Механизмы участия нитрозилирующего стресса в формировании клинического полиморфизма бронхиальной астмы

Козина, Ольга Владимировна

Диссертации по медицине → Патологическая физиология

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Механизмы участия нитрозилирующего стресса в формировании клинического полиморфизма бронхиальной астмы

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Козина, Ольга Владимировна Томск 2010 г.

Ученая степень: доктора медицинских наук

ВАК РФ: 14.03.03

Автореферат диссертации по медицине на тему Механизмы участия нитрозилирующего стресса в формировании клинического полиморфизма бронхиальной астмы

На правах рукописи

,„ 004600376

Козина Ольга Владимировна

МЕХАНИЗМЫ УЧАСТИЯ НИТРОЗИЛИРУЮЩЕГО СТРЕССА В ФОРМИРОВАНИИ КЛИНИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ

14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

1 ДПР 2010

Томск-2010

004600376

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН

Огородова

Людмила Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Шерстобоев Евгений Юрьевич

Степовая Елена Алексеевна

Кондакова Ирина Викторовна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук НИИ физиологии СО РАМН

Защита состоится: «_»_2010 г. на заседании диссертационного

совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан » ^^^ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Бронхиальная астма (БА) является глобальной медико-социальной проблемой [GINA, 2009]. Сегодня в мире насчитывается около 300 миллионов больных БА. Согласно прогнозам к 2025 г. этот показатель может составить 400 миллионов. В России ежегодно регистрируется около 115 тысяч впервые выявленных больных. В 2007 г. на учете состояло более 1,2 миллионов больных астмой. Эта болезнь является причиной более 2 миллионов дней временной нетрудоспособности работающего населения и 4 миллионов дней госпитализации ежегодно на территории России (по данным Федерального государственного статистического наблюдения). В структуре инвалидности удельный вес БА среди болезней органов дыхания составляет 64,9%, а в трудоспособном возрасте 80,9% [Чучалин А.Г., 2009].

Проблемы диагностики и лечения БА связаны с выраженным клиническим полиморфизмом болезни [Anderson G.P., 2008; Holgate S.T., 2008; Bue M. et al., 2009]. Выделяют аллергический и неаллергический фенотип БА, с быстрым и медленным прогрессированием снижения функции легких, с эозинофилыюй и нейтрофильной инфильтрацией, терапевтически чувствительную и терапевтически резистентную. Неблагоприятным прогнозом отличается тяжелая терапевтически резистентная БА, что связано с неконтролируемым воспалением. В последние годы предметом пристального внимания пульмонологов всего мира является проблема тяжелого, неконтролируемого, резистентного к лечению течения БА, сопровождающегося высокой частотой инвалидизации и смертности больных [Чучалин А.Г., 2007; Огородова Л.М. и соавт., 2008; Цой А.Н., Архипов В.В., 2008, Bousguet J. et al., 2007; Bateman E.D. et al., 2008]. Недостаточная эффективность базисной терапии в условиях регулярного лечения может быть ассоциирована как с генетически детерминированной кортикостероидной резистентностью, так и снижением ответа на кортикостероиды, связанным с прогрессированием воспаления и ремоделирования дыхательных путей (ДП), в значительной мере обусловливающих сохранение у пациентов симптомов бронхиальной гиперреактивности и обструкции бронхов [Черняк Б. А., Воржева И.И., 2008].

Сегодня сформулированы клинические критерии фенотипов БА, но патофизиологические аспекты их развития остаются не до конца ясными [Фассахов P.C., 2005]. В связи с этим выяснение фундаментальных аспектов клинического полиморфизма БА является актуальным, поскольку невозможно с позиции современных знаний предложить персонифицированные подходы к терапии этой болезни. Результаты последних исследований привели к пониманию важной роли оксида азота в развитии БА [Гельцер Б.И. и соавт., 2003; Brune В., 2003; Ricciardolo F.L.M. et al., 2004; Li C.Q., Wogan G.N. 2005; Gaston B. et al., 2008; Ichikawa T. et al., 2008]. Известно, что молекула оксида

азота (NO*), будучи реакционно-способным соединением, участвует в развитии БА путем прямого и непрямого вклада в аллергическое воспаление [Осипов А.Н., 2007; Giustarini D. et al., 2003]. Прямой заключается в том, что оксид азота, как сигнальная молекула, регулирует функции бронхиального дерева и является одним из релаксирующих факторов эпителиального происхождения, регулирует функцию реснитчатого эпителия, бронхиальную и легочную гемодинамику. Непрямой путь участия оксида азота в механизмах БА реализуется при помощи биохимических превращений метаболитов N0' в реакциях воспаления [Bove P.F., Vliet А., 2006]. Около 85% от общего уровня NO-содержащих веществ в организме здорового человека составляют нитраты и нитриты и примерно 10% - S-нитрозосоединения, которые рассматриваются как депо NO' [Hess D.T., 2005; Kutzia A. et al., 2006; Gaston В., 2007].

Нитриты, будучи стабильными метаболитами аэробного окисления NO', отражают как продукцию NO' (ферментативную и неферментативную), так и активность воспаления в ДП [Невзорова В.А. и соавт., 2001; Гельцер Б.И. и соавт., 2003; Филиппова Н.А. и соавт., 2006; Козырицкая Д.В. и соавт., 2007; Gookin J.L. et al., 2002; Kharitonov S.A. et al., 2004; Ricciardolo F.L.M. et al., 2004; Paredi P., 2005; Kharitonov S.A., Barnes P.J., 2006; Barnes P.J. et al., 2009; Brindicci C. et al., 2009]. В отношении других метаболитов NO' исследования находятся в стадии накопления данных и носят в основном экспериментальный характер [Saleh D. et al., 1998; Dweik R. et al., 2001; Ischiropoulos H., 2003; Celio S. et al., 2006; Ichikawa T. et al., 2008; Maarsingh H. et al., 2009].

Для обозначения механизмов развития воспаления, включающих повышенную генерацию активных форм азота (АФА) и повреждение высокоактивными соединениями азота молекулярных компонентов клетки, в работах J.S. Stamler et al. (1998), по аналогии с оксидативным стрессом (oxidative stress), предложен термин «нитрозилирующий стресс (nitrosative stress)». Изучение закономерностей нитрозилирующего стресса является сегодня одним из развивающихся научных направлений [Klatt Р., 2000; Dalle-Donne I. et al., 2005; Chiappetta G., 2009]. В частности, регуляция образования метаболитов NO* и причины нарушения депонирования NO' S-нитрозотиолами при аллергическом воспалении ДП, с точки зрения формирования нитрозилирующего стресса, до сих пор остаются малопонятными.

В развитии мультифакториальной болезни, к которой относится БА, участвуют несколько факторов (механизмов). Конечный фенотип формируется в результате взаимодействия генетических особенностей индивида и внешнесредовых факторов [Пузырев В.П., 2003]. Морфологические и молекулярные особенности, лежащие в основе этой гетерогенности, не известны. На сегодняшний день показано сцепление БА и ее клинических проявлений со многими хромосомными регионами [Фрейдин М.Б., Пузырев В.П., 2007; Schwartz D.A., 2004; Gao L., Barnes K.C., 2009]. Однако

вследствие сложного клинического фенотипа БА, полигенной модели наследования и значительной роли воздействий внешней среды в развитии и прогрессировании этого заболевания, большее число генов подверженности к астме до сих пор остается до конца не идентифицированным и требует дальнейшего исследования.

Несомненно, не только выраженность воспаления, но и генотип больного БА влияет на процессы превращения метаболитов N0' и их накопление в ДП. Однако данных об участии генов, контролирующих образование и метаболизм N0', в настоящее время недостаточно. Несмотря на значительные достижения и большое число публикаций в области респираторной медицины [Nevin B.J., Broadley K.J., 2002; Bove P.F., Vliet A., 2006; Valko M. et al., 2006; Fitzpatrick A.M., 2009; Lewis S.J., Gaston В., 2009], некоторые пути превращений NO' при БА с этих позиций не изучены вообще.

Предположительно уровень экспрессии и полиморфизм генов NO-синтаз (NOS) ассоциированы с нарушением метаболизма NO' и персистенцией аллергического воспаления в ДП, а снижение активности глутатион-Б-трансферазы (GST), участвующей в реакции редокс-циклирования глутатиона, может быть причиной нарушения депонирования NO' S-нитрозотиолами. В этой связи получение новых научных знаний о закономерностях регуляции нитрозилирующего стресса при воспалении ДП создаст теоретические предпосылки для разработки новых диагностических и лечебных технологий. Определение патогенетического значения полиморфных вариантов генов NOS и GST, закономерностей экспрессии NOS при БА позволит сформулировать принципиально иные вмешательства в патологический процесс, основанные на разработке новых фармакологических мишеней персонифицированной терапии БА.

Цель исследования:

Установить общие закономерности развития нитрозилирующего стресса при аллергическом воспалении дыхательных путей и обосновать его значение в формировании клинического полиморфизма бронхиальной астмы.

Задачи исследования:

1. Определить содержание метаболитов нитрозилирующего (нитриты, нитрозоглутатион, 3-нитротирозин) и оксидативного (малоновый диальдегид) стрессов, а также активность (супероксиддисмутаза, каталаза) и содержание (глутатион) компонентов антиоксидантной системы в дыхательных путях у больных бронхиальной астмой с разной тяжестью и в разные периоды болезни. Установить их роль в механизмах нарушения функции легких при бронхиальной астме.

2. Установить специфические тканевые и клеточные маркеры структурно-функциональных нарушений слизистой оболочки бронхов больных бронхиальной астмой в зависимости от тяжести, периода болезни и содержания

метаболитов оксида азота в дыхательных путях.

3. Изучить содержание цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-8, ФНО-а, ИНФ-у) в бронхиальном смыве у больных бронхиальной астмой и проанализировать ассоциацию количества этих цитокинов с уровнем метаболитов нитрозилирующего стресса.

4. Обосновать участие генов NOS в регуляции продукции метаболитов оксида азота и формировании аллергического воспаления дыхательных путей путем оценки уровня мРНК NOS1, NOS2, NOS3 в бронхобиоптатах больных бронхиальной астмой. Выявить взаимосвязь экспрессии генов NOS1, NOS2 и NOS3 с тяжестью бронхиальной астмы, нарушениями функции легких и содержанием метаболитов оксида азота в бронхиальном смыве и конденсате выдыхаемого воздуха.

5. Установить взаимосвязь полиморфизма 276С/Т и 186А/С гена NOS1, 343С/- и -954G/C гена NOS2, 894G/T и 260GCCC/- гена NOS3 с содержанием метаболитов оксида азота в бронхиальном смыве и конденсате выдыхаемого воздуха.

7. Разработать концепцию, раскрывающую общие закономерности развития нитрозилирующего стресса при аллергическом воспалении дыхательных путей и обосновывающую выбор молекулярных мишеней терапии клинических фенотипов бронхиальной астмы.

Научная новизна

В результате выполнения настоящей диссертационной работы получены новые теоретические знания и сформулирована концепция клинического полиморфизма бронхиальной астмы с позиции нитрозилирующего стресса. Впервые проведен системный анализ инициации, формирования и регуляции нитрозилирующего стресса и полученные результаты сопоставлены с клинико-функциональными, морфологическими и фармакологическими характеристиками болезни.

Впервые обоснована фундаментальная концепция нитрозилирующего стресса при аллергическом воспалении дыхательных путей у больных бронхиальной астмой, заключающаяся в том, что нарушение образования S-нитрозотиолов сопровождается избыточным накоплением 3-нитротирозина и нитритов в дыхательных путях и приводит к персистенции воспаления и повреждению слизистой бронхов.

Приоритетными являются данные о том, что нитрозилирующий стресс может проявляться накоплением в бронхиальном смыве преимущественно

нитритов, что ассоциировано с легкими и обратимыми симптомами болезни и обратимыми нарушениями функции легких. В случае реализации нитрозилирующего стресса преимущественно за счет повышения уровня 3-нитротирозина в бронхиальном смыве регистрируются необратимые тяжелые, резистентные к терапии симптомы и функциональные проявления болезни.

Новыми являются результаты, полученные методом дискриминантного анализа, показавшие, что среди изученных метаболитов нитрозилирующего стресса наибольший вклад в формирование клинического полиморфизма бронхиальной астмы вносят показатели уровня нитрозоглутатиона. Прогрессирование тяжести заболевания происходит при усугублении дефицита нитрозоглутатиона в бронхиальном смыве.

Впервые показано, что интенсивность нитрозилирующего стресса при воспалении на фоне бронхиальной астмы ассоциирована с развитием оксидативного стресса и с существующим дисбалансом в сторону интенсификации нитрозилирующего стресса (кратное увеличение 3-нитротирозина в сравнении с малоновым диальдегидом в бронхиальном смыве).

Абсолютно приоритетными являются данные о молекулярно-генетических механизмах нитрозилирующего стресса. Так, установлено, что аллель -954С гена индуцибельной NOS ассоциирован с формированием нитрозилирующего стресса при бронхиальной астме. Патогенетический вклад данного полиморфизма подтвержден высоким уровнем мРНК индуцибельной NOS в бронхобиоптатах больных и высоким уровнем нитритов и 3-нитротирозина в бронхиальном смыве.

В результате обобщения клинических, функциональных, генетических характеристик пациентов с привлечением многофакторного дискриминантного анализа получены приоритетные данные об ассоциации экспрессии конститутивных изоформ (нейрональной NOS, эндотелиальной NOS) в бронхиальных биоптатах с улучшением паттерна воспаления и показателей функции легких при бронхиальной астме, а в случае повышенной экспрессии гена индуцибельной NOS в ткани бронхов - с ухудшением состояния слизистой оболочки бронхов и низкими значениями показателей функции внешнего дыхания при бронхиальной астме.

Впервые установлено участие генов GST в регуляции нитрозилирующего стресса при бронхиальной астме. Показано, что для функционально неактивной комбинации GSTT1 *0/GSTMl *0 характерно нарушение содержания метаболитов оксида азота, а именно, высокий уровень 3-нитротирозина и дефицит нитрозоглутатиона в связи с ферментативным дефицитом GST. У пациентов с данной комбинацией аллелей зарегистрирован экстремально высокий уровень 3-нитротирозина и низкий уровень нитрозоглутатиона в

бронхиальном смыве. Данный молекулярный механизм является фактором риска тяжелой бронхиальной астмы в связи с необратимым характером накопления 3-нитротирозина, низким бронходилатационным потенциалом на фоне дефицита нитрозоглутатиона и плохим ответом на терапию.

Новыми являются результаты о роли нитрозилирующего стресса в ремоделировании дыхательных путей при бронхиальной астме. Так, установлено, что повышенное содержание 3-нитротирозина ассоциировано с текущим воспалением, уменьшением объемной плотности и высоты покровного эпителия, реснитчатых и бокаловидных эпителиоцитов, снижением относительного объема желез, значительным увеличением толщины базальной мембраны и относительного объема соединительной ткани. Увеличение уровня 3-нитротирозина в дыхательных путях ассоциировано с более высокой плотностью провоспалительных клеточных элементов и провоспалительных цитокинов (гистиомакрофагальные элементы, нейтрофилы, лимфоциты, ИЛ-8, ФНО-а). Таким образом, метаболит нитрозилирующего стресса 3-нитротирозин является маркером необратимого повреждения дыхательных путей.

Теоретическая и практическая значимость

Работа выполнена в области клинической патофизиологии бронхиальной астмы. В результате выполнения работы предложена концепция, раскрывающая значение нитрозилирующего стресса как базисного механизма аллергического воспаления дыхательных путей. Концепция описывает закономерности участия метаболитов оксида азота в поддержании аллергического воспаления с учетом активности воспаления (тяжесть, период болезни), тканевых и клеточных маркеров ремоделирования бронхов, цитокинопосредованной коммуникации (ТЬ1/ТЬ2-цитокины) и генотипа больного (NOS, GST).

Установленные в исследовании новые патогенетически важные молекулярные маркеры клинического полиморфизма бронхиальной астмы (генотип GSTT1 *0/GSTMl *0 генов GST, генотипы СС и GC полиморфизма -954G/C гена NOS2) с позиции функциональности NOS и GST могут стать молекулярными мишенями для разработки новых терапевтических подходов персонифицированной патогенетической терапии и новых клеточных технологий в лечении бронхиальной астмы.

Важное практическое значение имеют результаты исследования, раскрывающие взаимосвязь закономерностей развития нитрозилирующего стресса с формированием клеточных и тканевых паттернов воспаления, в том числе ассоциированных с феноменом «терапевтическая резистентность».

Результаты исследований могут быть использованы при подготовке врачей-терапевтов, клинических фармакологов, пульмонологов, иммунологов-аллергологов, педиатров.

Положения, выносимые на защиту: 1. Нитрозилирующий стресс является одним из ведущих механизмов

аллергического воспаления дыхательных путей при БА и характеризуется повышением образования нитритов (при легкой и среднетяжелой формах болезни) в бронхиальном смыве, конденсате выдыхаемого воздуха и 3-нитротирозина (при тяжелых формах болезни) в бронхиальном смыве. Преимущественное повышение нитритов в бронхиальном смыве ассоциировано с увеличением плотности эозинофильного инфильтрата в бронхобиоптатах. Преимущественное повышение 3-нитротирозина - с увеличением содержания нейтрофилов, снижением объемной плотности и высоты покровного эпителия, реснитчатых и базальных эпителиоцитов, снижением относительного объема железистой ткани, значительным увеличением толщины базальной мембраны и относительного объема соединительной ткани.

2. Участие гена NOS2 в регуляции продукции метаболитов оксида азота является базисным механизмом развития и поддержания аллергического воспаления. Уровень мРНК NOS2 снижается у больных после стандартной противовоспалительной терапии с использованием глюкокортикостероидов в течение 6 месяцев. Повышенный уровень экспрессии NOS2 ассоциирован с увеличением содержания как нитритов, так и 3-нитротирозина в бронхиальном смыве.

3. Полиморфизм генов GST ассоциирован с дефицитом нитрозоглутатиона и избирательным накоплением 3-нитротирозина в дыхательных путях при аллергическом воспалении, что является фактором риска формирования тяжелой БА в связи с развитием специфического паттерна воспаления -ремоделирования дыхательных путей. Развитие необратимого ремоделирования слизистых бронхов, ассоциированное с повышенным уровнем 3-нитротирозина и низким уровнем нитрозоглутатиона, определяет участие нитрозилирующего стресса в формировании клинического полиморфизма БА.

Апробация и реализация работы

Основные результаты работы обсуждены на XVI Европейском респираторном конгрессе (Мюнхен, 2006), представлены на конгрессе терапевтов Юга России (Ростов-на-Дону, 2009), 18 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Екатеринбург, 2008), 19 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2009), 4 национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2009), на конгрессе педиатров России (Томск, 2009), на проблемной комиссии по патофизиологии, на теоретических семинарах кафедр патофизиологии, педиатрии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава. Диссертация апробирована на заседании апробационного совета НИИ фармакологии СО РАМН (Томск, 2010). Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры биохимии и молекулярной биологии, госпитальной терапии, терапии ФУВ, педиатрии ФУВ, факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета Сибирского государственного медицинского университета, на кафедре

биологии и химии Камчатского государственного университета имени Витуса Беринга, на кафедре иммунологии и аллергологии Волгоградского государственного медицинского университета, на кафедре клинической иммунологии и аллергологии Казанского государственного медицинского университета.

В работе приводятся результаты исследований, выполненных при поддержке грантов 6-ой рамочной программы Евросоюза GABRIEL, РФФИ 09-04-99121 -р_офи и ФЦП ГК № 02.512.11.2281.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 10 полнотекстовых статей - в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 372 страницах машинописного текста, содержит 94 таблицы, 49 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, глав по материалам и методам исследования, результатам собственных исследований, обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Библиографический указатель содержит 376 источников литературы, из которых 79 отечественных и 297 зарубежных.

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В результате скрининга 282 взрослых, находящихся на амбулаторном учете в поликлиниках г. П-Камчатского, и отвечающих критериям включения, в исследование включены 142 человека: 77 здоровых и 65 больных БА. Основную часть работы составили результаты комплексного обследования 65 пациентов (13 мужчин и 52 женщины, в возрасте от 19 до 60 лет, средний возраст - 46,48± 1,79 лет), из которых у 8 диагностирована легкая, 27 -среднетяжелая, 30- тяжелая БА. На базе Камчатского краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями (главный врач - Э.А. Ломан) проведены: сбор конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ); забор периферической крови для иммунологических, биохимических, молекулярно-биологических исследований; иммунологическое обследование. На базе первой городской больницы г. П-Камчатского (главный врач -C.B. Мачидловский) проведены: клинико-функциональное обследование больных, верификация диагноза, лечение. В Камчатском краевом онкологическом диспансере (главный врач - А.М. Щанкин) проведена бронхоскопия с получением бронхоальвеолярного смыва (БС) и бронхобиоптата. Исследование биохимических маркеров предпринято на базе кафедры биохимии и молекулярной биологии медико-биологического факультета ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава г. Томска (зав. кафедрой - профессор, д.м.н. В.Ю. Серебров). Химический синтез и определение нитрозоглутатиона осуществлены на кафедре общей химии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава г. Томска (зав. кафедрой - профессор д.х.н. М.С. Юсубов). Молекулярно-генетические исследования выполнены на базе ЦНИЛ ГОУ ВПО СибГМУ

Росздрава г. Томска (зав. ЦНИЛ - профессор, д.м.н. А.Н. Байков). Морфологические исследования проведены на базе кафедры морфологии и общей патологии медико-биологического факультета ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (зав. кафедрой - профессор, д.м.н. И.В. Суходоло). Исследование выполнено на базе протокола, одобренного локальным комитетом по этике ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава г. Томска (заключение №383 от 31.01.2006). Критерии включения пациентов с бронхиальной астмой:

• Амбулаторные и стационарные пациенты

• Возраст пациентов от 19 до 60 лет

• Положительные результаты кожных аллергопроб

• Пациенты, имеющие ранее подтверждённый диагноз БА

• Тест на обратимость положительный (ОФВ] с сальбутамолом >12%, >200мл)

• Отсутствие соответствующей тяжести БА терапии в течение последнего месяца до включения в исследование

• Пациенты, не имевшие острых респираторных заболеваний, а также обострений астмы в течение предшествующих 4 недель

• Пациенты, умеющие правильно пользоваться ингалятором, пикфлоуметром, способные адекватно оценивать своё состояние, а также своевременно и правильно заполнять дневники самоконтроля.

Диагноз и тяжесть заболевания определяли в соответствии с рекомендациями международного согласительного документа вША 2006 и национальной программы лечения и профилактики БА. Критерии включения в контрольную группу

Контрольную группу составили 77 волонтеров, 27 из них включены для проведения биохимических и иммунологических исследований (4 мужчин и 23 женщины в возрасте от 19 до 60 лет, средний возраст 45,32±7,30 лет). Все они являются жителями г. П-Камчатского. Это - добровольцы без аллергических заболеваний на момент включения и в анамнезе, без гельминтозов, острых и хронических заболеваний в стадии обострения в течение трех месяцев до включения, не получавших в течение последнего месяца определенных препаратов (системные ингаляционные глюкокортикостероиды, антилейкотриеновые препараты, пролонгированные теофиллины, пролонгированные Рг - агонисты, кромогликат натрия, недокромил натрия, омализумаб), с отрицательными аллергопробами и 1§Е<100 МЕ/мл. У всех обследованных показатели функциональных тестов подтверждали отсутствие патологии органов дыхания. Для выполнения молекулярно-генетических исследований включена вся группа, из них 9 (11,7%) мужчин, 68 (88,3%) женщин, соответствующих указанным выше критериям включения.

Больные посетили клинику четыре раза (Визиты 0 - 3), волонтеры - два

раза (Визиты 0 и 1). Продолжительность исследования составила 26 недель: 2 недели - наблюдение и обследование, 24 недели - лечебный период. После назначения терапии, адекватной степени тяжести, и стабилизации клинико-функциональных показателей пациенты дважды госпитализировались для проведения фибробронхоскопии и биопсии (табл. 1).

Таблица 1

Схема обследования волонтеров и больных бронхиальной астмой

Процедуры Волонтеры Больные БА

Этап I -исходный период (4 нед.±7 дн.) Этап II -лечебный период (24 нед.±7 дн.)

Визит 0 Визит 1 Визит 0 Визит 1 Визит 2 Визит 3

Информированное согласие X X

Включение/исключение X X

Демографические данные X X

Оценка ФВД X X X

Выдача дневника • X X X X

АСТ-тест - оценка клинико-функциональных показателей X X X X

Забор периферической крови X X X

Сбор КВВ X X X

Бронхоскопия(БС) X

Бронхоскопия (биопсия, БС) X X

В настоящем исследовании лечение больных БА, вне зависимости от степени тяжести заболевания, осуществляли комбинированным препаратом Серетид - комбинация флутиказона пропионата (ФП) и сальметерола. Использовали двукратный режим дозирования. Пациенты с легкой БА получали препарат Серетид в дозе 250 мкг/сут по ФП, со среднетяжелой БА в дозе 500 мкг/сут по ФП, в случае тяжелой БА доза Серетида увеличивалась до 1000 мкг/сут по ФП. Бронхолитическую терапию короткодействующими р2-адреномиметиками использовали для купирования симптомов БА. В течение всего лечебного периода больные заполняли дневник самоконтроля и посещали клинику через 12 (Визит 2) и 24 (Визит 3) недели.

Исследование вентиляционной функции легких. Оценка функциональных тестов проведена у всех включённых в исследование. Для оценки характера нарушений функции внешнего дыхания (ФВД) и доказательства обратимости были определены: форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ), объем форсированного выдоха за 1 сек (ОФВ0 на оборудовании MasterScope (Erich

Jaeger GMBH, Германия), ПСВ - пикфлоуметрами Mini-Wright, в утренние и вечерние часы до приёма лекарственных препаратов.

Получение бронхиальных смывов (БО и биоптатов осуществляли по стандартной методике (Robinson D.S., 1998) гибким фиброскопом BF1T20 (Olympus, Япония) в условиях эндоскопического кабинета. Процедура БС осуществлялась через тубус бронхоскопа путем введения 50 мл стерильного изотонического раствора NaCl, подогретого до 37°С, с немедленной аспирацией в специальный силиконизированный контейнер (Полосухин В.В., 1995). Полученные БС были разделены на аликвоты и помещены на хранение в сосуд Дюара (жидкий азот) для последующего единовременного определения метаболитов. Измерение изучаемых показателей проводили в супернатанте БС.

Биоптаты получали со слизистой оболочки среднедолевого бронха методом щипковой биопсии, в количестве двух фрагментов: для молекулярно-биологических исследований помещали на хранение в сосуд Дюара (жидкий азот), а для патоморфологической оценки - в 10% нейтральный забуференный формалин.

Цитоморфологические методы. Из зафиксированного в 10% нейтральном забуференном формалине материала после стандартной проводки и заливки готовили срезы толщиной 5-7 мкм с последующей окраской гематоксилином и эозином (Лили Р., 1969). Качественную и количественную оценку слизистой оболочки бронхов проводили на световом микроскопе при увеличении 200,400, 900. При морфометрическом исследовании методом точечного счета сеткой Автандилова оценивали объемную плотность покровного эпителия и отдельных клеток (мм3/мм3), относительный объем соединительной ткани и желез (%). С помощью окуляр-микрометра измеряли высоту покровного эпителия, толщину базальной мембраны (мкм). Подсчет плотности различных клеточных популяций в 1 мм2 собственной пластинки слизистой оболочки проводили в графическом редакторе Adobe PhotoShop 7.0.

Получение конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ) осуществляли, используя метод, при котором пациент последовательно выдыхал через рот, в отсутствие носового дыхания (назальные клипсы), в у-образную полипропиленовую трубку с внутренним диаметром 5 мм, помещенную в полиэтиленовую пробирку, опущенную в стакан со льдом. Для предотвращения контаминации экспирата слюной (слюна содержит большие количества нитритов) полипропиленовую трубку изгибали в у-образную петлю.

