Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Лизосомальные протеолитически ферменты при злокачественных новообразованиях яичников: значение в диагностике опухолей и оценке их метастатической способности

12 <3 0 6 9 2

Российская акаде

'Российская академия медицинских наук ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

на правах рукописи

КОЗЫРЕВА ЕЛЕНА АДЕКСАНДРОША

ЛИЗОСОМАЛЬНЫЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ПРИ ЗЯОКА'ЕСТВЕКНЫХ НОВООБРАЗОВАНИЯХ ЯИЧНИКОВ : ЗНАЧЕНИЕ В ДИАГНОСТИКЕ ОПУХОЛЕЙ И ОЦЕНКЕ ИХ МЕТАСТАТИЧЕСКОЙ СПОСОБНОСТИ

14.00.14 - онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1992

Работа выполнена в Онкологическом научном центре РАМН (Директор ~ академик РАМН К.НЛрапезников).

Научный руководитель - доктор шдадансках наук, .

профессор Л.С.Еассалык

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук Д.В.Комов

доктор медицинских наук Г.А.Яровая

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт онкологии им. Петрова, Санкт-Петербург.

Защита состоится " 1992 г. на заседании

специализированного совета при Онкологическом научном центре РАШ (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией ыокно ознакомиться в библиотеке ОВД РАМН

Автореферат разослан "/У" 1992 г.

Учений секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

В.С.Турусов

"' /

...„г! Общая характеристика работы

' ^тотальность проблемы. Проблема злокачественных опухолей яичников продолжав? оставаться чрезвычайно актуальной, что связано с высокой частотой заболевания (6—10/? всех опухолевых образований женских половых органов), трудностями ранней диагностики и неудовлетворительными результатами лечения, которые за последние десятилекия существенно не улучшились. Смертность от рака яичников стоит на первом месте среди гинекологических раков. Основной причиной летальных походов при этой патологии является раннее метастазирование и рецздивпровакие.

Особенностью метастазирования рака яичников является преобладание метастазов кшлантацконного характера в органа брюшной полости, что, по-видимому, обусловлено высокой кьвазивной способностью клеток рака яичников, которые проникают даже через такой мощный заданий барьер как брюшина. Изучение биологических механизмов такой выраженной агрессивности злокачественных опухолей яичников может явиться еще одним шагом ка пути решения этой важной проблемы онкогинекологии.

За последние несколько лет были достигнуты определенные успехи в изучении биохимических аспектов метастазировакия злокачественных опухолей. Рядом авторов, было доказано участие про-тсолитических ферментов в процессах инвазии и метастазированин (КиШпз м,1983;Н1со1зоп Н., 1984;Ыо1:*а Ь., 1989). К такзш ферментам относятся цистеиновые протеиназы - катепсины В и Ь , ас-партилъная протеиназа - катепскн о , коллагеназа, активатор плаз-шноген , которые прямо пли опосредованно принимают участие в деградации внеклеточного матрикса (ламинша, фибронектша, коллагена) и облегчают инвазию раковых клеток. Роль этих ферментов

в процессе метастазирования злокачественных опухолей'яичников практически не изучена. В начале 8С-х годов появились сообщения зарубежных авторов об обнаружении высокой активности катепси-на В в опухолях и астатической жидкости больных раком яичников, в которых было сделано предположение об участки этого фермента в процессе инвазии клеток рака яичников (когШ«.,1981;£1оале з. 1985). Однако, эти работы'не были проложены, а отечествешше исследования в этом направлении до настоящего времени отсутстзу ют.

Следует отметить такне, что ранее не проводилось изучение возможности использования протеолитпческих ферментов в целях да агностики и прогноза течения злокачественных новообразований яичников.

IIель к зада та исследования. Делъю настоящего исследования явилось изучение активности и некоторых свойств основных представителей трех групп лизосомальных протеолитических ферментов дастеиновых протеиказ - кагешлшов В и ь , аспарткльной протеи. назы - катепсина в , а такке кислой фосфатазы в опухолях, сыв< ротке крови и асцитической гадаости больных раком яичников и к значение в процессе метастазированда злокачественных опухолей яичников.

Для осуществления цели исследования были поставлены следу вдие задачи:

1. Провести определение активности лизосомальншс протеолк тических ферментов в злокачественных опухолях яичников, в сывс ротке крови, асцитической жидкости и клетках, выделенных из ас цитов больных рс.здм яичников.

2. Изучить зависимость активности протеолитических ферме! тов от биологических особенностей опухолевого процесса: гисто;

- з -

гического мша, степени дафферзвцировки клеток, размера опухо-та и стадии заболевания.

3. Сопоставитьактивность протеалиптсккх ферментов в злокачественных и доброкачест"енных опухолях яичников, а также морфологически неизмененных яичниках.

4. Изучить возмоякое диагностическое и прогностическое значение определения активности протеояиткчееких ферментов в опухолях, сыворотке крови и асцитической жидкости болышх раком яичников.

