Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Консервирование тромбоцитов замораживанием до -80 градусов С под защитой диметилацетамида

РГ6 од

- 3 ОПТ 1996

На правах рукописи

ЗАХАРОВ Виктор Викторович

КОНСЕРВИРОВАНИЕ ТРОМБОЦИТОВ ЗАМОРАЖИВАНИЕМ ДО -80°С ПОД ЗАЩИТОЙ ДИМЕТИЛАЦЕТАМИДА

14.00.29 - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в Военно-медицинской академии Научный руководитель:

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник

В.В.Данильченко

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.Н.Мельникова доктор медицинских наук С.А.Матвеев Ведущая организация:

Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования

заседании специал , .....

при Российском научно-исследовательском институте гематологии и грансфузиологии (Санкт-Петербург, 193024, 2-я Советская, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

Автореферат разослан 96 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат медицинских наук В.С.Быков

Защита состоится

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность.

Трансфузии концентратов тромбоцитов приобрели в последние годы большое значение как эффективное средство терапии геморрагического синдрома, обусловленного недостатком количества или функциональной неполноценностью тромбоцитов (Абдулкадыров K.M., 1994; Аграненко В.А. с соавт., 1995; Car R. et al., 1990; McShin R.L. et al., 1993). Дальнейшее совершенствование методов лечения сердечнососудистых, гематологических заболеваний, онкологических больных, пострадавших с тяжелой сочетанной травмой связано с достаточным обеспечением клиник данной трансфузионной средой (Дуткевич И.Г., 1987; Матвеев С.А., 1988; Аграненко В.А. с соавт., 1994; Lee E.J. et al., 1990; Owens M. et al., 1994).

Потребности в тромбоцитоконцентратах постоянно возрастают, в то время когда уменьшение количества доноров стало все более отрицательно сказывается на обеспечении лечебных учреждений гемо-трансфузионными средствами (Мельникова В.Н. с соавт., 1983; Селиванов Е.А. с соавт., 1994; Воробьев А.И., 1995; Рыжков C.B. с соавт., 1995; Данильченко В.В., 1996). Очевидно, что решение этой задачи возможно лишь в результате создания запасов тромбоцитоконцентра-тов в специализированных "банках" крови.

Реальность применения атомного оружия, авария на Чернобыльской АЭС убедительно подтверждают необходимость накопления ресурсов кровяных пластинок в интересах экстремальной и военной медицины (Брюсов П.Г., 1995; Калеко С.П. с соавт.. 1995; Шевченко Ю.Л. с соавт., 1995). Поэтому вопросы заготовки и разработки эффективных методов низкотемпературного консервирования тромбоцитов в последнее время приобрели большую актуальность (Компаниец A.M. с соавт., 1992; Азовская С.А., 1995; Angelini A. et al., 1992).

По мнению специалистов (Дудаева А.А., 1983; Фефелова И.В. с соавт., 1991: Азовская С.А., 1995; Valéry C.R., 1983; Bertolini F. et al., 1993), низкотемпературное консервирование тромбоцитов с диметил-сульфоксидом (ДМСО) позволяет максимально сохранять биологическую активность кровяных пластинок. Вместе с тем, являясь эффективным криопротектором, ДМСО обладает достаточно выраженными токсическими свойствами. Требуется удаление криофилактика из клеточной взвеси перед трансфузией, что усложняет процесс низкотемпературного консервирования и приводит к дополнительным повреждениям тромбоцитов.

В нашей стране для клинического применения разрешен способ криоконсервирования тромбоцитов при -196°С с 2,5% раствором диме-тилацетамида (ДМАЦ). Однако технологический процесс криоконсервирования клеток является многоэтапным и предусматривает использование программного замораживателя, наличие хранилища типа ХБ-05 с постоянным пополнением запасов жидкого азота, применение алюминиевых контейнеров.

Все это значительно усложняет использование данного способа консервирования тромбоцитов в учреждениях службы крови. Поэтому возникла необходимость разработки эффективного метода замораживания кровяных пластинок при -80° в электрических морозильниках.