Определение цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-8, ФНО-а, ИНФ-у) в сыворотке крови и БС проводили твердофазным иммуноферментным методом с использованием тест-систем «ИЛ-4-ИФА-Бест», «ИЛ-8-ИФА-Бест», «ФНО-а-ИФА-Бест», «гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ» ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск.

Определение Ig Е в сыворотке периферической крови и БС проводили одностадийным (сэндвич) твердофазным иммуноферментным анализом

тест-системами «Диаплюс» фирмы «Roche», Швейцария.

Содержание нитритов в КВВ и БС устанавливали по цветной реакции с реактивом Грисса. К 200 мкл исследуемого образца добавляли 50 мкл реактива Грисса, розовая окраска развивалась в течение 10 мин. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине волны 540 нм. Калибровочную кривую строили по известным концентрациям нитрита натрия.

Содержание малонового диальдегида (МДА1 в БС определяли спектрофотометрически по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой, оценивая количество образовавшегося триметинового комплекса по оптической плотности при длине волны 535 нм [Матвеев С.Б., 1999].

Содержание 3-нитротирозина (3-НТ) в БС определяли спектрофотометрически по реакции с соляной кислотой, оценивая максимум светопоглощения при длине волны 370 нм [Каминская Л.Ю., 2005 г].

Активность каталазы в БС определяли спектрофотометрически при 410 нм по реакции пероксида водорода с солями молибдата [Королюк М.А., 1988].

Активность супероксиддисмутазы (СОД) в БС определяли спектрофотометрически по реакции торможения аутоокисления адреналина в адренохром при длине волны 485 нм [Брусов О.С., 1978].

Содержание мочевины в сыворотке периферической крови и БС оценивали спектрофотометрически с помощью набора реагентов «Мочевина-Ново» (Вектор Бест, Новосибирск) согласно приложенной инструкции.

Содержание нитрозоглутатиона (GSNO) в БС определяли в два этапа. Первоначально провели химический синтез GSNO [Hart T.W., 1985]: навеску GSH (153,5 мг) растворяли в 1 мл воды и охлаждали до 5 С. Для подкисления среды использовали 0,25 мл 2N соляной кислоты, тщательно перемешивали. Затем порциями добавляли нитрит натрия (34,5 мг), инкубировали 40 мин при температуре 5 С. Раствор приобретал ярко-красный цвет. Полученный раствор обрабатывали охлажденным ацетоном (12 мл), перемешивали 10 мин. Образовавшиеся хлопья розового цвета выпадали в осадок. Суспензию центрифугировали 7 мин при 6000 об/мин. Надосадок выливали, к осадку добавляли последовательно холодный эфир, ацетон, эфир по 6 мл и каждый раз центрифугировали 4 мин при 6000 об/мин. Осадок розового цвета сушили под тягой. Сухой порошок в плотно закрытом флаконе, экранированный от действия солнечных лучей, хранили при температуре -3 С. На втором этапе работы строили калибровочную прямую и определяли концентрацию GSNO в БС больных БА. GSNO растворяли в физиологическом растворе по 9 контрольным точкам и измеряли светопоглощение растворов GSNO при длине волны 335 нм с помощью спектрофотрметра UNICO - 2800.

Содержание глутатиона (GSH) в БС определяли спектрофотометрически по реакции с 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислотой при длине волны 412 нм [Anderson М.Е., 1985].

Периферическую (венозную) кровь для молекулярно-биологических исследований забирали из локтевой вены, утром натощак в стерильную пробирку, содержащую 2,5 мл 3% ЭДТА, в объеме 10 мл.

Выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых проводили стандартным методом с использованием фенол-хлороформной экстракции [Lahiri D.K. etal., 1992].

Определение полиморфизма генов NO-синтаз осуществляли методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Амплификацию проводили на автоматическом амплификаторе ДТ96 (ДНК-технология, Москва), используя праймеры, специфичные к участку гена («Биосет», Новосибирск) и ферменты рестрикции («Сибэнзим», Новосибирск): NOS1 276С/Т: forward 5'-GACAAAGTTAATATATTATGCTG-3' BsmF I

reverse 5'-CCCАТАСATATGCATTTTTCC-3', NOS1 186A/C: forward 5'-CCCCACAGTGAAGAACATCTG-3' Bso I

reverse 5'-AATTCTGAGTCATCGGTGCC-3', NOS2 -954G/C: forward5-GTATGAGGTGGGGAGACTCAGAAAGC-3' AlwN I

reverse 5 '-TTCTAAATGCCAAGAGCTTCAGC-3', NOS2 343C/-: forward 5-ACCCCTGGAAGCCTACAACTGCAT-3' FriO I

reverse 5'-GCCACTGCACCCTAGCCTGTCTCA-3', NOS3 894G/T: forward 5-AAGGCAGGAGACAGTGGATG-3' NlalV

reverse 5-TCCCTTTGGTGCTACGT-3', NOS3 260GCCC/-: forward 5'- GGCAGGTGTGAGGAGCATCC-3' Fnu4HI

reverse 5'- GCCTCCGTTGTTCTCAGGTA-3' Амплификат подвергали гидролизу соответствующей рестриктазой при оптимальной для фермента температуре в течение 12-24 ч. Продукты рестрикции фракционировали в 6% полиакриламидном геле в течение 120 мин при 160 В. Фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ-свете.

Определение полиморфизма генов глутатион-8-трансфераз для генов GSTT1 и GSTM1 проводили с помощью мультиплексной ПЦР [Spurdle А.В., 2001]. Амплификацию проводили на автоматическом амплификаторе ДТ96 (ДНК-технология, Москва), используя структуру праймеров («Биосет», Новосибирск), специфичных к участку гена:

GSTM1 «нуль»-аллель: forward 5'-TGCTTCACGTGTTATGGAGGTTC 3' reverse 5' -GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3' GSTT1 «нуль»-аллель: forward 5'-GGTCATTCTGAAGGCCAAGG -3' reverse 5'-TTTGTGGACTGCTGAGGACG -3' Внутренний контроль forward 5'-CAAGTCTCCCCTCACTCCCC -3' - участок гена ER: reverse 5'- GTGCGAGTGGCTCAGTGTGT -3'

Гомозиготность по «нулевым» аллелям генов GSTT1 и GSTM1 определяли по отсутствию соответствующих фрагментов размером 131 и

114 п.н. Наличие этих фрагментов свидетельствовало о гомо- либо гетерозиготности по одной нормальной копии гена. Для внутреннего контроля амплификации определяли фрагмент гена ER размером 181 п.н.

Выделение тотальной РНК из биоптатов. Образцы ткани слизистой бронхов, полученные в ходе БФС сразу после забора помещались в эппендорфы и замораживались в жидком азоте при температуре -196°С, где они и хранились вплоть до момента выделения РНК. Выделение тотальной РНК проводили с использованием набора для выделения ДНК и РНК на колонках «QIAGEN RNA/DNA» (QIAGEN, Германия).

Определение уровня экспрессии генов NO-синтаз в бронхобиоптатах проводили в режиме реального времени (РТ-ПЦР), используя коммерческие наборы, разработанные и произведенные в ООО «Биосан» (г. Новосибирск) на амплификаторе с детекцией флуоресценции «Биомс1» (г. Томск, Россия). РТ-ПЦР выполняли с использованием следующих праймеров и зондов: мРНК NOS1: forward 5'- TTCGGCTGTGCTTTGATGGA-3',

reverse 5'- GTTGACCGACTGGATTTAGGGCTCT -3', проба: FAM-TGGCGTCCTTTGATGTT-BHQ, мРНК NOS2: forward 5'- -GGAAGCGGTAACAAAGGAGATAGAA 3',

reverse 5'- GGCAGGGCGTACCACTTTAGCT -3', проба: FAM CCTGTGTGCTTTGATGGA-BHQ, мРНК NOS3: forward 5'- GCCAAGGGCACCGGCATCACCAGGA -3',

reverse 5'- GTTACCAGCACCAGCGTCTCGT -3', проба: FAM-TTGCGTGCTTTGATCCT-BHQ.

Определение уровня экспрессии проводили путем сравнения пороговых уровней флюоресценции маркерного гена и гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ГАФДГ), уровень экспрессии которого принимался за 100%.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Statistica 5.5а (StatSoft, USA). Для нормально распределенных выборок данных вычисляли среднее арифметическое (М), ошибку среднего арифметического значения (ш); оценку статистической значимости различий средних проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Для выборок, распределение которых отличалось от нормального, рассчитывали медиану (Me) и интерквартильный размах. Для оценки статистической значимости различий показателей выборок, не подчиняющихся закону нормального распределения, использовали непараметрические критерии: Манна-Уитни (U-тест) (сопоставление двух независимых групп) и критерий Вилкоксона для парных сравнений (сопоставление двух зависимых групп). С целью обнаружения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (R). Для выявления наиболее значимых показателей, по которым наблюдались межгрупповые различия, был проведен кластерный и пошаговый дискриминантный анализ. Различия между показателями считали

статистически значимыми при значении р<0,05 [Реброва О.Ю., 2002]. Сравнение распределения частот аллелей и генотипов в группах обследованных проводили с помощью точного теста Фишера. Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с БА сравнивали частоты генотипов в группах больных и здоровых индивидов, используя критерий х2 с поправкой Йетса на непрерывность, а также с применением двустороннего точного критерия Фишера. О величине ассоциации разных генотипов (или их комбинаций) с заболеванием судили по величине отношения шансов (OR) [Pearce N., 1993], величины, показывающей, во сколько раз выше вероятность заболеть для индивида с определенным генотипом (или комбинацией генотипов). Обсуждение величин OR проводили при уровне значимости не более 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клннико-функциональиая характеристика больных бронхиальной астмой при включении в исследование

Клинические и параклинические исследования, выполнены во всех группах пациентов. Установлены значения IgE, превышающие контроль у всех больных БА, что отражает патогенетическую структуру заболевания в представленной выборке пациентов (легкая форма - 192,0 МЕ/мл (95% CI: 56,1-796,9), среднетяжелая - 184,2 МЕ/мл (95% CI: 95,0-390,0), тяжелая - 115,7 МЕ/мл (95% CI: 48,8-276,0), группа контроля - 67,21 МЕ/мл (95% CI: 41,3-81,0). Не выявлено зависимости данного показателя от тяжести болезни.

У всех обследованных больных выявлены сниженные показатели ОФВь ПСВ и ФЖЕЛ, которые статистически значимо отличались в группах больных, выявлена бронхиальная обструкция на уровне мелких (МОС25) и средних (МОС50) бронхов (табл. 2). Наиболее выраженное нарушение вентиляции легких по обструктивному типу выявлено в группе больных тяжелой астмой. Полученные результаты объяснимы, поскольку эти показатели являются критериями диагностики тяжести БА, GINA 2006.

При включении в исследование все больные имели симптомы астмы, у всех пациентов уровень ACT был ниже 19 баллов (неконтролируемая БА). Никто из пациентов в период включения в исследование не получал ИКС на регулярной основе и в объеме, соответствующем тяжести БА. Результаты мониторирования пациентов в лечебной фазе исследования показали в целом положительную клинико-функциональную динамику. Так, при легкой и среднетяжелой БА установлено уменьшение тяжести дневных, ночных симптомов (исчезновение при легкой), частоты применения скоропомощной терапии, восстановление до референтных значений показателей функции легких, значительное сокращение (до 0 при легкой) обострений, госпитализаций. У всех больных с легкой БА уровень ACT поднялся до 25 баллов, что свидетельствует о контролируемом течении болезни, при

Таблица 2

Показатели функции внешнего дыхания и ACT - теста в изучаемых группах больных бронхиальной астмой на фоне

лечения, М±ш

Показатели Больные бронхиальной астмой исходно Больные бронхиальной астмой после лечения

Легкая, п=8 Среднетяжелая, п=27 Тяжелая, п=30 Легкая, п=8 Среднетяжелая, п=27 Тяжелая, п=30

ОФВь % от должного 84,51±1,94# 74,28±1,87"# 58,87±2,29"м# 89,87±0,64 80,12±1,66" 69,77±2,69"м

ФЖЕЛ, % от должного 89,22±2,04## 80,49±2,89,## 78,24±3,20" 113,40±4,21 94,41±3,18" 73,67±3,09"м

Утренние значения пев, % 85,22±1,39# 77,49±1,8Г# 58,59*2,63"^ 99,64±2,27 82,35±1,98" 69,14±2,04"м

МОС 25, % 80,27±2,31* 76,31±1,89,## 63,20±6,47,л 88,27±1,30 82,31±1,89 63,00±4,52*д

МОС 50, % 83,23*1,94*" 72,90±5,66 60,16±5,12 93,23±1,22 79,88±2,03 65,04±1,27

МОС 75, % 90,34±3,11 86,69±6,12 80,3±4,48 96,34±1,11 91,69±6,12 77,30±5,48

АСТ-тест, балл 18,25*0,36*" 15,04±1,19,## 13,65*0,16"^ 24,50±0,19 23,92±0,18 18,18±0,34"м

Примечание:

* - р<0,05," - р<0,001 - уровень значимости различий по сравнению с пациентами с легкой астмой Л-р<0,05, лл-р<0,001 - уровень значимости различий по сравнению с пациентами со среднетяжелой астмой #-р<0,05, ##-р<0,001 - значимость различий при сравнении показателей исходно и после лечения

среднетяжелой БА у 75% больных достигнут контроль над астмой. Можно предположить, что применение стандартной противовоспалительной терапии в объемах, соответствующих тяжести БА, позволило снизить активность воспаления в ДП в связи с чем болезнь приняла бессимптомное течение.

При тяжелой БА, несмотря на в целом положительную динамику клинико-функциональных параметров на фоне стандартного лечения, ни у одного больного не достигнут контроль над болезнью (ACT менее 19), ниже референтных остались показатели функции легких, число госпитализаций и обострений не претерпело достоверно значимой динамики. С позиции клинической патофизиологии это можно объяснить или необратимым компонентом ремоделирования бронхиальной стенки или персистирующим воспалением, несмотря на высокие дозы глюкокортикостероидов, включая ИКС. По данным P.J. Barnes (1998) распространенность терапевтически резистентной БА (по определению European espiratory society (1999), при которой не удается достичь контроля над симптомами болезни, несмотря на применение адекватных доз ингаляционных кортикостероидов (ИКС) в течение не менее 6 месяцев) составляет 5-10% общей популяции больных данным заболеванием. Проблема неконтролируемого течения БА гораздо более масштабна и число таких больных достигает 60% в Европейских странах [AIRCEE, AIRE, 2004; Огородова Л.М. и соавт., 2009]. Среди причин неконтролируемого течения активно обсуждается персистенция воспаления [Bousquet J., 2000; Vignola A.M., 2000; Goleva E., 2006; Barnes P.J., 2009] с развитием нитрозилирующего стресса в ДП, закономерности формирования и влияние которого на патофизиологические проявления астмы не ясны.

2. Закономерности развития нитрозилирующего стресса при бронхиальной астме

Опираясь на ранее проведенные исследования [Nevin B.J., 2002; F.L.M. Ricciardolo et al., 2004; Paredi P., 2005; Kharitonov S.A., Barnes P.J., 2006; Bove P., 2006], нами разработана модель реакций NO', описывающая ключевые пути формирования метаболитов NO' при воспалении (рис. 1). Для подтверждения научной гипотезы участия метаболитов NO' в формировании нитрозилирующего стресса изучено содержание 3-НТ, нитритов и GSNO.

Установлено высокое содержание нитритов в КВВ и БС при БА, отражающее тяжесть и период болезни (активность воспаления). После лечения достоверное снижение уровня нитритов в КВВ и БС зарегистрировано при всех тяжестях БА, но только при легкой астме исследуемый показатель достиг контроля (рис. 2*). Учитывая, что бронходилатационный эффект связан с участием NO' через рГЦ/цГМФ - зависимые механизмы [Ballou D.P. 2002, Friebe A., Koesling D., 2003], интенсивное образование нитритов можно рассматривать и как факт, отражающий снижение доли NO*, участвующего в модуляции тонуса ДП. Установленные нами взаимосвязи подтвердили

НЬ(Ге2*)С>2 Оксигемоглобин -

НЬРе2+Дезоксигемоглобин

цигруллин

N0*2

аргинин

ГГФ

- НЬРе3* + N03'

МетгсмоглобиЕ

— - ньгно

Нитр озогемоглобин

— - ныто

Нитр обильный комплекс

♦ N0"

| Гуанкпатцикпаза -

цГМФ •»—---Г'

|Са2+, ниорелансация

N0*3

окислбнная форма

6-фосфо-КАБРН+ ггаоконат

/ Глюкоз 0-6-фосфатдегидро-геназа

Глутатиок-героксидаза Глутатиок-редуктаза

\ 74 /V

Х * 4 ЫАБР

ОБН Глутатион

Глюкозо- _ б-<Ьос6ат

2АТФ

гликолиз

ЫАОН

2 лактата — глюкоза

ОЗИО Нитр оз ог лутатио н

1соду» Си*, &

ГМДА \

Т ПОЛ, Тфагоцитарной активности Т окислительный стр есс

Т воспаление рН< 7.0

ЫО"3

Нитраты

Рис. 1. Модель реакций оксида азота при воспалении Обозначения:--------реакции, в ходе которых реагирует N0*; ■

тирозин-Ж52+ ОН 3-Нитр о тирозин

■ реакции, в ходе которых образуется N0*

возможное участие нитритов в механизмах, связанных с ограничением воздушного потока в бронхах больных БА (ОФВ1 (R=-0,53; р=0,00750), ПСВ (R=-0,54; р=0,03700)), обосновывая существенный вклад токсичных метаболитов в развитие БА.

Установлены высокий уровень 3-НТ и низкий - GSNO в БС, ассоциированные с тяжестью болезни. Содержание данных метаболитов претерпело положительную динамику на фоне лечения у всех больных, за исключением пациентов с тяжелой БА. Дефицит GSNO в данном случае может быть обусловлен рядом причин, которые сегодня обсуждаются в научной литературе. Роль S-нитрозотиолов - донировать NO', обеспечивая эффекты оксида азота на некотором расстоянии от места его синтеза. В последние годы активно обсуждается гипотеза о дефиците S-нитрозотиолов в бронхиальном секрете при БА, несмотря на высокий уровень NO' в выдыхаемом воздухе [Vliet А., 2006; Gaston В. et al., 2009; Fitzpatrick A.M., 2009; Lewis S.J., Gaston B, 2009]. Возможно, это связано с активным метаболизмом S-нитрозотиолов (с высвобождением NO') и тиолов (вследствие окислительного стресса), либо имеет место нарушение их образования с участием GSH и NO'. В рамках данного исследования обнаружено, что нарушение депонирования NO' у больных Б А ассоциировано с ухудшением параметров ФВД (ОФВ] (R=0,50; р=0,00009), ПСВ (R=0,51; р=0,00002), что подтверждает участие GSNO в механизмах бронхообструкции. Что касается значительного повышения 3-НТ в БС больных БА, выявленное в работе, следует указать, что его повышение было ассоциировано с основными показателями обструкции легких ОФВь% (R=-0,64; р=0,00008), ПСВ,% (R=-0,56; р=0,00088), ФЖЕЛ,% (R=-0,58; р=0,00047), подтверждая вклад данного метаболита в патофизиологические механизмы тяжелой БА. Предположительно повышение концентраций 3-НТ, во-первых, связано с нарастанием вентиляционной недостаточности по обструктивному типу по мере нарастания тяжести БА [Гельцер Б.И. и соавт, 2003], что приводит компенсаторному увеличению продукции NO'. Во-вторых, при более тяжелом течении заболевания в респираторном тракте регистрируется накопление АФК [Викторов И.В., 2000], реагирующих с NO' с образованием ONOO", который, кроме того, что является сильным окислителем (образование гидроксильного радикала, активация ПОЛ, повреждение митохондрий и ДНК, ингибирование каталитической, функциональной активности белков и продукции сурфактанта), способен связываться с белковыми молекулами по остаткам тирозина с образованием 3-НТ [Matata В.М., Galinanes M., 2002; Ischiropoulos H, 2003; Radi R., 2004; Dalle-Donne I. et al., 2005]. Так, группой японских исследователей представлена патофизиологическая роль ONOO" в процессах ремоделирования ткани бронхов. Ими продемонстрировано влияние пероксинитрита на продукцию фибронектина, коллагена, десмина (маркера миофибробластов) и увеличение

синтеза трансформирующего фактора роста р за счет активации NF-kB [Ichikawa T. et al., 2008].

Таким образом, y больных БА нарушено образование GSNO, сопровождающееся избыточным накоплением 3-НТ и нитритов, с формированием нитрозилирующего стресса.

В настоящее время обсуждаются различные механизмы нарушения метаболизма N0' при воспалении. Согласно данным литературы, источником нитритов является N0', образующийся как с участием ферментов NOS, так и посредством химического превращения - неферментативным путем [Осипов А.Н. и соавт, 2007; Ricciardolo F.L.M. et al., 2004; Hess D.T., 2005; Bove P.F., Vliet A., 2006; Kutzia A. et al., 2006]. Поэтому способность NO' к быстрым окислительно-восстановительным реакциям можно рассматривать как один из путей нарушения физиологической роли NO' в респираторном тракте.

Принимая во внимание «пересечение метаболических путей» NO' и Ог", являющихся первичными природными радикалами и имеющих сопоставимые сигнальные свойства и эффекторные молекулы [Valko M. et al., 2007], в работе проведена оценка интенсивности оксидативного стресса (МДА, СОД, каталаза, GSH) в ДП (рис. 3*). До лечебного периода у всех больных зарегистрировано высокое содержание МДА в БС, что отражает тяжесть заболевания. После лечения уровень данного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) достоверно снизился при легкой и среднетяжелой, достигнув значений контроля только в группе легкой БА. Установлена прямая корреляция между уровнем МДА и содержанием 3-НТ и нитритов в БС (R=0,62; р=0,00023 и R=0,67; р<0,01600, соответственно) и обратная - с уровнем GSNO (R=-0,60; р=0,00023), что указывает на взаимосвязь изучаемых явлений и патогенетические механизмы дисрегуляции, а также подтверждает что повышение образования нитритов свидетельствует об интенсивности аллергического воспаления в ДП [Dweik R.A. et al., 2001].

Усиленную внутриклеточную продукцию АФК и АФА, интенсификацию свободнорадикального окисления (СРО) в органах дыхания больных БА связывают с повреждением, последующей десквамацией эпителия ДП и развитием бронхиальной гиперреактивности [Ercan H. et al., 2006]. Известно, что несоответствие между скоростью СРО и возможностями АОЗ приводит к их ингибированию, тем более выраженному, чем тяжелее БА [Таганович А.Д. и соавт., 2002; Болевич С.Б. и соавт., 2006]. В нашем исследовании этот процесс отражался в снижении активности каталазы по мере прогрессирования тяжести БА и в полном дефиците активности СОД (возможно, это связано с ингибирующим влиянием продуктов СРО) в группе больных тяжелой БА. Аналогичные данные получены и другими исследователями [Андрушкевич В.В. и соавт., 2000; Юлдашева И.А. и соавт., 2003; Варшавский Б.Я. и соавт., 2003]. Снижение активности каталазы определяет

мкМ 15 т

5 + 0

3 4 рд„<0,0001

* 0,8

Легкая БА

0,8

73 рдо=0,0090 «

0.8 —♦

П,1 ш=0.0083 —1#

4,1

т 0,8 0,6 -- 0,4 -0,2 -- О

мкМ 12 --

ОД.

Среднетяжелая БА 0,4

Тяжелая БА

Д4

Рдо~0,0213

рд„=0,0164

шм_,

6,6 р¡,о=0,0233

Т 0,4 -- 0,3 -- 0,2 --0,1 о

мМ

210 -140 -70 -О --

Легкая БА

0,8

Среднетяжелая БА 0,8

-#-

Тяжелая БА

рдо=0,0053

4,8 а 2,0 Й

Рдо~0,0403

1 Р>6*_^

Легкая БА

Среднетяжелая БА

Тяжелая БА

рд„=0,0289

15,6

Легкая БА - Исходно

Среднетяжелая БА В После лечения

Тяжелая БА

-Контроль

Рис. 2. Сравнительная характеристика содержания в конденсате выдыхаемого воздуха - нитритов (А), в бронхиальном смыве - нитритов (Б), 3-нитротирозина (В) и нитрозоглутатиона (Г) в контрольной группе и в группах больных бронхиальной астмой, исходно и после лечения Примечание: # - р<0,01 по сравнению с контролем

Рд0 - значимость по сравнению с исходными показателями

мкМ

1,5 -1 -0,5 0

0,035 ♦—

0,035

—♦—

0,035

—^

р„о=0,0003 2^0,05

0,97 рдо=0,0385 1

1б1 #

1,55

[И

-- 0,03 0,02 + 0,01 О

Легкая БА

Среднетяжелая БА

мМ 12 т

4 + О

10,2 «—

10,2 ♦

Тяжелая БА

10,2 -♦

р ¡>о=0,0373 рдо<0,0001 В 6,6

1 73 4>2 2,5 | # 1 К £ 8>° К- 1 \ # 1 6,5

Легкая БА

мккат/л 6 -г

4 -2 -О —

2,2

Среднетяжелая БА

2,2

Тяжелая БА

2,2

0,5 #

Рдо=0,0460

-«- Рда~0,0245 4 Рьг0,0025-Ь 4.3

0,4 й| 2,7 0,1«

Легкая БА

у.е./мин'мл 32,4 90 60

Г ф

36,5

1 127,4

Среднетяжелая БА

32,4 —♦-

Тяжелая БА

32,4 —♦

69.6 ||

40,9

рдо<0,0001

30 + 20 10 О

Легкая БА I Исходно

Среднетяжелая БА ■ После лечения

Тяжелая БА -♦- Контроль

Рис. 3. Сравнительная характеристика содержания малонового диальдегида (А) и глутатиона (Б), активности каталазы (В) и супероксиддисмутазы (Г) в бронхиальном смыве в контрольной группе и в группе больных бронхиальной астмой, исходно и после лечения Примечание: # - р<0,001 по сравнению с контролем

рДо - значимость по сравнению с исходными показателями

Il II

«ь

VO «

чГ

> >

I '

Jlj

<a <N

S 5:5 S

v Я?

Макрофаги, Макрофаги, Лимфоциты, Лимфоциты, Нейтрофилы, Нейтрофилы, Эозинофилы, Эозинофилы,

исходно

после лечения

исходно

после лечения

исходно

после лечения

исходно

после лечения

Рис. 5. Сравнительная характеристика цитологических показателей слизистой оболочки бронхов больных БА

80 !

^60 «

140 -\ о.