Научная новизна. Впервые в отечественной практике получены дакнке о'5 активности и свойствах ферментов катепсиков Б, ь , ю и кислой фосфатазы в опухолях п биологических ;хидкоетях больных злокачественный и доброкачественными новооеразевашяш яичников.

Показано, что существует зависимость активности цкетеико-вых протеиназ в злокачественных опухолях яичников от гистологического типа и степени дпфференцпровки клеток, а таняе отмечено, что высокая активность катепсяна В в опухолях больных раком яичников является отражением повышенной метастатической способности раковых клеток.

Впервые проведено изучение возможности использования про-тпояитическнх ферментов для диагностики и оценки прогноза течения рака яичников.

Практическая ценность. Результаты исследования показал!, что в злокачественных опухолях яичников активность лнзссомаль-шве про^еолитических ферментов и, особенно цистеияовых протеиназ - катеисинов Зль значительно повышена по сравнению с уровнем их активности в доброкачественных опухолях яичников'и морфологически неизменных яичниках. Предложено использовать определение активности катепсиков В и. ь в опухолях для дц-гнос-

тики рака яичников.

Определение активности катепсина В в злокачественных олухо лях яичников у первичных больных может быть использовано для оценки прогноза течения рака яичников: установлен критический уровень активности этого фермента, превышение которого являете? неблагоприятна'.'. прогностически признаком, указывающим на высокую вероятность развития раннего рецидива (в течение первого года после, операции) заболевания. Критический уровень активное-ти катепсика В в опухолях больных раком яичников монет быть использован как фактор индивидуального прогноза.

Для наблюдения за характером течения заболевант предаага ется также использовать определение уровня активности катепси-нов В и ь к кислой фоофатазы в сыворотке крови больных раком яичников,

Адпобацяя диссертации. Апробация диссертации проведена нг совместно! конфоренции отделений гинекологии, общей онкологии, лабораторий клинической биохимик, цитолохии НШ хшшчэекой о) 1 колопш ОНЦ РАМН, лаборатории бъотшш опухолей НИИ канцерогенеза ОЩ РАМН и кафедры Московской медицинской Академии 10 се тября 1391 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 работы, 3 сданы в печать.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах ыашшописи и состоит из введения, 3 глав/ за1Ш кия, выводов, указателя литература, вклачащего зарубе&ннх и отечественных авторов, иллюстрирована ДД^абхяшт я £ рисунками.

Содержание работы Материалы и метода исследования

Для выполнения, поставленных в работе задач было проведено клинико-лабораторше обследование 60 первичных больных раком яичников и 15 больных доброкачественными опухолями яичников. Б качестве контроля исследовались ткани 19-ти макроскопически и микроскопически неизмененных яичников и сыворотка крови -20 доноров.

Активность протэолитических ферментов - катепсинов В, -ь , в и кислой фосфатазы была исследована з удаленных во время операции опухолях и взятой до операции крови больных злокачественными и доброкачественные опухолями яичников, в тканях неизмененных яичников и крови доноров, а тадге в асцитической падкости и в клетках, выделанных из асцитов больных раком яичников.

Средний возраст больных составил 50,5 лет, у В0% больных заболевание выявлено на поздних стадиях (Ш~ГУ), преобладающим гистологическим типом злокачественны:-: опухолей являлась серозная цкетаденокарцинома - 58/5 случаев (ьегцкнозная и эндометрио-идная цкетаденокарцкнома были обнаружены у 15 и 10$ больны;: соответственно), высокая, умеренная и шгзкая степень дифферент-цировки опухолевых клеток была выявлена у 41%, 39% к 22% больных соответственно.

Оценка степони распространенности опухолевого процесса проводилась по системе ТИМ (Классификация злокачественных опухолей по системе ТцМ: Методические рекомендации, 1981).

У 38 из 60 больных раком, яичников был прослежен характер те"ешш заболевания на протяжении одного года после операции.

Гоыогенаты опухолей получали по методу Покровского (2968) в собственной модификации (Е.А.Козырева с соазт., 1991). Выде-леше клеток из асептической жидкости проводили по метод.,' Шсг^

(198I), подсчет количества разных типов клеток (опухолевых, ыштоофагов, летфоцитоз к лейкоцитов) осуществлялся в лаборатории цитологии НИИ КО ВОЗД РАШ ко методу Лкфшиц (1986 ), количество клеток каждого типа выражалось в процентах от обцего количества всех клеток в цитограмме.

Определение активности кагепскнз В проводили по методу Pete гг. (IS72) в 1<юдифшсации (А.В.Васильев с соавт., 1983) спектрофлгаоршетричесга (субстрат N -бензоил - DL аргинин ->&-нафтилаивд "serve Германия);

Определение актквно&гк кателсика L проводили с домощыр сдактрошлиоржетрического метода Kirochke (1982) ¡(субстрат

" " США)

С32- phe-arg -7BaidoMethylcovusarin Sigma '

Определение активности катепсика в проводили спектро-фотометрическкм методом Barret (19?7) (субстрат-гемоглобин, " Sigffla США.).