Цель исследования:

Разработать эффективный способ низкотемпературного консервирования тромбцитов при -80°С под защитой 2,5% раствора диметил-ацетамида.

Задачи исследования:

1. Разработать методику замораживания тромбоцитов в электрохолодильнике при -80°С в полимерных контейнерах "Компопласт" без использования аппарата программного замораживания.

2. Изучить влияние способа получения тромбоцитоконцеггтратов на их морфофункциональную характеристику и эффективность замораживания при -80°С и -196°С.

3. Провести сравнительное исследование морфофункциональных свойств тромбоцитов, замороженных при -80°С и -196°С под защитой 2,5% раствора диметилацетамида.

4. Оценить криозащитное действие на тромбоциты 2,5% раствора ДМАЦ (при -80°С и -196°С) и 5% раствора ДМСО.

Научная новизна.

Разработан эффективный метод низкотемпературного консервирования тромбоцитов при -80°С с 2,5% раствором диметилацетамида. Впервые показана возможность замораживания кровяных пластинок в электрохолодильнике до -80°С в отечественных полимерных контейнерах без использования аппарата программного замораживания. Установлено, что тромбоцлтоконцентраты, консервированные при -80СС, по своим морфофункционалышм характеристикам превосходят концентраты тромбоцитов, криоконсервированные при -196°С. Впервые выявлена более высокая морфофункциональная сохранность клеток при низкотемпературном консервировании тромбоцитоконцентратов, заготовленных с помощью аппаратов-фракционаторов крови, чем концентратов кровяных пластинок, полученных способом дифференцированного центрифугирования консервированной донорской крови.

Практическая значимость работы и ее реализация.

Разработанный метод позволяет эффективно замораживать тромбоцитоконцентраты в отечественных полимерных контейнерах в электрохолодильнике (при -80°С) без использования аппарата программного замораживания, что существенно упрощает организацию создания "банков" кровяных пластинок.

Консервирование тромбоцитов при -80°С под ¡защитой 2,5% раствора диметилацетамида обеспечивает большую 'сохранность функциональных свойств, чем их криоконсервирование в жидком азоте (-)96°С).

Использование тромбоцитоконцентратов, полученных с помощью аппаратов-фракционаторов крови, для низкотемпературного консервирования значительно повышает функциональную полноценность кровяных пластинок для клинического применения.

Полученные в ходе исследований материалы использованы при подготовке отчета по теме НИР 100-95-пб "Обоснование системы долгосрочного хранения запасов гемотерапевтических средств, их транспортировки и применения в военное время"; применяются в практической деятельности НИЛ - Центра крови и тканей Военно-медицинской академии; включены в цикл лекций для слушателей академии.

Основные материалы исследований доложены и обсуждены на Всеармейской научной конференции "Актуальные вопросы гематологии" (С.-Петербург, 1995), II-ой международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии" (Ялта-Гурзуф, 1996), 237-ом заседании научного общества гематологов и трансфузио-логов Санкт-Петербурга (1996).

По теме исследования опубликовано 5 печатных работ, оформлено 4 рационализаторских предложения.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы.

Текст иллюстрирован 16 таблицами и 18 рисунками. Указатель литературы включает 187 источников, в том числе 86 отечественных и 101 зарубежных работ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный метод низкотемпературного консервирования тромбоцитов при -80°С под защитой 2,5% раствора диметилацетамида в полимерных контейнерах "Комггопласт" не требует использования аппарата программного замораживания и алюминиевых контейнеров.

2. Тромбоцитоконцентраты, замороженные предложенным методом, по своим морфофункциональным характеристикам превосходят концентраты тромбоцитов, криоконсервированные при -196°С.

3. Концентраты тромбоцитов, заготовленные с помощью аппа-ратов-фракционаторов крови, лучше сохраняют свои морфофункцио-нальные свойства при низкотемпературном консервировании^ чем тромбоцитоконцентраты, полученные методом дифференцированного центрифугирования консервированной донорской крови.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материм и методы исследования

Исследования по изучению и оптимизации методов долгосрочного хранения концентрата тромбоцитов ( КТ ) выполняли в научно-исследовательской лаборатории - Центре крови и тканей Военно-медицинской академии.