220 -

■

I в

П il

Рдо~0,01796 ■

[*#

NOS1, исходно

I Легкая БА

NOS1, после лечения

NOS2', исходно

NOS2, после лечения

NOS3, исходно

NOS3, после лечения

■ Среднетяжелая БА 1 Тяжелая БА

Рис. 7. Сравнительная характеристика экспрессии мРНК NOS в слизистой оболочке бронхов больных БА Примечание: рдо - значимость различий по сравнению с исходными показателями; # - р<0,05 по сравнению с NOS1 (критерий Вилкоксона); * - р<0,05 по сравнению с NOS2 (критерий Вилкоксона); • — р<0,001 для пациентов легкой и тяжелой бронхиальной астмой (U-критерий Манна-Уитни); ▼ - р<0,05 для пациентов легкой и среднетяжелой бронхиальной астмой (U-критерий Манна-Уитни); ■ -р<0.001 для пациентов среднетяжелой и тяжелой бронхиальной астмой (U-критерий Манна-Уитни)

мкМ 15 -| 12 -9 -6 -3 -О -

мкМ 8 6 4 2 О

мМ 280 -

210 -

140

70 Н

мМ 8 6 4 -2 -О

ОБТТ1 * 0Ю8ТМ1 *0 7,6

3,8

[

0§ТТ1*0/08ТМ1*0

08ТТ1*0/С8ТМ1*0

ОД 0,1 #

08ТТр0/0§ТМ1*0

Легкая, до лечения Среднетяжелая, до лечения Тяжелая, до лечения

рА =0,0009 рдо=0,0029 11,6

С8ТТ1*1/08ТМ1*1

рдо=0,0191

рдо=0,0373 1,9

I О

Р»о=0,0173 6 0 4,9 —

0,9

1,7

С8ТТ1*1/08ТМ1*1

0,0038

Рдо=0,0379 76,0 54>| 5,7 1,6

вБТТ 1 * 1 /вБТМ 1 * 1

Рдо-0,0479

6,8

рдо=0,0117

3,0 3'

р ¡,„=0,0489 0,62 1,0

08ТТ1*Ш8ТМ1*1

I Легкая, после лечения I Среднетяжелая , после лечения I Тяжелая, после лечения

Рис. 9. Сравнительная характеристика содержания в конденсате выдыхаемого воздуха - нитритов (А), в бронхиальном смыве - нитритов (Б), 3-нитротирозина (В) и нитрозоглутатиона (Г) у больных бронхиальной астмой, стратифицированных в зависимости от СЗТТ1 *1/05ТМ1 */ и (лУТУ/ *()/С8ТМ] *0, исходно и после лечения Примечание: # - р<0,01 по сравнению с 6'5'777 *1/СБТМ1 *1

Рд0 - значимость по сравнению с исходными показателями

накопление в клетке перекиси водорода, изменение структуры различных биомакромолекул, повреждение мембраны клеток. Учитывая, что в присутствии Fe2+ из перекиси водорода образуется гидроксил-радикал, запускающий ПОЛ [Меньшикова Е.Б., 2006], можно ожидать его участие и в свободнорадикальных реакциях с N0'.

Что касается СОД - фермента, участвующего в реакции дисмутации супероксид аниона, необходимо отметить компенсаторное повышение его активности при среднетяжелой, и отсутствие компенсаторного повышения при тяжелой БА. Известно, что угнетение активности СОД может быть обусловлено его повреждением низкомолекулярными полипептидными

соединениями-ингибиторами и перекисью водорода [Valko М. et al., 2007].

В настоящее время обсуждается и другой механизм влияния на активность фермента - способность N0' формировать нитрозильные комплексы, вытесняя медь за счет нитрозилирования SH-групп белков, участвующих в транспорте и депонировании металлов переменной валентности [Liu S. et al., 2000]. Как показало проведенное исследование высокие уровни 3-НТ у больных в период симптоматической БА связаны со снижением активности СОД, и данные зависимости подтверждены отрицательными коэффициентами корреляции (R=-0,53; р=0,02576). Вероятно, одним из возможных механизмов повышения уровня токсичных метаболитов N0* может быть способность СОД конкурировать с N0' за Ог". Известно, что при повышении концентрации N0' способность данного фермента конкурировать с N0* за Ог' резко падает, обусловливая реакции между N0* и Ог* с образованием пероксинитрита (ONOO), а в дальнейшем - нитритов, нитратов и 3-НТ [Radi R., 2004; Ли Д.Д. и соавт., 2005; Ponczek М.В., Wachowicz В., 2005]. В связи с этим, в настоящее время высказывается предположение, что баланс NO'/ONOO" связан с действующей концентрацией NO' [Dweik R.A., 2001; Ischiropoulos Н., 2003].

Выявленный низкий уровень GSH у больных БА свидетельствует о прооксидантном сдвиге GSH—>GSSG равновесия в клетке и об окислении значительной части GSH (GSH—>GSSG). Как известно, тиол-дисульфидное равновесие является обратимым, оно играет ключевую роль в модулировании разных функций в физиологических условиях [Суханова Г.А., 2000; Fitzpatrick А.М. et al., 2009]. Иными словами, смена редокс-статуса является сигналом к перестройке метаболизма [Reynaert N.L. et al., 2005]. От внутриклеточного редокс-статуса пары GSSG/2GSH зависит как чувствительность целого ряда белков, участвующих в процессе передачи регуляторных сигналов, так и способность GSH восстанавливать самые важные антиоксиданты [Droge W., 2002]. Можно предположить, что накопление GSH по мере утяжеления БА происходит вследствие торможения его утилизации, обусловленного радикал-зависимым снижением активности

глутатионпероксидазы [Droge W., 2002]. Но, по всей видимости, выявленное

увеличение концентрации GSH по мере утяжеления БА в условиях выраженного окислительного и нитрозилирующего стрессов, свидетельствует в пользу включения компенсаторных процессов и мобилизации его функций в клетках [Valko М. et al., 2007; Fitzpatrick A.M. et al., 2009]. После курса базисной противовоспалительной терапии при легкой и среднетяжелой астме достигнута коррекция в соотношении интенсивности ПОЛ и активности АОС, уменьшилось содержание нитритов и 3-НТ, увеличился уровень GSNO. При тяжелой БА динамика содержания 3-НТ и GSNO отсутствовала. Приведенный выше фактический материал убедительно свидетельствует, что интенсивность нитрозилирующего стресса ассоциирована с развитием оксидативного стресса.

Для оценки роли метаболитов N0' в формировании клинического полиморфизма БА применили дискриминантный анализ (табл. 3; рис. 4).

Таблица 3

Диагностическая значимость метаболитов оксида азота для дифференциального

диагноза разных форм бронхиальной астмы до лечения

Показатели Формы БА

Легкая Среднетяжелая Тяжелая

Число пациентов, п 8 27 30

Правильная классификация, % 100 100 87

Лямбда Уилкса и уровень значимости для включенных в уравнение ЛДФ метаболитов N0' GSNO, мМ 0,53; р=0,00366

3-НТ, мМ 0,50; р=0,01888

Нитриты в КВВ, мкМ 0,53; р=0,00504

Лямбда Уилкса=0,44013; F=8,12; р<0,00001

Примечание: ЛДФ - линейная дискриминантная функция; Лямбда Уилкса и Р -критерии ЛДФ; р - уровень значимости для показателей, включенных в ЛДФ

4 Среднетяжелая БА Легкая БА

-3-2-1 0 1 2 3 4 Тяжелая БА Корень 1

Рис. 4. Результаты дискриминанта ого анализа патогенетического полиморфизма бронхиальной астмы с учетом метаболитов нитрозилирующего стресса

Результаты анализа подтвердили, что исследуемая совокупность больных не была однородной (р<0,00001) и достоверно значимый вклад в различия между изучаемыми группами больных внесли нитриты КВВ, 3-НТ и 08Ж). Причем, наибольшим был вклад уровня ОБЫО (лямбда Уилкса = 0,53; р=0,00366). Точность диагностики составила от 87% до 100%.

Определенно, при аллергическом воспалении ДП имеются патогенетические фенотипы, связанные с изменчивостью метаболизма N0", причем патогенетические фенотипы демонстрируют тесную ассоциацию с клиническим полиморфизмом БА.

Систематизация закономерностей нитрозилирующего стресса в дыхательных путях позволила выделить два варианта его реализации при БА:

1. Нитрозилирующий стресс с преимущественным накоплением нитритов, повышение уровня которых в БС и КВВ ассоциировано с клинико-функционалъными нарушениями у больных БА. Данный вариант нитрозилирующего стресса зарегистрирован только при легкой и среднетяжелой БА, является обратимым как с позиции биохимических, так и клинико-функциональных характеристик, что позволяет считать его механизмом терапевтически-чувствительного фенотипа болезни.

2. Нитрозилирующий стресс с преимущественным и необратимым накоплением 3-НТ, тесно коррелирующий с необратимыми нарушениями показателей функции легких, сохраняющимися даже после 6 месяцев лечения с применением системных кортикостероидов и высоких доз ИКС. Данный вариант нитрозилирующего стресса ассоциирован с формированием тяжелой неконтролируемой БА, терапевтически резистентным фенотипом.

3. Взаимосвязь нитрозилирующего стресса с иммунологическими и морфологическими параметрами воспаления при бронхиальной астме

Одной из задач исследования было выявление закономерностей и особенностей формирования структурно-функциональных нарушений в строении слизистой оболочки бронхов больных БА в зависимости от вариантов развития нитрозилирующего стресса в процессе аллергического воспаления. Для подтверждения роли метаболитов N0' в регуляции аллергического воспаления и ремоделировании бронхов при различных клинических формах БА изучено содержание ТЫ/ТЬ2 цитокинов в БС и периферической крови, проведены морфометрические и цитологические исследования слизистой оболочки бронхов больных БА до- и после лечения.

Известно, что в результате персистирующего воспаления при БА формируются специфические морфологические изменения тканей стенки бронхов, в рамках которых регистрируются процессы ремоделирования, составляющие патогенетическую основу неконтролируемого течения астмы. В данном исследовании установлены значимые различия в инфильтрации слизистой оболочки бронхов эффекторными клетками: при легкой БА

преобладали эозинофилы (р=0,01019), при среднетяжелой выявлен полиморфноклеточный инфильтрат, при тяжелой - увеличение плотности нейтрофилов (р=0,04160) (рис. 5*).

Выявленная при тяжелой БА полиморфноклеточная инфильтрация с нейтрофилией в воздухоносных путях у больных тяжелой БА объяснима высоким уровнем синтезируемого хемоаттрактанта для нейтрофилов (ИЛ-8), приводящего к рекрутированию нейтрофилов и эскалации генерации АФК и АФА [Holgate S.T., 2008; Wang Y.H., Liu Y.J., 2008]. По мнению ряда исследователей, такой тип клеточной инфильтрации может быть связан со снижением уровня рецепторов для ИЛ-5 на реснитчатом эпителии, в связи с его выраженной деструкцией, отражением применения высоких доз кортикостероидов и свидетельством инфицирования ДП. На сегодняшний день нет единого мнения о преобладании какого-либо типа эффекторных клеток в воспалительном инфильтрате, особенно в случае тяжелой БА [Barreiro Е. et al., 2004; Holgate S.T., Polosa R., 2006; Anderson G.P., 2008]. Недавние исследования патоморфологической характеристики тяжелой БА (brittle) показали преобладание в составе инфильтрата слизистой оболочки бронхов гистиомакрофагальных элементов, лимфоцитов, нейтрофилов при тяжелой БА на фоне относительно более низкого по сравнению с легкой формой болезни числа эозинофилов [Огородова Л.М и соавт., 2008]. Современные исследователи склонны считать, что преобладание нейтрофилов ассоциировано с нейтрофильной эластазой, обладающей деструктивным и ремоделирующим действием на ткани [CundallM., 2003; Simpson J.L., 2005; Аверьянов A.B., Поливанова А.Э., 2007], что приводит к необратимым структурным изменениям ткани бронхов, имеющим крайнюю степень выраженности у пациентов с тяжелой БА. С другой стороны, объяснением цитологического полиморфизма возможно является баланс про- и антиапоптотических систем, который ассоциирован с уровнем NO* [Степовая Е.А. и соавт., 2008; Brune В., 2003; Zhang X. et al., 2003; Li C.Q., Wogan G.N., 2005; Saffar A.S. et al., 2007; Shaojin D., Chang С., 2007]. Наши результаты косвенно подтверждают, что развитие апоптоза ассоциировано с уровнем NO'. После лечения ГКС (включая СКС) наибольшее количество клеток, инфильтрирующих слизистую оболочку бронха, выявлено при тяжелой БА, причем по-прежнему достоверно доминировали нейтрофилы - от 56 до 94 клеток в 1 мм2 (медиана равна 82), (р<0,00001). Изменение клеточного состава и плотности инфильтрата на фоне терапии отмечено лишь при легкой и среднетяжелой БА.

При морфометрическом анализе ткани бронхов в рамках данного исследования установлены типичные изменения (табл. 4). При легкой -отсутствие выраженных нарушений и сохранность слизистой бронхов, что нельзя сказать о тяжелой БА, где присутствовали все признаки ремоделирования: уменьшение толщины эпителиального пласта, снижение

Таблица 4

Морфометрические показатели слизистой оболочки бронхов у больных бронхиальной астмой, Ме (25%-75%)

Исследуемые параметры Больные бронхиальной астмой исходно Больные бронхиальной астмой после лечения

Легкая, п=8 Среднетяжелая, п=27 Тяжёлая, п=30 Легкая, п=8 Среднетяжелая, п=27 Тяжёлая, п=30

Объемная плотность всего покровного эпителия, мм /мм 0,37 (0,34-0,48) рт<0,00001 0,27(0,22-0,31) рл=0,00709 0,13 (0,11-0,23) Рср=0,00008 0,36 (0,30-0,42) 0,37 (0,29-0,42) 0,19(0,17-0,29)

Объемная плотность реснитчатых эпителиоцитов, мм /мм 0,12 (0,09-0,13) рт=0,00028 0,12 (0,10-0,14) 0,06 (0,04-0,08) р^О,00028 0,41 (0,40-0,43) # рт<0,00001 0,17 (0,12-0,20) # рл<0,00001 0,11 (0,06-0,12)

Объемная плотность бокаловидных эпителиоцитов, мм /мм 0,04 (0,01-0,04) 0,07 (0,06-0,09) рл=0,00013 0,04 (0,02-0,06) рф<0,00001 0,09 (0,08-0,09) # рт=0,03030 0,07 (0,05-0,09) 0,06 (0,04-0,07)

Объемная плотность базальных эпителиоцитов, мм /мм 0,11 (0,10-0,14) рт=0,01019 0,05 (0,05-0,08) рл=0,02595 0,05 (0,03-0,06) 0,23 (0,22-0,24) # рт=0,03030 0,10 (0,07-0,12) # рл=0,02564 0,07 (0,05-0,08)

Относительный объем желез, % 77,9 (72,8-79,9) рт=0,00019 63,5 (54,3-66,5) р„=0,01790 30,2(16,5-41,6) рср<0,00001 78,4 (69,7-81,1) рт=0,01400 59,5 (54,7-68,7) рл=0,04260 29,5 (24,5-42,8) рср=0,04296

Относительный объем соединительной ткани, % 21,8 (19,9-26,9) рт=0,00019 36,5 (26,8-42,7) рл=0,03224 65,3 (49,4-74,6) Рср<0,00001 18,6 (18,0-19,2) # рт=0,03030 38,0 (35,7-40,5) рл=0,00500 70,5 (63,9-75,5) р^О,04296

Высота эпителиального пласта, мкм 61,0 (59,5-65,8) рт=0,00918 68,7 (55,2-75,5) 35,6(20,6-41,7) рср=0,00006 58,6 (50,3-59,9) рт=0,00150 54,5 (48,6-66,9) 26,7 (23,5-32,5) рф=0,00365

Толщина базальной мембраны, мкм 8,6 (4,2-9,6) рт=0,01895 9,6 (5,8-10,5) 19,6 (15,6-27,4) Рср<0,00001 9,7 (4,8-10,6) рт=0,03030 10,1 (5,2-11,9) 20,9(15,2-26,7) Рср=0,01009

Примечание:

рл — уровень значимости по сравнению с легкой бронхиальной астмой (Ц-критерий Манна-Уитни)

Рср — уровень значимости различий по сравнению со среднетяжелой бронхиальной астмой (U-критерий Манна-Уитни) рт - уровень значимости различий по сравнению с тяжелой бронхиальной астмой (U-критерий Манна-Уитни) # - р<0,05 по сравнению с исходными показателями (критерий Вилкоксона)

объемной плотности покровного эпителия, уменьшение относительного объема желез, фиброз собственной пластинки, что проявлялось в увеличении относительного объема соединительной ткани и утолщении базальной мембраны. Частично эти изменения были выражены и при среднетяжелой форме болезни - снижение объемной плотности покровного эпителия с одновременным уменьшением общего числа реснитчатых и базальных клеток в сравнении с легкой. На фоне лечения, через 6 месяцев терапии ИКС, наиболее значимые улучшения структурной организации слизистой оболочки бронхов наблюдались у больных легкой БА. При среднетяжелой БА после лечения восстановилась только архитектоника эпителия, другие показатели изменились незначительно. При тяжелой БА применение адекватной степени тяжести базисной терапии не сопровождалось динамикой патоморфологических показателей слизистой оболочки бронхов.

Таким образом, у больных с разной тяжестью БА установлены отличительные паттерны воспаления с преимущественным участием тех или иных эффекторных клеток, характеризующиеся наличием (при тяжелой БА) или отсутствием (при легкой БА) выраженных признаков ремоделирования тканей стенки бронхов, что составляет основу клинического полиморфизма БА.

Структурная перестройка бронхов является ответом на сложные взаимодействия цитокинов и медиаторов, вовлеченных в воспалительный ответ при Б A [GIN А, 2006]. В настоящее время известно большое количество стимулов, способных инициировать и поддерживать процесс ремоделирования бронхов, однако отдельные факторы, влияющие на ремоделинг, продолжают изучаться [Holgate S.T., 2006; Lee J.Y. et al., 2006; Cohen L. et al., 2007].

Задачей нашего исследования была оценка вклада нитрозилирующего стресса в формирование морфологического и клинического полиморфизма БА. Корреляционный анализ установил, что накопление разных метаболитов NO* ассоциировано со специфическими изменениями морфологии. Так, преимущественное накопление 3-НТ коррелирует с уменьшением объемной плотности (R=-0,50, рдо=0,01231) и высоты покровного эпителия (R=-0,57, рдо=0,00332), реснитчатых (R=-0,55, рдо=0,02306; R=-0,72, рпослс=0,00006) и базальных эпителиоцитов (R=-0,60, рдо=0,01888; R=-0,56, Рпослс=:0,00431), снижением относительного объема желез (R=-0,57, рДо=0,00037), значительным увеличением толщины базальной мембраны (R=0,54, рдо=0,01431) и относительного объема соединительной ткани (R=0,53, рдо=0,00007) и интенсивной аккумуляцией нейтрофилов в ДП (R=0,87, рдо<0,0001; R=0,82, р1ЮСЛе<0,0001). Преимущественное накопление нитритов коррелирует с плотностью реснитчатых (R=-0,53, рдо=0,02496) и базальных эпителиоцитов (R=-0,52, рдо=0,00010) и накоплением эозинофилов (R=0,74, рдо=0,01400). Характерно, что на фоне лечения эти корреляции не изменялись, что свидетельствует о необратимости данных процессов.

Что касается ОБМО, его содержание положительно коррелировало с показателями, характеризующими сохранность эпителия - плотностью реснитчатых (11=0,62, рпосле=0,0022) и базальных эпителиоцитов (11=0,62, рпосле=0,0022) и отрицательно - с объемом соединительной ткани (Я=-0,61, рдо=0,0290), т.е. с процессами ремоделирования. В целом данный раздел исследования показал, что закономерности цитоморфологических изменений бронхиальной стенки ассоциированы с вариантами развития нитрозилирующего стресса.

Таким образом, выраженность нитрозилирующего стресса и структура его метаболитов связаны как с функциональными, так и морфологическими изменениями ДП при аллергическом воспалении. Как показали результаты дискриминантного анализа морфологические паттерны аллергического воспаления ДП коррелируют с клиническим полиморфизмом при БА.

Результаты данной работы, полученные при исследовании цитокинопосредованной межклеточной коммуникации, подтвердили важную роль Т112-воспаления, ассоциированного с повышением уровня ИЛ-4 в БС, а также значение повышенного уровня других провоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИНФ-у, ИЛ-8) в БС при БА. Известно, что изменение спектра медиаторов, секретируемых клетками бронхолегочного аппарата, лежит в основе селективного накопления разных популяций лейкоцитов в воспалительном инфильтрате [Старикова Э.А. и соавт., 2005]. Сравнительный анализ содержания цитокинов в БС показал существенные различия у пациентов в зависимости от тяжести БА с наименьшим уровнем медиаторов у больных легкой БА. Отмечена значимая разница в соотношении регуляторных молекул в БС при разной тяжести БА, что характеризует разную активность воспаления в ДП при БА. Более высокое соотношение ИЛ-4/ИНФ-у установлено при легкой БА - 5,4 (95% С1: 4,2-12,7), наименьшее - при тяжелой БА 1,53 (95% С1: 1,0-1,9). При среднетяжелой БА соотношение составило 4,2 (95% С1: 2,1-5,5). После лечения у всех больных изменилось соотношение ТЫ/ТЬ2 цитокинов. Известно, что механизм действия ГКС на клетки иммунной системы и вырабатываемые ими цитокины связан с изменением транскрипции генов, имеющих патогенетическое значение при БА [Вашеэ РЛ., 2002]. Так, при легкой БА достоверно уменьшилось содержание ИЛ-8 (р=0,01172), и значимо снизилось соотношение ИЛ-4/ИНФ-у (р=0,03569). При среднетяжелой БА после лечебного периода в 2 раза снизились уровни ИНФ-у (р=0,01387) и ИЛ-8 (р=0,00649), изменилось соотношение ИЛ-4/ИНФ-у (р=0,04159). При тяжелой БА содержание ИНФ-у уменьшилось в 3 раза (р=0,00222), уровень ФНО-а снизился в 1,6 раза (р=0,00187) с повышением соотношения ИЛ-4/ИНФ-у (р=0,000147). Однако уровень ИЛ-8 не претерпел динамики на фоне лечения.

В целом, содержание цитокинов отражало тяжесть воспаления и на фоне лечения их уровень снижался. Однако содержание ИЛ-4 и ИЛ-8 не

изменилось в рамках лечебного периода, определяя сохраняющуюся высокую клеточностъ и явления ремоделирования при тяжелой БА.

Для оценки вклада провоспалительных цитокинов в патофизиологические проявления БА проведен корреляционный анализ. Выявлены отрицательные взаимосвязи с показателями ФВД (ОФВ1; ПСВ и ФЖЕЛ) как для ИЛ-4 (R=-0,61, рдо=0,00003; R=-0,55, рдо=0,00029 и R=-0,63, рдо=0,00002, соответственно), так и для ИНФ-у (R=-0,69, рдо<0,00001; R=-0,50, рдо=0,00231 и R=-0,69, рдо<0,00001, соответственно), которые сохранились и в период ремиссии. Представленные результаты свидетельствуют о том, что по мере нарастания активности аллергического воспаления усиливается вклад Thl/Th2 провоспалительных цитокинов в функциональные характеристики астмы. Закономерными, на наш взгляд, являются выявленные ассоциации высоких значений провоспалительных цитокинов на фоне нерегулярного лечения БА с повышенным образованием токсичных метаболитов N0', усугубляющих аллергическое воспаление. С увеличением в БС концентрации ИЛ-4, ИЛ-8 и ФНО-а достоверно повышался уровень 3-НТ в БС (R=0,60, рдо=0,00015; R=0,69, рДо=0,00001 и R=0,74, рдо<0,00001, соответственно) и снижался запас GSNO (R=-0,51, рдо=0,00911; R=-0,58, рдо=0,00011 и R=-0,51, рдо=0,00086, соответственно). После лечения выявленные корреляции сохранились, лишь ослабла их взаимосвязь. Данные ассоциации подтверждают возможные патогенетические механизмы дисрегуляции метаболитов N0' (с активацией нитрозилирующего стресса), опосредованные как Thl, так и Th2 цитокинами. С другой стороны, полученные результаты раскрывают дифференцированный вклад различных метаболитов N0' БС в формирование цитокинового профиля в ДП при БА, что согласуется с данными, полученными при исследовании цитокинов сыворотки крови [Silvestri М. et al., 2006] и мокроты [Celio S. et al., 2006] больных астмой. С этой позиции развитие нашей концепции о вариантах нитрозилирующего стресса выглядит следующим образом (рис. 6):

—Ту __II вариант_

-' Г1ЕС : I '

ИЛ-4. Нитриты. ИНеПтрофклы 1 I Аэтшюфнлы OSNO Щ——¿и----- ---------------------1 .

"-----V-'

4-—-' Тяжелая БД

Легкая н среднотяжслая БД

Рис. 6. Варианты развития нитрозилирующего стресса и клинический полиморфизм бронхиальной астмы

• При 1-ом варианте (реализация нитрозилирующего стресса за счет преимущественного накопления нитритов в БС и КВВ) развитие БА характеризуется повышением уровня ИЛ-4 и эозинофильным паттерном воспаления в стенке бронхов.

• При 2-ом варианте (реализация нитрозилирующего стресса за счет преимущественного накопления 3-НТ в БС) развитие БА характеризуется, наряду с повышенным уровнем ИЛ-4, высоким содержанием ИЛ-8 и ФНО-а, соответственно нейтрофильным паттерном воспаления слизистой бронхов и морфологическими признаками необратимого ремоделирования ДП.

4. Уровень экспрессии генов NO-сннтаз в бронхобиоптатах больных бронхиальной астмой

Продукция N0" находится под генетическим контролем, поэтому участие N0' в формировании патофизиологических изменений при БА может варьировать в зависимости от дифференциальной экспрессии изоформ NOS. Для оценки связи уровня мРНК NO-синтаз с количеством синтезируемого оксида азота изучена экспрессия генов NOS в бронхобиоптатах 65 больных БА (рис. 7*). При исследовании бронхобиоптатов до и после курса противовоспалительной терапии выявлена матричная активность всех изоформ NOS. Это является свидетельством того, что все изоформы в той или иной степени участвуют в синтезе N0" в ДП, но в настоящее время обсуждаются различные механизмы их участия в развитии воспаления. Предполагается, что эффекты NOS1 и NOS3 реализуются через рГЦ/цГМФ - зависимые механизмы, тогда как эффекты N0S2 ассоциированы с S-нитрозилированием и повышением уровня N0' и его метаболитов [Hess D.T., 2005; Kutzia A. et al., 2006; Bove P.F., Vliet A., 2006; Gaston В., 2007]. Исходно нами установлена статистически значимо более выраженная экспрессия генов NOS2 и NOS3 в сравнении с NOS] при любой тяжести БА. Дифференцированная оценка уровня экспрессии генов NOS в группах пациентов с различной степенью тяжести позволила выявить ряд особенностей.

Наименьший уровень мРНК NOS1 определен при тяжелой БА - менее половины активности в сравнении с легкой, и среднетяжелой БА. Учитывая, что NOS1 известна, как нейротрансмиттер нервных синапсов, а также как регулятор физиологических процессов дыхания [Luhrs H. et al., 2002], можно предположить, что снижение экспрессии этой изоформы фермента связано с развитием бронхообструкции при тяжелой БА, обусловленным дефектностью выделения нейромедиаторов и срывом синаптической передачи.

Экспрессия NOS3 в стенке бронхов у всех больных БА, вне зависимости от тяжести, была сопоставимой. Эндотелиальиая NOS относится к конститутивным изоформам фермента, она экспрессируется постоянно и обеспечивает базальную продукцию NO* [Pechkovsky D.V. et al., 2002]. 95% активности этого фермента обеспечивается эндотелиальными клетками. Идентичная экспрессия мРНК NOS3 в ткани бронхов у больных разными формами тяжести БА и незначительный удельный вклад образующегося под влиянием активации NOS3 оксида азота в общую NO'-продуцирующую функцию ДП при БА свидетельствуют о существовании конститутивных

процессов образования эндогенного пула этой молекулы.

Противоположная ситуация зарегистрирована в отношении мРНК NOS2: при тяжелой форме болезни уровень экспрессии NOS2 до лечения оказался самым высоким. Следует отметить, что NOS2 обеспечивает наибольший удельный вес в структуре избыточной продукции N0' ДП и экспрессия данной изоформы активируется бактериальными полисахаридами и цитокинами, которые секретируются активированными макрофагами, легочными фибробластами, эозинофилами, нейтрофилами, лимфоцитами, тучными, эпителиальными клетками, гладкими мышцами сосудов [Murad F., 2006; Laprise С. et al., 2004]. Как показали результаты данной работы, увеличение экспрессии NOS2 опосредовано участием ИЛ-4 (R=0,53; рдо=0,01683), ФНО-а (R=0,61; рдо=0,00038) и ИНФ-у (R=0,51; рдо=0,00419), подтверждая регуляцию провоспалительными цитокинами ферментативной продукции NO*. Чаще всего повышенную экспрессию NOS2 в эпителиоцитах связывают с инфекцией ДП. Механизм реализации антивирусного и антибактериального действия N0' определяется S-нитрозилированием протеиназ и транскрипционных факторов, необходимых для репликации вирусов и бактерий, а также изменением структуры поверхностных рецепторов, ответственных за адгезию микроорганизмов [Mannick J.B., 2006].