Определение активности кислой ФосФатази проводилось коло ршетричесшйм методом (Л.Л.Паашнцева о соавт., 1885) (субстрат 1 р-нитрофенилфосфаг, "iferfc ", Гермащщ) при определении активности простатической кислой фосфатами использовали ингибитор -ь"+" тартрат.

Для определения активности латентной оюжы катепсина В в сыворотке крови и асцитической жидкости использовался метод Mort (IS83) (активатор - дексул),

Полученные данные обрабо^щд на компьютере системы 'ÏBM а использованием программы "otatgrafic statistic!.

Результаты исследований к их обсувденке

Изучение активности лизосомалышх лротеолитических ферментов в злокачественных опухолях яичников

Исследование активности лизосомаяькых протеолигоческах £ ментов з опухолях первичных больных раком яичников, больных г

рокачественннми .опухолями яичников и в тканях морфологически неизмененных яичников показало,'что уровень активности яизосо-малышх катепсинов В, ь ,э , а также кислой фосфатьзк в злокачественных опухолях повышается по сравнении с добрскачествепшет опухолями и неизмененными яичниками, табл. I. При этом, выявлено значительное повышение активности цистеиповкх протеиназ в злокачественных опухолях: Кат В - в 18,5 и 13 раз и КатЬ - в Э и 4 раза относительно доброкачественных опухолей и неизмененных яичников соответственно (р< 0,001). Для Кати и К£ выявлена лнаь тенденция к повышению активности этих Ферментов относительно неизшненшх яичников (р>0,05) и некоторое лсвыаюняе активности Кат2 (в 1,5 раза, р<.0,05), (в 2 раза, р<0,001) и ее простатического изогаермента (в 2 раза, р<0,05) относительно доброкачественных опухолей. Обнаруженный лааи феномен преимущественного и одновременного повышения активности катепскнов В и ъ по сравнению с кателслном э в злокачественных опухолях яичников, дает основание предположить, что по-Ешпзние активности цястеиновых протеиназ является отяйчителъ-кой особенностью клеток рака яичников и, в некоторой степени, подтверждает предположение других авторов об участии катепси-нов В е 1 в каскадных реакциях ограниченного протеолиза в раковых клетках.

Високие уровни активности лизсеомальннх протсолитическкх ферментов з злокачественных опухолях яичников являются, по-ви-дилому, отражением нарушения нор.лального синтеза этих ферментов з раковкх клетках. Молекулярная основа изменения активности протеиназ в опухолях не известна, Возможные причинами могут быть мутации в генах катепсинов, нарушение транскрипции, трансляции или поеттранслявдошюго процесеинга продуктов генов

Таблица I

Активность протеолитических ферментов в злокачественных и доброкачественно; опухолях яичников и в тканях неизмененных яичников, X + «

Исследуемый !........................ Катепспны ] Ш . • ш

материал 1 .. 1 ! ¡В | ь . | {шло ль/шн/мг.белка|пмоль/мин/мг.беяка { С нмоль/мин/да.белка !Ед/мг.бел-1Ед/мг,бел-! ка ! ка ! 1

Злокачестзен-ные опухоли 983,0+99,3** 271,2+32,0** 44,814,Iх 17,9+1; 3^ 5,0+0,6х

"и = 60

Доброкачественные опухоли п = 19 53,0+9,3 29,0^4,3 28,6+9,2 8,7+0,9 2,2+0,3

Неизмененные яичники 76,7+3,4 64,3+8,1 34,7+2,7 12,2+1,8 3,1+0,6-

а = 19

х - различия статистически значимы относительно доброкачественных опухолей р<0,05

** - различия статистически значимы относительно доброкачественных опухолей --------------п / П.001

в клетках рака яичников по сравнен® с нормальной тканью, которые могут привести к появлению дополнительных форм ферментов или к усилению синтеза проферментов.

В нашем исследовании получены данные о существовании зависимости активности катепсинов В и ь от гистологического, типа, степени дафференшровки клеток, метастатической активности (стадии заболевания). Так, более высокая активность этих ферментов обнаружена в муцинозных щютаденокарвдномах, в нязкода^ференци-рованных опухолях, в опухолях, которые' активно матастазировали в органы брюшной полости и, соответственно, в опухолях больных раком яЕЧнгков с И-1У стадиями заболевания (табл. 2).

Таблица 2

Активность катепсинов в опухолях больных раком яичников в зависимости от особенностей опухолевого процесса, х + а

................................................ Характеристики злока- Катепсивн

В 1 1

чественных опухолей »

яичников голодь/отн/мг. белка ! шлолъ/ют/мг.

! белка

Гистологический тип опухоли

Серозная ЦАК в =35

Ыуцинозная ЦАК и = 9

Эндометршядная ЦАК

л = 6 иветлоклеточная ЦАК

п = 5 Другие а = 5

896,2+129,2 1228,0+270,2

1023,2+369,7 680,6+35,9 897,0+308,2

259,8+34,3 469,0+84,7

211,3+97,5

284,8+87,2

122,7+45,0

45,2+5,4 43,0+11,4

44,8+13,2

32,9+3,0

54,1+13,2

Степень дафференцировки высокая п = 20 упревшая ц - 16 ягзкая п = Ю

831,5+182,2 1103,7+211,0 1209,6+270,2

212,1+44,5 321,1+49,7 274,3+69,8

45,1+6,5

60,0+10,9

33,2+6,3

Стадия заболевания 1-И П1-1У

332,6+250,9 1052,4+108,9

247,9+55,0 276,4+37,7

37,2+6,0 46,4+4,7

Следует отметить, что наиболее выраженные изменения активности выявлены для Кат В - активность этого фермента оказалась в 2 раза вкше в тех злокачественных опухолях яичников, которые метастазировади по бршине и в 1,6 раз выше в тех, которые давали метастазы в большой сальник, по сравнению с уровнем активности в кеметастаэирувдих опухолях (р<0,01), табл. 3.

Таблица 3

Активность катедсиков в опухолях больных раком яичников в зависимости от наличия или отсутствия метастазов в брюшной полости, X + Ш

Катепсины

Группы больных 1 в з, | У

(Пмоль/мнн/кг. ; белка имоль/мин/мг.} белка } НШЛЬ/МИН/МГ белка

I. С метастазам! э брюшину 1078,0+113,5х 256,9+30,7 48,3±5,0

п = 46

2. Без метастазов в брюшину 586,2+106,9 222,5^48,7 37,5+5,0

п = 14

4. С метастазами в большой сальник 1084,4+119,7 267,0+32,2 44,0+5,2

п — 43 -

5. Без метастазов в большой сальник 622,6+95,6 203,3+41,5 38,2+3,8

и = 17

х - различия^мезду' группами I и 2 статистически значимы

^ - различия мезду группами 4 и 5 статистически значимы р<0,01

В литераторе имеются данные о том, что гистологический тш злокачественных опухолей яичников оказывает влияние на частоту метастазирования и муцююзные цистаденокарциномы мотастазируют

>ежв (в 665? случаев), чем серозные и зндометрпоиднне раки (в 78$ ¡лучаев). Однако, у исследуемых наш больных муццнознши злока-гественными опухолями метастазы были выявлена более часто - в ?7% случаев. Известно таюы, что зизкода&^ренвдроэшшый рак яичников метастазирует в 1,6 раза чаде, чем зысокодафферекцкрован-ешй (В.1.Вшо1\уров, IS85).

Кньо.1И словами, более высокая активность цкстеиковых протеи-наз и, особенно, кйтепаина В, обнарукена з опухолях, которые по своей природе являются более злокачественными и агрессивными, что, до-видигаму^ связано с особенностями их гистогенеза к эмбриогенеза. Полученные наш данные согласуются с результатами исследований активности цкстеиновых протекказ в клеточных линиях ышшных меланом BIS с разным метастатическим потенциалом, согласно которым, активность катепснна В в малаксмах с высоким метастатическим потенциалов во много раз вше, чем в меланомах с низкой метастатической способностью (sioano в., I986;Rcchin I., IS89).

В ходе статистической обработки полученных данных бнли выявлены выраженные индивидуальные колебания уровней активности лизосомальккх протеиназ в опухолях больных раком яичников (для Кат В - от 100,0 до 2901,0 пюль/шн/мг. белка, для Кат X - от 12,0 до 980,0 шоль/ман/мг.белка и для Кат а - от 12,4 до 166,0 пмоль/мин/мг.белка). Подобные различия в уровнях активности ферментов, скорее всего, связаны ^ тем, что злокачественные опухоли находились на разных стадиях опухолевой прогрессии и, соответственно,- обладали разным метастатическим фенотипом. Это предположение в целом подтвердилось в ходе дальнейшего исследования: в связи с тем, что в злокачественных опухолях яичников обнаружено резкое повышение активности Кат В при наличии указанных шщивидуальных колебаний, .нами определен критический уровень активности этого Фврглзнта, пол^ченаС. cs^Tcr^nc^r • '

ке данных, равный: медиане и составившей 723,5+100,0 пмоль/шш/ мг.белка, рис. I.

В зависитете,от критического уровня все больные раком яичников били разделены на две группы: 1-е низкой активность Кат В в опухолях ( 723,5+100,0 тюль/шн/мг.белка) а П - с высокой активностью Кат В в опухолях (723,5+100,0 тюлъ/ьш/ьк белка), при этом количество больннх в группах оказалось одина* вым и равнш 30.

Сравнительное изучение некоторых особенностей роста злокг чественнкх спролей у больных выд ленных нами групп показало, что у больных раком яичников с высокой активностью Кат В в о л,1 холях (11-я группа) более часто обнаруживаются опухоли с низко) степенью дафференцировки клеток (25$) и Ш-1У стадии заболевай {Ь2%}, чем у больных с низкой активностью Кат В в опухолях (Ь группа) - 12 и 73$ соответственно. При этом, у больных второй группы чаще выявлялось метастатическое поракение брюшины (87$ большого сальника (Щь), капсулы печени (28$) и петель кишечк ч ка {30%), чем у больных 1-й группы (67%, 60$, 18$ к 6,6% соот ветственно).

Обнаружено такке, что у больных П-й грушей Частота внявл ниа равних.рецидивов рака яичников была более чем в два раза выше (86$), по сравнению с больными 1-й группы (40$),

Ретроспективный анализ характера течения заболевания у 38 больных раком яичников показал, что у тех больных, у кото| были выявлены ранние рецидивы рака яичников (в течение первот года после операции) активность Кат В в удаленных во время о] рации опухолях ге только превышала критический уровень актив] сти, но и была выше, чег,: у больных без рецидивов за гот же т од наблюдения, табл. 4.

Pre.т.Распределение больных раком яичников в зависимости от уровня активности катепсина В в опухолях.

и СО

2 3

Активность катепсина В пмоль/мин/мг.бел. ( х 1000 ) .

Таблица 4

Активность лротеолиткческих ферментов в злокачественных опухолях больных раком яичников прослеженным течение?/, заболевания, X + т

Группы больных т ............ 1 Катепсизы ; _ КФ ^ 1Ш Щц/мг.белка

; В 1пмоль/мин/мг.белка ^ ! р белка тлоль/шн/мг. бо лжа| мкмоль/мин/мг. бел4-! ка !

Больные с рецидивом и = 25 1420,0+102,2х 321,0+49,6х 56,8+6,7 18,6+2,6 4,5+0,6

Больные з

ремиссии 591,6+110,0 142,0+38,5 46,7+3,5 19,9+2,9 5,3+1,3

и= 13

х - различия между сравнмваеглыми группами статистически значимы, р<0,01

- 1Ь -

Однако, наш отмечено, что опухоли некоторых больных раком кчников, в которых активность Кат В была низкой (от 74,0 до

,0 пмоль/мин/мг.балка), такЕе активно метастазирсвали и рецидивировали. По-видимому, эти опухоли в момент операции находились на том этапе развития, тогда ухе произошла секреция фермента из опухоли, которая не восполнилась его синтезом. Скорее всего'не все клетки рака яичников обладают способностью к синтезу больного количества протеолитических ферментов, а их метастатическая активность осуществляется за счет вовлечения других механизмов.

Исследование активности протеслитических ферментов в первичных злокачественных опухолях яичников и метастатических узлах большого сальника одних и тех не больных выявило выраженную тенденцию к повышению активности Кат В и Кат ь в метастазах большого сальника по сравнению с первичными опухолями, табл. 5. | , Таблица 5

Активность протеолитических ферментов в первичных и метастатических злокачественных опухолях яичников, х + т

т

Исследуемый 1 материал !

Катепсины

В

ъ

п

{ №

! Ей/ют,

•вмоль/мин/ !пмольЛяш/!пмоль/етц/ <3едка !мг.белка !мг.балка ! мг.белка!

ИКФ Вд/мг. белка

Первичная опухоль

/ п = 29

/

; Метастазы в большой саль ник

п

= 29

920,0+ 209,9+ 39,8+ 16, Е* 4,2+

174,0 39,5 4,1 1,9 0,4

1393,5+ 262,0+ 43,7+ 19,3+ 5,6±

' 203,6 32,0 3,4 1,6 0,7

Эти данные дают основание предполагать, что метастатические опухоли в брюшной полости образуют те клони клеток первичных злокачественных опухолей яичников, которые синтезируют и, возможно, секретируют повышенные количества протеиназ.

Било проведено таете изучение частоты повышения активности яизосомальных протеолитических ферментов в опухолях и неизмененных яичниках. Критерием оценки повышения активности ферментов явилась величина активности какдого фермента X + 2 2> , рассчитанная для тканей неизмененных яичников и составившая для Кат В, Кат ъ - Ю5,5 и 133,3 шголь/мин/мг.белка соответственно, для Кат в - 57,7 нмоль/шн/мг.белка, для Ш и ПК© - 27,6 и 8,7 нмоль/мин/мг.белка соответственно. У большинства большее раком яичников частота повышения активности Кат В и Кать оказалась намного выше, чем других ферментов - 93,3 и 65^ соответственно при низкой частоте повышения активности этих ферментов в доброкачественных опухолях яичников - 5 и 0% соответственно, табл. 6. Эти данные свидетельствуют о высокой чувствительности и специфичности повышения акт.шности Кат В к Кат ъ в злокачественных опухолях яичников к возможности использования их доя диагностики.

Изучение активности лизосомальных протеолитических ферментов в сыворотке крови больных злокачественными и доброкачественными опухолями яичников

Обнаружено * что активность катепешов В,1> и В в сыворотке крови больных раком яичников соответственно в 4, 2 и 1,8 раза вше, чем в сыворотке крови доноров (р<0,01), табл. 7. Различия в уровнях активности протеиназ в сыворотке крови больных злокачественными и доброкачественными опухолями яичников были статистически значимы только для катепсинов В и ъ (р<0,01), а для Кат X) они были незначительны. Основной причиной увеличения активности протеиназ в крови больных раком яичников является, скорее всего, повышение активности этих ферментов в самих злокачественных опухолях. Возможно это происходит в результате нарушения

Таблица 6

Частота повышения "активности протеолиткческих ферментов 5 злокачественных и доброкачественных опухолях яичников и в тканях неизмененных яичников

Исследуешй |..... " Кат В | Кат 1 { Кат 0 | КВ V » ГШ

материал (число!частота {число ;слу- ¡повышения¡случаев ! % !чаев ¡частота 'число ¡частота ! число '.частота ¡число ! повышения! случа-довыщения! с лу- ! повышения! о луча! % 1 ев ! % '.чаев ! % ! ев 1 частота -! повышения ! %

Злокачественные опухоли 56 93,3 39 65 II 18,3 5 8 8 13

и = 60

- -- а. „. . . ~

Доброкачественные опухоли Г 5х 0 ООО 00 0 0

•п= 19

Неизмененные яичники 0 0 X 5 15 I 10,5 I 5

Пв 19

Таблица 7

Активность протеолитических ферментов в сыворотке крови больных злокачественными и доброкачественными опухолями яичников и доноров, X ±т

Группы обследования ; Катепсины 1® I ПКФ

I В { ь { ¡нмоль/мин/мл , тлохь/тп/ж | кмоль/мин/шг Ед/л { Е&/л !

Больные злокачественными новообразованиями 50 о.эв+о^э** о,о4+р,оо2хх*х 33,4+1, Т**»* 9,2+0,4ХХ<

Больные доброкачественными новообразованияш! 71= 15 О.^О.Об^ 0,03+0,001 20,3±2,4 4,4±0,2 0,56+0,03

Доноры п = 20 0,25+0,02 0,02+0,001 18,110,3 3,05+0,3 0,47+0,07

х - различия статистически значимы относительно больных доброкачественными опухолями (р<0,01)

-различая статистически значимы относительно доноров (р<0,001)

баланса в системе эндогенных ингибиторов- протеиназ (oit - НИ, е^-ТПИ и -макроглобулина) при снижении активности последних. Несколько неожиданными оказались полученные нами дашше об увеличений активности KS и ее простатического изофермента в сыворотке крови больных раком яичников по сравнению с же активностью в крови доноров (в 3 и 2 раза соответственно, р< 0,001) ж больных доброкачественными опухолями яичников (в 2 и 1,7 раз соответственно, р < 0,01), так как повышение активности этих ферментов в злокачественных опухолях яичников по сравнению с контролем было невелико. Возможно, что Ш, синтезируясь в раковых клетках, бистро сокретируетея в кровь, не успевая накапливаться, либо повышение активности К& носит неспецифический характер (поступление фермента из клеток крови, которые разрушаются при токсическом действии опухоли).

Мы показали, что активность Кат В и сыворотке крови повышается после воздействия пепсина в кислой среде in vitro и предположили, что фермэст находится в латентной форме и, тает быть, поэтому не в полной мере проявляет свои протеолитическую активность по отношению к используемому нами субстрату. Показало, также, что интенсивность активации Кат В пепсином в сыворотке кррви больных раком яичников в 3,5 раза выше, чем.в сыворотке■кро?и

больных доброкачественными опухолями (в 1,5'раза).ид<>норов (в / ' 1 ' Г,2 раза), табл. 8. При итом, повышение активности Кат В.по сравнению с исходным уровнем после воздействия пепсина было>выявлено у 7Ь% больных раком яичников, у 40$ больных доброкачественными опухолями яичников и лишь у 20$ доноров. | Эти позволяют

предпололнть, что клетки рака яичников (^щтеэгфуют и секретируат в кровь аномальную форму Кат В, которая обладает более высокой протеолитической активностью неспособностью к актизавди в гадалой среде.

Таблица 8

Изменение активности катепсина В в сыворотке крови больных злокачественными и доброкачественными опухолями яичников и доноров после воздействия попсина при рН 3,0 (X ±а )

Сыворотка крови Больные раком п= 12 —г ! ¡ t ) Больше добро- ¡ качественными } опухолями { ц= 10 ! Доноры а= 12

Др активации 0,85+0,0? 0,62+0,057 0,21+0,015

После активации 2,97+0,02 0,93+0,08 0,25±0,02

Для изучения диагностической значимости определения активности кателсинов, Ш и ПК5Б в сыворотке крови болышх раком яични-крв, было проведено исследовапе частоты повышения активности атих ферментов в сыворотке крови больных и доноров относительно величины X + 2& , рассчитанной для сыворотки крови доноров, Табл. 9.

Таблица 9

Чувствительность и слепифичность тестов на определение активности протеолитическых ферментов в сыворотке крови больных ракой яичников

Катепсивн | íi ! ffi@ Показатели |-¡---¡--!

„__i_в_j_5—j р j___

0,028 20,8 5,78 1,15

84 82 86 32

54 54 100 100

Анализ данных пика; ал высокую чувствительность тестов на определения активности катепсинов В,ъ и Q , Ш в сыворотке крови больных раком яичников, однако, только тест на определение актк

л + 2Ъ ' 0,42 нмоль/мин/ю

Чувствптель- qo кость %

Споциййчность

%' 27

ности К§ обладает высокой специфичностью - 100$, которая для катепсинов В, ь к о составила липа 2%, 54$ и 54$ соответственно. В связи с этзш, мы не можем предложить использовать катеп-сины В, ъ и в в качестве маркеров сыворотки крови у больных раком яичников.

Изучение активности лизосомальных протеолитических ферментов в еевдтичеекой жидкости больных раком яичников

Особенностью развития опухолевого процесса при раке яичников является образование асцитичэской жидкости, в которой находятся раковые клетки, открепившиеся от злокачественной опухоли, что способствует миграции этих клеток в брюшной полости и мета-стазированш (И.Д.Нечаева, 1987). В нашем исследовании показано что в асцитах первичных больных раком яичников обнаруживается активность катепсинсв В,ъ и D , КФ в ПКФ. Активность катепси-| нов 3,ь и D в асците соответственно в 1,7, 3 и 4 раза (р< 0,001 для всех ферментов), а активность I® и ГШ - в 2,5 и 10 раз соответственно (р <0,001)- превышала уровни их активности в сыворотке крови тех же больных, табл. 10. Существует предположение, '-то протеолитические ферменты попадают в асцит из плазмы крови <Сг«еяЬаии G. , 1981), однако, полученные наг® данные позволяют думать и о других источниках фер!внтов в асцитах больных раком яичников. Скорее всего, что сами клетки злокачественных опухолей .яичников (как первичных, так л метастатических) и сегрегируют ферменты или их проформ непосредственно в асцятичесиую гладкость. Интерес представляют полученные наш данные о повышении активности катепсинов В, 1 и s в асцитах большее раком яичников, у которых в течение года после операции были выявлены рецидивы, ио сравнению с уровнем их активности в асцитах, больных без ровддквор за тот из период, табл. II.

Таблица 10

Сравнение активности протеолитических ферментов в астатической жидкости к сыворотке крови больных раком яичникоз, X + т

Исследуе- 1........................... .......................... 1 Катепоины | КФ I ПКФ ОбЩИЙ белок г/л

мый материал *........ I т ¡В ! Ь ! пмоль/ман/мг, белка \ пмэлъ/шц/мг. ! ! белка ! 0 1нмолъ4ощ/мг. ! белка ?]5ц/мг. белка! Дд/мг.бвл-| | ка ! 1

Асшггиче-скал жидкость 32 24,0+2,7х 2,0+0,2х 2,0+0,2* 0,3^0,05х 0,15+0,001х 19,2+3,4х

Снворот-ка крови «=32 14.0+1,3 0,9+0,2 0,5+0,04 1 0,14+0,007 0,01+0,003 63,6+1,06

х - различия статистически значимы относительно сыворотки крову р<0,001

"•ТабМца II

Активность протеэлитических ферментов в асцитической кидкости 'больных раком яичников в зависимости от характера течения -заболевания, X

--------------- . Группы больных " ' -................. Катепсины ! ю" • ГХКФ

/Б / - > нмоль/мин/г.иелка; 1и | ¡шольДаш/г.бел:са ; V ш^ояь/шхн/г. белка ! Ед/г. бе"яка;! Ед/г. балка | 1 ,,________

Больные с рецидивами 13 28,7+5,2 3,4+0,5 21 £н-0 у 2 0,38+0,06

Больные без рецидивов 1,8+0,4 1,8+0,5 0,42±0,2 0,1-г0-;06

5

Для выяснения возмокного источника катепсинов в асцитах, было проведено исследование активности Катепсинов В и о в клетках, выделенных из асцитов 16 больных раком яччшков. Мы доказали, что в астатической жидкости находятся не только опухолевые клетки (24$ от общего количества меток в цитограммах), но и другие типы клеток - макрофаги (16$), лимфоциты (22$), лейкоциты (13%) и клетки мезотелия (15%), в которых обнаружена активность катепсинов В и в . При этом, активность Катз оказалась более высокой в самой асцитической етдкости, чем в клетках, тогда как активность Кат В - выше в клетках, чем в асците, табл.12.

Таблица 12

Активность катепсинов В и в в асцитической жидкости и клетках асцитической лшдкости больных

ЛТ I

раком яичнз-ыов, X ¿и

Исследуемый | Катешины В нмоль/миц/мл ; Катепсин в

материал |до активации ¡после активации |шжодь/мин/мл '

Асцитическая жидкость 0,42+0,05 2,5+0,6 32,9+3,2

П= 16

Клетки асцитической жидкости 1,95+0,5 2,9+0,7 8,7+0,8

П* 16

Изучение свойств Кат В в асцитах 25 первичных больных р-ако яичников показало, что этот фермент в асците, так же как и в сь воротке крови находится в латентной форме, так кал его активность повышается после воздействия пепсина в кислой среде в 6 раз по сравнению с исходной. Существенно, что Кат В клеток а< цитов больных раком ясч1шков прием: ;ески не изменяет свою акти кость при этих же условиях (исходная активность -

— —

1,95 кюв/ш/мл, активность после активации -2,9 кмсльАшн/мл, поэтому, мокно полагать, что Кат В асцитической аидкости не является лизосомальнш ферментом, а, скорее всего,его секретируе-мой формой или проферментом.

Нами показано также, что активация Кат В пепсином происходит более интенсивно в асцитах больных, у которых в дальнейшем появилась ранние рещдавд рака яичников (повышение активности фермента в 9,3'раза по сравнению с исходной), чем у больных без рецидивов (в 2,3 раза), табл. 12. Возможно, что синтез и секреция Кат В с более выраженной протеолктяческой активностью в кислой среде является одним из проявлений метастатического фенотипа клеток рака якчьаксз,

вывода

1. В злокачественных опухолях яичшасов обнаружено повышение j активности лизосомаяьных цкстеиновых протеиназ по сравнении с

доброкачественными опухолями шчтшов и .морфологически неизмененными яичниками: разков-катэпсина В (в 18,5 и ю раз соответственно) к менез значительное - катепсина Ь ■ (в S и 4 раза cor -ветствэнно). Выявлено таккв -некоторое повыкание активности л. яо~ сокальном аспартилыюй ¡протепназн - катеноида х> в злокачественных' опухолях яичников по сравнении с доброкачественными оиухоля-Чй и некзмепеннцг.т яичниками.

2. Установлено, что тестн на определение активности катеп-сннов В и 1 в злокачествэы'ых опухолях яичников могут бнгь ис-подг-зоваш в диагностике на основании их высокой чувствительности (93? и 65% соответственно) и специфичности (бол«?« Ö0/J для двух ферментов). Для оцвфщ прогноза у больных раком яичников

на протяжения первого года после операции предложено кспогьзовать критический уровень активности катепсина В в опухолях, равный

/2;!,5±1<ю,0 тюльЛшц/мг.б9лка, превышение которого евидетельст-иуот о неблагоприятном течении заболевания.

3. Установлена зависимость уровней актнвностл катепсинов В 4 ь в злокачественных опухолях яичников от таких характеристик опухоли как гистологический тип, степень дкфференцировки и стадии заболевания.

4. Обнаружено повышение•активности катепсинов В, I я и в сыворотке кров: больных раком яичников по сравнению с контролем. . Тесты на определение активности катепсинов В, 1 и ц в сыворотке крови больных раком яичников обладают высокой чувствительностью (92$, 84% и 82$ соответственно), но низкой специфичностью

(2%, 54$ ж 54% соответственно), поэтому они могут быть использованы для мониторинга. Показано, что катепсин В в сыворотке , крови находится в латентной форме. ' 1

5. Активность катепсинов В, ь и з обнарр'.ена в аспитичес-кок жидкости больных раком яичников, при этом уровень активности этих ферментов в асцитах соответственно в 1,7, 3 и 4 раза виде, чем в сыворотке крови тех же больных. Показано, что катепсин В в асците, так же как и в сыворотке крови находится в латентной форме. Выявлено, что в клетках, выделенных из асцатической жидкости, активность катепсина 3 в 4»б раз выше, чем в самой жидкости, в то же вреда,.активность катепсина б в 4 раза выше в астатической жидкости по сравнению с его активностью в клетках.

6. Обнаружено, что активность кислой фоофатазы в злокачественных опухолях яичников в 2 раза выше, чем в доброкачественных опухолях и незначительно превышает уровень ее активности в неизмененных яичниках. В сыворотке крови больных раком яичников активность кислой фосфатазы превышает уровень активности этого фе мента в сыворотке крови доноров и больных доброкачественными оп

холями яичников в 3 и 2 раза соответственно. Установлена высокая чувствительность (более 90$) и 'специфичность (более 90$) этого теста, который может быть использован для диагностических целей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лизосомальнке нротеолктические ферменты при раке яичников. Воггр. мед.хшии. J« 4. 1991 г. С.21-23 (в соавт. с Басса-лык Д.С., лордаета K.M., Васильевым A.B.).

2. Протеолитичэские ферменты лизоеом и метасгазирование рака яичников. Материалы G Всесоюзного симпозиума "Метастазярова-ние злокачественных опухолей. Новые подхода". 22-24 октября

1991 г., с.59-60 (в соавт. с Еассалык Л.С., Борланда К.И., Васильевым A.B.).

УЧАСТОК МНОЖИТЕЛЬНОЙ Т5ХКИКМ ВОНИ А^И СССР

nöwT^nsw*'3.Öi?2 n- »AKAS W ТИР»» 100 зх>.