Объектом изучения являлся концентрат тромбоцитов, получаемый методом селективного выделения этих клеток из крови, содержащий 2,5 «Ю11 или более кровяных пластинок. Получение КТ осуществляли в соответствии с "Руководством по военной траисфузио-логии"(1991) двумя способами: методом дифференцированного цен-

трифугирования консервированной донорской крови, взятой на одном из стандартных консервантов, и аппаратным методом.

В первом случае, мы брали 4 - 6 доз одногруппной по системе ABO консервированной (на глюгицире) донорской крови. Для осаждения эритроцитов и лейкоцитов и получения плазмы, обогащенной тромбоцитами (ОТП), кровь центрифугировали на центрифуге К-80 в течение 15 мин со скоростью 1200 об/мин при температуре 22°С. Взвесь тромбоцитов из одной дозы донорской крови содержала 50-70*109 клеток. Затем собирали в одном компопласте 4-6 доз одно-группных по системе ABO порций тромбоцитов, полученных вышеописанным способом. Взвесь тромбоцитов (100-150мл) центрифугировали при 2500 об/мин в течение 25 мин при температуре 22°С; надоса-дочный слой удаляли и получали концентрат тромбоцитов в 50-60 мл плазмы. Такой тромбоцитоконцентрат после 30-40 мин экспозиции являлся исходным материалом для исследования.

Во втором случае концентрат тромбоцитов получали с помощью отечественых фракционаторов крови РК-0,5 и ФК-3,5. На первом этапе у донора проводили операцию аппаратного тромбоцитафереза и получали терапевтическую дозу тромбоцитов в 300 - 400 мл плазмы. Затем, ОТП центрифугировали со коростью 2500 об/мин в течение 25 мин при температуре 22°С на центрифуге К-80. После удаления надо-садочного слоя получали концентрат тромбоцитов, содержащий более 2,5» 10" клеток в 50-60 мл плазмы.

В качестве криопротекторов в нашей работе были использованы диметилсульфоксид (ДМСО) и диметилацетамид (ДМАЦ).

Криоконсервирование тромбоцитов при температуре -196°С в жидком азоте под защитой диметилацетамида (ДМАЦ) осуществляли по общепринятой методике в соостветствии с "Руководством по Военной трансфузиологии" (1991). После добавления криопротектора смесь

тромбоцитов с ограждающим раствором (в соотношении 1:1) переводили из компопласта в герметичный алюминиевый контейнер емкостью 160 мл. Охлаждение смеси осуществляли со скоростью 3°С в минуту до температуры -60°С в аппарате программного замораживания биологических объектов, производства ИПКБ и КМ АН УССР. Затем алюминиевый контейнер с тромбоцитами помещали в хранилище ХБ-05 с жидким азотом, где происходило дальнейшее снижение температуры до -196°С и хранение КТ.

Замораживание, хранение тромбоцитов в жидком азоте (при -196°С) под защитой 5% раствора ДМСО, а также оттаивание осуществляли по методике, используемой при криоконсервировании кровяных пластинок под защитой 2,5% раствора ДМАЦ.

Замораживание и хранение тромбоцитов при -80°С проводили в электрорефрижераторе фирмы "Reveo".

На первом этапе потребовалось разработать методику замораживания КТ. Низкотемпературное консервирование тромбоцитов при -80°С осуществляли в том же компопласте, в котором был получен КТ. Криопротектор добавляли к тромбоцитоконцентрату медленным наслоением по стенке пластикатного контейнера (в течение 3-5 мин.) с одновременным его переворачиванием для перемешивания суспензии тромбоцитов. Объемное соотношение криофилактика и КТ - 1:1. В качестве криопротекторов в нашем исследовании были выбраны 5% раствор ДМАЦ ("Тромбокриодмац") и 10% раствор ДМСО; в суспензии тромбоцитов их конечная концентрация составляла соответственно 2,5% и 5%. Компопласт с взвесью кровяных пластинок в растворе криофилактика сразу же помещали в металлический пенал-холдер с картонными прокладками толщиной 1-1.5 мм между стенками холдера и контейнером. Затем холдер помещали в низкотемпературный прилавок на -80°С для замораживания и хранения.