Доказательством участия генов NOS в регуляции бронхиальной проходимости являются результаты анализа ассоциаций между активностью экспрессии этих генов и показателями функции легких. Так, в данном исследовании установлена прямая корреляционная связь между уровнем экспрессии нейрональной и эндотелиальной изоформ NO-синтаз в ткани бронхов и параметрами ОФВ1 (R=0,66; рдо<0,00001 и R=0,59; рдо=0,00265, соответственно). Это подтверждает изложенные выше данные о значении недостаточной экспрессии мРНК NOS! и NOS3 в дисрегуляции бронхиальной проходимости при БА. Напротив, отмечена статистически значимая зависимость между высоким уровнем экспрессии индуцибелыгой NO-синтазы и ограничением воздушного потока в легких, которая сохранилась и после курса полноценной контролирующей терапии: ОФВь% (R=-0,76, рдо<0,00001), ПСВ,% (R=-0,59, рдо=0,00065), ФЖЕЛ,% (R=-0,50; рдо=0,00459).

Учитывая необратимое снижение экспрессии NOS1 при тяжелой БА и более высокую экспрессию NOS2 до лечения у этих пациентов, можно утверждать, что данный молекулярный механизм принимает участие в дисрегуляции бронхиального тонуса и поддержании бронхообструктивного синдрома при тяжелой БА. Вероятно, участие NOS2 в регуляции бронхиальной проходимости является базисным молекулярным механизмом болезни, определяющим сущность патологических изменений в ДП - воспаления и бронхообструкции. Как реализуется этот молекулярный механизм на морфологическом уровне?

С целью уточнения вклада различных изоформ NO-синтаз в процесс ремоделирования бронхиальной стенки больных БА изучена связь морфологических признаков бронхобиоптатов у больных БА с уровнем экспрессии генов NOS. Интенсивное образование N0* эпителиоцитами ДП и клетками воспаления при участии N0S2 является ключевым событием воспаления при астме [Zhang X. et al., 2003; Dinakar С., 2004; Han X. et al., 2004]. Именно индуцибельная изоформа производит наномолярные количества NO', на несколько порядков превышающие уровень синтеза оксида азота конститутивными формами синтаз. Дополнительным подтверждением значимости экспрессии генов NOS2 явились данные о том, что экспрессия NOS2 в бронхобиоптатах у пациентов БА сопровождалась значимым утолщением базальной мембраны (R=0,52; рдо=0,03338). Эффективность лечения зависела от интенсивности снижения экспрессии мРНК NOS2, что подтверждалось тесной корреляцией уровня мРНК NOS2 с показателями ремоделирования стенки бронхов - объемом соединительной (R=0,60; рпосте=0,01007) и объемом железистой ткани (R=-0,58; рТОсле=0,01182), как свидетельство того, что даже после лечения экспрессия NOS2 поддерживает текущие процессы ремоделирования в бронхах.

Анализ связи уровня мРНК NOS и основных метаболитов NO' раскрывает дифференцированный вклад различных изоформ NOS в метаболизм этой молекулы. Оказалось, что экспрессия различных генов NOS опосредует аккумуляцию либо токсичных метаболитов N0' (в случае повышенной экспрессии мРНК NOS2), либо определяет циркуляцию устойчивых доноров NO' (в случае повышенной экспрессии мРНК NOSI и NOS3). В результате корреляционного анализа установлено наличие тесной связи между активацией в ткани бронхов NOS2 и повышением уровня 3-НТ (R=0,56; р=0,00320) и дефицитом GSNO (R=-0,54; рдо=0,00198). Выявленные связи между экспрессией генов NOS в бронхобиоптатах и маркерами воспаления -содержанием метаболитов N0' в ДП, с клиническими, функциональными проявлениями астмы, морфометрическими параметрами слизистой позволяют сделать вывод о том, что NO-синтазы вносят существенный вклад в поддержание процессов ремоделирования и бронхообструкции при БА.

Как продемонстрировано в данном разделе исследования, повышение уровня мРНК NOS2 в слизистой бронхов определяет формирование нитрозилирующего стресса, ремоделирование бронхов и развитие тяжелых неконтролируемых терапевтически резистентных форм БА.

5. Роль полиморфизма генов NO-синтаз и глутатион-8-трансфераз в развитии нитрозилирующего стресса при бронхиальной астме

Обнаруженные ассоциации метаболитов нитрозилирующего стресса с клинико-патофизиологическими характеристиками БА потребовали более детального изучения механизмов участия генов, ассоциированных с

нарушением метаболизма N0' при аллергическом воспалении ДП. Возможно, полиморфные варианты генов NOS и GST, благодаря молекулярным механизмам участия их продуктов в изменении метаболизма N0", могут влиять на вариабельность фенотипических проявлений БА.

Исследование роли полиморфизма генов NOS и G S'Г в детерминации изменчивости количественных признаков проводили, анализируя различия средних рангов показателей у носителей разных генетических вариантов.

Анализ связи полиморфизма гена N0S1 с уровнем мРНК NOS1 и содержанием метаболитов N0' в КВВ и БС. Уровень мРНК N0S1 и содержание метаболитов N0' до курса противовоспалительной терапии у пациентов с разными полиморфными вариантами 276С/Т и 186А/С гена N0S1 были сопоставимы. По завершении лечебного периода у всех пациентов, гомозиготных по аллелю А полиморфизма 186А/С гена NOS1, отмечена положительная динамика в отношении нитритов в КВВ, нитритов и GSNO в БС, но при стратификации по тяжести заболевания зарегистрировано снижение уровня нитритов в КВВ и увеличение уровня GSNO в БС только у больных легкой и среднетяжелой Б А, гомозиготных по данному аллелю (р<0,01). Таким образом, не выявлена взаимосвязь изученных полиморфизмов гена N0S1 с уровнем токсичных метаболитов N0* в КВВ и БС и развитием нитрозилирующего стресса при БА.

Анализ связи полиморфизма гена NOS2 с уровнем мРНК N0S2 и содержанием метаболитов N0' в КВВ и БС. В данном исследовании проанализированы полиморфизмы -954G/C и 343С/- гена N0S2. Изучение метаболизма N0' при различных полиморфизмах данного гена у больных БА после курса противовоспалительной терапии позволило установить, что только наличие гомозиготности по аллелям -954G и 343С гена N0S2 связано со значимым снижением уровня мРНК NOS2 (рдо=0,00189 и рдо=0,03820, соответственно), а также снижением содержания нитритов в БС и КВВ, увеличением уровня GSNO в БС (р<0,05). Это свидетельствует об эффективности кортикостероидной терапии в отношении изучаемых показателей у больных, не имеющих нуклеотидные замены (генотип GG полиморфизма -954G/C и генотип СС полиморфизма 343С/-) в промоторном регионе гена N0S2. В целом, это позволило выдвинуть, а в дальнейшем подтвердить гипотезу о вкладе гена NOS2 в формирование клинического полиморфизма БА, поэтому дальнейший анализ результатов проведен в группах больных, стратифицированных по тяжести БА. По окончании лечебного периода у больных, гомозиготных по аллелю -954G гена NOS2, при любой тяжести БА установлено значимое снижение уровня мРНК NOS2 (р=0,04850, р=0,04640 и р=0,04311 для легкой, среднетяжелой и тяжелой БА, соответственно), повлекшее за собой снижение нитритов как в КВВ (р=0,04311, р=0,00020 и р=0,00080 для легкой, среднетяжелой и тяжелой БА,

соответственно), так и в БС (р=0,04311, р=0,02411 и р=0,04858 для легкой, среднетяжелой и тяжелой БА, соответственно). Напротив, у пациентов, гомозиготных по мутантному аллелю -954С, и гетерозигот отсутствовала динамика мРНК индуцибельной NOS, и как следствие, у этих пациентов не зарегистрировано снижения 3-НТ и нитритов в БС после лечения. Это отражает персистенцию воспаления в бронхах, поддерживаемого NOS2.

Анализ связи полиморфизма гена NOS3 с уровнем мРНК NOS3 и содержанием метаболитов N0' в КВВ и БС. В данном исследовании проанализированы полиморфизмы 894G/T и 260GCCC/- гена NOS3. До лечения у пациентов с генотипом GG полиморфизма 894G/T и GCCCGCCC полиморфизма 260GCCC/- обнаружены значимо низкие уровни нитритов в БС по сравнению с гомозиготными по мутантному аллелю и гетерозиготными больными (р894т<0,00001 и ргбо^О.ОООО!, соответственно). После курса противовоспалительной терапии у всех больных, вне зависимости от полиморфизма гена NOS3, произошло значимое снижение нитритов в БС и КВВ и восстановление GSNO в БС. При распределении больных по тяжести БА и рассматриваемым полиморфизмам NOS3 не выявлено различий по содержанию метаболитов NO'.

Из обсуждаемых полиморфизмов генов NOS лишь аллельный вариант -954С индуцибельной изоформы фермента являлся предиктором, ассоциированным с неблагоприятным течением БА и ответом на противовоспалительную терапию. Пациенты с данным аллелем в отличие от больных, имеющих дикий тип, демонстрировали худшие показатели функции легких и низкую чувствительность к терапии. Возможно, это связано с тем, что точечная замена G/C в положении -954 п.о., находится в сайте связывания транскрипционного фактора NF-кВ. Ранее установлено, что экспрессия гена NOS2 ассоциирована с активацией NF-кВ [Kim К.М. et al., 2002; Shaojin D., Chang C., 2007; Fitzpatrick A.M. et al., 2009]. Использование целого ряда стимуляторов экспрессии гена NOS2 (ИНФ, ЛПС, ФНО, ИЛ-1, прооксиданты) приводит к активации NF-кВ. Ингибиторы NF-кВ блокируют экспрессию гена NOS2 и индукцию белка индуцибельной NO-сшггазы [Lin С.С. et al., 2000]. В свою очередь, активность NF-кВ регулируется NO* [Marshall Н.Е., Stamler J.S., 2002]. В физиологических условиях синтезируемые конститутивными NOS количества NO* оказывают супрессивное влияние на активность NF-кВ. Высокие количества NO*, синтезируемые NOS2, угнетают активность NF-кВ либо непосредственно, либо стабилизируя ингибитор этого важного транскрипционного фактора, обеспечивая, тем самым, механизм саморегуляции в системе NO' — NF-кВ.

Резюмировать данный раздел работы можно новыми научными данными о том, что полиморфизм -954G/C гена NOS2 участвует в формировании нитрозилирующего стресса при аллергическом воспалении ДП.

Анализ связи полиморфизма генов GSTT1 и GSTM1 с содержанием метаболитов оксида азота. Гипотезой данного раздела диссертационного исследования было предположение, что активность генов GST связана с изменением механизмов превращения метаболитов NO" и нарушением депонирования N0', и что эти нарушения обусловливают клинико-функциональные проявления БА. Учитывая, что процессы превращения ксенобиотиков в организме человека хорошо скоординированы, для оценки вклада генетических механизмов в контроль превращения метаболитов N0" и эффективность базисной противовоспалительной терапии при БА исследованы «нулевые» и нормальные генотипы генов GSTT1 и GSTM1 и их комбинации. Наиболее существенные результаты получены при анализе связей функционально активных (GSTT1 *1 и GSTM1 */) и неактивных аллелей (GSTT1*0 и GSTM1*0) генов GST и их комбинаций с интенсивностью нитрозилирующего стресса. Оценка частот генотипов генов GST позволила определить преобладание мутантных генотипов GSTT1*0 и GSTM1*0 у больных БА по сравнению со здоровыми (х2=12,69; р=0,00037 и %2=5,40; р=0,02018, соответственно). При анализе степени риска дальнейшего прогрессирования и неблагоприятного исхода БА установлены ассоциации как с GSTT1 *0 (OR=6,4), так и GSTM1*0 (OR=2,63). Это согласуется с результатами проведенных популяционных исследований, свидетельствующих о повышенной частоте нулевых аллелей генов GSTT1 и GSTM1 у больных БА [Брагина Е.Ю. и соавт., 2003; Сардарян И.С., 2009; Pemble S. et al., 1994; Brasch-Andersen С. et al., 2004; Tamer L. et al., 2004], и подтверждает, что индивидуальная чувствительность к повреждению бронхиального эпителия существенно зависит от полноценности ферментов биотрансформации ксенобиотиков 2 фазы, а именно GST, катализирующих реакцию инактивации высокоактивных генотоксичных агентов путем их конъюгации с GSH [Bolt Н.М., Their R., 2006; Sampsonas F. et al., 2007]. Дополнительно к известным данным, проведенное нами исследование и сопоставление результатов распределения частот генотипов с тяжестью БА показало, что с утяжелением БА возрастает частота функционально неактивного GSTT1*0 варианта (12,5%, 18,5% и 46,7% для легкой, среднетяжелой и тяжелой БА, соответственно) с достигнутым уровнем значимости по двухстороннему критерию Фишера для больных тяжелой БА (р=0,04889 и р<0,00001, в сравнении со среднетяжелой БА и контролем). Важное значение имеют данные, полученные при анализе комбинаций изучаемых полиморфных вариантов генов GSTT1 и GSTM1. Учитывая, что комбинация GSTTJ *0/GSTMl *0 встречалась только при тяжелой БА (/3=7,91, р=0,00490), был рассчитан относительный риск развития тяжелой БА у пациентов с двойным «нулевым» генотипом -OR=13,82 (95% CI: 1,73-296,91; р=0,00495), указывающий, что функциональную значимость в развитии воспаления может иметь не один

конкретный рисковый генотип, а их специфическая комбинация, и свидетельствующий о наличии молекулярно-генетических предпосылок (участие генов GST) для реализации предрасположенности к формированию тяжелой БА. В результате генетически обусловленного полиморфизма ферментов может возникать дефицит, либо значительное повышение содержания отдельных метаболитов NO", предопределяя особенности клинического фенотипа БА, На рис. 8 представлена электрофореграмма, демонстрирующая отсутствие амплификата GSTT1 и GSTM1 у 10 пациентов тяжелой БА.

ЕЯ вЯТТ] вБТМ!

Рис. 8. Результаты анализа конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК у больных бронхиальной астмой по генам 05777 и ОЗТМ1

Примечание: ЕЯ - контроль амплификации, 183 п.н; 6-15 - генотип СБТТ] *0/СБТМ1 *0; 2, 4, 18 - СБТТ1*1/СЗТМГЧ, 131 и 114 п.н., соответственно; 1,3,16- 05ТТ1 Ч)/СБТМ1 *1; 5- СШ1 *1ЮЗТМ1 *0

При анализе содержания метаболитов N0' в группах больных, стратифицированных по генотипам, установлено, что вне зависимости от тяжести у всех больных-носителей генотипа С8ТТ1*1 уровень С8МО был в 2 раза выше по сравнению с генотипом 05777*0 (р=0,00720). В группах с разной тяжестью БА не отмечено различий по исходному содержанию метаболитов N0' между больными с разными генотипами <75777. Однако наличие дефектного генотипа (75777*0 у больных БА, обусловливало трудности в достижении контроля над заболеванием в связи с персистирующим воспалением на фоне некоррегируемого уровня нитритов, С^МО и 3-НТ в БС при всех тяжестях БА. Что касается гена 057М/, больные БА при любом полиморфном варианте имели сопоставимые значения нитритов и С8КО, как до, так и после курса противовоспалительной терапии. При анализе содержания 3-НТ на фоне противовоспалительной терапии выявлена патологическая значимость генотипа С57М7Ю: отсутствие динамики у больных легкой (р=0,10881), среднетяжелой (р=0,71550) и тяжелой БА (р=0,345232). На рис. 9* представлено содержание метаболитов N0', стратифицированных в зависимости от двух комбинаций полиморфных вариантов генов СБТ (двойной «нулевой» и функциональный) и тяжести БА. Получены данные, подтверждающие эффективность противовоспалительной терапии в отношении

* - См. цветную вкпадку

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

всех метаболитов N0* у больных легкой, среднетяжелой и тяжелой БА, имеющих комбинацию С&ГП *1/СБТМ1 */. В случае тяжелой Б А у носителей СЗТТ! *0Ю$ТМ1 *0 - отклонения по содержанию метаболитов N0' в БС, выявленные при первоначальном обследовании, не изменяются после лечения. При сопоставлении результатов исследования метаболитов N0' у больных -носителей комбинации <75777 *0/СЕТМ1 *0 (тяжелая БА) с больными -носителями других комбинаций генотипов, у первых отмечены наиболее («экстремально») высокий уровень 3-НТ (202,5 мМ (95% С1: 81,5-300,0)) и низкий ОБЫО (0,12 мМ (95% С1: 0,10-0,46)) в БС и отсутствие динамики на фоне лечения (243 мМ (95% С1: 156,0-314,75) и 0,12 мМ (95% С1: 0,10-0,46), соответственно), подтверждая наше предположение, что от функциональной активности генов £?5Т зависит изменение путей метаболизма N0'.

В целом представленные данные, подтверждают первоначальную гипотезу данного исследования о том, что активность генов (полиморфизмы б&777 и СЗТМ1) связана с изменением путей превращения метаболитов N0", нарушением депонирования N0", морфологическими признаками ремоделирования стенки бронхов и клшшко-функциональными проявлениями БА. Возможно, именно дефект ферментативного сопровождения ОЗТ в метаболизме вБИ и ОБЫО является ведущим фактором терапевтической резистентности БА. В подтверждение этих данных ранее установлены ассоциации полиморфных вариантов «нулевых» генотипов генов (75777, СБТМ] и С8ТР1 с БА, как в отдельности, так и в комбинации друг с другом [Макарова С.И. и соавт., 2004; Батрзогш И. й а1., 2007; 1тЬос1еп М. е1 а1., 2008]. Наши результаты позволили раскрыть механизмы реализации этих ассоциаций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нитрозилирующий стресс является одним из базисных механизмов аллергического воспаления ДП, который реализуется образованием токсичных (нитриты, 3-НТ) и нетоксичных (С5КЮ) метаболитов в процессе их взаимопревращения. Повышение содержания метаболитов N0* в ДП положительно коррелирует с уровнем провоспалительных цитокинов. Продукция N0' контролируется генами N05, причем статистически значимый вклад в развитие нитрозилирующего стресса вносит ген N052 и его полиморфизм -9540/С. Специфичность регуляции нитрозилирующего стресса связана с комбинацией функционально неполноценных генотипов СЕТП *0Ю$ТМ1 *0, ассоциированной с селективным накоплением 3-НТ и выраженным дефицитом 08>Ю в ДП при аллергическом воспалении, которые сохраняются даже на фоне применения адекватных степени тяжести доз ИКС в течение 6 мес. У больных, имеющих данное сочетание генотипов, воспаление реализуется в формирование необратимого ремоделирования бронхов и развитие тяжелых терапевтически резистентных форм БА. Полученные нами результаты подтвердили первоначальную гипотезу исследования о том, что

выявленные морфологические изменения ДП, ассоциированные с нитрозилирующим стрессом, свидетельствуют о важной роли гена GST как фактора риска реализации тяжелой неконтролируемой астмы, что позволяет отнести полиморфизм GSTT1 *0/GSTMl *0 к числу новых фармакологических мишеней персонифицированной терапии Б А (рис. 10).

55 Ъ,

ь s

Si Щ

GSTT1*1/GSTM1*1

is „

о я Й

Е Ä

а о

в <в

х g

2 о

•5 С

>5 |

о SJ о

GSNO

■ел

о С

эозинофнльная инфильтрация, отсутствие выраженных нарушений и сохранность слизистой бронхов

Ч.

|ПСВ, [ФЖЕЛ, легкая, среднетяжелая терапевтически чувствительная БА

GSTT1*0/GSTM1*Q

Ч .....-

о/ ■

\ i

ONOO" Щ

ьэ

о\

(Л

I ^

недтрофильная инфильтрация, ремодештрование бронхиальной стенки

III ОФВь

ш пев, m фжел,

тяжелая БА терапевтически резист ентная неконтролируемая БА

Рис. 10. Схема участия нитрозилирующего стресса в формировании клинического полиморфизма бронхиальной астмы и фармакологические мишени для персонифицированной терапии бронхиальной астмы

ВЫВОДЫ

бронхиальном смыве больных бронхиальной астмой, что связано с тяжестью и периодом болезни. Данные изменения ассоциированы со снижением показателей функции легких: ОФВь ПСВ и развитием бронхообструкции. Оксидативный стресс характеризуется повышением уровня МДА, снижением активности СОД и каталазы в зависимости от тяжести и периода болезни. Интенсивность перекисного окисления липидов и недостаточность антаоксидантной системы ассоциированы с высоким уровнем нитритов и 3-нитротирозина.

2. Аллергическое воспаление при бронхиальной астме сопровождается формированием различных паттернов воспаления, ассоциированных с вариантом нитрозилирующего стресса. Так, повышение уровня нитритов в бронхиальном смыве и конденсате выдыхаемого воздуха прямо коррелирует с эозинофильной инфильтрацией, выраженным нарушением структуры слизистой бронхов, что чаще встречается при легкой и среднетяжелой бронхиальной астме. Значительное повышение уровня 3-нитротирозина в бронхиальном смыве прямо коррелирует с нейтрофильной инфильтрацией и выраженными признаками ремоделирования слизистой бронхов, а именно снижением объемной плотности и высоты покровного эпителия, реснитчатых и базальных эпителиоцитов, снижением относительного объема железистой ткани, значительным увеличением толщины базальной мембраны и относительного объема соединительной ткани. Данный паттерн воспаления установлен при тяжелой бронхиальной астме.

3. Участие ИЛ-4, ИЛ-8, ФНО-а, ИНФ-у в регуляции воспаления дыхательных путей характеризуется повышением их уровня при бронхиальной астме любой тяжести и в любом периоде болезни. Что касается ИНФ-у, то его уровень повышается при тяжелых формах БА и снижается после лечения. Повышение уровня 3-нитротирозина в бронхиальном смыве прямо коррелирует с повышением уровня ИЛ-8 и нейтрофильной инфильтрацией бронхов, повышение ИЛ-4 - с увеличением эозинофильной инфильтрации бронхов. Отсутствие динамики ИЛ-4 и ИЛ-8 в бронхиальном смыве в сторону снижения ассоциировано с отсутствием динамики уровня 3-нитротирозина и нитритов при тяжелой бронхиальной астме.

4. Установлена экспрессия генов всех NO-синтаз в бронхобиоптатах больных бронхиальной астмой как до, так и после лечения. Выявлена значимо низкая экспрессия NOS1 при тяжелой форме болезни и значимо высокая экспрессия NOS2. После стандартного курса терапии с применением глюкокортикостероидов значимо снижается только экспрессия NOS2, что обосновывает вклад именно этого фермента в воспаление. Повышение уровня мРНК NOS2 в бронхобиоптатах больных прямо коррелирует с содержанием 3-нитротирозина и нитритов в бронхиальном смыве, снижением ОФВь ПСВ, ФЖЕЛ.

5. Аллельный вариант -954С гена NOS2 ассоциирован с повышенным

уровнем мРНК NOS2 в бронхобноптатах больных бронхиальной астмой, высоким содержанием нитритов и 3-нитротирозина в бронхиальном смыве.

6. Аллельный вариант GSTT1*0 ассоциирован с исходно более низким уровнем нитрозоглутатиона по сравнению аллельным вариантом GSTT1*!, а также ассоциирован с отсутствием восстановления уровня нитрозоглутатиона после лечения.

7. Комбинация нефункциональных генотипов GSTT1 *0/GSTMl *0 установлена только при тяжелой бронхиальной астме. Данная комбинация ассоциирована с наиболее высоким содержанием 3-нитротирозина и наиболее низким уровнем нитрозоглутатиона в бронхиальном смыве. У больных -носителей данной комбинации генотипов не зарегистрировано динамики функциональных, биохимических и морфологических параметров после лечения, что является механизмом развития терапевтической резистентности при тяжелой астме.

8. Нитрозилирующий стресс является базисным механизмом аллергического воспаления, который реализуется образованием токсичных (нитриты, 3-нитротарозин) и нетоксичных (нитрозоглутатион) метаболитов в процессе их взаимопревращения. Повышение содержания метаболитов оксида азота в дыхательных путях положительно коррелирует с уровнем провоспалительных цитокинов. Продукция оксида азота контролируется генами NOS, причем статистически значимый вклад в развитие нитрозилирующего стресса вносит ген NOS2 и его полиморфизм -954G/C. Специфичность регуляции нитрозилирующего стресса связана с носительством комбинации функционально неполноценных генотипов GSTT1*0/GSTM1*0, ассоциированной с селективным накоплением 3-нитротирозина и выраженным дефицитом нитрозоглутатиона в дыхательных путях при аллергическом воспалении. У больных астмой, носителей данной комбинации генотипов, воспаление реализуется в формирование необратимого ремоделирования бронхов и развитие тяжелых терапевтически резистентных форм бронхиальной астмы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для диагностики причин неконтролируемого течения бронхиальной астмы на фоне базисной противовоспалительной терапии ингаляционными глюкокортикостероидами рекомендовано изучение полиморфизма генов GSTT1 и GSTM1.

2. Типирование полиморфизма -954G/C гена NOS2 рекомендуется для предсказания благоприятного и неблагоприятного течения бронхиальной астмы и ответа на противовоспалительную терапию.

3. Возможно использование 3-нитротирозина в бронхиальном смыве, как маркера интенсификации нитрозилирующего стресса и необратимого повреждения дыхательных путей при бронхиальной астме.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Features of production nitric oxide at patients with a bronchial asthma / O.V. Kozina, V.A. Egorov, E.V. Komjakova, N.N.Chusova // Abstr. 16th European Respiratory Society. Annual Congress. Munich, Germany, 2006. - P. 445.

2. Метаболиты оксида азота и их значение в патогенезе бронхиальной астмы / О.В. Козина, Л.М. Огородова, В.В. Андрушкевич и др. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - № 6. - С. 34-37.

3. Клинико-биохимические аспекты развития обструкции бронхов при бронхиальной астме / О.В. Козина, В.В. Андрушкевич, А.Э. Сазонов и др. // Пульмонология. - 2008. - № 2. - С. 52-57.

4. Козина, О.В. Образование и биологическая роль NO при аллергическом воспалении / О.В. Козина, Л.М. Огородова // Бюллетень сибирской медицины. -2009.-Т. 8,№3.-С. 95-104.

5. Козина, О.В. Вклад токсических метаболитов NO в формирование эозинофилыюго воспаления при бронхиальной астме / О.В. Козина, Л.М. Огородова, Е.А. Геренг и др. // Пульмонология. - 2009. - № 4. - С. 69-73.

6. Структурно-функциональные изменения в слизистой оболочке бронхов при хронических воспалительных заболеваниях / Е.А. Геренг, И.В. Суходоло, Р.И. Плешко, Л.М. Огородова, Е.Б. Букреева, О.В. Козина и др. // Бюллетень СО РАМН. - 2009. - № 5. - С. 35-39.

7. Роль генетических факторов в формировании тяжелой бронхиальной астмы / О.В. Козина, И.В. Петрова, А.Э. Сазонов и др. // Съезд терапевтов Юга России «Врач XXI века: сегодня и завтра», Ростов на Дону, 2009. - С. 56.

8. Огородова, Л.М. Участие метаболитов NO в регуляции аллергического воспаления и их вклад в ремоделирование слизистой оболочки бронхов у больных бронхиальной астмой / Л.М. Огородова, О.В. Козина, Е.А. Геренг // Российский аллергологический журнал. - 2009. - № 5. - С. 11-17.

9. Роль клеточных и молекулярных мишеней в формировании различных паттернов воспаления при гетерогенных фенотипах тяжелой бронхиальной астмы / Е.А. Геренг, И.В. Суходоло, Л.М. Огородова, Р.И. Плешко, Л.И. Волкова, О.В. Козина и др. // Пульмонология. - 2009. - № 5. - С. 78-82.

