1 характеризовался меньшей вирулентностью (см. рис. 1). Музейный штамм №13 оказался практически не вирулентным для мышей при интрацеребральном заражении.

ю 15 20 25

Сутки после заражения

ТО 15 20 25

Сутки после заражения

Рис. 1. Динамика развития инфекции при заражении мышей в мозг различными штаммами С.аКпсапэ (п=10-15 мышей в группе)

а) ИД 2хЮ7КОЕ

б) ИД 8х10?КОЕ

1 - музейный штамм №1;

2, 3, 4 - клинические штаммы №№ 1459, 1755, 520

Развитие кандидозной инфекции характеризовалось выделением возбудителя из ткани мозга у всех животных в течение 10 суток как после пнтрацеребрального заражения клиническим штаммом №1755, так и музейным штаммом №1. Отмечалась более высокая степень инфицирования внутренних органов при заражении клиническим штаммом №1755.

Морфологическая характеристика инфекпии складывалась на основании изучения морфологических изменений, развивающихся после интрацеребрального заражения мышей в ткани мозга, почках и сердце (наиболее пораженных биосубстратах), п морфо-тинкториальных свойств клеток С.аНнсапэ в пораженных тканях. Разработанная 4-балльная система оценки патологического процесса в зависимости от его характера и интенсивности позволила дать детальную характеристику развивающейся инфекции.

Оценка степени морфологических изменеий в ткани мозга проводилась в соответствии со следующими критериями:

4 балла. Крупный очаг воспаления в области заражения со склонностью к нагноению, наличие в других отделах мозга метастатических мелких очагов воспаления (гранулем, степень зрелости которых соответствует сроку взятия материала), содержащих бластные формы и мицелий гриба, очаговый менингит, вен-трикулит, разрастание глии.

3 балла. Те же изменения, что и при поражении мозга на 4 балла, но метастатических очагов воспаления меньше, отсутствие гнойного компонента.

2 балла. Очаг воспаления в области заражения хорошо ограниченный, как правило, не содержит вегетирующих форм гриба; единичные лимфо-гистпоцитарные скопления, очаговый менингит, вентрикулит.

1 балл. Изменения менее выражены, чем на 2 балла, отек, полнокровие сосудов мозга, очаговый менингит, вентрикулит.

0.5 балла. Только скопления мононуклеаров, в основном, в области заражения.

0 баллов. Отсутствие изменений.

В каждой группе животных определяли средний индекс поражения.

Для характеристики степени поражения почек также использовали 4-балльную систему, исходя из следующих критериев.

4. балла. В ранние сроки регистрируется тотальное поражение коркового и мозгового вещества почки в виде гнойных инфильтратов или гранулем, обширных очагов гнойного расплавления, дистрофии эпителия, гидронефроза; наблюдается разрастание мицелия. В более поздние сроки, к 6-м суткам, характерно поражение мозгового слоя почек, главным образом, лоханок, где вегетирующий гриб задерживается длительное время в виде "грибных шаров" (слущенный эпителий, разрастание мицелия, скопление мононуклеаров с примесью полиморфно-ядерных лейкоцитов), отмечается понефронное запустевание канальцев, разрастание соединительной ткани.

3 балла. Те же изменения (см. характеристику поражения почек на 4 балла), но ограниченные одним отделом почек.

2 балла. Единичные очаги воспалительной инфильтрации, не всегда содержащие элементы гриба, полнокровие.

1 балл. Интерстициальная инфильтрация, полнокровие.

При морфологических изменениях почек на 1 и 2 балла ве-гетирующие грибы выявляются, как правило, только в лоханках.

0.5 балла. Слабо выраженная интерстициальная инфильтрация.

0 баллов. Отсутствие изменений.

Степень поражения сердца оценивали также по 4-балльной системе в зависимости от количества мелких метастатических очагов воспаления или гранулем, обнаруженных в миокарде.

Гистологическое исследование показало, что инфекция, вызванная клиническим штаммом №1755, характеризуется тяжелыми изменениями, патоморфологической особенностью которых является появление множественных мелких очагов воспаления в ткани мозга и раннее (в первые сутки) поражение почек и сердца. При заражении мышей в мозг музейным штаммом №1 множественные микроабсцессы в ткани мозга не развивались, тяжелые поражения почек отмечались только после 5-6-х суток; в более ранние сроки эти изменения были слабо выражены. Инфекция, развивающаяся при заражении мышей в мозг вирулент-

ным штаммом С.albicans, охарактеризована как кандпдозный энцефаломенпнгит, осложненный генерализованным кандидо-зом. Острое гнойное воспаление в ткани мозга, почках и сердце сменяется гранулематозной реакцией и фибропластическимп процессами.

Сравнение характера развивающейся инсЬекпии при заражении мышей грибами С.albicans в мозг п в вену. Интрацереб-ральное заражение мышей музейным штаммом №1 или клиническим №1755 вызывает более растянутое во времени течение инфекционного процесса и более позднюю гибель животных по сравнению с внутривенным введением этих штаммов при равных ИД. Гистологически при интрацеребральном заражении вегети-рующие грибы Candida в ткани мозга выявляются более продолжительное время. Поражение почек и миокарда выражено слабее и нарастает медленнее сравнительно с развитием процесса, вызванным внутривенным введением культуры.

Общая схема развития кандидозной инфекции мышей после введения различных штаммов С.albicans в мозг п в вену с учетом всех показателей представлена в таблице 1.

Эксперименты с введением в мозг убитой нагреванием культуры С.albicans. В связи с литературными данными о грану-лематозных изменениях, возникающих во внутренних органах (печени и селезенке) при введении мышам убитой культуры С.albicans в вену (B.JI. Белянин и др. 1984), представляли интерес опыты с введением убитой культуры С.albicans в мозг. Это позволило подойти к оценке роли антигенного компонента в ответной морфологической реакции тканей мозга и внутренних органов мышей на интрацеребральное введение.

Эксперименты с культурой, убитой нагреванием, проводили следующим образом. Взвесь грибов С.albicans №1755 нагревали на водяной бане при 100° С в течение 15 минут (гибель клеток после нагревания контролировали посевом взвеси на агаризован-ную среду Сабуро), после чего аналогично опытам с живой культурой, принятую дозу 4хЮ7кОЕ вводили в мозг 70 мышам. Гистологическое исследование ткани мозга, почек и сердца проводили в динамике до 30-х суток наблюдения.

Уже через 2 часа после введения гретой культуры в указанных биосубстратах выявлялись бесструктурные интенсивно ок-

Таблица 1

Сравнительная характеристика кандидозной инфекции мышей, вызванной введением различных

штаммов С.а1Ысапз в мозг и в вену

В мозг В вену

Клинические Музейные Клинические Музейные

Особенности течения инфекции

7 штаммов, в т. ч. №1755*3 - Снижение мессы тела; - Неврологическая симптоматика у всех животных; - Гибель 25-90% животных в течение 25суток при введении ИД =5x10® КОЕ; гибель 100% животных в течение 8-20 суток при введении ИД=2-8х10' КОЕ штамм №1 - Снижение массы тела; - Неврологическая симптоматика у некоторых животных; - Отсутствие гибели в течение 25 суток при введении ИД= 5хЮ"КОЕ; гибель 7080% животных с течение 25 суток при введении ИД -8х 107 " 2х Ю8КОЕ штамм №13 - Снижение массы тела; - Отсутствие неврологической симптоматики; - Отсутствие гибели в течение 25 суток при введении ИД= 10®"Ю®КОЕ 7 штаммов, в т. ч. №1755*) - Снижение массы тела; - Неврологическая симптоматика у некоторых животных; - Гибель 100% животных в течение 15 суток при введении ИД =5х106 КОЕ ; гибель 100% животных в течение 3-8 суток при введении ИД =2-8х107 КОЕ штамм №1 - Снижение массы тела; - Неврологическая симптоматика у единичных животных; - Гибель 80% животных в течение 25 суток при введении ИД = 2х107 КОЕ; гибель 100% животных в течение 14 суток при введении ИД =8х 107 " 2х Ю8КОЕ

Таблица 1 (продолжение)

Сравнительная характеристика кандидозной инфекции мышей, вызванной введением различных

штаммов С.albicans в мозг и в вену

В мозг В вену

Клинические Музейные Клинические Музейные

Высеваемость C.albicans из организма мышей

штамм №1755 - Выделение С.а1Ысапз из мозга, печени, селезенки, почек у всех мышей, из крови- у трети животных в течение 10 суток при введении ИД=5хЮ6КОЕ . штамм№1 - Выделение C.albicans из мозга у всех мышей, из селезенки и почек- у 40-70% животных, из крови возбудитель не выделялся в течение 10 суток при введении ИД=4х10^К0Е штамм №1755 Выделение C.albicans из мозга у 60% мишей, из почек- у 80-100% животных в течение 8-10 суток при введении ИД=5хЮ6КОЕ. Выделение возбудителя из мозга и почек у всех животных в течение срока жизни (2-4 суток) при введении ИД=4хЮ''КОЕ -

I

i-i

Таблица i (окончание)

Сравнительная характеристика кандидозной инфекции мышей, вызванной введением различных

штаммов С.albicans в мозг и в вену

В мозг В вену

Клинические Музейные Клинические Музейные

Патоморфологкческая характеристика инфекции

штамм №1755 - Множественные мелкие очаги воспаления в различных отделах головного мозга; - Длительность вегетации гриба в мозге не < 6 суток; - Развитие тяжелых поражений почек и сердца к 3-м суткам после инфицирования ИД=4Х1()7КОЕ пггамм№1 - Отсутствие множественных мелких очагов воспаления в различных отделах головного мозга; - Развитие тяжелых поражений почек после 6-х суток при введении ид -4х 107 - 2х 1<)8кОЕ - Отсутствие изменений в сердце; - Морфотинкториальные свойства гриба не изучали. штамм №1755 -Множественные мелкие очаги воспаления в различных отделах головного мозга; - Обнаружение вегетативных форм гриба в мозге до 2-3 суток. - Развитие тяжелых поражений почек и сердца уже на 1-е сутки после инфицирования ИД=4х107КОЕ. -

лз

I

Примечание. Штамм №1755 использовался в химиотерапевтических опытах;

П ff

- - изучение не проводили.

рашенные, убитые нагреванием бластоспоры гриба, сохраняющие ШИК-положительнуго реакцию до 30-х суток. Через сутки в ткани мозга появлялись единичные мелкие макрофа-гальные инфильтраты, приобретающие в дальнейшем лимфо-гис-тиоцитарный характер и сохраняющиеся до конца наблюдения. Аналогичные инфильтраты выявлялись и в почках, реже- в миокарде.

Исходя из полученных нами экпериментальных данных можно предположить, что при внутримозговом заражении С.albicans гранулематозная реакция в значительной степени обусловлена антигенными свойствами возбудителя, что согласуется с результатами В.Л.Белянина и соавт. (1984г.), полученными при введении убитой культуры С.albicans мышам в вену.

При интрацеребральном введении гретой культуры моноци-тарные гранулемы обнаруживались в ткани мозга до 30-х суток опыта и, по-видимому, не являлись специфичными. Аналогичные по виду скопления мононуклеаров выявлялись нами в те же поздние сроки и после введения мышам в мозг не смертельных доз других микроорганизмов, в частности: S.aureus, Ps.aeruginosa, Kl. pneumoniae.

2. Модель капдидозпого эицефаломепиигита мышей в хи-миотерапевтических исследованиях

Изучение активности высокоэффективных в клинике анти-микотиков на модели кандидозной инфекции мышей, вызванной интрацеребральным заражением, позволило провести сравнительную оценку этих препаратов и определить значение критериев выживаемости животных и высеваемости С.albicans из организма мышей для определения степени эффекта.

. По критерию выживаемости на данной модели определены высокоактивные полиены: амфотерицин В и его N-метилглюка-миновая соль амфоглюкамин, а также микогептин. Следует отметить, что микогептин уступал по активности амфотерицину В и амфоглюкамину только в дозах до 10 мг/кг в день, а в более высоких дозах - от 10 до 80 мг/кг в день - активность этих препаратов была практически равноценной. Синтетические антими-котики проявили меньшую активность по сравнению с полиена-мп; по показателю выживаемости наиболее активным оказался

5-фторцитозин, затем следовали кетоконазол и итраконазол. Увеличение длительности лечения кетоконазолом в дозах 40, 80 и 160 мг/кг в день и итраконазолом в дозах 40 и 80 мг/кг в день с 5 до 10 дней повышало эффективность проведенной химиотерапии обоими препаратами, а более интенсивное лечение (2 раза в день) способствовало повышению эффективности только кетоконазола.

На разработанной модели дана сравнительная оценка активности антимикотиков при введении внутрь в близких между собой терапевтических дозах в динамике до 30-х суток по показателю выживаемости (см. рис. 2). Наиболее высокую активность проявили амфотерицин В и микогептин: 90 и 83% выживших животных (результаты изучения амфоглюкамина на рисунке не представлены, т. к. в диапазоне доз от 60 до 100мг/кг препарат не изучали). 5-фторцитозин к концу опыта характеризовался средней активностью - 55% выживших животных. Кетоконазол как при 5-ти, так и 10-ти дневном лечении обеспечивал высокую выживаемость на 10-е сутки, однако к концу опыта этот показатель резко снизился до 33 и 40%. Эффект ит-раконазола также выражался, в основном, в увеличении продолжительности жизни животных, при этом 10-дневная терапия обеспечивала более высокую выживаемость животных по сравнению с 5-дневной, однако к 30-м суткам показатель выживаемости снизился до уровня 30 и 15%. Активность нистатина была близка к итраконазолу.

Результаты изучения высеваемости С.albicans из организма выживших к 30-м суткам мышей, леченных полиенами, показали, что взятые в опыт низкие дозы амфоглюкамина (от 0,1 до 1,0 мг/кг), средние дозы микогептина (от 10 до 80мг/кг) и высокие дозы амфотерицина В (от 15,6 до 500 мг/кг) не снижали об-семененность мозга: практически у всех животных к концу опыта высевалась С.albicans. Выделение возбудителя из сердца, печени, селезенки, почек мышей, леченных полиенами, к концу опыта снижалось в большинстве случаев до 0-40%. При 5-дневном лечении амфоглюкамином в минимальной дозе 0,1 мг/кг из почек С.albicans высевалась у 80% животных к концу наблюдения. Высеваемость в ранние сроки после лечения полиенами изучали только в опыте с микогептином. У всех мышей, лечен-

Сутки после заражения

Рис. 2. Сравнительная активность антимикотиков на модели кандидозного энцефаломенингита мышей 1- амфотерицин В; 62,5мг/кг х 5 дней 80мг/кг х 5 дней 100мг/кг х бдней 80мг/кг х 10 дней 80мг/кг х 5 дней 80мг/кг х 10 дней 80мг/кг х 5 дней 02,5мг/кг х 5 дней

2- микогептин;

3- 5-фторцитозин;

4- кетоконазол;

5- кетоконазол;

6- итраконазол;

7- итраконазол;

8- нистатин;

9- контроль

п=10-50 мышей в группе

ных микогептином в дозах 20, 40 и 80 мг/кг, на 5-е и 10-е сутки наблюдения выделялась С.albicans из мозга, однако по сравнению с группой контрольных (нелеченных) животных препарат снижал выделение возбудителя из внутренних органов.

Санация мозга при лечении 5-фторцитозином, кетоконазо-лом и итраконазолом, как и в опытах с полиенами, не достигалась. Только при 10-дневной терапии кетоконазолом в максимальной дозе 160 мг/кг отмечалось достоверное снижение высе-ваемости C.albicans из мозга как сразу после окончания лечения, так и в конце эксперимента у выживших животных. Так же, как и микогептин, синтетические антимикотики снижали выделение возбудителя из внутренних органов по окончании 5 и 10-дневного лечения; аналогично опытам с полиенами при лечении синтетическими антимикотиками у выживших к 30-м суткам животных наблюдалось закономерное снижение высеваемости C.albicans из внутренних органов.

Количественное определение обсемененности мозга по окончании 5-дневного лечения эффективными дозами антимико-тиков показало более четкие различия в степени активности изученных препаратов по показателю высеваемости. Независимо от интенсивности лечения (1 или 2 раза в день) и метода посева инфицированного материала (дорожкой или газоном) лучшим санирующим эффектом обладали амфотерицин В, микогептин и кетоконазол (табл.2).

Морфологическая опенка эффективности антимикотиков на данной модели проводилась по разработанным нами критериям, включающим степень воспалительной реакции в ткани мозга и почках, а также характер вегетации и морфо-тинктори-альные свойства гриба. Обосновано использование гистологических методов для сравнительной оценки препаратов в ранние сроки развития инфекции: до 5-6-х суток опыта, т.к. именно в этот период времени отмечается интенсивная вегетация гриба и формируются гранулемы, которые потом сохраняются до конца наблюдения. По данным патоморфологического исследования ре-ференс-препараты по степени антимикотического действия (от большего к меньшему) распределились в следующем порядке: амфотерицин В, микогептин, б-фторцитозин, кетоконазол и ит-раконазол. Таким образом, морфологические данные подтвер-

Таблица 2

Влияние противокандидозной терапии на выделение С. albicans из мозга мышей (заражение интрацеребрально 4x10 7 КОЕ)

Схема лечения Препарат, доза в мг/кг ПОСЕВ

до рожкой газоном

средний балл среднее число колоний (хЮ2) среднее число колоний (хю^)

1 раз в день х 5 дней внутрь Микогептин 40 1,0±0,16 19±1,5 2б±1,б

Амфотерицин В 15,6 0,8±0,22 17±1,8 21±1,2

Кетоконазол 80 1,3±0Д0 36±2,6 41±2,7

Играконазол 80 2,2±0,25 98±4,2 102±4,0

5-фторцитозин 100 2,0±0,23 78±3,0 80±3,1

Контроль 3,3±0,10 200±9,б >200 (сплошной рост)

2 раза в день х 5 дней внутрь Микогептин 40 0,8±0,20 14±0,9 -

Амфотерицин В 15,6 0,7±0Д7 15±0,8 -

Амфотерицин В 125 0,4±0,18 10±0,8 -

Кетоконазол 80 1,0±0,17 30±2,5 -

Итраконазол 40 2,4±0,22 113±4,0 -

5-фторцитозин 100 1,3±0,10 60±3,3 -

Контроль 3,7±0,16 218±8,1 -

Примечание. - посев не проводили;

п=3 мыши в группе.

ждают результаты изучения активности препаратов по показателям выживаемости и высеваемости, т.к. все предложенные нами критерии, в основном, коррелировали между собой.

Комбинированная терапия кяттдттдозного энпеФаломенинги-та мышей б-Фторпитозином и амФотерипином В. Пятидневное лечение при комбинированной терапии двумя антимикотиками из различных классов химических веществ повышало эффективность лечения и способствовало увеличению продолжительности жизни животных как на 10-е, так и 30-е сутки опыта (92 и 66%) по сравнению с монотерапией. Лечение только 5-фторцито-зином внутрь в дозе 25 мг/кг обеспечивало продолжительность жизни 70 и 42%, лечение амфотерицином В под кожу в дозе 0,1 мг/кг - 71 и 37% на 10-е и 30-е сутки соответственно. Таким образом, данная модель позволяет выявить преимущества активной комбинации препаратов по сравнению с монотерапией.

Изучение активности новых химических соединений на модели каттттттттопгтого энпеФаломенингита мышей. Изучена активность 8 оригинальных соединений из классов пирролохпнолина, тиазолидиндиова и азоиндола с антикандпдозной активностью в опытах in vitro в пределах МПК не выше 32 мкг/мл. По результатам выживаемости практически все вещества оказались неактивными или слабо активными. Только производное азоиндола ХТОС-226 в дозе 31 мг/кг приближалось по активности к итра-коназолу. Более высокая активность этого вещества по сравнению с его аналогом ХТОС-225 при равных МПК (16 мкг/мл) возможно связана с его фармакокинетикой, что является предметом особого исследования.

ВЫВОДЫ

1. Разработана химиотерапевтическая модель кандидозной инфекции мышей, вызванной интрацеребральным заражением, которую можно охарактеризовать как кандидозный энцефа-ломенингит, осложненный генерализованным кандидозом.

2. Разработанная модель позволяет воспроизвести патологический процесс, сходный с кандпдозными поражениями ткани и оболочек мозга у человека.

3. Модель кандидозного энцефаломенингита мышей отличается от модели генерализованного кандидоза, вызванного внутривенным заражением мышей грибами С. albicans, более длительным течением инфекции и более выраженными изменениями ткани и оболочек мозга.

4. Разработанная модель позволяет выявить антимикотическую активность препаратов и химических соединений, а также провести сравнительную оценку степени выявленного эффекта на основании выживаемости, продолжительности жизни животных, высеваемости С. albicans из организма мышей и данных морфологического исследования ткани мозга и внутренних органов.

5. На разработанной модели подтверждена активность известных антимикотиков; с учетом всех показателей наиболее высоким эффектом обладали полиеновые антибиотики амфоте-рицин В и микогептин, среди синтетических препаратов выявлена преимущественная активность б-фторцитозина и ке-токоназола.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Экспериментальная кандидозная инфекция мышей, вызванная интрацеребральным заражением // Антибиотики и мед. биотехнология. - 1987. - №1. - с. 48-53 (соавт. Падейская E.H., Кутчак С.Н.).

2. Химиотерапевтическая активность кетоконазола, амфоглюкамина и микогептина на модели кандидоза центральной нервной системы белых мышей // Хим. фарм. журн. - 1987.

- №8. - с. 955-959 (соавт. Падейская E.H.).

3. Сравнительная характеристика экспериментальных моделей менингоэнцефалитов белых мышей, вызванных Ps. aeruginosa, Kl. pneumoniae, S. aureus и С.albicans // Сбор, науч. трудов ВНИХФИ "Экспер. и клин, химиотерапия вирусных и бактериальных инфекций". - М., 1987. - с. 82-96 (соавт. Падейская E.H., Шипилова Л.Д., Кутчак С.Н.).

4. Экспериментальная химиотерапия бактериальных и капди-дозного гнойных менингоэнцефалитов в опытах на мышах // Там же. - с. 96-106 (соавт. Падейская E.H.).

5. Патоморфологическая оценка моделей кандидозной инфекции мышей, вызванной внутривенным и внутримозговым заражением // Антибиотики и химиотерапия. - 1990. - №11. -с. 29-34 (соавт. Скосырева А.М., Падейская E.H.).

6. Синтез и протпвомпкробная активность гидрохлоридов 2-амино-3-арилазоиндолов // Хим. фарм. журн. - 1990.- №11.

- с.34-36/ (соавт. Портнов Ю.Н., Забродняя В.Г., Булага С.Н., Филитис Л.Н., Амелькин O.IO., Силин В.А., Падейская E.H.).

7. Синтетические химиотерапевтические препараты для лечения микозов. Обзор литературы // Хим. фарм. журн. - 1993.

- №4. - с. 12-23 (соавт. Падейская E.H.).

8. Сравнительная оценка активности кетоконазола, итраконазо-ла и 5-фторцитозина на модели кандидозного энцефаломе-нингита мышей // Хим. фарм. журн. - 1994. - №3. - с. 9-13 (соавт. Скосырева А.М., Падейская E.H.).