Исследования морфофункциональной полноценности тромбоцитов, криоконсервированных в жидком азоте при температуре -196°С и замороженных в электрорефрижераторе фирмы "Reveo" при температуре -80°С, проводились в 8-ми сериях опытов (табл. 1).

Первые две серии опытов (криоконсервирование КТ при температуре -196°С под защитой 2,5% ратсвора ДМАЦ) рассматривались как контрольные.

Оценку морфофункциональной полноценности кровяных пластинок проводили по следующим методикам: подсчет количества тромбоцитов; определение количества нормальных (овально-дискоидных) и патологических форм тромбоцитов с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ); определение степени суммарной АДФ-индуцированной и агристин-индуцированной агрегации тромбоцитов модифицированным методом Борна (использовались агрегирующие агенты ЮрМ АДФ и 15мг агристина из набора реактивов фирмы "Reanal"); определение степени реакции тромбоцитов на гипотонический шок (РГШ) по Хандину; определение рН концентрата тромбоцитов; исследование перекисного окисления липидов в тромбоцитах по уровню содержания малонового диальдегида (МДА) методом Uchiyama М. и Michara М. в модификации Андреевой с соавт. (1988); подсчет количества лейкоцитов в тромбоцитоконцентрате.

Таблица I

Характеристика исследованных концентратов тромбоцитов

Метод консервирования Аппаратный метод получения КТ Получение КТ методом дифференцированного центрифугирования Всего образцов КТ

Криоконсерви-рование при -196°С под защитой 2,5% раствора ДМАЦ 11 15 26

Криоконсерви-рование при -196°С под защитой 5% раствора ДМСО 6 6 12

Замораживание при температуре -80°С под защитой 2,5% раствора ДМАЦ 12 26 38

Замораживание при температуре -80°С под защитой 5% раствора ДМСО 7 8 15

Всего образцов КТ 36 55 91

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

На первом этапе работы определена морфофункциональная полноценность тромбоцитов, получаемых различными способами, и оценена возможность их использования для дальнейшего низкотемпературного консервирования.

Установлено, что концентраты тромбоцитов, получаемые как с помощью аппаратов-фракционаторов крови ФК-3,5 и РК-0,5, так и методом дифференцированного центрифугирования донорской крови, по своим морфофункциональным характеристикам являются полноценной гемотрансфузионной средой, пригодной для клинического применения, и могут быть использованы для низкотемпературного консервирования. Количество клеток в тромбоцитококцентратах, полученных с помощью фракционаторов крови составило 298,7±8,4*109, а способом дифференцированного центрифугирования донорской крови -306,6±12,7»109. Величина рН находилась в пределах 7,17+0,08 и 7,12±0,07, примесь лейкоцитов - 1,01 ±0,12 и 1.05±0,14 в зависимости от способа получения КТ. Установлено, что кровяные пластинки, полученные с помощью аппаратов-фракционаторов крови, по показателям функциональной полноценности превосходят тромбоциты, приготовленные из донорской крови методом дифференцированного центрифугирования (табл. 2).

АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов соответственно составила 59,1 ±1,4% и 54,2±1,3% (р<0,05), агристин-индуцировакная агрегация - 74,04±1,46% и 65,8±1,3 соответственно (р<0,001), реакция на гипотонический шок у сепараторных тромбоцитов - 43,95±1,52% и у тромбоцитов, полученных из донорской крови, - 38,8±1,4% (различия также достоверны, р<0,05).