10. Козина, О.В. Функциональное состояние микробицидных систем при бронхиальной астме / О.В. Козина, Е.В. Комякова, В.А. Егоров // Дальневосточный медицинский журнал. - 2009. - № 4. - С. 10-13.

11. Козина, О.В. Дефицит нитрозоглутатиона при бронхиальной астме / О.В. Козина // 19 национальный конгресс по болезням органов дыхания. Москва, 2009.-С. 172.

12. Особенности экспрессии генов NOS в слизистой бронхов при бронхиальной астме / О.В. Козина, Л.М. Огородова, П.А. Селиванова и др. // Пульмонология. - 2009. - № 6. - С. 78-82.

13. Козина, О.В. Участие метаболитов NO в регуляции атопического

воспаления / О.В. Козина, JI.M. Огородова // Сборник материалов 4 национального конгресса терапевтов. Москва, 2009. - С. 121. 14. Козина, О.В. Метаболизм нитрозотиолов при аллергическом воспалении / О.В. Козина//Бюллетень СО РАМН.-2010.-№ 1.-С. 109-116.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

GINA - Global Initiative for Asthma

GSH - восстановленный глутатион

GSNO - нитрозоглутатион

GST - глутатион-8-трансфераза

GSTT1 - ген глутатион-8-трансферазы тета 1

GSTMI - ген глутатион-8-трансферазы мю 1

NO* - оксид азота

NOSI - ген нейрональной NO-синтазы

NOS2 - ген индуцибельной NO-синтазы

NOS3 - ген эндотелиальной NO-синтазы

OR - отношения шансов

3-НТ — 3-нитротирозин

АОЗ - антиоксидантная защита

ACT - тест по контролю над астмой

АФА - активные формы азота

АФК - активные формы кислорода

БА - бронхиальная астма

БС - бронхиальный смыв

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДП - дыхательные пути

ЖС - ингаляционные кортикостероиды

ИЛ - интерлейкин

ИНФ - интерферон

КВВ - конденсат выдыхаемого воздуха

МДА - малоновый диальдегид

МОС25-75 - максимальные объемные скоростные потоки выдоха на

уровне 25, 50, 75%

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ОФВ) - объем форсированного выдоха за первую секунду

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПСВ - пиковая скорость выдоха

РНК - рибонуклеиновая кислота

РТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

СОД - супероксиддисмутаза

СРО - свободнорадикальное окисление

ФВД - функция внешнего дыхания

ФЖЕЛ - форсированная жизненная емкость легких

ФНО - фактор некроза опухоли

ФП - флутиказона пропионат

Тираж 100. Заказ № 1200 Издательство «Пограничник северо-востока» тел. (4152) 43-91-43 683003, г. Петропавловск-Камчатский, ул. Набережная, 12

Оглавление диссертации Козина, Ольга Владимировна :: 2010 :: Томск

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современные представления о патогенезе бронхиальной астмы.

1.1.1. Иммунологические механизмы воспаления дыхательных путей при бронхиальной астме.

1.1.2. Воспаление и ремоделирование дыхательных путей при бронхиальной астме.

1.1.2.1. Гетерогенность бронхиальной астмы.

1.1.2.2. Персистирующее аллергическое воспаление.

1.1.2.3. Ремоделирование бронхиального дерева.

1.2. Нитрозилирующий стресс и его патофизиологические проявления в организме.

1.2.1. Образование, химические и биологические свойства оксида азота.

1.2.2. Регуляторные функции оксида азота и его метаболитов.

1.2.2.1. Участие оксида азота в патофизиологических процессах.

1.2.2.2. Участие 8-нитрозотиолов в патофизиологических процессах.

1.2.2.3. Участие 3-нитротирозина и пероксинитрита в патофизиологических процессах.

1.3. Роль синтаз оксида азота в организме.

1.3.1. Семейство синтаз оксида азота. Структура и функции.

1.3.2. Генетика синтаз оксида азота.

1.4. Роль глутатион-8-трансфераз в организме.

1.4.1. Семейство глутатион-Б-трансфераз. Структура и функции

1.4.2. Генетика глутатион-Б-трансфераз.

ГЛАВА 2. КЛИНИЧЕСКИЕ ГРУППЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕМ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Эпидемиологические методы.

2.2. Иммунологические методы.

2.2.1. Определение цитокинов в сыворотке периферической крови и бронхиальном смыве.

2.2.2. Определение иммуноглобулина Е в сыворотке периферической крови и бронхиальном смыве.

2.3. Биохимические методы.

2.3.1. Определение содержания нитритов в конденсате выдыхаемого воздуха и бронхиальном смыве.

2.3.2. Определение содержания малонового диальдегида в бронхиальном смыве

2.3.3. Определение содержания 3-нитротирозина в бронхиальном смыве.

2.3.4. Определение активности каталазы в бронхиальном смыве.

2.3.5. Определение активности супероксиддисмутазы в бронхиальном смыве

2.3.6. Определение содержания мочевины в сыворотке периферической крови и бронхиальном смыве.

2.3.7. Определение содержания нитрозоглутатиона в бронхиальном смыве.

2.3.8. Определение содержания глутатиона в бронхиальном смыве.

2.4. Специальные методы исследования.

2.4.1. Получение конденсата выдыхаемого воздуха.

2.4.2. Получение бронхиального смыва и взятие бронхобиоптатов.

2.4.3. Микроскопия и морфометрия бронхобиоптатов.

2.5. Молекулярно-биологические исследования ДНК и РНК.

2.5.1. Выделение геномной ДНК.

2.5.1.1. Определение полиморфизма генов КО-синтаз.

2.5.1.2. Определение полиморфизма генов глутатион-8-трансфераз.

2.5.2. Выделение тотальной РНК из биоптатов.

2.5.2.1. Определение уровня экспрессии генов ИО-синтаз в бронхобиоптатах

2.6. Клиническое обследование и лечение больных бронхиальной астмой.

2.7. Функциональные методы исследования функции легких.

2.7.1. Пикфлоуметрия.

2.7.2. Оценка функции внешнего дыхания.

2.8. Характеристика групп исследования.

2.8.1. Клинико-функциональная характеристика больных бронхиальной астмой.

2.8.2. Характеристика контрольной группы.

2.9. Статистические методы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Характеристика маркеров нитрозилирующего стресса в конденсате выдыхаемого воздуха и бронхиальном смыве при бронхиальной астме.

3.1.1. Содержание нитритов в дыхательных путях при бронхиальной астме

3.1.2. Содержание 3-нитротирозина в бронхиальном смыве при бронхиальной астме.

3.1.3. Содержание нитрозоглутатиона в бронхиальном смыве при бронхиальной астме.

3.2. Характеристика маркеров оксидативного стресса (МДА, GSH, каталаза, СОД) в бронхиальном смыве при бронхиальной астме.

3.3. Характеристика тканевых и клеточных маркеров слизистой оболочки бронхов больных бронхиальной астмой.

3.3.1. Результаты цитологического и морфометрического исследования бронхобиоптатов у больных бронхиальной астмой до лечения.

3.3.2. Результаты цитологического и морфометрического исследования бронхобиоптатов у больных бронхиальной астмой после лечения.

3.3.3. Результаты корреляционного анализа, характеризующие ассоциацию морфологических и биохимических изменений в дыхательных путях при бронхиальной астме.

3.3.4. Результаты многомерного статистического анализа морфологических, биохимических и основных патофизиологических проявлений бронхиальной астмы.

3.4. Содержание цитокинов (ИЛ-4, ФНО-а, ИЛ-8, ИНФ-у) и реагиновых антител в сыворотке периферической крови и бронхиальном смыве.

3.5. Характеристика экспрессии генов ]\Ю-синтаз в бронхобиоптатах больных бронхиальной астмой.

3.6. Оценка роли полиморфизма генов ЫО-синтаз (N031, N082, N083) при бронхиальной астме.

3.6.1. Особенности экспрессии мРНК нейрональной Ж)-синтазы и содержание метаболитов оксида азота у больных бронхиальной астмой с разными генатипами гена нейрональной Ж)-синтазы.

3.6.1.1. Результаты исследований гена нейрональной ИО-синтазы по локусу 276С/Т в зависимости от тяжести бронхиальной астмы.

3.6.1.2. Результаты исследований гена нейрональной ИО-синтазы по локусу 186А/С в зависимости от тяжести бронхиальной астмы.

3.6.2. Особенности экспрессии мРНК индуцибельной Ж)-синтазы и содержание метаболитов оксида азота у больных бронхиальной астмой с разнымихенатипами гена индуцибельной >Ю-синтазы.

3.6.2.1. Результаты исследований гена индуцибельной Ж)-синтазы по локусу -9540/С в зависимости от тяжести бронхиальной астмы.

3.6.2.2. Результаты исследований гена индуцибельной ЫО-синтазы по локусу 343С/- в зависимости от тяжести бронхиальной астмы.

3.6.3. Особенности экспрессии мРНК эндотелиальной Ж)-синтазы и содержание метаболитов оксида азота у больных бронхиальной астмой с разными генатипами гена эндотелиальной Ж)-синтазы.

3.6.3.1. Результаты исследований гена эндотелиальной Ж)-синтазы по локусу 8940/Т в зависимости от тяжести бронхиальной астмы.

3.6.3.2. Результаты исследований-гена эндотелиальной Ж)-синтазы по локусу 260ССОС/- в зависимости от тяжести бронхиальной астмы.

3.7. Оценка роли полиморфизма генов глутатион-8-трансфераз. (08ТТ1 и при бронхиальной астме.

3.7.1. Ассоциации генотипов и комбинаций генотипов генов ОБТИ и (З&ТМ/ с бронхиальной астмой.

3.7.2. Содержание метаболитов оксида азота у больных бронхиальной астмой с разными генотипами генов GlS'7T7 и (?£ГМ/.

3.7.3. Содержание метаболитов оксида азота у пациентов с разными генотипами генов СБТТ! и (?6ТМ/ в зависимости от тяжести бронхиальной астмы.

3.7.4. Содержание метаболитов оксида азота у пациентов с разными комбинациями генотипов генов 08ТТ1 и С5ГМ/ в зависимости от тяжести бронхиальной астмы.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Закономерности развития нитрозилирующего стресса при бронхиальной астме.

4.2. Взаимосвязь нитрозилирующего стресса с иммунологическими и морфологическими параметрами воспаления при бронхиальной астме.

4.3. Участие генов >ТО-синтаз и глутатион-Б-трансфераз в развитии нитрозилирующего стресса и формировании клинического полиморфизма бронхиальной астмы

4.3.1. Новые данные об экспрессии генов ТчЮ-синтаз в бронхобиоптатах больных бронхиальной астмой.

4.3.2. Роль полиморфизма генов ТчЮ-синтаз и глутатион-8-трансфераз в развитии нитрозилирующего стресса при бронхиальной астме.

Введение диссертации по теме "Патологическая физиология", Козина, Ольга Владимировна, автореферат

Актуальность проблемы

Бронхиальная астма (БА) является глобальной медико-социальной проблемой [GINA, 2006]. Сегодня в мире насчитывается около 300 миллионов больных БА. Согласно прогнозам к 2025 г. этот показатель может составить 400 миллионов. В России ежегодно регистрируется около 115 тысяч впервые выявленных больных. В 2007 г. на учете состояло более 1,2 миллионов больных астмой. Эта болезнь является причиной более 2 миллионов дней временной нетрудоспособности работающего населения и 4 миллионов дней госпитализации ежегодно на территории России (по данным Федерального государственного статистического наблюдения). В структуре инвалидности удельный вес БА среди болезней органов дыхания составляет 64,9%, а в трудоспособном возрасте 80,9% [78].

Проблемы диагностики и лечения БА связаны с выраженным клиническим полиморфизмом болезни [94, 169, 211, 221]. Выделяют аллергический и неаллергический фенотип БА, с быстрым и медленным прогрессированием снижения функции легких, с эозинофильной и нейтрофильной инфильтрацией, терапевтически чувствительную и терапевтически резистентную. Неблагоприятным прогнозом отличается тяжелая терапевтически резистентная БА, что связано с неконтролируемым воспалением. В последние годы предметом пристального внимания1 и тревоги пульмонологов всего мира является проблема тяжелого, фармакотерапевтически неконтролируемого, резистентного к лечению даже новыми классами лекарственных препаратов течения БА, сопровождающегося р высокой частотой инвалидизации и смертности больных [10, 70, 81, 102, 106, г

• 345]. Недостаточная эффективность базисной терапии в условиях регулярного лечения может быть ассоциирована как с генетически детерминированной кортикостероидной резистентностью, так и снижением ответа на t кортикостероиды, связанным с прогрессированием воспаления и ремоделирования дыхательных путей, в значительной мере обусловливающих сохранение у пациентов симптомов бронхиальной гиперреактивности и обструкции бронхов [75].

В настоящее время, несмотря на существование четко сформулированных клинических критериев отдельных фенотипов БА, их патофизиологические механизмы остаются до конца не ясны. В связи с этим, поиск фундаментальных аспектов клинической неоднородности когорты больных БА является высокоактуальным, поскольку невозможно сформулировать клинические рекомендации по диагностике и лечению БА без знания механизмов формирования того или иного фенотипа заболевания.

Результаты последних исследований привели к пониманию важной роли оксида азота в развитии БА [47, 223, 241, 274, 290]. Известно, что молекула оксида азота (N0'), будучи реакционно-способным соединением, участвует в развитии БА путем прямого и непрямого вклада в аллергическое воспаление [42, 273]. Прямой заключается в том, что оксид азота, как сигнальная молекула, регулирует функции бронхиального дерева и является одним из релаксирующих факторов эпителиального происхождения, регулирует функцию реснитчатого эпителия, бронхиальную и легочную гемодинамику. Непрямой путь участия оксида азота в механизмах бронхиальной астмы реализуется при помощи биохимических превращений метаболитов N0* в реакциях воспаления [119]. Около 85% от общего уровня МЭ-содержащих веществ в организме здорового человека составляют нитраты и нитриты и примерно 10% - 8-нитрозосоединения, которые рассматриваются как депо N0* [126, 297, 337]. Считается, что нитриты, являясь одними из стабильных метаболитов аэробного окисления N0", отражают как продукцию N0* (ферментативную и неферментативную), так и активность воспаления в дыхательных путях [274]. Между тем, остаются нерешенными вопросы, касающиеся причин инвертированного действия N0", хотя и считается общепризнанным факт высокой N0" реактивности дыхательных путей, а повышение концентрации N0" и нитритов рассматривается как показатель активности воспаления [17, 25, 61, 79, 121, 149, 154, 194, 268, 274]. В отношении остальных метаболитов NO* существующие исследования находятся в стадии накопления данных и носят в основном экспериментальный характер [71, 178, 216, 222, 231, 240, 282].

Для обозначения широкой группы взаимосвязанных явлений, включающих повышенную генерацию активных форм азота (АФА) и повреждение высокоактивными соединениями азота молекулярных компонентов клетки, J.S. Stamler и соавт. (1998), по аналогии с оксидативным стрессом (oxidative stress), предложили термин - нитрозилирующий стресс (nitrosative stress), изучение которого, является одним из развивающихся научных направлений [236, 271, 299, 304]. Однако, механизмы, регулирующие образование метаболитов NO" и причины нарушения депонирования NO" S-нитрозотиолами при аллергическом воспалении дыхательных путей, с точки зрения формирования нитрозилирующего стресса, до сих пор остаются малопонятными.

В развитии мультифакториальной болезни, к которым относится БА, участвуют несколько факторов (механизмов). Конечный фенотип формируется в результате взаимодействия генетических особенностей индивида и внешнесредовых факторов [52]. Морфологические и молекулярные особенности, лежащие в основе этой гетерогенности не известны. На сегодняшний день показано сцепление БА и ее клинических проявлений со многими хромосомными регионами [73, 182, 326]. Однако вследствие сложного клинического фенотипа БА, полигенной модели наследования и значительной роли воздействий внешней среды в развитии и прогрессировании этого заболевания, большее число генов* подверженности к астме до сих пор остается до конца не идентифицированным и требует дальнейшего исследования.

Несомненно, не только выраженность воспаления, но и генотип пациента, больного БА, регулирует процессы превращения метаболитов NO* и их накопление в ДП. Однако данных об участии генов, контролирующих образование и метаболизм NO", в настоящее время недостаточно. Несмотря на колоссальные достижения и огромное число публикаций в области респираторной медицины, некоторые пути превращений N0" при БА с этих позиций не изучены вообще [87, 119, 180, 268, 337].

Тем не менее, существующие на сегодняшний день данные позволяют предположить, что уровень экспрессии и полиморфизм генов NO-синтаз (NOS) может являться одним из факторов нарушения метаболизма NO', усугубляющих аллергическое воспаление дыхательных путей, а нарушение активности глутатион-8-трансферазы (GST), участвующей в реакции редокс-циклирования глутатиона, приведёт к нарушению депонирования NO' S-нитрозотиолами. В этой связи чрезвычайно важно понять особенности инициации, формирования и регуляции нитрозилирующего стресса у больных БА и определить молекулярные механизмы дефицита нитрозоглутатиона в дыхательных путях при БА и их значение в патофизиологических проявлениях заболевания.

Данный подход представляется очень важным с практической точки зрения, поскольку изучение причин гиперпродукции нитритов, исследование метаболитов N0' и их роли в клиническом полиморфизме БА, а также определение патогенетического значения полиморфных вариантов генов NOS и GST в соответствии с регуляцией экспрессии NOS способно привести к открытию принципиально иных способов вмешательства в патологический процесс, основанных на разработке новых фармакологических мишеней персонифицированной терапии БА.

Цель исследования

Задачи исследования

4. Обосновать участие генов NOS в регуляции продукции метаболитов оксида азота и формировании аллергического воспаления дыхательных путей путем оценки уровня мРНК NOSl, NOS2, NOS3 в бронхобиоптатах больных бронхиальной астмой. Выявить взаимосвязь экспрессии генов NOSl, NOS2 и NOS3 с тяжестью бронхиальной астмы, нарушениями функции легких и содержанием метаболитов оксида азота в бронхиальном смыве и конденсате выдыхаемого воздуха.

6. Выявить взаимосвязь полиморфизма GSTT1 *1/0 и GSTM1 *1/0 генов GST с уровнем метаболитов оксида азота в конденсате выдыхаемого воздуха и бронхиальном смыве, клинико-функциональными и морфологическими характеристиками бронхиальной астмы. Оценить вклад полиморфизма этих генов в контроль образования нитрозоглутатиона в дыхательных путях. 7. Разработать концепцию, раскрывающую общие закономерности развития нитрозилирующего стресса при аллергическом воспалении дыхательных путей и обосновывающую выбор молекулярных мишеней терапии клинических фенотипов бронхиальной астмы.

Научная новизна

Впервые обоснована фундаментальная концепция нитрозилирующего стресса при аллергическом воспалении дыхательных путей у больных бронхиальной астмой, заключающаяся в том, что нарушение образования 8-нитрозотиолов сопровождается избыточным накоплением 3-нитротирозина и нитритов в дыхательных путях и приводит к персистенции воспаления и повреждению слизистой бронхов.

Приоритетными являются данные о том, что нитрозилирующий стресс может проявляться накоплением в бронхиальном смыве преимущественно нитритов, что ассоциировано с легкими и обратимыми симптомами болезни и обратимыми, нарушениями функции легких. В случае реализации нитрозилирующего стресса преимущественно за счет повышения уровня 3-нитротирозина в бронхиальном смыве регистрируются необратимые тяжелые, резистентные к терапии симптомы и функциональные проявления болезни.

В результате обобщения клинических, функциональных, генетических характеристик пациентов с привлечением многофакторного дискриминантного анализа получены приоритетные данные об ассоциации экспрессии конститутивных изоформ (нейрональной NOS, эндотелиальной NOS) в бронхиальных биоптатах с улучшением паттерна воспаления и показателей функции легких при бронхиальной астме, а в случае повышенной экспрессии гена индуцибельной NOS в ткани бронхов - с ухудшением состояния слизистой оболочки бронхов и низкими значениями показателей функции' внешнего дыхания при бронхиальной астме.

Впервые установлено участие генов GST в регуляции нитрозилирующего t стресса при бронхиальной астме. Показано, что для функционально неактивной комбинации GSTT1 *0/GSTMl *0 характерно нарушение содержания метаболитов оксида азота, а именно, высокий уровень 3-нитротирозина и дефицит нитрозоглутатиона в связи с ферментативным дефицитом GST. У пациентов с данной комбинацией аллелей зарегистрирован экстремально высокий уровень 3-нитротирозина и низкий уровень нитрозоглутатиона в бронхиальном смыве. Данный молекулярный механизм является фактором риска тяжелой бронхиальной астмы в связи с необратимым характером накопления 3-нитротирозина, низким бронходилатационным потенциалом на фоне дефицита нитрозоглутатиона и плохим ответом на терапию.

Внедрение результатов исследования

Основные положения и выводы диссертационной работы, используются в учебном процессе кафедры биохимии и молекулярной биологии, госпитальной терапии, терапии ФУВ, педиатрии ФУВ, факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета Сибирского государственного медицинского университета, на кафедре биологии и химии Камчатского государственного университета имени Витуса Беринга, на кафедре иммунологии и аллергологии Волгоградского государственного медицинского университета, на кафедре клинической иммунологии и аллергологии Казанского государственного медицинского университета.

Апробация работы

Основные результаты работы обсуждены на XVI Европейском респираторном конгрессе (Мюнхен, 2006), представлены на 18 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Екатеринбург, 2008), конгрессе терапевтов Юга России (Ростов-на-Дону, 2009), 19 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2009), 4 национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2009), на конгрессе педиатров России (Томск, 2009), на проблемной комиссии по патофизиологии, на теоретических семинарах кафедр патофизиологии, педиатрии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава. Диссертация апробирована на заседании апробационного совета НИИ фармакологии СО РАМН (Томск, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 10 полнотекстовых статей, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК.

Теоретическое и практическое значение работы

Работа выполнена в области клинической патофизиологии бронхиальной астмы. В результате выполнения работы предложена концепция, раскрывающая значение нитрозилирующего стресса как базисного механизма аллергического воспаления дыхательных путей. Концепция описывает закономерности участия метаболитов оксида азота в. поддержании аллергического воспаления с учетом активности, воспаления (тяжесть, период болезни), тканевых и клеточных маркеров ремоделирования бронхов, цитокинопосредованной коммуникации (Th 1 /Th2-цитокины) и генотипа больного (NOS, GST).

Установленные в исследовании новые патогенетически важные молекулярные маркеры клинического полиморфизма бронхиальной астмы. генотип GSTT1 *0/GSTMl *0 генов GST, генотипы CC и GC полиморфизма -954G/C гена NOS2) с позиции функциональности NOS и GST могут стать молекулярными мишенями для разработки новых терапевтических подходов персонифицированной патогенетической терапии и новых клеточных технологий в лечении бронхиальной астмы.

Положения, выносимые на защиту

1. Нитрозилирующий стресс является одним из ведущих механизмов аллергического воспаления дыхательных путей при БА и характеризуется повышением образования нитритов (при легкой и среднетяжелой формах болезни) в бронхиальном смыве, конденсате выдыхаемого воздуха и 3-нитротирозина (при тяжелых формах болезни) в бронхиальном смыве. Преимущественное повышение нитритов в бронхиальном смыве ассоциировано с увеличением плотности эозинофильного инфильтрата в бронхобиоптатах. Преимущественное повышение 3-нитротирозина - с увеличением содержания нейтрофилов, снижением объемной плотности и высоты покровного эпителия, реснитчатых и базальных эпителиоцитов, снижением относительного объема железистой ткани, значительным увеличением толщины базальной мембраны и относительного объема соединительной ткани.

2. Участие гена NOS2 в регуляции продукции метаболитов, оксида азота является базисным механизмом развития и поддержания аллергического воспаления. Уровень мРНК NOS2 снижается у больных, после стандартной противовоспалительной терапии с использованием глюкокортикостероидов в течение 6 месяцев. Повышенный уровень экспрессии NOS2 ассоциирован с увеличением содержания как нитритов, так и 3-нитротирозина в бронхиальном смыве.

3. Полиморфизм генов GST ассоциирован с дефицитом нитрозоглутатиона и избирательным накоплением 3-нитротирозина в дыхательных путях при аллергическом воспалении, что является фактором риска формирования тяжелой Б А в связи с развитием специфического паттерна воспаления -ремоделирования дыхательных путей. Развитие необратимого ремоделирования слизистых бронхов, ассоциированное с повышенным уровнем 3-нитротирозина и низким уровнем нитрозоглутатиона, определяет участие нитрозилирующего стресса в формировании клинического полиморфизма БА.

Объем и структура диссертации

Заключение диссертационного исследования на тему "Механизмы участия нитрозилирующего стресса в формировании клинического полиморфизма бронхиальной астмы"

ВЫВОДЫ

1. Развитие и поддержание аллергического воспаления в дыхательных путях при бронхиальной астме связано с реализацией оксидативного и нитрозилирующего стрессов. Нитрозилирующий стресс характеризуется повышением уровней 3-нитротирозина в бронхиальном смыве и нитритов в бронхиальном смыве, конденсате выдыхаемого воздуха, снижением содержания нитрозоглутатиона в бронхиальном смыве больных бронхиальной астмой, что связано с тяжестью и периодом болезни. Данные изменения ассоциированы со снижением показателей функции легких: ОФВь ПСВ и развитием бронхообструкции. Оксидативный стресс характеризуется повышением уровня МДА, снижением активности СОД и каталазы в зависимости от тяжести и периода болезни. Интенсивность перекисного окисления липидов и недостаточность антиоксидантной системы ассоциированы с высоким уровнем нитритов и 3-нитротирозина.

5. Аллельный вариант -954С гена NOS2 ассоциирован с повышенным уровнем мРНК NOS2 в бронхобиоптатах больных бронхиальной астмой, высоким содержанием нитритов и 3-нитротирозина в бронхиальном смыве.

7. Комбинация нефункциональных генотипов GSTT1*0/GSTM1*0 установлена только при тяжелой бронхиальной астме. Данная комбинация ассоциирована с наиболее высоким содержанием 3-нитротирозина и наиболее низким уровнем нитрозоглутатиона в бронхиальном смыве. У больных -носителей данной комбинации генотипов не зарегистрировано динамики функциональных, биохимических и морфологических параметров после лечения, что является механизмом развития терапевтической резистентности при тяжелой астме.

8. Нитрозилирующий стресс является базисным механизмом аллергического воспаления, который реализуется образованием токсичных (нитриты, 3-нитротирозин) и нетоксичных (нитрозоглутатион) метаболитов в процессе их взаимопревращения. Повышение содержания метаболитов оксида азота в дыхательных путях положительно коррелирует с уровнем провоспалительных цитокинов. Продукция оксида азота контролируется генами NOS, причем статистически значимый вклад в развитие нитрозилирующего стресса вносит ген NOS2 и его полиморфизм -954G/C. Специфичность регуляции нитрозилирующего стресса связана с носительством комбинации функционально неполноценных генотипов GSTT1 *0/GSTMl *0, ассоциированной с селективным накоплением 3-нитротирозина и выраженным дефицитом нитрозоглутатиона в дыхательных путях при аллергическом воспалении. У больных астмой, носителей данной комбинации генотипов, воспаление реализуется в формирование необратимого ремоделирования бронхов и развитие тяжелых терапевтически резистентных форм бронхиальной астмы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Козина, Ольга Владимировна

1. Аверьянов, A.B. Нейтрофильная эластаза и болезни органов дыхания / A.B. Аверьянов, А.Э. Поливанова // Цитокины и воспаление. -2007.-Т. 6,-№4.-С. 3-8.

2. Аксенович, Т.И. Статистические методы генетического анализа признаков человека / Т.И. Аксенович. Новосибирск, 2001. - 128 с.

3. Анаев, Э.Х. Структурно-функциональная характеристика и роль эозинофилов в патогенезе и лечении бронхиальной астмы / Э.Х. Анаев,

4. A.JI. Черняев, А.Р. Татарский // Пульмонология. 1994. - № 4. - С. 82-86.

5. Анализ связи полиморфизма генов GSTT1, GSTM1, CYP2C19 и CYP2E1 с атопией у жителей г. Томска / М.Б. Фрейдин, Е.Ю. Брагина, Ф.И. Петровский и др. // Мед. иммунол. 2003. - Т. 5, № 1-2. - С. 107-122.

6. Андреева, H.A. Нитрооксидергические нейроны органов дыхания / H.A. Андреева, Т.А. Шуматова, П.А. Мотавкин // Бюл. экспер. биол. и мед. -2000. Т. 129, № 2. - С. 222-224.

7. Антагонистические эффекты изоформ рецептора интерлейкина-5 при бронхиальной астме / А.Э. Сазонов, И.И. Иванчук, JI.M. Огородова и др. // Мед. иммунол. 2004. - № 1-2. - С. 121-126.

8. Ассоциация полиморфизма промоторной области генов NO-синтаз с развитием бронхиальной астмы / И.В. Петрова, Д.В. Козырицкая, Е.М. Камалтынова, JIM. Огородова // Пульмонология. 2007. - № 4. - С. 52-55.

9. Ассоциация полиморфных ферментов биотрансформации ксенобиотиков с предрасположенностью к бронхиальной астме у детей с наследственной отягощенностью и без таковой / В.А. Вавилин, С.И. Макарова,

10. B.В. Ляхович и др. // Генетика. 2002. - Т. 38, № 4. - С. 539-545.

11. Афанасьева, И.С. Наследственный полиморфизм глутатион S-трансферазы печени человека в норме и при алкогольном гепатите / И.С. Афанасьева, В.А. Спицин // Генетика. 1990. - Т. 26, № 7. - С. 1309-1314.

12. Базисная терапия тяжелой бронхиальной астмы у взрослых. Данные национального исследования НАБАТ / А.Г. Чучалин, JIM. Огородова, Ф.И. Петровский и др. // Пульмонология. 2004. - № 6. - С.68-77.

13. Биохимические механизмы токсичности окислов азота / JI.A. Тиунов, Н.Я. Головенко, Б.Н. Галкин, В.А. Баринов // Успехи соврем, биол.- 1991. Т. 111, вып. 5.-С. 738-750.

14. Бронхопульмонология / Г.И. Лукомский, М.Л. Шулутко, М.Г. Виннер и др. М. : Медицина, 1982. - 388 с.

15. Брусов, О.С. Современное состояние учения о простагландинах / О.С. Брусов, А.М. Герасимов, Л.Ф. Панченко // Патол. физиол. 1978. - № 6. -С. 3-15.

16. Ванин, А.Ф. Оксид азота регулятор клеточного метаболизма / А.Ф.Ванин // Соросовский образовательный журнал. - 2001. - Т. 7, № 11. -С. 7-12.

17. Викторов, И.В. Роль оксида азота и других свободных радикалов в ишемической патологии мозга / И.В. Викторов // Вестн. РАМН. 2000. - № 4. -С. 5-11.

18. Влияние донатора NO нитрозотиола глутатиона на уровень окислов азота и малонового диальдегида в крови крыс / Л.Ю. Каминская, A.A. Жлоба, Л.А. Александрова и др. // Артериал. гипертен. 2005. - Т. 11, № 1. - С. 5-9.

19. Генетические факторы предрасположенности к бронхиальной астме / Т.Э. Иващенко, О.Г. Сиделева, М.А. Петрова и др. // Генетика. 2001. - Т. 37, № 1.-С. 107-111.

20. Генные сети / H.A. Колчанов, Е.А. Ананько, Ф.А. Колпаков и др. // Молек. биол. 2000. - Т. 34, № 4. - С. 533-544.

21. Геном человека и гены «предрасположенности». Введение в предиктивную медицину / B.C. Баранов, Е.В. Баранова, Т.Э. Иващенко и др. -СПб. : Интермедика, 2000. 272 с.

22. Гинтер, Е.К. Популяционная генетика и медицина / Е.К. Гинтер // Вестн. РАМН. 2001. - № 10. - С. 25-31.

23. Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы / Под ред. А.Г. Чучалина. М. : Атмосфера. - 2006. - 106 с.

24. Гриппин, М.А. Патофизиология легких / М.А. Гриппин. М. : Восточная книжная компания. - 1997. - 344 с

25. Деев, И.А. Молекулярно-генетические механизмы нарушения программируемой гибели эозинофилов при бронхиальной астме у детей / И.А. Деев, А.Э. Сазонов, JI.M. Огородова // Пульмонология. 2007. - № 4. -С. 17-22.

26. Динамика биохимических маркеров воспаления воспаления в оценке эффективности базисной фармакотерапии при бронхиальной астме / В.А. Невзорова, Е.В. Просекова, Б.И. Гельцер и др.// Тер. архив. 2001. -№ 3. - С. 24-27.

27. Значение транскрипционного фактора р53 в механизмах апоптоза эозинофилов больных бронхиальной астмой / И.И. Иванчук., JI.M. Огородова, И.В. Петрова и др. // Сиб. мед. журн. 2004. - Т. 19, № 4. - С. 57-59.

28. Изменения свойств эндотелиальных клеток линии EA.hy 926 под влиянием фактора некроза опухоли а, интерферона-у и интерлейкина-4 / Э.А. Старикова, И.С. Фрейдлин, Д.И. Соколов, С.А. Сельков // Иммунология. -2005. № 2. - С. 83-87.

29. Изучение1 связи полиморфизма глутатион-8-трансферазы PI с бронхиальной астмой и атопическим дерматитом / О.Г. Сафронова, В.А. Вавилин, A.A. Ляпунова и др. // Бюл. экспер. биол. и мед. 2003. - Т. 136, № 7. - С. 84-87.

30. Интерлейкин-5 и бронхиальная астма / Л.М. Огородова,

31. A.Э. Сазонов, И.И. Иванчук, JI.B. Капилевич; под ред. А.Г. Чучалина. Томск : Изд-во Том. ун-та, 2006. - 172 с.

32. Клинико-генетическнй анализ изменчивости уровня интерлейкина-5 у больных бронхиальной астмой / JI.M. Огородова, О.С. Кобякова, М.Б. Фрейдин и др. // Бюл. экспер. биол. и мед. 2001. -Прил.1. - С. 66-68.

33. Клиническое значение исследования экспрессии гена IL-5 при бронхиальной астме / JI.M. Огородова, А.Э. Сазонов, И.И. Иванчук и др. // Пульмонология. 2004. - № 4. - С. 54-59.

34. Кобякова, О.С. Клинико-патогенетическая характеристика и базисная терапия тяжелой неконтролируемой астмы: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Томск, 2005. - 46 с.

35. Кузьменко, Д.И. Свободнорадикальное окисление липидов, активные формы кислорода и антиоксиданты: роль в физиологии и патологии клетки: учебное пособие / Д.И. Кузьменко, В.Ю. Серебров, С.Н. Удинцев. -Томск : Изд-во ТПУ, 2007. 214 с.

36. Курносов, М.Н. Определение нитритов в слюне / М.Н. Курносов // Лаб. дело. 1991. - № 3. - С. 34-37.

37. Меньшиков, В.В. Лабораторные методы исследования в клинике /

38. B.В. Меньшиков. М. : Медицина, 1987. - 350 с.

39. Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк, Л.И. Иванова, А.Т. Майорова, Т.Н. Токарев // Лаб. дело. 1988. - № 1. - С. 16-19.

40. Механизмы индукции и развития воспаления (сообщение 2) / A.A. Майборода, Е.Г. Кирдей, И.Ж. Семинский и др. // Сиб. мед. журн. -1995. -№ 1 С. 5-11.

41. Механизмы регуляции функций гладких мышц вторичными посредниками / М.Б. Баскаков, М.А. Медведев, И.В. Ковалев и др. Томск : Гавань, 1996. - 154 с.

42. Никитина, Л.Ю. Особенности нарушения апоптоза эозинофиловпри тяжелой терапевтически-резистентной бронхиальной астме / Л.Ю. Никитина, Ф.И. Петровский, И.И. Иванчук, А.Э. Сазонов // Бюл. Сиб. медицины. 2005. - Т.4, № 4. - С. 64-70.

43. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меньшикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков и др. М. : Фирма «Слово», 2006. -556 с.

44. Оксидантно-антиоксидантный статус больных бронхиальной астмой при ингаляционной и системной глюкокортикоидной терапии / Б.Я. Варшавский, Г.В. Трубников, Л.П. Галактионова и др. // Тер. архив. -2003. -№3.- С. 21-24.

45. Осипов, А.Н. Биологическая роль нитрозильных комплексов гемопротеинов / А.Н. Осипов, Г.Г. Борисенко, Ю.А. Владимиров // Успехи биол. химии. 2007. - № 47. - С. 259-292.

46. Параметры атопии у детей с астмой усиливаются с накоплением нулевых аллелей глутатион-Б-трансферазы Ml / С.И. Макарова, О.Г. Сафронова, В.А. Вавилин и др. // Бюл. экспер. биол. и мед. 2004. - Т. 138, № 5. - С. 460^462.

47. Патоморфологическая характеристика нестабильной бронхиальной астмы (фенотип brittle) / Л.М. Огородова, П.А. Селиванова, Е.А. Геренг и др. II Тер. архив. 2008. - № 3. - С. 39-43.

48. Перекись водорода как маркер воспаления дыхательных путей у больных бронхиальной астмой / A.B. Емельянов, И.Г. Щербак, А. Абулимити и др. // Тер. архив. 2000. - № 12. - С. 27-30.

49. Петрова, И.В. Роль полиморфизма генов NO-синтаз при бронхиальной астме у детей: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Томск, 2004. -28 с.

50. Покровский, В.И. Оксид азота, его физиологические и патофизиологические свойства / В.И. Покровский, H.A. Виноградов // Тер. архив. 2005. - № 1. - С. 82-87.

51. Полиморфизм генов семейства глутатион-з-трансферазы (GST) при бронхиальной астме у детей / JI.A. Желенина, Т.Э. Иващенко, Н.С. Ефимова и др. // Аллергология. 2003. - № 2. - С. 13-16.

52. Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и особенности бронхиальной астмы у детей / В.В. Ляхович, С.М. Гавалов, В .А. Вавилин и др. // Пульмонология. 2002. - Т. 12, № 2. - С. 31-38.

53. Прогностическое значение исследования IL-4, INF-y и IgE в конденсате выдыхаемого воздуха при бронхиальной астме и аллергическом рините у детей / Т.Н. Суровенко, Я.С. Шелудько, О.В. Овчинникова и др. // Цитокины и воспаление. -2002. № 4. - С. 43-46.

54. Прогностическое значение мукоцилиарной недостаточности в достижении фармакотерапевтического контроля бронхиальной астмы / А.Н. Одиреев, В.П. Колосов, М.Т. Луценко, А.Б. Пирогов // Уральский мед. журн. 2008. - Т. 13, № 53. - С.39-46.

55. Пузырев, В.П. Генетика мультифакториальных заболеваний: между прошлым и будущим / В.П. Пузырев // Мед. генетика. 2003. - Т. 2, № 12. -С. 498-508.

56. Пузырев, В.П. Геномные исследования наследственной патологии и генетическое разнообразие сибирских популяций / В.П. Пузырев, В .А. Степанов, С. А. Назаренко // Мол. биол. 2004. - Т. 38, № 1. - С. 129-138.

57. Пузырев, В.П. Феном и гены-синтропии // Генетика человека и патология : сб. науч. тр. / под ред. В.П. Пузырева. Вып. 7. - Томск : Печатная мануфактура, 2004. - 296 с.

58. Реакции пероксинитрита и нитрита с органическими молекулами и гемоглобином / Д.Д. Ли, Р.В. Ян,,Х. Луо, Г. Зу // Биохимия. 2005. - Т. 70, № 10.-С. 1423-1431.

59. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение прикладных программ Statistica /О.Ю. Реброва. М. : Медиа-сфера, 2002. - 305 с.

60. Регуляторная роль оксида азота в апоптозе нейтрофилов / Е.А. Степовая, Т.В. Жаворонок, Ю.В. Стариков и др. // Бюл. экспер. биол. и мед. 2008. - Т. 146, № 12. - С. 646-650.

61. Роль свободнорадикальных процессов в патогенезе бронхиальной астмы / С.Б. Болевич, И.Г. Даниляк, А.Х. Коган и др. // Пульмонология. -1995.-№ 1-е. 18-24.

62. Роль полиморфизма генов Ж)-синтаз в развитии бронхиальной астмы у детей / Л.М. Огородова, И.В. Петрова, И.И. Иванчук и др. // Педиатрия им. Сперанского. 2007. - Т. 86, № 4. - С. 14-18.

63. Роль ферментов биотрансформации ксенобиотиков в предрасположенности к бронхиальной астме и формировании особенностей ее клинического фенотипа / В.В. Ляхович, В.А. Вавилин, С.И. Макарова и др. // Вестн. РАМН. 2000. - № 12. - С. Зб^Ю.

64. Роль эндогенного оксида азота в регуляции атопического воспаления при бронхиальной астме у детей / Ф.И. Петровский, Ю.А. Петровская, Л.М. Огородова и др. // Бюл. экспер. биол. и мед. 2001. -Прил. 1. - С. 57-59.

65. Сафронова, О.Г. Взаимосвязь между полиморфизмом гена 08ТР1 и бронхиальной астмой и атопическим дерматитом / О.Г. Сафронова, В.А. Вавилин, А.А. Ляпунова // Бюл. экспер. биол. и мед. 2003. - Т. 136, № 1.-С. 73-75.

66. Содержание окиси азота в слюне и легочная гипертензия у больных с различной степенью тяжести бронхиальной астмы / Э.Е. Назаретян, М.З. Нариманян, Т. В. Мартиросян, А.Ю. Гаспарян // Пульмонология. 2000. -№ 2. - С. 23-27.

67. Состояние процессов перекисного окисления липидов при энтеральной коррекции экспериментальной кровопотери / С.Б. Матвеев, В.В. Марченко, Т.С. Попова, ПЛ. Голиков // Вопр. мед. химии. 1999. -Вып. 2. - С. 140-144.

68. Смирнова, И.Ю. Роль полиморфизма генов NO-синтаз в формировании атопического дерматита и бронхиальной астмы у детей: Автореф. дис. канд. мед. наук. Томск, 2009. - 19 с.

69. Структура и активность ингибиторов NOS-специфичных к L-аргинин связывающему центру / С .Я. Проскуряков, А.Г. Конопляников, В .Г. Скворцов и др. // Биохимия. 2005. - Т. 70, вып. 1. - С. 14-32.

70. Суханова, Г.А. Биохимия клетки / Г.А. Суханова, В.Ю. Серебров. -Томск : Изд-во Чародей, 2000. 183 с.

71. Таганович, А.Д. Получение конденсата выдыхаемого воздуха и анализ маркеров заболеваний легких / А.Д. Таганович // Белорус, мед. журн. -2002. -№ 2. -С. 20-27.

72. Титов, В.Н. Оксид азота в реакции эндотелийзависимой вазодилатации. Основы единения эндотелия и гладкомышечных клеток в паракринной регуляции метаболизма / В.Н. Титов // Клин. лаб. диагн. 2007. -№ 2. - С. 23-39.

73. Тяжелая бронхиальная астма / JIM. Огородова, О.С. Кобякова, И.В. Суходоло, Е.А. Геренг. Томск : Изд-во Печатная мануфактура, 2009. -166 с.

74. Филиппова, H.A. Продукты NO-синтазной активности и воспаление дыхательных путей: метаболизм, патофизиологическая роль при аллергических заболеваниях / H.A. Филиппова, Л.Ю. Каминская, И.В. Михаленкова // Клин, лаб. диагн. 2006. - № 8. - С. 3-9.

75. Флетчер, Р. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины / Р. Флетчер, С. Флетчер, Э. Вагнер. М.: Медиа Сфера, 1998. - 347 с.

76. Фрейдин, М.Б. Геномные основы подверженности атопическим заболеваниям / М.Б. Фрейдин, В.П. Пузырев // Молекулярная медицина. -2007. -№3.~ С. 26-35.

77. Часовских, Н.Ю. Апоптоз й окислительный стресс / Н.Ю. Часовских, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий. Томск : Изд-во Печатнаямануфактура, 2009. 148 с.

78. Черняк, Б.А. Контролируемое течение бронхиальной астмы как основная цель терапии в повседневной клинической практике / Б.А. Черняк, И.И. Воржева // Атмосфера. Пульмонология и аллергология. 2008. - № 2.1. C. 34-38.

79. Чучалин, А.Г. Бронхиальная астма / А.Г. Чучалин. М. : Русский врач, 2001.- 144 с.

80. Чучалин, А.Г. Бронхиальная астма и астмаподобные состояния / А.Г. Чучалин // Рус. мед. журн. 2002. - Т. 10, № 5. - С. 232-235.

81. Чучалин, А.Г. Бронхиальная астма: состояние проблемы в 2009 г. и перспективы / А.Г. Чучалин // Материалы XIX Национального конгресса по болезням органов дыхания. Москва, - 2009. - С. 250.

82. Юлдашева, И.А. Роль оксида азота и процессов липопероксидации в формировании обструкции бронхов при бронхиальной астме / И.А. Юлдашева, М.И. Арипова // Клин. лаб. диагн. 2003. - № 5. - С. 3-5.

83. A genome-wide search for linkage to asthma / M. Wjst, G. Fisher, T. Immervoll, M. Jung // Genomics. 1999. - Vol. 58. - P. 1-8.

84. A new perspective on concepts of asthma severity and control //

85. D.R. Taylor, E.D. Bateman, L.P. Boulet et al. // Eur. Respir. J. 2008. - Vol. 32, N3.-P. 545-554.

86. A significant proportion of exhaled nitric oxide arises in large airways in normal subjects / P.E. Silkoff, P. McClean, M. Caramori et al. // Respir. Physiol. -1998.-Vol. 113.-P. 33-44.

87. Acute effects of aerosolized S-nitrosoglutathione in cystic fibrosis / A. Snyder, M. McPherson, J. Hunt et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2002. -Vol. 165.-P. 922-926.

88. ADAM33 as an example of a susceptibility gene / S.T. Holgate, Y. Yang, H.M. Haitchi etal. //Proc. Am. Thorac. Soc. -2006. Vol. 3. - P. 440-443.

89. Adcock, I.M. New targets for drug development in asthma /

90. Adler, K.B. Airway epithelium and mucus: intracellular signaling pathways for gene expression and secretion / K.B. Adler, Y. Li // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2001. - Vol. 25. - P. 397-400.

91. Airway glutathione homeostasis is altered in children with severe asthma: evidence for oxidant stress / A.M. Fitzpatrick, W.G. Teague, F. Holguin et al. //J. Allergy Clin. Immunol.-2009.-Vol. 123,N 1.-P. 146-152.

92. Airway remodeling in asthma / J.A. Elias, Z. Zhu, G. Chupp et al. // J. of Clin. Inv. 1999. - Vol. 104, N 8. - P. 985-999.

93. Alderton, W.K. Nitric oxide synthases : structure, function and inhibition / W.K. Alderton, C.E. Cooper // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2001. - Vol. 16, N3.-P. 17-20.

94. Allergen-induced peribronchial fibrosis and mucus production mediated by I kappa B kinase beta-dependent genes in airway epithelium / D.H. Broide, T. Lawrence, T. Doherty et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - Vol. 102. -P. 17723-17728.

95. Analysis of induced sputum in adults with asthma: identification of subgroup with isolated sputum neutrophilia and poor response to inhaled corticosteroids / R.H. Green, C.E. Brightling, G. Woltmann et al. // Thorax. 2002. -Vol. 57.-P. 875-879.

96. Analysis of the inducible nitric oxide synthase gene polymorphisms in Czech patients with atopic diseases / L.I. Holla, A. Stejskalova, V. Znojil, A. Vasku // Clin. Exp. Allergy. 2006. - Vol. 36, N 12. - P. 1592-1601.

97. Anderson, G.G. Recent advances in the genetics of allergy and asthma / G.G. Anderson, W.O. Cookson//Mol. Med. Today. 1999. - Vol. 5. - P. 264-273.

98. Anderson, G.P. Endotyping asthma: new insights into key pathogenic mechanisms in a complex, heterogeneous disease / G.P. Anderson // Lancet. -2008. Vol. 372. - P. 1107-1119.

99. Anderson, M.E. Determination of glutathione and glutathione sulfide in biological samples / M.E. Anderson // Methods Enzymol. 1985. - Vol. 113. — P. 548-555.

100. Association of a missense mutation in the NOS3 gene with exhaled nitric oxide levels / K.S. van's Gravesande, M.E. Wechsler, H. Grasemann et al. // Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2003. - Vol. 168. - P. 228-231.

101. Association of inducible nitric oxide synthase with asthma severity, total serum immunoglobulin E and blood eosinophil levels / J. Batra, T. Pratap Singh, U. Mabalirajan et al. // Thorax. 2007. - Vol. 62. - P. 16-22.

102. Association study of glutathione S-transferase PI (GSTP1) with asthma and bronchial hyper-responsiveness in two german pediatric populations / R. Nickel, A. Haider, C. Sengler et al. // Pediatric Allergy and Immunology. 2005. - Vol. 16, N6.-P. 539-541.

103. Asthmatic bronchial epithelial cells have a deficient innate immune response to infection with rhinovirus / P.A. Wark, S.L. Johnston, F. Bucchieri et al. // J. Exp. Med. -2005. V.201. - P. 937-947.

104. Barnes P.J. Glucocorticoid resistance in inflammatory diseases / P.J. Barnes, I.M. Adcock // Lancet. 2009. - Vol. 373, N 967. - P. 1905-1917.

105. Barnes P.J. The cytokine network in asthma and chronic obstructive pulmonary disease / P.J. Barnes // J. Clin. Invest. 2008. - Vol. 118, N 11. -P. 3546-3556.

106. Barnes, P.J. The role inflammation and anti-inflamatory medication in asthma / P.J. Barnes // Respir. Med. 2002. - Vol. 96. - P. 9-15.

107. Basal and stimulated protein S-nitrosylation in multiple cell types and tissues / A.J. Gow, Q. Chen, D.T. Hess et al. // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. -P. 9637-9640.

108. Bateman, E.D. Asthma and allergy a global perspective / E.D. Bateman, A. Jithoo // Allergy. - 2007. - Vol. 62, N 3. - P. 213-215.

109. Bcl-2 family mRNA and IL-5 mRNA expression in peripheral blood eosinophils of mild-to-moderate asthmatics / A. Sazonov, F. Petrovsky, E. Ageeva et al. // Medical Science Monitor. 2005. - Vol. 11, N 2. - P. 43^19.

110. Beckett, G.J. Glutathione S-transferases: biomedical applications / G.J. Beckett, J.D. Hayes // Adv. Clin. Chem. 1993. - Vol. 30. - P. 281-380.

111. Bellamy, T.C. Differential sensitivity of guanylyl cyclase and mitochondrial respiration to nitric oxide measured using clamped concentrations / T.C. Bellamy, V. Griffiths, J. Garthwaite // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. -P. 31801-31807.

112. Biopsies: bronchoscopic technique and sampling / D.S. Robinson, P. Faurschou, N. Barnes et al. // Eur. Respir. J. 1998. - Vol. 11. - P. 16-19.

113. Board, P:G. Isolation of cDNA clone and localization of the human glutathione S-transferase 3 on chromosome bands llql3 and 12ql3-14 / P.G. Board, G.C. Webb, M. Coggan// Ann. Hum. Genet 1989. - Vol. 53. - P. 205-213.

114. Bochner, B.S. Allergy and asthma / B.S. Bochner., Busse W.W. // J. Allergy Clin. Immunol. 2005. - V. 115. - P. 953-959.

115. Bogdan, C. Nitric oxide and the immune response / C. Bogdan // Nat. Immunol. 2001. - Vol. 2. - P. 907-916.

116. Bogdan, C. Nitric oxide and the regulation of gene expression / C. Bogdan // Trends Cell Biol. 2001. - Vol. 11. - P. 66-75.

117. Bolt, H.M. Relevance of the deletion polymorphisms of the glutathione S-transferases GSTT1 and GSTM1 in pharmacology and toxicology / H.M. Bolt, R. Thier // Curr. Drug. Metab. 2006. - Vol. 7, N 6. - P. 613-628.

118. Boulet, L.P. Airway remodelling: the future / L.P. Boulet, P.J. Sterk // Eur. Respir. J. 2007. - Vol. 306, N 2. - P. 831-834.

119. Bove, P. Nitric oxide and reactive nitrogen species in airway epithelial signaling and inflammation / P. Bove, A. van Der Vliet // Free Radic. Biol. Med. -2006. Vol. 41, N 4. -P. 515-527.

120. Bronchodilator S-nitrosothiol deficiency in asthmatic respiratory failure / B. Gaston, S. Sears, J. Woods etal. //Lancet. 1998. - Vol. 351. -P. 1317-1319.

121. Brune, B. Nitric oxide: NO apoptosis or turning it ON? / B. Brune // Cell Death Differ. 2003. - Vol. 10. - P. 864-869.

122. Calmodulin-dependent endothelium-derived relaxing factor/nitric oxide synthase activity is present in the particulate and cytosolic fractions of bovine aortic endothelial cells / U. Forstermann, J.S. Pollock, H.H. Schmidt et al. // Proc. Natl.

123. Acad. Sci USA. 1991. - Vol. 88. - P. 1788-1792.

124. Carpenter, L. Protein kinase C-delta activation by II-1 |3 stabilizes inducible nitric oxide synthase m RNA in pancreatic beta-cells / L. Carpenter, D. Cordery, T.J. Biden // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 5368-5374.

125. Cigarette smoking-induced changes in the number and differentiated state of pulmonary dendritic cells/Langerhans cells / P. Soler, A. Moreau, F. Basset et al. //Am. Rev. Respir. Dis. 1989. - Vol. 139. - P. 1112-1117.

126. Cloned human brain nitric oxide synthase is highly expressed in skeletal muscle / M. Nakane, H.H. Schmidt, J.S. Pollock et al. // FEBS Lett. 1993. -Vol. 316.-P. 175-180.

127. Cloning and expression of a cDNA encoding human endothelium-derived relaxing factor/nitric oxide synthase / S.P. Janssens, A. Shimouchi, T. Qertermous et al. // J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267. - P. 14519-14522.

128. Cloning, characterization and expression of a cDNA encoding an inducible nitric oxide synthase from the human chondrocyte / I.G. Charles, R.M. Palmer, M.S. Hickery et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993. - Vol. 90. -P. 11419-11423.

129. Combinations of the variant genotypes of GSTP1, GSTM1 and p53 are associated with an increased lung cancer risk / D.P. Miller, G. Liu, I. De Vivo et al. // Cancer Research. 2002. - Vol. 62. - P. 2819-2823.

130. Complex regulation of human inducible nitric oxide synthase gene transcription by Stat 1 and NF-kB / R.W. Ganster, B.S. Taylor, L. Shao, D.A. Geller

131. PNAS.-2001.-Vol. 98, N 15. -P. 8638-8643.

132. Contribution of nitric oxide synthases 1, 2, and 3 to airway hyperresponsiveness and inflammation in a murine model of asthma / G.T. De Sanctis, J.A. MacLean, K. Hamada et al. // J. Exp. Med. 1999. - Vol. 189. -P. 1621-1630.

133. Constitutive nitric oxide synthase gene polymorphisms and house dust mite respiratory allergy in an Algerian patient group / R. Djidjik, M. Ghaffor, M. Brun // Tissue Antigens. 2008. - Vol. 71, N 2. - P. 160-164.

134. Cooper, C.E. Nitric oxide and cytochrome oxidase: substrate, inhibitor or effector? / C.E. Cooper // Trends Biochem. Sci. 2002. - Vol. 27. - P. 33-39.

135. Crystal structure of constitutive endothelial nitric oxide synthase: a paradigm for pterin function involving a novel metal center / C.S. Raman, H. Li, P. Martasek et al. // Cell. 1998. - Vol. 95. - P. 939-950.