Таблица 2

Характеристика тромбоцитоконцентратов, полученных с помощью фракционаторов крови (I) и методом дифференцированного центрифугирования крови (II)

Показатели I п=36 II п=55 Р

Количество тромбоцитов в дозе, 298,7+8,4 306,55±12,70 >0,05

•109

Степень агрегации тромбоцитов:

- АДФ-индуцированной, % 59,1 ±1,4 54,2±1,3 <0,05

- агристин-индуцированной, % 74,04±1,46 65,8±1,3 <0,001

Реакция тромбоцитов на гипотони-

ческий шок, % 43,95±1,52 38,8±1,4 <0,05

рН 7,17±0,08 7,12±0,07 >0,05

Содержание МДА, нмоль/109клеток 0,247±0,015 0,282±0,014 >0,05

Количество лейкоцитов в КТ, *109 1,01 ±0,12 1,05±0,14 >0,05

Более высокая сохранность тромбоцитов при сепараторном методе получения подтверждается и данными сканирующей электронной микроскопии. Количество нормоцитов (овально-дискоидная форма клетки) в КТ, полученных с помощью сепараторов крови, составило 71%, а при получении КТ из донорской крови - 59%.

Полученные результаты позволили справедливо заключить, что при получении концентрата тромбоцитов, содержащего 250*109 и более клеток, с помощью аппаратов-фракционаторов крови имеет место

меньшая травматизация кровяных пластинок, чем при дифференцированном центрифугировании донорской крови с последующим приготовлением пула тромбоцитов. Это, вероятно, обусловлено тем, что тромбоциты при сепараторном способе получения в процессе приготовления концентрата тромбоцитов в 50-60 мл плазмы находятся в одном и том же хомпопласте и подвергаются однократному жесткому центрифугированию (со скоростью 2500 об/мин в течение 25 мин при температуре 22°С), а при приготовлении КТ из донорской крови в один компопласт собирают 4-6 доз одногруппных по системе ABO порций тромбоцитов и подвергают их повторному жесткому центрифугированию.

Учитывая полученные данные, мы исследовали влияние замораживания - хранения - оттаивания на жизнеспособность кровяных пластинок отдельно в каждой из групп КТ, полученных указанными способами.

В ходе изучения изменения морфофункциональных характеристик кровяных пластинок при криоконсервировании их под защитой 2.5% раствора ДМАЦ в жидком азоте (-196°С) с использованием аппарата программного замораживания установлено (табл. 3), что более высокую сохранность клеток выявляют тромбоцитоконцентраты, полученные сепараторным методом, по сравнению с таковой у КТ, приготовленных из донорской крови (64,50±1,85% и 59,3±1,7% соответственно, р<0,05). По данным сканирующей электронной микроскопии количество нормоцитов составило 51 % и 40 % соответственно.

Результаты исследования АДФ-индуцированной, аграстин-индуцированной агрегаций тромбоцитов и реакции их на гипотонический шок также выявили более высокую функциональную полноценность тромбоцитов, полученных с помощью сепараторов крови ФК-3,5 и РК-0,5.

Таблица 3

Характеристика тромбоцитоконцентратов. полученных сепараторным методом (I), из донорской крови (II) и криоконсервированных при температуре -196°Спод защитой 2,5% раствора ДМАЦ

Показатели I (п=11) II (п=15) Р

Сохранность тромбоцитов, % 64,50±1,85 59,3±1,7 <0,05

Степень агрегации тромбоцитов:

- АДФ-индуцированной, % 17,Ш,1 11,4±0,9 <0,001

- агристин-индуцированной, % 36,7±1,2 27,9±1,1 <0,01

РГШ,% 26,66±1,26 19,4±1,2 <0,01

рН 6,90±0,09 6,8510,13 >0,05

МДА в КТ, нмоль/109клеток 0,642±0,010 0,714±0,020 <0,01

Существенно, что снижение показателей функциональной полноценности тромбоцитов в процессе замораживания - хранения - опаивания отчетливо более выражено в концентратах тромбоцитов, приготовленных методом дифференцированного центрифугирования донорской крови. При этом, выявлена значительная активация перекисного окисления липидов в этих тромбоцитах. Уровень содержания МДА после оттаивания в КТ, полученных сепараторным методом составил 0,642+0.010 нмоль/Ю'клеток, а в КТ, приготовленных из донорской крови - 0,714±0,020 нмоль/109клеток (различия достоверны, р0,01), хо-

тя до замораживания достоверных различий в содержании малонового диальдегида не выявлялось.

Следовательно, метод получения тромбоцитоконцентрата имеет важное значение для сохранности морфофункциональных характеристик КТ в процессе низкотемпературного консервирования.

Тем не менее, концентраты тромбоцитов, полученные и тем, и другим способами и криоконсервированные под защитой 2,5% раствора ДМАЦ в алюминиевых контейнерах при температуре -196°С (жидкий азот) с использованием аппарата программного замораживания, по своим морфофункциональным характеристикам отвечают современным требованиям (Руководство Евросовета, 1995), предъявляемым к данной трансфузионной среде. Так как низкотемпературное консервирование тромбоцитов в этом случае осуществляли в соответствии с "Инструкцией по криоконсервированию клеток крови"(1995), то эти группы КТ рассматривались в нашей работе в качестве контрольных.

При изучении криоконсервирования тромбоцитов в алюминиевых контейнерах при температуре -196°С с 5% раствором ДМСО не выявлено значительных преимуществ в сравнении с 2,5% раствором ДМАЦ. Значимыми оказались лишь различия по агристин-индуцированной агрегации тромбоцитов (36,2+1,3% и 27,9±1,1% соответственно, р<0,01) и по реакции тромбоцитов на гипотонический шок (25,63±1.15% и 19,4±1,2 соответственно, р<0,05). Таким образом, можно заключить, что преимущества ДМСО как криофилактика перед ДМАЦ при низкотемпературном консервировании тромбоцитов в жидком азоте (- 196°С) незначительны.

При разработке метода замораживания кровяных пластинок в электрохолодильнике на -80°С перед нами стояла задача: не используя аппарат программного замораживания, найти такое техническое ре-

шение, при котором скорость охлаждения концентрата тромбоцитов в полимерном контейнере типа "Компопласг" соответствовала бы рекомендуемому в литературе диапазону скоростей замораживания тромбоцитов - 1-3°С/мин.

В результате проведенных поисковых исследований такое решение было найдено. Выявлено, что смесь тромбоцитоконцентрата с криофилактиком в объеме 100-120 мл (50-60 мл КТ и 50-60 мл криопро-тектора) внутри компопласта, помещенного в металлический пенал-холдер с картонными прокладками вдоль стенок толщиной 1,0-1,5 мм, охлаждается в электрохолодильнике на -80°С со скоростью 2-3°С/мин. Это позволило отказаться от дорогостоящего аппарата программного замораживания биологических объектов и существенно упростить процесс низкотемпературного консервирования тромбоцитов.

Было произведено изучение эффективности замораживания тромбоцитов по разработанной (в электрохолодильнике на -80°С) методике на 38 образцах концентратов тромбоцитов, из которых 12 - были получены сепараторным методом и 26 образцов - способом дифференцированного центрифугирования донорской крови.

В ходе исследований было установлено, что и сепараторные тромбоциты, и КТ, полученные из донорской крови и замороженные в электрохолодильнике на -80°С под защитой 2,5% раствора ДМАЦ в отечественных полмерных контейнерах типа "Компопласг", по своим морфофункциональным характеристикам значительно превосходят КТ, полученные аналогичным образом и криоконсервированные при температуре -196°С в алюминиевых контейнерах (табл. 4, 5).

После оттаивания тромбоцитов, сохраняемых при температуре -80°С под защитой 2.5% раствора ДМАЦ, сохранность клеток в КТ, полученных с помощью аппаратов-сепараторов клеток, составила 75,1 ±3,2%, в КТ, приготовленных из донорской крови, - 70,23±2,44%, в

то время, как в контрольных группах она была 64,50±1,85% и 59,3±1,7%. То есть сохранность клеток в концентратах тромбоцитов в процессе их замораживания в компопластах при температуре -80 "С была в среднем на 10% больше.

Таблица 4

Характеристика консервированных при температурах -196°С(1) и -80°С(П) тромбоцитоконцентратов, полученных сепараторным методом

Показатели I (п=11) 11 <п=12) Р

Сохранность тромбоцитов, % 64,50±1,85 75,1+3,2 <0,05

Степень агрегации тромбоцитов:

- АДФ-индуцированной, % 17,1 ±1,1 21,2±1,2 <0,05

- агристин-индуцированной, % 36,7+1,2 42,3+1,2 <0,01

РГШ, % 26,66±1,26 33,03±1,32 <0,001

рН 6,90+0,09 6,97±0,12 >0,05

МДА в КТ, нмоль/109клеток 0,642±0,010 0,60210,008 <0,05

Таблица 5

Храктеристика консервированных при температурах -196°С(1), -80°С(П) тромбоцитоконцентратов, полученных из донорской

крови

Показатели I (п=15) 11 (п=26) Р

Сохранность тромбоцитов, % 59,3±1,7 70,23±2,44 <0,01

Степень агрегации тромбоцитов:

- АДФ-индуцированной, % 11,4+0,9 15,5±1,1 <0,05

- агристин-индуцированной, % 27,9+1,1 31,7±1,2 <0,05

РГШ, % 19,4+1,2 23,97±0,94 <0,01

рН 6,85+0,13 6,93+0,09 >0,05

МДА в КТ, нмоль/109клеток 0,71410,020 0,63510,016 <0,01

Существенно, что по всем показателям функциональной полноценности КТ, сохраняемые по разработанной нами методике в электрохолодильнике на -80°С, также значительно превосходили КТ контрольных групп (-196°С). Подтверждают это и данные сканирующей электронной микроскопии. Количество нормоцитов в тромбоцитокон-центрате, сохраняемом в электрохолодильнике, составило 57% и 53% в зависимости от способа приготовления КТ.

Важно отметить, что КТ, полученные с помощью аппаратов-фракционаторов крови, также лучше сохраняют свои морфофункцио-нальные свойства в процессе низкотемпературного консервирования в электрохолодильнике, чем КТ, приготовленные из донорской крови.

Использование 5% раствора ДМСО в качестве криофилактика для замораживания тромбоцитов при температуре -80°С показало его незначительные преимущества перед 2,5% раствором ДМАЦ, применяемым для этих же целей. Отмечались лучшие показатели агристин-индуцированной агрегации тромбоцитов (39,3±1,2% и 31,7±1.2% соответственно, р<0,01) и реакции тромбоцитов на гипотонический шок (30,4±1,3% и 23,97+0,94% соответственно, р<0,01). По другим показателям значимых различий не выявлено. Это позволяет нам заключить, что для низкотемпературного консервирования тромбоцитов в качестве криопротектора целесообразнее использовать диметилацетамид, который менее токсичен, чем диметилсульфоксид и не требует отмывания перед трансфузией декриоконсервированных тромбоцитов реципиенту.

Результаты выполненных исследований свидетельствуют о возможности преимущественного развития консервирования тромбоцитов при -80°С в отечественной пластикатной таре. Это позволяет повысить эффективность низкотемпературного консервирования тромбоцитов (увеличить сохранность морфофункциональных свойств кровяных пластинок в процессе замораживания - хранения - оттаивания), значительно упростить его для учреждений службы крови, отказавшись от применения жидкого азота, аллюминиевых контейнеров и аппарата программного замораживания.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод низкотемпературного консервирования тромбоцитов, обеспечивающий сохранность до 75% клеток при замораживании до -80°С под защитой 2,5% раствора ДМАЦ. Концентраты тромбоцитов, сохраняемые по предлагаемой методике, по своим мор-фофункциональным свойствам являются более полноценной гемо-

трансфузионной средой по сравнению с тромбоцитоконцентратами, криоконсервированными в жидком азоте (-196°С) общепринятым в нашей стране способом.

2. Предлагаемая нами методика замораживания и хранения тромбоцитов в электрохолодильнике позволяет отказаться от применения жидкого азота, алюминиевых контейнеров и аппарата программного замораживания, что значительно упрощает низкотемпературное консервирование кровяных пластинок.

3. Существенное значение доя низкотемпературного консервирования тромбоцитов имеет исходный уровень их морфофункциональ-ной полноценности, который определяется способом получения КТ. Для замораживания предпочтительнее использовать тромбоциокон-центрат, полученный с помощью аппаратов-фракционагоров крови.

4. При низкотемпературном консервировании тромбоцитов целесообразнее использовать в качестве криофилактика диметилацетамид, нежели диметилсульфоксид.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для низкотемпературного консервирования тромбоцитов с целью создания банка кровяных пластинок целесообразно использовать способ замораживания и хранения тромбоцитоконцентратов в пласти-катной таре отечественного производства при температуре -80°С в электрохолодильнике, позволяющий обеспечить высокую морфофунк-циональную полноценность тромбоцитов.

2. В качестве криопротектора при низкотемпературном консервировании тромбоцитов предпочтительнее использовать диметилацетамид, который по своим криозащитным свойствам не уступает широко распространенному за рубежом диметилсульфоксиду, но, при этом,

гораздо менее токсичен и не требует отмывания перед трансфузией тромбоцитоконцентрата реципиенту.

3. Заготавливать тромбоцитоконцентрат для низкотемпературного консервирования целесообразнее с помощью аппаратов-фракционаторов крови. Этот способ получения тромбоцитов позволяет обеспечить более высокую сохранность морфофункциональных свойств кровяных пластинок в процессе замораживания - хранения -оттаивания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Опыт работы банка криоконсервированного костного мозга доноров Н Актуальные вопросы гематологии : Тез. докл. Всеарм. науч. конф. - СПб.: ВМедА, 1995. - С. 113. (Соавт. Данильченко В.В.. Калеко С.П., Тюрин Р.В., Петренко Г.И., Сидоркевич C.B.).

2. Морфофункциональная оценка концентратов тромбоцитов, полученных различными способами И Новые информационные технологии в медицине и экологии : Тез. докл. П-й Международной конф. -Ялта-Гурзуф, 1996. - С. 40. (Соавт. Данильченко В.В., Сидоркевич C.B., Калеко С.П., Вильянинов В.Н., Тюрин Р.В.).

3. Метод замораживания тромбоциов в электрохолодильнике при температуре -80°С // Новые информационные технологии в медицине и экологии : Тез. докл. П-й Международной конф. - Ялта-Гурзуф, 1996. -С. 41-43. (Соавт. Данильченко В.В., Калеко С.П., Петренко Г.И., Сидоркевич С,В., Вильянинов В.Н., Тюрин Р.В., Мядзюта В.Б.).

4. Способ замораживания эритроцитов при -80°С II Новые информационные технологии в медицине и экологии : Тез. докл. П-й Международной конф. - Ялта-Гурзуф, 1996. - С. 15. (Соавт. Даниль-

ченко В.В., Калеко С.П., Петренко Г.И., Вильянинов В.Н., Рождественская E.H., Ващенко В.И.. Игнатович Г.П., Мядзюта В.Б.).

5. Клиническое применение криоконсервированных тромбоцитов у гематологических больных // Новые информационные технологии в медицине и экологии : Тез. докл. П-й Международной конф. - Ялта-Гурзуф, 1996. - С. 50-52. (Соавт. Петренко Г.И., Данильченко В.В., Тюрин Р.В., Богданов А.Н., Сидоркевич C.B.. Калеко С.П., Мядзюта В.Б.).

РАЦИОНАЛИЗАТОРСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Укладка для транспортировки тромбоцитов в замороженном состоянии : Удостоверение на рац. предложение № 5434/4/96. - СПб.: ВМедА, 1996.-С. 1.

2. Способ низкотемпературного консервирования тромбоцитов : Удостоверение на рац. предложение № 5435/4/96. - СПб.: ВМедА, 1996. -С. 1.

3. Приспособление для замораживания тромбоцитов в электрохолодильнике на -80°С : Удостоверение на рац. предложение № 5436/4/96. - СПб.: ВМедА, 1996. - С. 1.

4. Модификация приспособления для замораживания тромбоцитов в электрохолодилышке на -80°С : Удостоверение на рац. предложение № 5437/4/96. - СПб.: ВМедА, 1996. - С. 1.