136. Darling, K.E. Effects of nitric oxide on Pseudomonas aeruginosa infection of epithelial cells from a human respiratory cell line derived from a patient with cystic fibrosis / K.E. Darling, T.J. Evans // Infect. Immun. 2003. - Vol. 71. -P. 2341-2349.

137. Decreased expression of yocardial eNOS and caveolin in dogs with hypertrophic cardiomyopathy / A. Piech, P.E. Massart, C. Dessy et al. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physioh 2002. - Vol. 282, N 1. - P. H219-H231.

138. Decreased levels of nitrosothiols in the lower airways of patients with cystic fibrosis and normal pulmonary* function./ H: Grasemann, B. Gaston, K. Fang et al. // J. Pediatr. 1999. - Vol. 135. - P. 770-772.

139. Decreased renal expression of nitric oxide synthase isoforms in adrenocorticotropin-induced and, corticosterone-induced hypertension / Y.K. Lou,

140. C. Wen, S.C. Schafer et al. // Hipertensión. 2001. - Vol. 37. - P. 1164-1170.

141. Demchenko, I.T. Nitric oxide and cerebral blood flow responses to hiperbaric oxygen / I.T. Demchenko, A.E. Boso, T.J. O'Neill // J. Appl. Physiol. -2000.-Vol. 88.-P. 1381-1389.

142. Dewson, G. Interleukin-5 inhibits translocation of Bax to the mitochondria, cytochrome c release, and activation of caspases in human eosinophils / G. Dewson, G.M. Cohen, A.J. Wardlaw // Blood. 2001. - Vol. 98, N 7. -P. 2239-2247.

143. Diamond, G. The innate immune response of the respiratory epithelium / G. Diamond, D. Legarda, L.K. Ryan // Immunol. Rev. 2000. - Vol. 173. - P. 27-38.

144. Differences in airway cytokne profile in severe asthma compared to moderate asthma / J. Shannon, P. Ernst, Y. Yamauchi et al. / Chest. 2008. -Vol. 133, N2.-P. 420-426.

145. Differential proteolytic enzyme activity in eosinophilic and neutrophilic asthma / J.L. Simpson, RJ. Scott, M.J. Boyle et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. -2005. Vol. 172. - P. 559-565.

146. Differential regulation of nitric oxide synthases and their allosteric regulators in heart and vessels of hypertensive rats / A. Piech, C. Dessy, X. Havaux et al. // Cardiovasc. Res. 2003. - Vol. 57. - P. 456^167.

147. Dinakar, C. Exhaled nitric oxide in the clinical management of asthma / C. Dinakar // Curr. Allergy Asthma Rep. 2004. - Vol. 4. - P. 454^159.

148. Distinguishing severe asthma phenotypes: role of age at onset and eosinophillic inflammation / C. Miranda, A. Busacker, S. Baizar et al. // J. Allergy Clin. Immunol. 2004. - Vol. 113. - P. 101-108.

149. Distribution of human i-NANC bronchodilator and nitric oxide-immunoreactive nerves, / J.K. Ward, P.J. Barnes, D.R. Springall et al.' // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1995. - Vol. 13. - P. 175-184.

150. Domain interaction between NMDA receptor subunits and the postsynaptic density protein PSD-95 / H.C. Kornau, L.T. Schenker, M.B. Kennedy,

151. P.H. Seeburg// Science. 1995. - Vol. 269. -P. 1737-1740.

152. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function / W. Droge // Physiol. Rev. 2002. - Vol. 82. - P. 47-95.

153. Dweik, R.A. NO chemical events in the human airway during the immediate and late antigen-induced asthmatic response / R.A. Dweik, S.A. Comhair, B. Gaston // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2001. - Vol. 98. - P. 2622-2627.

154. Dyspnoea at rest and at the end of different exercises in patients with near-fatal asthma / E. Barreiro, J. Gea, C.J. Sanjuas et al. // Eur. Respir. J. 2004. -Vol. 24.-P. 219-225.

155. Eaton, D.L. Concise review of the glutathione S-transferases and their significance to toxicology / D.L. Eaton, T.K. Bammler // Toxicol. Sei. 1999. -Vol. 49.-P. 156-164.

156. Effects of aninterleukin-5 blocking monoclonal antibody on eosinophils, airway hyper-responsiveness, and the late asthmatic response / M.J. Leckie, A. ten. Brinke, J. Khan et al. // Lancet. 2000. - Vol. 356. - P. 2144-2148.

157. Effects of glutathione S-transferase Ml, maternal smoking during pregnancy, and environmental tobacco smoke on asthma and wheezing in children / F.D. Gilliand, Y.F. Li, L. Dubeau et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2002. -Vol. 166.-P. 457-463.

158. Endogenous nitrogen oxides and bronchodilator S-nitrosothiols in human airways / B. Gaston, J. Reilly, J.M. Drazen et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1993.-Vol. 90.-P. 10957-10961.

159. Endothelial nitric oxide synthase is expressed in cultured human bronchiolar epithelium / P. Shaul, A.J. North, L.C. Wu et al. // J. Clin. Invest 1994. -Vol. 94.-P. 2231-2236.

160. Enzyme catalysis and regulation / K. Panda, R.J. Rosenfeld, S. Ghosh et al. // Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 31020-31030.

161. Eosinophil-associated TGF-betal mRNA expression and' airways fibrosis in bronchial asthma / E.M. Minshall, D.Y. Leung, R.J. Martin et al. // Am. J.

162. Respir. Cell Mol. Biol. 1997. - Vol. 17, N 3. - P. 326-333.

163. Epithelial cell proliferation contributes to airway remodeling in severe asthma / L. Cohen, X. E, J.Tarsi et al // Am J Respir Crit Care Med. 2007. -Vol. 176.-P. 138-145.

164. Evalutation of airway inflammation by quantitative Thl/Th2 cytocine mRNA me asurement in sputum of ast asurementhma patients / E. Truyen, L. Coteur, L. Overbergh et al. // Thorax. 2006. - Vol. 61, N 3. - P. 202-208.

165. Evidence of a role of tumor necrosis factor alpha in refractory asthma / M.A. Berry, B. Hargadon, M. Shelley et al. // N. Engl. J. Med. 2006. - Vol. 354. -P. 697-708.

166. Expression of nitric oxide synthase-2 in the lungs decreases airway resistance and responsiveness / J. Hjoberg, S. Shore, L. Kobzik et al. // J. Appl. Physiol. 2004. - Vol. 97. - P. 249-259.

167. Fanta, C.H. Drug therapy for asthma / C.H. Fanta // N. Engl. J. Med. -2009.-Vol. 24.-P. 1002-1014.

168. Fischer, A. Nitric oxide synthase in neurons and nerve fibers of lower airways and in vagal sensory ganglia of man / A. Fischer, B. Hoffmann // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1996. - Vol. 154. - P. 209-216.

169. Fischer, A. Nitric oxide, synthase in vagal sensory and sympathetic neurons innervating the guinea-pig. trachea / A. Fischer, B. Mayer, W. Kummer // J. Auton. Nerv. Syst. 1996. - Vol. 56: - P. 157-160.

170. Fixman, E.D. Basic mechanisms of development of airway structural changes in asthma / E.D. Fixman, A. Stewart, J.G. Martin // Eur. Respir. J. 2007. -Vol. 29, N2.-P. 379-389.

171. Formation of S-nitrosothiols via direct nucleophilic nitrosation of thiols by peroxynitrite with elimination of hydrogen peroxide / A. van der Vliet, P. A. Hoen, P.S. Wong et al. // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. - P. 30255-30262.

172. Forstermann, U. Expressional control of the "constitutive" isoforms of nitric oxide synthase (nNOS and eNOS) / U. Forstermann, J.P. Boissel, H. Kleinert // FASEB J. 1998. - Vol. 12. - P. 773-790.

173. Foster, M.W. S-nitrosylation in health and disease / M.W. Foster, T.J. McMahon, J.S. Stamler. // Trends in Molecular Medicine. 2003. -Vol. 9, N4.-P. 160-168.

174. Frayer, A.A. The development of glutathione S-transferase and glutathione peroxidase activities in human lung / A.A. Frayer, R. Hume, R.C. Strange // Biochim. Biophys. Acta. 1986. - Vol. 883. - P. 448^153.

175. Fredberg, J.J. Bronchospasm and its biophysical basis in airway smooth muscle Electronic resource. / J.J. Fredberg // Respiratory Research. Electronic data. - 2004. - Mode of access: http://respiratory-research.eom/content/5/l/2.

176. Free 3-nitrotyrosine in exhaled breath condensates of children fails as a marker for oxidative stress in stable cystic fibrosis and asthma / S. Celio, H. Troxler, S. Durka et al. // Nitric Oxide. 2006. - Vol. 15, N 3. - P. 226-232.

177. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease / M. Valko, D. Leibfritz, J. Moncol et al. // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2007. - Vol. 39, N 1. - P. 44-84.

178. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer / M. Valko, C.J. Rhodes, J. Moncol et al. // Chemico-Biological Interactions. -2006. Vol. 160, N 1. - P. 1^40.

179. Friebe, A. Regulation of nitric oxide-sensitive guanylyl cyclase / A. Friebe, D. Koesling // Circ. Res. 2003. - Vol. 93. - P. 96-105.

180. Gao, L. Recent advances in genetic predisposition to clinical acute lung injury / L. Gao, K.C. Barnes // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 2009. -Vol. 296, N 5. - P. L713-L725.

181. Gaston, B. Nitric oxide and thiol groups / B. Gaston // Biochim. Biophys. Acta.-1999.-Vol. 1411.-P. 1317.

182. Genetic alterations of glutathione S-transferases in asthma: do they modulate lung growth and response to environmental stimuli? / F. Sampsonas, M.A. Archontidou, E. Salla et al. // Allergy. Asthma. Proc. 2007. - Vol. 28, N 3. -P. 282-286.

183. Genome-wide search for asthma susceptibility loci in a founder population / C. Ober, NJ. Cox, M. Abney et al. // Hum. Mol. Genet. 1998. - Vol. 7, N9.-P. 1393-1398.

184. Global Initiative for asthma. Global Strategy for Asthma Management and Prevention Electronic resource. 2006. - Mode of access: http://www.ginasthma.com.

185. Glucocorticoids regulate inducible nitric oxide synthase by inhbiting tetrahydrobiopterin synthesis and L-arginine transport / W.W. Simmons, D. Ungureanu-Longrois, G.K. Smith et al. // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. -P. 23928-23937.

186. Glutathione S-transferase genotype increases risk of progression from bronchial hyperresponsiveness to asthma in adults / M. Imboden, T. Rochat, M. Brutsche et al. // Thorax. 2008. - Vol. 63, N 4. - P. 322-328.

187. Glutathione S-transferase Ml and PI genotype, passive smoking, and peak expiratory flow in asthma / C.N. Palmer, A.S. Doney, S.P. Lee et al. // Pediatrics. 2006. - Vol. 118, N 2. - P. 710-716.

188. Glutathione S-transferase PI gene polymorphism and air pollution as interactive risk factors for childhood asthma / Y.L. Lee, Y.C. Lin, Y.C. Lee et al. // Clin. Exp. Allergy. 2004. - Vol. 34, N 11. - P. 1707-1713.

189. Glutathione S-transferase PI, maternal smoking, and asthma in children:a haplotype-based analysis / Y.F. Li, WJ. Gauderman, D.V. Conti et al. // Environ Health Perspect. 2008. - Vol. 116, N 3. - P. 409-415.

190. Glutathione S-transferase theta 1 gene deletion and risk of acute myeloid leukemia / C. Crump, C. Chen, F.R. Appelbaum et al. // Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 2000. - Vol. 9. - P. 457-460.

191. Glutathione-S-transferase gene polymorphisms (GSTT1, GSTM1, GSTP1) as increased risk factors for asthma / L. Tamer, M. Calikoglu, N.A. Ates et al. // Respirology. -2004. Vol. 9, N 4. - P. 493-498.

192. Gookin, J.L. Inducible nitric oxide synthase mediates early epithelial repair of porcine ileum / J.L. Gookin, J.M. Rhoads, R.A. Argenzio // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2002. - Vol. 283. - P. 157-168.

193. Gorren, A.C. Tetrahydrobiopterin in nitric oxide synthesis: a novel biological role for pteridines /A.C. Gorren, B. Mayer // Curr. Drug. Metab. 2002. -Vol. 3, N2. - P. 135-157.

194. Grasemann, H. Neuronal NO synthase (NOS1) is a major candidate gene for asthma / H. Grasemann, C.N. Yandava, J.M. Drazen // Clinical and Experimental Allergy. 1999. - Vol. 29. - Supl. 4. - P. 39-41.

195. Grasermann, H. Airway nitric oxide levels in cystic fibrosis patients are related to a polymorphism in the neuronal nitric oxide synthase gene / H. Grasemann // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. - Vol. 162, N 6. - P. 2172-2176.

196. Genetic alterations of glutathione S-transferases in asthma: do they modulate lung growth and response to environmental stimuli? / F. Sampsonas, M.A. Archontidou, E. Salla et al. // Allergy Asthma Proc. 2007. - Vol. 28, N 3. -P. 282-286.

197. Guanabenz-mediated inactivation and enhanced proteolytic degradation of neuronal nitric-oxide synthase / S. Noguchi, S. Jianmongkol, A.T. Bender et al. // J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275: - P: 2376-2380.

198. Guanylyl cyclases, nitric oxide, natriuretic peptides, and airway smooth muscle function / A.M. Hamad, A. Clayton, B. Islam, A.J. Knox // Am. J. Physiol.1.ng Cell. Mol. Physiol. 2003. - Vol. 285. - P. 973-983.

199. Guengerieh, F.P. Cytochrome P450s, drugs and diseases / F.P. Guengerieh //Molecular Interventions. 2003. - Vol. 3, N 4. - P. 8-18.

200. Hammad, H. Dendritic cells and epithelial cells: linking innate and adaptive immunity in asthma / H. Hammad, B.N. Lambrecht // Nat Rev Immunol. -2008.-Vol. 8.-P. 193-204.

201. Hart, T.W. Some observations concerning the S-nitroso and S-phenylsulphonyl derivatives of L-cysteine and glutathione / T.W. Hart // Tet. Lett. -1985.-Vol. 26, No 16.-P. 2013-2016.

202. Hayes, J.D. Glutathione S-transferase polymorphisms and their biological consequences / J.D. Hayes, R.C. Strange // Pharmacology. 2000. -Vol. 61.-P. 154-166.

203. Hayes, J.D. Glutathione transferases / J.D. Hayes, J.U. Flanagan, I.R. Jowsey // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2005. - Vol. 45. - P. 51-88.

204. Helms, M.N. Role of SGK1 in nitric oxide inhibition of ENaC in Na+-transporting epithelia / M.N. Helms, L. Yu, B. Malik // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2005. - Vol. 289. - P. 717-726.

205. Henderson, E.M. SNOR and wheeze: the asthma enzyme? / E.M. Henderson, B. Gaston // Trends in Molecular Medicine. 2005. - Vol. 11, N 11.-P. 481^184.

206. Hereditary differences in the expression of human glutathione transferase activity on trans-stilbene oxide are due to a gene deletion / J. Seidegard, W.R. Vorachek, R.W. Pero et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - Vol. 85. -P. 7293-7297.

207. Heterogeneous distribution of type I nitric oxide synthase in pulmonary vasculature of ovine fetus / C. Tzao, P.A. Nickerson, J.A. Russell et al. // Histochem. Cell Biol. 2000. - Vol. 114. - P. 421-430.

208. High serum levels of tumour necrosis factor-a and interleukin-8 in severe asthma: markers of systemic inflammation? / M. Silvestri, M. Bontempelli,

209. M. Giacomelli et al. // Clinic. Exp. Allergy. 2006. - Vol. 36, N 11. - P. 1373-1381.

210. Holgate, S.T. Pathogenesis of asthma / S.T. Holgate // Clin. Exp. Allergy. 2008. - Vol. 38. - P.872-897.

211. Holgate, S.T. The genetics of allergy and asthma: concluding comments / S.T. Holgate // Clin. Exp. Allergy. 1995. - Vol. 25. - Suppl. 2. -P. 124-125.

212. Holgate, S.T. The mechanisms, diagnosis, and management of severe asthma in adults / S.T. Holgate, R. Polosa // Lancet. 2006. - Vol. 368. - P. 780-793.

213. Host defense mechanisms triggered by microbial lipoproteins through toll-like receptors / H.D. Brightbill, D.H. Libraty, S.R. Krutzik et al. // Science. -1999. Vol. 285. - P. 732-736.

214. Human alveolar epithelial cells induce nitric oxide synthase-2 expression in alveolar macrophages / D.V. Pechkovsky, G. Zissel, C. Stamme et al. // Eur. Respir. J. 2002. - Vol. 19. - P. 672-683.

215. Human bronchial epithelium controls Th2 responses by Thl-induced, nitric oxide-mediated STAT5 dephosphorylation: implications for the pathogenesis of asthma / U. Eriksson, U. Egermann, M.P. Bihl et al. // J. Immunol. 2005. -Vol. 175.-P. 2715-2720.

216. Human glutathione S-transferase PI polymorphism: relationship to lung tissue enzyme activity and population freguency distribution / M.A. Watson, R.K. Stewart, G.B. Smith et al. // Carcinogenesis. 1998. - Vol. 19. - P. 275-280.

217. Human glutathione S-transferase theta (GSTT1): cDNA cloning and the characterization of a genetic polymorphism / S. Pemble, K.R. Schroeder, S.R. Spencer et al. // Biochem. J. 1994. - Vol. 300. - P. 271-276.

218. Identification of a novel asthma susceptibility gene on chromosome lqter and its functional evaluation / J.H. White, M. Chiano, M. Wigglesworth et al. // Hum. Mol. Genet. 2008. - Vol. 17, N 13. - P. 1890-1903.

219. IgE Modulates neutrophil survival in asthma: role of mitochondrial pathway / A.S. Saffar, M.P.Alphonse, L. Shan et al. // J. Immunol. 2007. -Vol. 178.-P. 2535-2541.

220. Immunopathogenesis of bronchial asthma / M. Buc, M. Dzurilla, M. Vrlik, M. Bucova // Arch. Immunol. Ther. Exp. 2009. - Vol. 57. - P. 331-344.

221. Increased glucocorticoid receptor beta alters steroid response in glucocorticoid-insensitive asthma / E. Goleva, L.B. Li, P.T. Eves et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2006. - Vol. 173. - P. 607-616.

222. Increased iNOS activity is essential for pulmonary epithelial tight junction dysfunction in endotoxemic mice / X. Han, M.P. Fink, T. Uchiyama et al. // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2004. - Vol. 286. - P. 259-267.

223. Inducible nitric-oxide synthase generates superoxide from the reductase / Y. Xia, L.J. Roman, B.S. Masters, J.L. Zweier // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. -P. 22635-22639.

224. Inflammatory subtypes in asthma: assessment and identification using induced sputum / J.L. Simpson, R. Scott, M.J. Boyle et al. // Respirology. 2006. -Vol. 11. -P. 54-61.

225. Interaction of nitric oxide synthase with the postsynaptic density protein PSD-95 and alpha-1-syntrophin mediated by PDZ domains / J.E. Brenman, D.S. Chao, S.H. Gee et al. // Cell. 1996. - Vol. 84. - PI 757-767.

226. Ischiropoulos, H. Biological selectivity and functional aspects of protein tyrosine nitration / H. Ischiropoulos // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. -Vol. 305.-P. 776-783.

227. Janssen-Heininger, Y.M. Recent advances towards understanding redox mechanisms in the activation of nuclear factor kappa B / Y.M. Janssen-Heininger, M.E. Poynter, P.A. Baeuerle // Free Radic. Biol. Med. 2000. - Vol. 28. -P. 1317-1327.

228. Kabesch, M. Glutathione S transferase deficiency and passive smoking increase childhood asthma / M. Kabesch, C. Hoefler, D. Carr //Thorax. 2004. - Vol. 59, N7.-P. 569-573.

229. Kilani, M.M. RSV causes HIF-1 alpha stabilization via NO release in primary bronchial epithelial cells / M.M. Kilani, K.A. Mohammed, N. Nasreen // Inflammation. 2004. - Vol. 28. - P. 245-251.

230. Kim, S.F. Inducible nitric oxide synthase binds, S-nitrosylates, and activates cyclooxygenase-2 / S.F. Kim, D.A. Huri, S.H. Snyder // Science. 2005. -Vol. 310.-P. 1966-1970.

231. Klatt, P. Regulation of protein function by S-glutathiolation in response to oxidative and nitrosative stress / P. Klatt, S. Lamas // Eur. J. Biochem. 2000. -Vol. 267, N 16. - P. 4928-4944.

232. Knight, D.A. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease / D.A. Knight, S.T. Holgate // Respirology. 2003. - Vol. 8. -p. 432-446.

233. Kuwano, K. Epithelial cell apoptosis and lung remodeling / K. Kuwano // Cell. Mol. Immunol. 2007. - Vol. 4, N 6. - P. 419-^129.

234. Lambrecht, B.N. Dendritic cells and the regulation of the allergic immune response / B.N. Lambrecht // Allergy. 2005. - Vol. 60, N 3. - P. 271-282.

235. L-Arginine deficiency causes airway hyperresponsiveness after the lateasthmatic reaction // H. Maarsingh, B.E. Bossenga, I.S. Bos et al. // Eur. Respir. J. -2009. Vol. 34, N 1. - P. 191-199.

236. Li, C.Q. Nitric oxide as a modulator of apoptosis / C.Q. Li, G.N. Wogan // Cancer Lett. 2005. - Vol. 226. - P. 1-15.

237. Livingston, E. Systemic sensitivity to corticosteroids in smokers with asthma / E. Livingston, R. Chaudhuri, A.D. McMahon // Eur. Respir. J. 2007. -Vol. 29.-P. 64-71.

238. Localization of nitric oxide synthase in human nasal mucosa with nasal allergy / H. Kawamoto, M. Takumida, S. Takeno et al. // Acta Otolaryngol. 1998. -Vol. 539.-P. 65-70.

239. Loesch, A. Electroimmunocytochemical localization of endothelial and neuronal isoforms of nitric oxide synthase in rat cerebral basilary artery / A. Loesch, G. Burnstock // Acta Neurobiol. Exp. 1995. - Vol. 55. - P. 45-55.

240. Lung sources and cytokine requirements for in vivo expression of inducible nitric oxide synthase / R.L. Warner, R. Paine, P.L. Christensen et al. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1995. - Vol. 12. - P. 649-661.

241. Macrophage endothelial nitric-oxide synthase autoregulates cellular activation and pro-inflammatory protein expression / L. Connelly, A.T. Jacobs, M. Palacios-Callender et al. // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. - P. 26480-26487.

242. Mannick, J.B. Immunoregulatory and antimicrobial effects of nitrogen oxides / J.B. Mannick // Proc. Am. Thorac. Soc. 2006. - Vol. 3, N 2. - P. 161-165.

243. Marshall, H.E. Nitrosative stress-induced apoptosis through inhibition of NF-kappa B / H.E. Marshall, J.S. Stamler // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. -P. 34223-34228.

244. Matata, B.M. Peroxynitrite is an essential component of cytokinesproduction mechanism in human monocytes through modulation of nuclear factor-kappa B DNA binding activity / B.M. Matata, M. Galinanes // J. Biol. Chem. -2002. Vol. 277. - P. 2330-2335.

245. Maternal glutathione S-transferase GSTP1 genotype is a specific predictor of phenotype in children with asthma / W.D. Carroll, W. Lenney, F. Child et al. // Pediatr. Allergy Immunol. 2005. - Vol. 16, N 1. - P. 32-39.

246. McLeish, S. Gene environment interactions in asthma / S. McLeish, S.W. Turner // Arch. Dis. Child. 2007. - Vol. 92. - P. 1032-1035.

247. Mechanism of transfer of NO from extracellular S-nitrosothiols into the cytosol by cell-surface protein disulfide isomerase / N. Ramachandran, P. Root, X.M. Jiang et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - Vol. 98. - P. 9539-9544.

248. Mechanisms of asthma and allergic inflammation oxidative stress and genetic and epidemiologic determinants of oxidant injury in childhood asthma / H. Ercan, E. Birben, E.A. Dizdar et al. // J. Allergy Clin. Immunol. 2006. -Vol. 118, N5.-P. 1097-1104.

249. Mechanisms of virus-induced asthma exacerbations: state-of-the-art ary

250. GA~LEN and interairways document / N.G. Papadopoulos, P. Xepapadaki, P. Mallia // Allergy. 2007. - Vol. 62, N 5. - P. 457-470.

251. Mitchell, D.A. Thioredoxin catalyzes the S-nitrosation of the caspase-3 active site cysteine / D.A. Mitchell, M.A. Marietta // Nat. Chem. Biol. 2005. -Vol. l.-P. 154-158.

252. Modulation of airway epithelial cell ciliary beat frequency by nitric oxide / B. Jain, I. Rubinstein, R.A. Robbins et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. - Vol. 191. - P. 83-88.

253. Molecular cloning and characterization of human endothelial nitric oxide synthase / P.A. Marsden, K.T. Schappert, H.S. Chen et al. // FEBS Lett. 1992. -Vol. 307.-P. 287-293.

254. Molecular cloning and expression of inducible nitric oxide synthase from human hepatocytes / D.A. Geller, C.J. Lowenstein, R.A. Shapiro etal. // Proc. Natl.

255. Acad. Sci. U.S.A. 1993. - Vol. 90. - P. 3491-3495.

256. Molecular cloning, structure, and chromosomal localization of the human inducible nitric oxide synthase gene / N.A. Chartrain, D.A. Geller, P.P. Koty et al. // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. - P. 6765-6772.

257. Molecular mechanism for activation and regulation of matrix metalloproteinases during bacterial infections and respiratory inflammation / T. Okamoto, T. Akuta, F. Tamura et al. // Biol. Chem. 2004. - Vol. 385. -P. 997-1006.

258. Mucosal nitric oxide may tonically suppress plasma exudation / J.S. Erjefalt, I. Erjefalt, F. Sundler, C.G. Persson // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1994. Vol. 150. - P. 227-232.

259. Multiple contributing roles for NOS2 in LPS-induced acute airway inflammation in mice / T. Okamoto, K. Gohil, E.I. Finkelstein et al. // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2004. - Vol. 286. - P. 198-209.

260. Myeloperoxidase and protein oxidation in cystic fibrosis / A. Van Der Vliet, M.N. Nguyen, M.K. Shigenaga et al. // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2000. - Vol. 279. - P. 537-546.

261. Nathan, C.F. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens / C.F. Nathan, M.U. Shiloh // Proc. Natl. Acad. Sci. 2000. - Vol. 97. - P. 8841-8848.

262. Nathan, C.F. Role of nitric oxide synthesis in macrophage antimicrobial activity / C.F. Nathan, I.B. Hibbs // Curr. Opin. Immunol. 1993. -Vol. 3. - P. 65-70.

263. Nevin, B.J. Nitric: oxide in respiratory diseases / B.J. Nevin, K.J. Broadley // Pharmacology & Therapeutics. 2002. - Vol. 95, N 3. -P: 259-293.

264. NF-kappa B activation in airways modulates allergic inflammation butnot hyperresponsiveness / M.E. Poynter, R. Cloots, T. van Woerkom et al. // J. Immunol. 2004. - Vol. 273. - P. 7003-7009.

265. Nikitovic, D. S-nitrosoglutathione is cleaved by the thioredoxin system with liberation of glutathione and redox regulating nitric oxide / D. Nikitovic, A. Holmgren//J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. -P. 19180-19185.

266. Nitrative stress in refractory asthma / H. Sugiura, Y. Komaki, A. Koarai, M. Ichinose // J. Allergy Clin. Immunol. 2008. - Vol. 121, N 2. - P. 355-360.

267. Nitric oxide activates diverse signaling pathways to regulate gene expression / J. Hemish, N. Nakaya, V. Mittal, G. Enikolopov // J. Biol. Chem. -2003. Vol. 278. - P. 42321-42329.

268. Nitric oxide and S-nitrosothiols in human blood / D. Giustarini,

269. A. Milzani, R. Colombo et al. // Clinica Chimica Acta. 2003. - Vol. 330, N 1-2. -P. 85-98.

270. Nitric oxide in health and disease of the respiratory system / F.L.M. Ricciardolo, P.J. Sterk, B. Gaston, G. Folkerts // Physiol. Rev. 2004. -Vol. 84.-P. 731-765.

271. Nitric oxide in the human respiratory cycle / T.J. McMahon, R.E. Moon,

272. B.P. Luschinger et al. // Nat. Med. 2002. - Vol. 8. - P. 711-717.

273. Nitric oxide provokes tumor necrosis factor-alpha expression in adult feline myocardium through a cGMP-dependent pathway / D. Kalra, G. Baumgarten, Z. Dibbs et al. // Circulation. 2000. - Vol. 102. - P. 1302-1307.

274. Nitric oxide represses inhibitory kappaB kinase through S-nitrosylation / N.L. Reynaert, K. Ckless, S.H. Korn et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. -Vol. 101.-P. 8945-8950.

275. Nitric oxide synthase and nitric oxide production in in vivo-derived mast cells / M. Gilchrist, M. Savoie, O. Nohara et al. // J. Leukoc. Biol. 2002. -Vol. 71.-P. 618-624.

276. Nitric oxide synthase in human and rat lung: immunocytochemical and histochemical localization / D.S. Bredt, C.J. Lowenstein, J. Drazen et al. // Am. J.

277. Respir. Cell Mol. Biol. 1993. - Vol. 9. - P. 371-377.

278. Nitric oxide synthase-immunoreactive neurons in the human and porcine respiratory tract / R.O. Diaz, A.C. Villaro, L.M. Montuenga et al. // Neurosc. Lett. -1993.-Vol. 162.-P. 121-124.

279. Nitric oxide synthase polymorphisms and asthma phenotypes in Chinese children / T.F. Leung , E.K. Liu, N.L. Tang // Clin. Exp. Allergy. 2005. - Vol. 35, N 10.-P. 1288-1294.

280. NO chemical events in the human airway during the immediate and late antigen-induced asthmatic response / R. Dweik, S. Comhair, B. Gaston et al. // PNAS. 2001. - Vol. 98, N 5. - P. 2622-2627.

281. NO but not NO radical relaxes airway smooth muscle via cGMP-independent release of internal Ca2+ / L.J. Janssen, M. Premji, L. Hwa et al. // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 2000. - Vol. 278. - P. 899-905.

282. Ogino, K. Biomarkers of oxidative/nitrosative stress: an approach to disease prevention / K. Ogino, D.H. Wang // Acta. Med. Okayama 2007. -Vol. 61, N4.-P. 181-189.

283. Park, S.W. Nitric oxide upregulates the cyclooxygenase-2 expression through the cAMP-response element in its promoter in several cancer cell lines / S.W. Park, M.W. Sung, D.S. Heo // Oncogene. 2005. - Vol. 24. - P. 6689-6698.

284. Parks, W.C. Matrix metalloproteinases as modulators of inflammation and innate immunity / W.C. Parks, C.L. Wilson, Y.S. Lopez-Boado // Nat: Rev. Immunol. 2004. - Vol. 4. - P. 617-629.

285. Pattern of NOS2 and NOS3* mRNA expression in human A549 cells and primary cultured AEC II / D.V. Pechkovsky, G. Zissel, T. Goldmann et al. // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 2002. - Vol. 282. - P. L684-L692.

286. Pearce, N. What does the odds ratio estimate in a case-control study? / N. Pearce // Int. J. Epidemiol. 1993. - V. 26, N 6. - P. 1189-1192.

287. Peroxynitrite augments fibroblast mediated tissue remodeling via myofibroblast differentiation / T. Ichikawa, H. Sugiura, A. Koarai et al. // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 2008. - Vol. 295, N 5. - P. 800-808.

288. Pilz, R.B. Regulation of gene expression by cyclic GMP / R.B. Pilz, D.E. Casteel // Circ. Res. 2003. - Vol. 93. - P. 1034-1046.

289. Polymorphisms at the glutathione S-transfrase GSTM1, GSTT1 and GSTP1 loci: risk of ovarian cancer by histological subtype / A.B. Spurdle, P.M. Webb, D.M. Purdie et al. // Carcinogenesis. 2001. - Vol. 22. - P. 67-72.

290. Polymorphism at the glutathione S-transferase GSTP1 locus. A new marker for bronchial hyperresponsiveness and asthma / A.A. Fryer, A. Bianco, M. Hepple et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. - Vol. 161. -P. 1437-1442.

291. Ponczek, M.B. Interaction of reactive oxygen and nitrogen species with proteins / M.B. Ponczek, B. Wachowicz // Postepy Biochem. 2005. - Vol. 51, N2.-P. 140-145.

292. Positive and negative regulation of I kappa B kinase activity through IKK beta subunit phosphorylation / M. Delhase, M. Hayakawa, Y. Chen, M. Karin // Science. 1999. - Vol. 284. - P. 309-313.

293. Protection from experimental asthma by an endogenous bronchodilator / L.G. Que, L. Liu, Y. Yan et al. // Science. 2005. - Vol. 308. - P. 1618-1621.

294. Protein S-nitrosylation: purview and parameters / D.T. Hess, A. Matsumoto, S.O. Kim et al. // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2005. - Vol. 6. -P. 150-166.

295. Proteins and lipids define the diffusional field of nitric oxide / D.M. Porterfield, G.D. Laskin, S.K. Jang et al. // Am. J. Phisiol. Lung. Cell. Mol. Phisiol. 2001. - Vol. 281. - P.904-912.

296. Proteins as biomarkers of oxidative/nitrosative stress in diseases: thecontribution of redox proteomics / I. Dalle-Donne, A. Scaloni, D. Giustarini et al. // Mass Spectrom. 2005. - Vol. 24. - P. 55-99.

297. Proteolitic cleavage of inducible nitric oxide synthase (iNOS) by calpain I / G. Walker, J. Pfeilschifter, U. Otten, U. Kunz // J. BioChem. Biophys. Acta. -2001.-Vol. 1568.-P. 216-224.

298. Proteolytic degradation of nitric oxide synthase: effect of inhibitors and role of hsp90-based chaperones / Y. Osawa, E.R. Lowe, A.C. Everett et al. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003. - Vol. 304. - P. 493^149.

299. Pulmonary neutrophil infiltration in murine sepsis: role of inducible nitric oxide synthase / H.M. Razavi, F. Wang, S. Weicker et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004. - Vol. 170. - P. 227-233.

300. Purication and cDNA sequence of an inducible nitric oxide synthase from a human tumor cell line / P.A. Sherman, V.E. Laubach, B.R. Reep, E.R. Wood // Biochemistry. 1993. - Vol. 32. - P. 11600-11605.

301. Quantitative identification of protein nitration sites / G. Chiappetta, C. Corbo, A. Palmese et al. // Proteomics. 2009. - Vol. 9, N 6. - P. 1524-1537.

302. Radi, R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration / R. Radi // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004. - Vol. 101. - P. 4003-4008.

303. Radi, R. Reactions of nitric oxide with metalloproteins / R. Radi // Chem. Res. Toxicol. 1996. - Vol. 9, N 5. - P. 828-835.

304. Raed, A. NO chemical events in the human airway during the immediate and late antigen-induced asthmatic response / A. Raed, K. Dwei, A. Suzy et al. // PNAS. 2001. - Vol 58, N 5. - P. 2622-2627.

305. Reactive nitrogen species and tyrosine nitration in the respiratory tract: epiphenomena or a pathobiologic mechanism of disease? / A. van der Vliet, J.P. Eiserich, M.K. Shigenaga, C.E. Cross // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1999. -Vol. 160.-P. 1-9.

306. Reactive oxygen and nitrogen species in inflammatory process / RRutkowski, S.A. Pancewicz, K. Rutkowski, J. Rutkowska // Pol. Merkur.1.karski-2007.-Vol. 23, N 134.-P. 131-136.

307. Regulation of amiloride-sensitive Na+ transport by basal nitric oxide / K.M. Hardiman, C.M. McNicholas-Bevensee, J. Fortenberry et al. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2004. - Vol. 30. - P. 720-728.

308. Regulation of apoptosis by nitrosative stress / K.M. Kim, P.K. Kim, Y.G. Kwon et al. // J. Biochem. Mol. Biol. 2002. - Vol. 35, N 1. - P. 127-133.

309. Regulation of ciliary beat frequency by the nitric oxide-cyclic guanosine monophosphate signaling pathway in rat airway epithelial cells / D. Li, G. Shirakami, X. Zhan, R.A. Johns // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2000. - Vol. 23. -P. 175-181.

310. Regulation of eosinophil apoptosis by nitric oxide: Role of c-Jun-N-terminal kinase and signal transducer andactivator of transcription 5 / X. Zhang, E. Moilanen, A. Lahti et al. // J. Allergy Clin. Immunol. 2003. - Vol. 112. -P. 93-101.

311. Regulation of ion channel structure and function by reactive oxygen-nitrogen species / S. Matalon, K.M. Hardiman, L. Jain et al. // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. -2003. Vol. 285. - P. 1184-1189.

312. Regulatory effects of iNOS on acute lung inflammatory responses in mice / C.L. Speyer, T.A. Neff, R.L. Warner et al. // Am. J. Pathol. 2003. -Vol. 163.-P. 2319-2328.

313. Relationship between genotype and enzyme activity of glutathione S-transferases Ml and PI in Chinese / S.L. Zhong, S.F. Zhou, X. Chen et al. // Eur. J. Pharm. Scien. 2006. - Vol. 28, N 1-2. - P. 77-85.

314. Relationship between glutathione S-transferase gene polymorphisms and enzyme activity in Hong Kong Chinese asthmatics / J.C. Mak, S.P. Ho, H.C. Leung et al. // Clin. Exp. Allergy. 2007. - Vol. 37, N 8. - P. 1150-1157.

315. Reversal of impaired wound repair in iNOS-deficient mice by topical adenoviral-mediated iNOS gene transfer / K. Yamasaki, H.D. Edington, C. McClosky et al. //J. Clin. Invest. 1998. - Vol. 101. - P. 967-971.

316. Reversing the defective induction of IL-10-secreting regulatory T cells in glucocorticoid-resistant asthma patients? / E. Xystrakis, S. Kusumakar, S. Boswell et al. // Clin. Invest. 2006. - Vol. 116. - P. 146-155.

317. Revisiting the kinetics of nitric oxide (NO) binding to soluble guanylate cyclase: the simple NO-binding model is incorrect / D.P. Ballou, Y. Zhao, P.E. Brandish, M.A. Marietta // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99. -P. 12097-12101.

318. Reynaert, N.L. Nitric oxide and redox signaling in allergic airway inflammation / N.L. Reynaert, K. Ckless, E.F. Wouters // Antioxid. Redox. Signal. -2005.-Vol. 7.-P. 129-143.

319. Richardson, G. Potential therapeutic uses for S-nitrosothiols / G. Richardson, N. Benjamin // Clin. Sci. Lond. 2002. - Vol. 102, N 1. - P. 99-105.

320. Role of circulating nitrite and S-nitrosohemoglobin in the regulation of regional blood flow in humans / M.T. Gladwin, J.H. Shelhamer, A.N. Schechter et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - P. 11482-11487.

321. Romagnani, S. Regulatory T cells: which role in the patogenesis and treatment of allergic disorders? / S. Romagnani // Allergy. 2006. -Vol. 61, N 1. -P. 3-14.

322. Sadikot, R.T. Targeted immunomodulation of the NF-kappa B pathway in airway epithelium impacts host defense against Pseudomonas aeruginosa / R.T. Sadikot, H. Zeng, M. Joo // J. Immunol. 2006. - Vol. 176. - P. 4923^1930.

323. Schwartz, D.A. Environmental genomics; a key to understanding biology, pathophysiology and disease / D.A. Schwartz, J.H. Freedman, E.A. Linney // Hum. Mol. Genet. 2004. - Vol. 13. - P. 217-224.

324. Shaojin, D. S-nitrosylation/denitrosylation and apoptosis of immunecells / D. Shaojin, C. Chang // Cell. Mol. Immunol. 2007. - Vol. 4, N 5. - P. 353-358.

325. Shaul, P.W. Regulation of endothelial nitric oxide synthase: location, location, location / P.W. Shaul // Annu Rev Physiol. 2002. - Vol. 64. - P. 749-774.

326. Singel, DJ. Chemical physiology of blood flow regulation by red blood cells: the role of nitric oxide and S-nitrosohemoglobin / D.J. Singel, J.S. Stamler // Ann. Rev. Physiol. 2005. - Vol. 67. - P. 99-145.

327. S-nitrosoglutathione as a substrate for y-glutamyl transpeptidase / N. Hogg, R. Singh, E. Konorev et al. //Biochem. J. 1997. - Vol. 323. - P. 477-481.

328. S-nitrosoglutathione breakdown prevents airway smooth muscle relaxation in the guinea pig / K. Fang, R. Johns, T. Macdonald et al. // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2000. - Vol. 279. - P. 716-721.

329. S-nitrosoglutathione inhibits aradrenergic receptor-mediated vasoconstriction and ligand binding in pulmonary artery / E. Nozik-Grayck, E. Whalen, J.S. Stamler et al. // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 2006. -Vol. 290.-P. 136-143.

330. S-Nitrosoglutathione reductase an important regulator in human asthma / L.G. Que, Z. Yang, J.S. Stamler et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2009. -Vol. 180, N3.-P. 226-231.

331. S-nitrosohemoglobin: a dynamic activity of blood involved in vascular control / L. Jia, C. Bonaventura, J. Bonaventura, J.S. Stamler // Nature. 1996. -Vol. 380.-P. 221-226.

332. Blood flow regulation by S-nitrosohemoglobin in the physiological oxygen gradient / J.S. Stamler, L. Jia, J.P. Eu et al. // Science. 1997. - Vol. 276, N5321.-P. 2034-2037.

333. S-Nitrosothiol signaling in respiratory biology / B. Gaston, D. Singel, A. Doctor, J.S. Stamler // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2006. - Vol. 173. -P. 1186-1193.

334. S-Nitrosothiols inhibit cytokine-mediated induction of matrix metalloproteinase-9 in airway epithelial cells / T. Okamoto, G. Valacchi, K. Gohil etal. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2002. - Vol. 27. - P. 463-473.

335. S-nitrosothiols signal the ventilatory response to hypoxia / A. Lipton, M. Johnson, T. Macdonald et al. //Nature. 2001. - Vol. 413. - P. 171-174.

336. S-Nitrosylated GAPDH initiates apoptotic cell death by nuclear translocation following Siahl binding / M.R. Hara, N. Agrawal, S.F. Kim et al. //Nat. Cell Biol. 2005. - Vol. 7. - P. 665-674.

337. S-nitrosylation of matrix metalloproteinases: signaling pathway to neuronal cell death / Z. Gu, M. Kaul, B. Yan et al. // Science. 2002. - Vol. 297. -P. 1186-1190.

338. S-nitrosylation of mitochondrial caspases / J. Mannick, C. Schonhoff, N. Papeta et al. // J. Cell. Biol. 2001. - Vol. 154. - P. 1111-1116.

339. Sparkman, L. Nitric oxide increases IL-8 gene transcription and mRNA stability to enhance IL-8 gene expression in lung epithelial cells / L. Sparkman, V. Boggaram // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2004. - Vol. 287. -P. 764-773.

340. Stability of asthma control with regular treatment: an analysis of the Gaining Optimal Asthma controL (GOAL) study / E.D. Bateman, J. Bousquet, W.W. Busse et al. // Allergy. 2008. - Vol. 63, N 7. - P. 932-938.

341. Stamler, J.S. Fang nitrosylation the prototypic redox-based signaling mechanism / J.S. Stamler, S. Lamas, C. Ferric // Cell. 2001. - Vol. 106, N 6. -P. 675-683.

342. Stamler, J.S. Oxidative modifications in nitrosative stress /J.S. Stamler, A. Hausladen//Nat. Struct. Biol. 1998. - Vol. 5, N4.-P: 247-249.

343. Structural characterization of nitric oxide synthase isoforms reveals striking active-site conservation / T.O. Fischmann, A. Hruza, X.D. Niu et al. // Nat.

344. Struct. Biol. 1999. - Vol. 6, N 3. - P. 233-242.

345. Structural organization of the human neuronal nitric oxide synthase gene (NOS1) / A.V. Hall, H. Antoniou, Y. Wang et al. // J. Biol. Chem. 1994. -Vol. 269.-P. 33082-33090.

346. Structure and chromosomal localization of the human constitutive endothelial nitric oxide synthase gene / P.A. Marsden, H.Q. Heng, S.W. Scherer et al. // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268. - P. 17478-17488.

347. Stuehr, D.J. Arginine metabolism: enzymology, nutrition, and clinical significance enzymes of the L-arginine to nitric oxide pathway / D.J. Stuehr // J. Nutr. 2004. - Vol. 134. - Suppl. - P. 2748-2751.

348. Stuer, D. Oxygen reduction by nitric-oxide synthases / D. Stuer, S. Pou, G.M. Rosen // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 14533-14536.

349. Subcellular targeting and differential S-nitrosylation of endothelial nitric-oxide synthase / P.A. Erwin, D.A. Mitchell, J. Sartoretto et al. // J. Biol. Chem.-2006.-Vol. 281.-P. 151-157.

350. The association between glutathione S-transferase PI, Ml polymorphisms and asthma in taiwanese schoolchildren / Y.L. Lee, T.R. Hsiue, Y.C. Lee et al.//Chest. 2005.-Vol. 128.-P. 1156-1162.

351. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and 02 / D.D. Thomas, X. Liu, S.P. Kantrow, J.R. Lancaster // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - Vol. 98. - P. 355-360.

352. The catabolic fate of nitric oxide: the nitric oxide oxidase and peroxynitrite reductase activities of cytochrome oxidase / L.L. Pearce, A.J. Kanai, L.A. Birder et al. // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 13556-13562.

353. The genetic dissection of complex traits in a founder population / C. Ober, M. Abney, M.S. McPeek // Am. J. Hum. Genet. 2001. - Vol. 69, N 5. -P. 1068-1079.

354. The human liver glutathione S-transferase gene superfamily: expression and chromosome mapping of an Hb subunit cDNA / J.L. De Long, T.M. Chang,i r

355. J. Whang-Peng et al. // Nucleic. Acid Res. 1988. - Vol. 16. - P. 8541-8554.

356. The role of epithelial NO in airway viral infection / W. Xu, S. Zheng, R.A. Dweik, S.C. Erzurum // Free Radic. Biol. Med. 2006. - Vol. 41, N 1. - P. 1928.

357. Theoretical evidence for enhanced NO dimerization in aromatic hosts: implications for the role of the electrophile NO2 in nitric oxide chemistry / Y.L. Zhao, M.D. Bartberger, K. Goto et al. // J. Am. Chem. Soc. 2005. - Vol. 127. -P. 7964-7965.

358. Three members of the nitric oxide synthase II gene family (NOS2A, NOS2B, and NOS2C) colocalize to human chromosome 17 / K.D. Bloch, J.R. Wolfram, D.M. Brown et al. // Genomics. 1995. - Vol. 27. - P. 526-530.

359. Timoshenko, A.V. Presentation of NO metabolites (nitrate/nitrite) in blood sereum and pleural effusions from cancer patients with pleurisy / A.V. Timoshenko, O.V. Maslakova, B. Werle // Cancer. Lett. 2002. - Vol. 182. -P. 93-99.

360. Two closely linked but separable promoters for human neuronal nitric oxide synthase gene transcription / J. Xie, P. Roddy, T.K. Rife et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1995. - Vol. 92. - P. 1242-1246.

361. Type I nitric oxide synthase in the human lung is predominantly expressed in capillary endothelial cells / H. Luhrs, T. Papadopoulos, H.H. Schmidt, T. Menzel // Respir. Physiol. 2002. - Vol. 129. - P. 367-374.

362. Tyrosine nitration on p65: a novel mechanism to rapidly inactivate nuclear factor-kappa B / S.W. Park, M.D. Huq, X. Hu, L.N. Wei // Mol. Cell: Proteomics. 2005. - Vol: 4. - P. 300-309.

363. Wang, Y.H. The IL-17 cytokine family and their role in allergic inflammation / Y.H Wang, Y.J Liu // Curr Opin Immunol. 2008. - Vol. 20. -P. 697-702.

364. Watkins, D.N. Regulation of the inducible cyclo-oxygenase pathway in human cultured airway epithelial (A549) cells by nitric oxide / D.N. Watkins,

365. M.J. Garlepp, P.J. Thompson //Br. J. Pharmacol. 1997. - Vol. 121. - P. 1482-1488.

366. Wechsler, M.E. Exhaled nitric oxide in patients with asthma. Association with NOS1 genotype / M.E. Wechsler, H. Grasermann // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. - Vol. 162, N 6. - P. 2043-2047.

367. Wenzel, S.E. Asthma: defining of the persistent adult phenotypes / S.E. Wenzel // Lancet. 2006. - Vol. 368. - P. 804-813.

368. Wong, H.R. Nuclear factor-kappa B and nitric oxide regulating life and death: nonsense or harsh reality? / H.R. Wong // Am. J. Respir. Crit. Care Med.1998. Vol. 26. - P. 1470-1471.

369. Xanthine oxidase-mediated decomposition of S-nitrosothiols / M. Trujillo, M. Alvarez, G. Peluffo et al. // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. -P. 7929-7934.

370. Xue, C. Localization of endothelial NOS at the basal microtubule membrane in ciliated epithelium of rat lung / C. Xue, S J. Botkin, R.A. Johns // J. Histochem. Cytochem. 1996. - Vol. 44. - P. 463-471.

371. Zandi, E. Bridging the gap: composition, regulation, and physiological function of the I kappa B kinase complex / E. Zandi, M. Karin // Mol. Cell. Biol.1999.-Vol 19.-P. 4547-4551.

372. Zhang, Y. S-Nitrosothiols: cellular formation and transport / Y. Zhang, N. Hogg // Free Radic. Biol. Med. 2005. - Vol. 38, N 7. - P. 831-838.

373. Zheng, S. Impaired innate host defense causes susceptibility to respiratory virus infections in cystic fibrosis / S. Zheng, B.P. De, S. Choudhary // Immunity. 2003. - Vol. 18. - P. 619-630.

374. Анализируемый показатель Периферическая кровь Бронхиальный смыв Конденсат выдыхаемого воздуха Бронхобиоптат

375. Больные БА Контроль Больные БА Контроль Больные БА Контроль Больные БА Контроль

376. МДА 1, 3 визит 1 визит 1, 3 визит 1 визит

377. СОД 1, 3 визит 1 визит 1, 3 визит 1 визитвБН 1,3 визит 1 визит 1, 3 визит 1 визит 1. ОЭШ 1, 3 визит 1 визит

378. Нитриты 1, 3 визит 1 визит 1, 3 визит 1 визит3.НТ 1,3 визит 1 визит

379. ИЛ-4 1, 3 визит 1 визит 1, 3 визит 1 визит

380. ИЛ-8 1, 3 визит 1 визит 1, 3 визит 1 визит

381. ФНО-а 1, 3 визит 1 визит 1, 3 визит 1 визит

382. ИНФ-у 1, 3 визит 1 визит 1, 3 визит 1 визитобщ 1, 3 визит 1 визит 1, 3 визит 1 визит

383. Мочевина 1, 3 визит 1 визит 1, 3 визит 1 визитмРНК N081 1, 3 визитшVШNOS2 1, 3 визитмРНК N083 1, 3 визит

384. Полиморфизм в8ТТ1 1 визит 1 визитв8ТМ1 1 визит 1 визит 1. N081 1 визит 1 визит 1. N082 1 визит 1 визит 1. N083 1 визит 1 визит

385. Микроскопия 1, 3 визит1. Информированное согласие1. Название программы

386. Механизмы участия нитрозилирующего стресса в формировании клинического полиморфизма бронхиальной астмы"1. Цель настоящей программы

387. Перед началом любой процедуры, связанной с данным исследованием, мы хотели бы, чтобы Вы ознакомились с данной информацией и, в случае

388. Вашего согласия, подписали эту страницу.

389. На все мои вопросы, относящиеся к данной программе, даны удовлетворительные ответы.

390. Я даю согласие на просмотр моей медицинской карты исследователем при условии сохранения им профессиональной конфиденциальности.

391. Я добровольно соглашаюсь принимать участие в данной программе и соглашаюсь соблюдать требования, о которых сообщил мне врач.

392. Я согласен сообщать врачу-исследователю о любых симптомах, ожидаемых или неожиданных, в случае если они появятся.

393. История болезни и/или медицинские записи, которые я передал врачу-исследователю, верны.

394. Я даю согласие на то, чтобы данные обо мне были занесены в компьютерный файл, обеспечивающий гарантию защиты лицами, определенными законодательством.

395. Я имею право обращаться к этим данным и при необходимости исправлять их через выбранного мною врача.

396. Я прочитал и понял данную основную информацию и информированное согласие, и я добровольно соглашаюсь принять участие в программе.

397. В каком возрасте поставлен диагноз1. Данные анамнеза:

398. Стаж основного заболевания

399. Характер проявления в начале заболевания1 атонический дерматит, 2 - риноконъюнктивалъный синдром, 3 -кашель. 4 - удушье)

400. При каких обстоятельствах возникли первые проявления заболевания1 пищевые продукты, 2 - при уборке помещений, 3 - укусы насекомых, 4 - в окружении животных, 5 - новые запахи, 6 - на фоне ОРЗ)

401. Как в дальнейшем протекало заболевание1 постоянно, 2 - периодически, 3 - сезонная зависимость)

402. Как часто бывают ОРЗ (1 часто; 2 - редко)

403. Есть ли при ОРЗ повышение температуры (1 да; 2 - нет)

404. Болел ли пациент воспалением легких (1 нет; 2 - да; 3 - более трех раз)

405. Причины возникновения удушья1.е сыром помещении; 2 физическая нагрузка; 3 - метеоусловия; 4 -прием лекарств; 5 - контакт с животными; 6 - запыленные помегцения; 7 -эмоциональные нагрузки; 8 - пищевые продукты)

406. Длительность вхождения в приступ (1 быстро; 2 - медленно)

407. Продолжительность приступа1 несколько часов; 2 - сутки; 3 - несколько суток)

408. Частота приступов (с указанием частоты ночных)

409. Наличие длительного светлого промежутка (1 есть; 2 - нет)1. Вы курите (1 да; 2 - нет)

410. Курят ли Ваши близкие, сослуживцы при Вас (1 есть; 2 - нет)

411. Лечение (общесуточная доза):1. СИТкортикостероиды per os1. ЖС1. Инталоподобные

412. Средства для купирования приступов

413. Другие препараты Сопутствующие заболевания:1. Поражения JIOP-органов1. Поражения ЖКТ1. Паразитоз1. Поражение почек1. Поражение ССС1. Семейный анамнез:

414. Страдают ли атопическими заболеваниями близкие родственники пациента (1 да; 2 - нет)1. Какими заболеваниями

415. БА; 2 - дерматит; 3 - РКС; 4 - лекарственная аллергия)1. Отягощенность по атопии1 нет; 2 - по материнской линии; 3 - по линии отца; 4 - по линии отца и матери одновременно)

416. Информативная родословная:

417. Примечание: черным отмечают больных Б А, белым аллергическими заболеваниями. Стрелкой отмечают пробанда - больного бронхиальной астмой, по которому была зарегистрирована семья. Квадрат - мужской пол, круг -женский.

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Механизмы участия нитрозилирующего стресса в формировании клинического полиморфизма бронхиальной астмы

Автореферат диссертации по медицине на тему Механизмы участия нитрозилирующего стресса в формировании клинического полиморфизма бронхиальной астмы

Оглавление диссертации Козина, Ольга Владимировна :: 2010 :: Томск

Введение диссертации по теме "Патологическая физиология", Козина, Ольга Владимировна, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "Механизмы участия нитрозилирующего стресса в формировании клинического полиморфизма бронхиальной астмы"

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Козина, Ольга Владимировна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций