КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ РЯДА СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Пальцева, Екатерина Михайловна

Диссертации по медицине → Клиническая лабораторная диагностика

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ РЯДА СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Пальцева, Екатерина Михайловна Москва 2011 г.

Ученая степень: доктора медицинских наук

ВАК РФ: 14.03.10

Автореферат диссертации по медицине на тему КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ РЯДА СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

На правах рукописи

ПАЛЬЦЕВА Екатерина Михайловна

КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ РЯДА СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

О з иДР 20(1

Москва 2011

4856615

Работа выполнена в Первом Московском государственном медицинском университете им. И.М. Сеченова Минздравсоцразви-тия РФ

Научные консультанты:

член-корреспондент РАМН, доктор химических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

СЕВЕРИН Сергей Евгеньевич

ЗАЛЕТАЕВ Дмитрий Владимирович

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

КУШЛИНСКИИ Николай Евгеньевич

ДУРНЕВ Андрей Дмитриевич

доктор медицинских наук

КИШКУН

Алексей Алексеевич

Ведущая организация: ФГУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента РФ

Защита состоится « 23 » марта 2011 г. в 10.00 на заседании Диссертационного Совета Д.208.071.04 в ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» (123995, Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1)

Автореферат разослан « /^ь февраля 2011 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» по адресу: 123445, Москва, ул. Беломорская, д. 19.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.208.071.04

доктор медицинских наук, профессор Морозова В.Т.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время все большую актуальность приобретает диагностика различных заболеваний на основе биологических маркеров. Набор известных биомаркеров на уровне клеток и субклеточных структур пополняется таковыми на уровне генома. Создание комплекса новых биохимических и молекулярно-генетических маркеров должно дать мощный импульс для развития диагностики, позволяющей определять риски развития заболеваний, обнаруживать патологию на ранних стадиях, а также прогнозировать течение болезни.

Усилия ученых направлены на идентификацию и характеристику молекулярных биомаркеров и разработку соответствующих тест-систем и методов оценки. Это одна из актуальных задач, решаемых молекулярной медициной. Определение комплекса биомаркеров позволяет выявить молекулярные механизмы возникновения заболеваний, а также находит применение в клинической практике для диагностики широко распространенных социально значимых муль-тифакториальных заболеваний - таких, как онкологические и сердечно-сосудистые.

Ранняя диагностика сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и необходимость создания систем быстрого определения риска их развития приобретают в последнее время все большую актуальность. ССЗ, в частности ишемическая болезнь сердца (ИБС) и ее осложнение - инфаркт миокарда (ИМ), продолжают оставаться главной причиной смертности мужчин и женщин в экономически развитых странах (Рагино Ю.И. и соавт., 2008; Шевченко О.П., Миш-нев О.Д., 2005; ТБ^каБ 5., Моовег V., 2004). Ежегодно в странах Западной Европы они становятся причиной смерти 4 млн человек, при этом почти в половине случаев смерть наступает в результате ИБС (Шевченко О.П., Мишнев О.Д., 2005). Болезнь коронарных сосудов -ведущая причина смертности среди населения США, составляющая более 25% смертей людей старше 35 лет (Каппе1 ^В., 2005). В Российской Федерации в 90-е годы в целом заболеваемость ИБС возросла на 24%, стенокардией - на 41%, острым ИМ - почти на 16%. Ежегодно в России от ССЗ умирают более 1 млн человек. По данным ВОЗ, в структуре смертности от ССЗ на долю ИБС приходится 47% (Щепин О.П. и соавт., 2009).

Многочисленные исследования последних лет ознаменовались определенными достижениями в изучении механизмов развития и прогрессирования ИБС. Создание новых групп фармацевтических препаратов и внедрение их в клиническую практику позволи-

ли снизить риск развития острой кардиоваскулярной патологии. Тем не менее ИБС и прогрессирование коронарного атеросклероза остаются главными причинами смертности и инвалидизации населения. Современная стратегия ведения пациентов с ИБС включает в себя раннюю и точную диагностику заболевания, стратификацию риска и прогноза, что требует поиска новых биологических маркеров и оценки их ассоциации с заболеванием. Наиболее важным представляется поиск ранних чувствительных и специфичных маркеров развития нестабильности атеросклеротических бляшек, изменение уровня которых можно обнаружить до или в отсутствие повреждения клеток миокарда (Вауеэ-Сешз А. е! а1., 2001).

Частота онкологических заболеваний неуклонно растет и начинает теснить сердечно-сосудистые. Так, заболеваемость злокачественными новообразованиями в Российской Федерации в 2001 г. составила 312,3 на 100 тыс. населения, в 2006 г. - 332,2 (Щепин О.П. и соавт., 2009).

Исследование молекулярно-биологических причин возникновения рака - одна из наиболее актуальных проблем современной молекулярной медицины. Основной причиной злокачественной трансформации клетки являются генетические факторы. Молеку-лярно-генетические исследования генома злокачественной опухоли представляют собой фундаментальную проблему, разрешения которой требует клиническая практика. В связи с тем, что частота онко-патологии постоянно растет, а возраст манифестации заболевания уменьшается, все большую актуальность приобретает проспективная диагностика онкопатологии в рамках ежегодных диспансеризаций и в группах риска.

Поиск и характеристика молекулярной патологии в злокачественных опухолях является самостоятельным и очень важным направлением в молекулярной диагностике, так как позволяет расшифровать механизмы канцерогенеза, определить прогноз заболевания, тактику лечения и осуществлять мониторинг рецидивирования. Разработка методов обнаружения молекулярных маркеров дает возможность создавать эффективные диагностические системы. Нами разработаны и описаны в данной работе системы молекулярных маркеров для диагностики светлоклеточного рака почки (СРП), рака предстательной железы (РПЖ), цервикальной интраэпителиальной неоплазии (ЦИН) и рака шейки матки (РШМ), увеальной меланомы (УМ).

Злокачественная трансформация клетки является процессом многоступенчатым, включающим накопление структурных и функциональных изменений в геноме клетки. К структурным, или генетическим, маркерам относят все нарушения, изменяющие структуру ДНК. В первую очередь, это крупные аномалии - такие, как делеции

целых хромосомных районов, содержащих гены-супрессоры опухолевого роста, и дупликации или амплификации районов, содержащих клеточные протоонкогены, факторы роста и др.; транслокации и инверсии хромосомного материала, в результате которых могут образовываться химерные гены с онкогенными функциями. Другим результатом структурных перестроек может оказаться ситуация, когда клеточный протоонкоген получает дополнительные активирующие регуляторные элементы и начинает гиперэкспрессироваться. И, наконец, к структурным аномалиям относят различные типы мутаций, которые могут активировать протоонкогены или инактиви-ровать гены-супрессоры (Залетаев Д.В. и соавт., 2009).

К функциональным маркерам относят все нарушения, которые не связаны с изменениями структуры ДНК, но приводят к изменениям в уровне экспрессии генов, участвующих в процессах канцерогенеза. Профиль экспрессии генов в опухоли кардинально изменен по сравнению с таковым в неизмененной ткани, поэтому определенные сочетания генов, теряющих свою экспрессию, или, наоборот, гипер-экспрессирующихся в определенном типе опухоли, могут являться диагностическими и прогностическими маркерами. Изменения в экспрессии гена без нарушения его нуклеотидной структуры относятся к эпигенетической регуляции. К таким функциональным нарушениям в первую очередь относят метилирование регуляторных районов генов-супрессоров опухолевого роста, что приводит к их полной инактивации (Залетаев Д.В. и соавт., 2009).

Каждая конкретная опухоль уникальна по набору патологических изменений, как и геном конкретного пациента. Для каждой опухоли существуют наиболее характерные пути регуляции и молекулярные маркеры, специфичные для начала заболевания, его прогрессии и терминальных стадий. Молекулярные маркеры позволяют четко определить стадию злокачественного процесса и проследить молекулярную эволюцию опухолевого процесса. Для опухолей различных тканей и органов такие маркеры могут значительно различаться.

Мониторинг молекулярных маркеров, которые обнаруживаются задолго до клинических проявлений, позволяет своевременно провести более тщательную диагностику и начать превентивную терапию. Определенные биологические и молекулярно-генетические маркеры или их сочетание позволяют выявить начальные стадии и установить прогноз заболевания, подобрать оптимальную тактику лечения и разработать таргетные терапевтические средства. Поэтому важнейшей практической задачей является разработка алгоритма исследования диагностических маркеров социально значимых заболеваний.

Цель исследования

Поиск и характеристика ключевых молекулярных маркеров сердечно-сосудистых и некоторых онкологических заболеваний с целью разработки лабораторно-диагностических систем для ранней диагностики, прогноза развития и оценки эффективности терапии этих заболеваний.

Задачи исследования

1. Провести сравнительный анализ уровня экспрессии активатора плазминогена урокиназного типа (иРА) и ингибитора активатора плазминогена 1 типа (РАМ) в моноцитах периферической крови больных со стабильным течением ИБС и больных с острым коронарным синдромом (ОКС) для выявления связи уровня экспрессии этих белков со степенью тяжести заболевания.

2. Определить уровни С-реактивного белка (СРБ) и адипонектина в крови больных со стабильным течением ИБС и с ОКС для оценки взаимосвязи этих показателей с риском возникновения ОКС.

3. Исследовать аллельные делеции генов-супрессоров УНЬ, В.А5БР1 и РШГи метилирование гена СВН1 при СРП с целью поиска прогностических критериев этого заболевания; исследовать мутации и метилирование гена УНЬ для определения эффективности назначения таргетной терапии СРП.

4. Изучить полиморфные варианты генов АВСВ1, ТСРВШ, НЮ и УДК для определения предрасположенности к развитию спорадического рака почки.

5. Исследовать потери гетерозиготности (ПГ) и микросателлит-ную нестабильность (МН) хромосомных районов 13qlA и 16q23 при РПЖ с целью поиска диагностических и прогностических критериев данного заболевания.

6. Оценить частоту образования химерных транскриптов ТМРК8Б2/ЕКС4, ТМРЯ552/ЕТУ1 и ТМРЯББ2/ЕТУ4 при РПЖ и определить их диагностический потенциал.

7. Исследовать нарушения эпигенетической регуляции экспрессии генов-супрессоров на ранних стадиях канцерогенеза шейки матки и определить маркеры, имеющие диагностический потенциал.

8. Исследовать аллельные делеции в хромосомах 3 и 1р36 при УМ с целью разработки диагностических и прогностических критериев данного заболевания.

9. Изучить морфологическую и молекулярно-генетическую внут-риопухолевую гетерогенность колоректальных аденокарцином.

Научная новизна

Важное значение имеют впервые полученные методом проточной цитофлюориметрии данные о характере изменения уровня экспрес-

сии РА1-1 в моноцитах периферической крови больных ИБС, так как одним из ее патогенетических факторов является снижение фибри-нолитической активности крови.

Впервые разработан метод определения молекулярно-генетиче-ских маркеров для оценки прогрессии первичной опухоли при СРП, а также метод выявления среди пациентов с метастатическим свет-локлеточным раком почки лиц, в отношении которых наиболее эффективно назначение таргетных препаратов, действие которых связано с УНЬ-зависимыми патогенетическими механизмами.

продемонстрировано, что при РПЖ наличие химерного онкогена ТМРВ.552/ЕКС4 является частым опухолеспецифическим событием, коррелирует с более агрессивными стадиями заболевания и может служить молекулярным маркером этого рака, а также маркером андрогеночувствительности опухолевых клеток и оценки ответа опухоли на гормональную терапию. Нами предложен способ определения экспрессии химерного онкогена ТМР11552/ЕИС4 методом обратной транскрипции мРНК с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) с использованием специфических праймеров.

Впервые предложены методики определения молекулярных маркеров метилирования при ряде онкологических заболеваний. Нами разработана система ДНК-маркеров (маркеры метилирования генов р16, МЬН1 и N33) для ранней диагностики РШМ, характеризующаяся высокой чувствительностью и специфичностью. Полученные результаты позволяют считать, что определение гиперметилирования генов-супрессоров вместе с цитологическим исследованием и тестированием вируса папилломы человека может служить основой для мониторинга женщин с высоким риском развития РШМ. Разработан метод определения метилирования генов N33 и С5ГРУ при аденокар-циномах предстательной железы (АКПЖ), что может помочь в диагностике данного заболевания.

Нами разработан метод выявления специфических молекулярных маркеров при УМ, который может использоваться для верификации диагноза «увеальная меланома», а также метод оценки прогрессии первичной опухоли при данном заболевании.

Впервые продемонстрирована молекулярно-генетическая внут-риопухолевая гетерогенность колоректальных аденокарцином.

Работа по определению молекулярно-генетических маркеров перечисленных онкологических заболеваний удостоена премии Прави-

тельства РФ 2009 г. в области науки и техники для молодых ученых («Разработка и внедрение методов ДНК-диагностики для раннего определения и прогноза некоторых онкологических заболеваний»).

Практическая значимость

Настоящая работа представляет практический интерес для диагностики и оценки прогноза таких социально значимых заболеваний, как ИБС и ряд злокачественных новообразований. На основании полученных данных выделен маркер развития ОКС, который можно определить в моноцитах периферической крови, а также биомаркеры, которые можно использовать для дополнительной оценки степени тяжести воспалительного процесса у больных со стабильным течением ИБС. Это позволяет предложить более детализированную программу диагностических мероприятий и своевременно скорректировать проводимую терапию.

Исследование аллельных делеций генов-супрессоров опухолевого роста, расположенных в коротком плече хромосомы 3, и метилирование гена СБН1 представляет собой метод оценки прогрессии и способности к метастазированию первичной опухоли при СРП. Полученные результаты легли в основу новой медицинской технологии. (Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/150.)

Разработанная нами медицинская ДНК-технология позволяет выделять УНЬ-зависимые и УНЬ-независимые группы пациентов с СРП и, соответственно, оптимизировать тактику и повысить эффективность лечения таргетными препаратами, действие которых связано с УНЬ-зависимыми патогенетическими механизмами. (Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/152.)

Для выявления пациентов с начальными стадиями РПЖ, а также для прогноза гистологически подтвержденного РПЖ в целях подбора оптимальной терапии нами разработана медицинская ДНК-технология, направленная на определение делеций хромосомных районов 13ql4 и 16я23 в биопсийных образцах больных. (Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/151.)

При РПЖ разработанная методика позволяет определять наличие химерного онкогена в ткани опухоли. Поскольку он служит маркером неблагоприятного прогноза и андрогеночувствительности опухоли, появляется возможность оптимизировать тактику и повысить эффективность лечения РПЖ. (Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/153.)

жать высокодозной химиотерапии, тяжелой инвалидизации и летального исхода. (Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/154 (ранняя диагностика РШМ).)

При УМ разработанный метод исследования аллельных делений в хромосоме 3 позволяет выявлять специфические молекулярные маркеры для верификации диагноза «увеальная меланома» в дополнение к применяемым в настоящее время диагностическим методам. (Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2009/319.)

Описанное в данной работе исследование потери гетерозиготно-сти в хромосомах 3 и 1рЗб представляет собой метод оценки прогрессии первичной опухоли при УМ. (Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2009/318.)

Личный вклад автора

Автором проведен подбор возможных молекулярных маркеров для диагностики и прогноза изучаемых онкологических заболеваний и ИБС. Осуществлены лабораторные исследования с использованием иммуноцитохимического, иммуногистохимического, цитофлюориметрического и иммуноферментного методов определения биомаркеров ИБС. Проведена статистическая обработка всех полученных данных. Автором проанализированы результаты, полученные при исследовании ключевых молекулярных маркеров ИБС и ряда онкологических заболеваний; сформулированы выводы и практические рекомендации.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в клинико-диагностическую работу в Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А. Герцена, Российском научном центре хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН.

Полученные практические и теоретические выводы применяются в учебном процессе на кафедрах биохимии Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова и МГУ им. М.В. Ломоносова, кафедре клинической лабораторной диагностики Российской медицинской академии последипломного образования.

Апробация работы

Апробация диссертации проведена 18 ноября 2010 г. на совместном заседании кафедр клинической лабораторной диагностики и биохимии ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава, кафедры биохимии, лаборатории

молекулярной генетики человека НИИ молекулярной медицины ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития РФ, лаборатории эпигенетики ГУ Медико-генетический научный центр РАМН (протокол № 19).

Материалы диссертации доложены на 20-м Европейском конгрессе патологии (Париж, Франция, 2005), Российском медицинском форуме (Москва, 2007), Конференции для молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007), на съездах Европейского общества генетики человека ЕБНв (Ницца, Франция, 2007 и Барселона, Испания, 2008), 7-м Международном симпозиуме по множественным факторам риска сердечнососудистых заболеваний (Венеция, Италия, 2008), 6-м Конгрессе по метаболическому синдрому, диабету II типа и атеросклерозу (Берлин, Германия, 2009), 6-й международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 25 печатных работ: 12 статей и 11 тезисов, главы в книгах «Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике онкологических заболеваний» и «Введение в молекулярную диагностику». Получено 7 разрешений на применение новых медицинских технологий (ФС №2008/150, ФС №2008/152, ФС №2008/151, ФС №2008/153, ФС №2008/154, ФС №2009/319, ФС №2009/318). Работа «Разработка и внедрение методов ДНК-диагностики для раннего определения и прогноза некоторых онкологических заболеваний» отмечена премией Правительства РФ 2009 года в области науки и техники для молодых ученых (распоряжение Правительства Российской Федерации от 1 марта 2010 года № 248-р, г. Москва).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 235 страницах и включает введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, 2 главы, в которых представлены результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации и список использованной литературы. Текст иллюстрирован 24 таблицами и 34 рисунками. Указатель литературы содержит 289 источников, из них 26 - работы отечественных авторов.

Положения, выносимые на защиту

1. Фактором риска развития ОКС у больных ИБС является нарушение регуляции гемостаза, обусловленное ростом уровня экспрес-

сии ключевого компонента системы фибринолиза РА1-1 в моноцитах периферической крови.

2. Изменение соотношения уровня СРБ и адипонектина в плазме крови больных со стабильным течением ИБС, а именно рост уровня СРБ при снижении уровня адипонектина свидетельствует о развитии воспаления и, как следствие, осложнений ИБС.

3. Структурная и функциональная патология генов-супрессоров УНЬ, 11А55Р1, РШГи СЮН1 имеют существенную диагностическую, прогностическую и терапевтическую значимость при СРП.

4. Аллельные делеции локуса 16q23, метилирование генов СБТР1 и N33 и экспрессия химерного гена ТМРКБ82/ЕВ.С4 являются ключевыми нарушениями при РПЖ и могут быть использованы в качестве маркеров для диагностики, прогноза течения и оценки эффективности лечения заболевания.

5. Система эпигенетических маркеров (аномальное метилирование Р16, МЬН1 и N33) имеет 85% чувствительность и специфичность и может быть использована для ранней диагностики РШМ.

6.Моносомия по хромосоме 3 и аллельные делеции хромосомного района 1р36 при УМ позволяют выявлять пациентов с агрессивным течением и высоким риском метастазирования первичной опухоли.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Биомаркеры в диагностике и определении прогноза ИБС

Были обследованы 162 пациента с ИБС в возрасте от 38 до 87 лет (средний возраст 62,5 ± 14,6 года), находившихся на стационарном лечении в Клинике кардиологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова с апреля 2006 г. по апрель 2008 г. С учетом цели и задач исследования пациенты были разделены на 2 основные группы. 1-ю группу составил 31 больной с ОКС (8 - с ИМ, остальные - с нестабильной стенокардией - НС), 2-ю - 131 больной со стабильным течением ИБС (все - со стабильной стенокардией). В каждой группе были выделены две подгруппы: с наличием или отсутствием сахарного диабета 2 типа (СД 2) и ожирения. В 3-ю (контрольную) группу включили 20 пациентов того же возраста, что и в основных группах, у которых диагноз ИБС был отвергнут на основании проведенного в стационаре обследования.

Критериями исключения из исследования были злокачественные новообразования, воспалительные заболевания в стадии обострения, признаки острого или обострения хронического инфекционного заболевания.

Клиническое исследование включало изучение анамнеза и данных объективного исследования с использованием лабораторно-ин-струментальных методов.

Все пациенты проходили обследование по схеме поэтапного ведения в случае предположения наличия ИБС: общий анализ крови и мочи, биохимический анализ крови, анализ липидного спектра, определение активности кардиоспецифических ферментов, а также запись электрокардиограммы (ЭКГ) в покое, эхокардиографическое (ЭхоКГ) исследование, суточное мониторирование ЭКГ по Холтеру, нагрузочный тест (тредмил-тест или велоэргометрия), сцинтигра-фию миокарда (по показаниям), дуплексное сканирование артерий, коронароангиографию (по показаниям).

Диагноз острого ИМ и НС ставили на основании жалоб пациента, данных клинического обследования, характерных изменений на ЭКГ, ЭхоКГ, определения уровня маркеров некроза миокарда в крови.

У всех обследуемых однократно брали венозную кровь в рамках стандартного исследования крови при поступлении в стационар. Общее содержание глюкозы, холестерина и триглицеридов в плазме крови определяли ферментативными методами.

Помимо общеклинических исследований, у каждого пациента получали фракцию мононуклеарных лейкоцитов периферической крови (МЛПК), а также определяли уровень биологических маркеров (СРБ и адипонектина) в сыворотке крови методом иммунофермент-ного анализа (ИФА).

Получение моноцитов из венозной крови

Фракцию МЛПК получали с помощью градиентного центрифугирования цельной крови в растворе фиколл-пак (Pharmacia). Далее клетки фиксировали 4% параформальдегидом (ПФ) и исследовали уровень экспрессии PAI-1 и иРА в моноцитах с помощью метода проточной цитофлюориметрии.

Для исследования содержания белков PAI-1 и иРА в моноцитах методом иммуноцитохимии полученную фракцию МЛПК культивировали в течение 1 сут, затем отделяли от поверхности чашек Петри с помощью раствора Версена (раствор натриевой соли этилендиами-нотетрауксусной кислоты) и осуществляли иммуноцитохимическое окрашивание.

Исследование экспрессии PAI-1 и иРА в моноцитах человека с помощью иммуноцитохимического метода

Иммуноцитохимическое окрашивание проводили с использованием моноклональных антител мыши к белку PAI-1 (Santa Cruz Biotechnology, клон С-9) и поликлональных антител кролика к белку uPA (Santa Cruz Biotechnology, клон H-140) в разведении 1:50. Затем

клетки инкубировали с FITC-конъюгированными вторичными антителами. Препараты исследовали с помощью флюоресцентной микроскопии. Стекла с контрольными клетками окрашивали с использованием системы визуализации Super Sensitive PolymerHRP IHC Detection Sysytem/DAB (BioGenex). В качестве первичных антител использовали моноклональные мышиные антитела к CD68 (DAKO Cytomation, клон PG-M1, разведение 1:700).

Исследование экспрессии PAI-1 и иРА в моноцитах человека с помощью метода проточной цитофлюориметрии

Окрашивание проводили с использованием первичных моно-клональных антител мыши к белку PAI-1 и поликлональных антител кролика к иРА в разведении 1:20. Затем добавляли к суспензии клеток FITC-конъюгат козьих антител к IgG мыши и FITC-конъюгат антител козы к IgG кролика (Santa Cruz Biotechnology) в разведении 1:500; инкубировали с моноклональными антителами мыши к CD14, меченными фикоэритрином (CD14-PE; «Сорбент»). Интенсивность флюоресценции измеряли с помощью проточного цитофлюоримет-ра EPICS-XL (Beckman Coulter).

Исследование экспрессии PAI-1 и иРА в атеросклеротиче-ских бляшках (АСБ) коронарных артерий с помощью иммуноги-стохимического метода и в моноцитах крови с помощью метода проточной цитофлюориметрии

Были обследованы 7 пациентов с ИБС в возрасте от 47 до 72 лет, находившихся на стационарном лечении в отделении кардиохирургии Клиники сердечно-сосудистой и общей хирургии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова с марта 2009 г. по май 2010 г. Пациенты был поделены на 2 группы: 1-ю группу составили 4 пациента со стабильным течением ИБС (стенокардия напряжения), 2-ю - 3 пациента с ОКС (2-е острым ИМ, 1-е НС). У всех обследованных, за исключением 1 из группы с ОКС, в анамнезе отмечен ИМ.

Венозную кровь брали перед операцией в стандартных условиях утром через 12-14 ч. после приема пищи. Выделение моноцитов и исследование экспрессии PAI-1 и иРА проводили с помощью метода проточной цитофлюориметрии по описанной выше методике.

Фрагменты коронарных артерий, полученных во время операции маммарокоронарного/аортокоронарного шунтирования, фиксировали в 10% забуференном формалине в течение 1 сут. Контролем служил фрагмент лучевой артерии одного из пациентов, полученный также во время операции.

Морфологическое исследование проводили на срезах толщиной 3-4 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином. Иммуно-

гистохимическое исследование осуществляли с использованием системы визуализации Super Sensitive Polymer-HRP IHC Detection Sysytem/DAB (BioGenex) в соответствии с прилагаемой инструкцией. В качестве первичных антител использовали кроличьи поликлональные антитела к uPA (abeam, разведение 1:50) и мышиные моноклональные антитела к PAI-1 (Santa Cruz, клон TJA6, разведение 1:50).

Определение биохимических маркеров атерогенеза в сыворотке крови методом ИФА

В работе для сэндвич-ИФА использовали наборы «ИФА СРБ» и «ИФА Адипонектин» на основе антител, полученных в совместных исследованиях Московского НИИ медицинской экологии, МГУ им. М.В. Ломоносова и лаборатории электронной микроскопии и им-муногистохимии Централизованного патологоанатомического отделения Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Статистическая обработка данных

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью компьютерных программ STATISTICA 6.0 и SPSS statistics 17.0. Статистические различия выборок оценивали по критерию Манна-Уитни. ROC-анализ проводили с помощью программы «SPSS statistics 17.0». Получали графические изображения характеристических кривых (ROC-curves, Receiver-Operator Characteristic curve) и площадь под кривой - AUC (Area Under Curve). Качество модели (диагностическая эффективность показателя) оценивали по общепринятой экспертной шкале для значений AUC.

Поиск ключевых маркеров и разработка ДНК-диагностических протоколов для ряда онкологических заболеваний

Клинический материал

С целью оценки прогрессии первичной опухоли при СРП исследованы аллельные делеции генов VHL, RASSF1, FHIT и CDH1 на материале 94 парных образцов (опухоль-норма) СРП, полученных от пациентов, проходивших лечение в Клинике урологии им. P.M. Фронштейна Первого МГМУ им. И.М. Сеченова; а также аномальное метилирование генов-супрессоров на материале 98 парных образцов светлоклеточных карцином и 29 парафиновых блоков СРП, полученных от пациентов, проходивших лечение в той же клинике. Для разработки молекулярно-генетической методики определения эффективности таргетной терапии при СРП использовали материал 123 удаленных первичных опухолей, полученных от пациентов, проходивших лечение в той же клинике. Для анализа полиморфных вариантов генов АВСВ1, TGFBR1, IL10 и VDR в норме и при спорадическом раке почки исследовано 98 парных образцов рака почки (РП)

(опухоль-норма), предоставленных Медицинским радиологическим научным центром РАМН и Клиникой урологии им. P.M. Фронштей-на Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. В качестве популяционного контроля использовали 151 образец крови здоровых доноров, предоставленный донорским пунктом Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Для определения ПГ и МН хромосомных районов 13q14 и 16q23 у пациентов с подозрением на РПЖисследован 51 микродиссекцион-ный образец больных с АКПЖ, 25 - с простатической интраэпите-лиальной неоплазией (ПИН), и 24 - с доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ). Для исследования экспрессии химерного гена TMPRSS2/EGR4 при РПЖ образцы ткани получены от 63 пациентов с диагнозом РПЖ, подвергшихся радикальной простатэктомии; 10 образцов получены от пациентов с диагнозом ДГПЖ. Образцы ткани ПЖ для определения маркеров метилирования представляли собой операционный материал больных с АКПЖ, ПИН и ДГПЖ, кроме того был получен аутопсийный материал неизмененной ПЖ. Все пациенты проходили лечение в отделении онко-урологии Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена.

Для определения аномального метилирования генов при РШМ были исследованы образцы дисплазии шейки матки (97 образцов), морфологически неизмененных тканей, прилегающих к дисплазии (51 образец), и образцы крови больных. Цервикальные мазки здоровых женщин (35 образцов) и женщин с фоновыми заболеваниями, которые были представлены эрозией шейки матки и цервикальной эктопией с выраженным воспалительным процессом (93 образца), взяты в женской консультации.

С целью выявления специфическихмолекулярныхмаркеров и оценки прогрессии первичной опухоли при УМ исследованы 107 парных образцов (норма-опухоль), полученных при операции энуклеации, и 17 образцов биоптатов, взятых методом тонкоигольной аспирационной биопсии, с соответствующими образцами периферической крови. Образцы получены от пациентов, проходивших обследование и лечение в Московском НИИ глазных болезней им. Гельмгольца.

Для молекулярно-генетического анализа клональной внутриопу-холевой гетерогенности в колоректалъных карциномах были получены образцы опухолей от И пациентов отделения колопроктоло-гического с хирургией тазового дна Российского Научного центра хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН. Все пациенты с первичными опухолями толстой кишки, представленными аденокарцино-мами без гематогенных метастазов, не получали ранее химиотера-певтического и лучевого лечения, в их анамнезе не было указаний на другие онкологические заболевания. Все опухоли после морфоло-

гического исследования классифицированы по TNM в зависимости от глубины инвазии и наличия пораженных лимфатических узлов. Для генетического анализа дополнительно брали венозную кровь больных.

Методы выделения ДНК и РНК

Выделение ДНК из парафиновых блоков проводили с гистологических срезов, полученных с помощью микротома. Осуществляли их депарафинизацию, опухолевые клетки и строму инкубировали с экстракционным буфером. Полученный лизат клеток, содержащий геномную ДНК, использовали для постановки ПЦР. Данную методику использовали для оценки прогрессии первичной опухоли и разработки молекулярно-генетической методики определения эффективности таргетной терапии при СРП, а также исследования клональной внутриопухолевой гетерогенности колоректальных карцином.

Выделение ДНК из свежего операционного и биопсийного материала, а также МЛПК проводили при исследовании спорадического РП, УМ, РШМ (только биоптаты и соскобы). Геномную ДНК из МЛПК и замороженных тканей выделяли методом обработки образцов протеиназой К с последующей фенолхлороформной экстракцией.

Лазерную микродиссекцию проводили на ткани РПЖ для определения ПГ и МН хромосомных районов 13ql4 и 16q23, а также маркеров метилирования с помощью системы лазерной микродиссекции ASLMD (Leica microsystems, Германия). Клетки, полученные с помощью микродиссекции, обрабатывали буфером, содержащим протеина-зу К. Полученный после инкубации раствор использовали для ПЦР.

Выделение РНК из операционного материала выполняли на ткани РПЖ для исследования экспрессии химерного гена TMPRSS2/EGR4. РНК выделяли методом кислофенольной экстракции с использованием набора «РИБО-золь-А» («АмплиСенс», Россия) по протоколу фирмы-производителя.

Потерю гетерозиготности в опухолевом материале определяли методом микросателлитного анализа. При исследовании ПГ в образцах СРП использовали по 2 динуклеотидных микросателлита на каждый из анализируемых генов: делеции VHL выявляли с помощью STR-маркеров D3S1317 и D3S1038, RASSF1 - D3S1568 и D3S966, FHIT - D3S1300 и D3S1234. При исследовании РПЖ для идентификации ПГ и МН в хромосомных районах 13ql4 и 16q23 использовали 3 высокополиморфных маркера: RB20int (внутриген-ный маркер RB1), D16S534 и D16S422. Для выявления специфических молекулярных маркеров и оценки прогрессии первичной опухоли при УМ проводили ПЦР микросателлитных маркеров D1S3669, D1S407, D1S1635, D1S2145, D1S243, D3S2398,D3S3520,16xTG_3q26.31,

D3S2459, D3S1234, D3S1300, D3S966, D3S1568, D3S1317, D3S1038. При исследовании колоректалъного рака определяли ПГ локусов 9р21 (.D9S942), 13р14 (.RB1int20), 10q23 (.D10S1761) и 17р13 (РТ53).

Методы анализа мутаций

Для оценки эффективности таргетной терапии при СРП анализ мутаций в кодирующей части гена VHL проводили с помощью SSCP-анализа (анализ конформационного полиморфизма одно-нитевой ДНК) ПЦР-продуктов и секвенирования. Мутации гена К-RAS при исследовании колоректалъного рака определяли аналогично.

Секвенирование ПЦР-продуктов проводили с использованием набора BigDye® Terminator v 3.1. Cycle Sequencing Kit фирмы Applied Biosystems с последующим анализом на генетическом анализаторе ABI PRISM 3100 по протоколам фирмы Applied Biosystems (США).

Исследование полиморфных вариантов генов

Мультилокусную ПЦР полиморфизмов генов АВСВ1, TGFBR1, IL10 и VDR при спорадическом РП проводили с использованием праймеров, фланкирующих исследуемые однонуклеотидные полиморфизмы (SNP - single nucleotide polymorphism) в каждом из генов. SNP определяли методом мини-секвенирования.

Методы анализа химерных генов

Для исследования экспрессии химерного гена TMPRSS2/EGR4 при РПЖ образцы РНК, растворенные в РНК-элюенте («Ампли-Сенс», Россия), обрабатывали ДНКазой. Обратную транскрипцию РНК проводили методом случайного праймирования с использованием High-Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystems, США) no протоколу фирмы-производителя в термоциклере GeneAmp2700. Затем проводили ПЦР и прямое секвенирование для определения химерных генов.

Методы анализа метилирования

При СРП для анализа метилирования промоторов генов CDH1 и VHL проводили обработку геномной ДНК метилчувствительной (МЧ) рестриктазой BstHHI («СибЭнзим», Новосибирск), которая служила матрицей для МЧ-ПЦР. При РШМ для анализа метилирования промоторных областей генов Р16, MLH1 и N33 проводили обработку геномной ДНК МЧ-рестриктазой Hpall. Метилирование генов определяли с помощью МЧ-ПЦР.

Электрофорез ПЦР-продуктов в 8% полиакриламидном геле

Разделение ПЦР-продуктов по молекулярной массе при анализе метилирования проводили с помощью вертикального электрофореза в 8% полиакриламидном геле (ПААГ). ПГ определяли с помощью электрофореза в 10% денатурирующем ПААГ. Визуальный контроль миграции ПЦР-продуктов осуществляли

относительно положения красителей бромфенолового синего и ксиленцианола. Затем проводили окрашивание ПААГ нитратом серебра.

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Graph Pad Instant 3.05. Уровень значимости а был принят равным 0,05. Многофакторный регрессионный анализ проводили с помощью программы Statistica v. 6.0.

Для анализа клинических ассоциаций химерного гена с прогрессией РПЖ были выбраны следующие критерии: степень диф-ференцировки опухоли по классификации Глисона, стадия процесса и наличие гормонального лечения перед простатэктомией. Пациенты по выбранному критерию были разделены на 3 группы, в которых сравнивали частоту химерного гена с помощью критерия Фишера.

Для изучения возможной связи между метилированием каждого из исследуемых генов и гистологическим критерием (степень диспластического процесса шейки матки; РПЖ, ПИН или ДГПЖ) проводили сравнение групп с помощью критерия %2. Чувствительность маркера рассчитывали как отношение истинно положительных результатов к сумме истинно положительных и ложноотрицательных результатов. Специфичность маркера рассчитывали по формуле: отношение истинно отрицательных результатов к сумме ложноположительных и истинно отрицательных результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

БИОМАРКЕРЫ В ДИАГНОСТИКЕ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ ИБС И ПРОГНОЗИРОВАНИИ ОСЛОЖНЕНИЙ

Сравнительная характеристика больных ИБС с ОКС и без ОКС по основным метаболическим параметрам

У больных ИБС с ОКС (1-я группа; п=31) и без ОКС (2-я группа; п=131) были сопоставлены основные метаболические параметры (табл. 1).

Анализ содержания липидов в плазме крови показал, что уровень липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) выходил за пределы рекомендуемых (норма < 100 мг/дл), содержание триглицери-дов (норма < 150 мг/дл) и общего холестерина (норма < 200 мг/дл) было повышено, а содержание липопротеидов высокой плотности

(ЛПВП; норма > 45 мг/дл) и липопротендов очень низкой плотности (ЛПОНП; норма < 200 мг/дл) у обследованных обеих групп не выходило за пределы нормы. Достоверных различий по этим параметрам между группами больных с ОКС и без ОКС не выявлено. Среднее содержание глюкозы в плазме крови у больных обеих групп было близким и практически нормальным (норма <110 мг/дл). Также не выявлено статистически значимых различий между этими группами по таким показателям, как средний возраст и индекс массы тела пациентов.

Таким образом, стандартные показатели липидного спектра и уровня глюкозы в сыворотке крови больных со стабильным и нестабильным течением ИБС статистически не различались, что исключает возможность их использования в качестве критериев, с помощью которых можно определять риск возникновения ОКС у больных со стабильным течением ИБС. Поэтому далее оценивали связь с заболеванием биохимических маркеров, в соответствии с изменениями уровня которых в клетках или сыворотке венозной крови можно было бы проводить дифференциальную диагностику сложных форм ИБС и прогнозировать риск развития осложнений.

Характеристика уровня иРА и РА1-1 в моноцитах периферической крови методами иммуноцитохимического окрашивания и проточной цитофлюориметрии

Изменение содержания в крови компонентов фибринолити-ческой системы является одним из факторов риска развития О КС у больных ИБС. На поздних стадиях атерогенеза увеличение экспрессии иРА приводит к повышенному протеолизу в

Таблица 1

Характеристика и основные метаболические параметры больных ИБС

Показатель ОКС+ (п=31) ОКС- (п=131) Р

Возраст, годы 69,26+11,33 66,02+10,02 0,12

Индекс массы тела, кг/м2 29,88+5,11 30,25±5,15 0,80

Глюкоза плазмы крови, мг/дл 107,83±42,96 107,27±42,75 0,95

Триглицериды, мг/дл 173,52±85,37 169,31±83,43 0,82

Общий холестерин, мг/дл 205,67±63,33 210,07±57,22 0,72

Холестерин ЛПВП, мг/дл 49,62+13,40 52,10+12,87 0,38

Холестерин ЛПНП, мг/дл 121,18±46,43 135,80+97,78 0,45

Холестерин ЛПОНП, мг/дл 34,67+17,05 32,99+15,29 0,62

Примечание. Отличия достоверны при значении р < 0,05.

АСБ коронарных артерий и, наконец, к их разрыву с последующим образованием тромботических наслоений в просвете сосуда (Brown N.J. et al., 2002). PAI-1, инактивируя урокиназу, ограничивает фибринолитическую активность местом расположения гемостатической пробки и предотвращает преждевременный лизис фибрина (Folsom A.R., 2001). Однако высокое содержание PAI-1 блокирует миграцию гладкомышечных клеток (ГМК) и способствует формированию нестабильных бляшек с пониженным содержанием этих клеток в сосудистой интиме, поэтому повышение концентрации этого белка в плазме крови больных ИБС также ассоциируется с плохим прогнозом заболевания (Lijnen H.R., 2002).

В основе патогенеза атеросклероза лежит хроническое воспаление сосудистой стенки, протекающее с преобладанием про-лиферативного компонента, основными клеточными эффекторами которого являются моноциты циркулирующей крови. Учитывая то, что макрофагальные «пенистые» клетки, образовавшиеся из моноцитов, являются типичным компонентом атероскле-ротической бляшки, уровень экспрессии иРА и PAI-1 определяли в моноцитах периферической крови больных со стабильным течением ИБС и с ОКС. В сравниваемые группы вошли 15 пациентов с ОКС (6 - с ИМ, остальные - с НС) и 27 больных со стабильным течением ИБС.

Для характеристики уровня иРА и PAI-1 в моноцитах периферической крови определяли количество клеток, окрашенных антителами к исследуемым белкам и содержание этих белков в клетках с помощью 2 методов: иммуноцитохимического окрашивания и проточной цитофлюориметрии.

По данным, полученным с помощью иммуноцитохимического метода, все С068-положительные клетки окрашивались антителами к иРА и PAI-1. Процент клеток в популяции, окрашенных антителами к исследуемым антигенам, не различался в группах и составлял от 77 до 99%. Однако интенсивность окрашивания и локализация окраски были различны в случае иРА и PAI-1: наиболее интенсивно клетки окрашивались антителами к PAI-1, что свидетельствует о более высоком уровне этого белка в клетках, чем иРА.

Цитофлюориметрический анализ, преимуществом которого является возможность не только рассчитать в популяции процент клеток, экспрессирующих исследуемые белки, но и оценить их количество, с одной стороны, подтвердил полученные с помощью иммуноцитохимического окрашивания результаты, а с другой - позволил количественно охарактеризовать содержание иРА и PAI-1 в клетках.

[25- -10» 75-

25 50 75 ИХ) 125

1 10 100

1000 х .1

1 10 100

Рис. 1. Исследование плотности экспрессии белков иРА и РА1-1 в СП 14+ моноцитах методом проточной цитофлюориметрии:

А - выявление популяции СБ14+ моноцитов после окрашивания С014-РЕ (красная флюоресценция). По оси абсцисс - структура клеток, усл. ед., по оси ординат - размер клеток, усл.ед.; Б, В, Г - гистограммы окрашивания Р1ТС-меченными антителами к иРА (пик 2) и РА1-1 (пик 3) СО!4+ моноцитов здорового добровольца (Б), больного со стабильным течением ИБС (В) и больного с ОКС (Г). Пик 1 - флюоресценция клеток, окрашенных только СЕ)14-РЕ. По оси абсцисс -интенсивность зеленой флюоресценции, усл.ед., по оси ординат - количество клеток, усл.ед.

Рис. 2. Плотность экспрессии белков РА1-1 (А) и иРА (Б) в моноцитах периферической крови: 1 - здоровые добровольцы; 2 - больные со стабильным течением ИБС; 3 - больные с ОКС

Данные, полученные с помощью метода проточной цито-флюориметрии и представленные на рис. 1, показывают, что среди СВ14-положительных клеток процент окрашенных антителами к иРА и РА1-1 очень высок (81,9-99,9%). При этом плотность экспрессии иРА и РА1-1, оцениваемая по средней интенсивности флюоресценции (МП) клеток, была различной в каждом случае, причем плотность экспрессии РА1-1 оказалась более высокой, чем иРА.

Сравнительный анализ показал (рис. 2 А, Б), что плотность экспрессии РА1-1 в моноцитах крови достоверно выше у больных с ОКС, чем без ОКС и в контрольной группе: соответственно 49,11+16,64, 37,95+18,43 (р<0,05) и 14,82+6,09 (р<0,0001). Достоверных различий плотности экспрессии иРА в группах больных с ОКС и без ОКС не обнаружено, однако она была достоверно выше, чем в контрольной группе - соответственно 5,04+1,30, 4,84±1,92 (р<0,05) и 2,25+0,88 (р<0,0001).

Полученные данные свидетельствуют о том, что плотность экспрессии исследуемых маркеров у больных ИБС достоверно более высокая, чем в контрольной группе, причем при стабильном течении ИБС плотность экспрессии РА1-1 в моноцитах периферической крови достоверно ниже, а при развитии НС и ИМ наблюдается ее повышение.

Таким образом, более высокий уровень экспрессии РАН в моноцитах периферической крови больных с ОКС позволяет предположить, что высокая локальная концентрация этого белка в атероскле-ротических бляшках, независимо от уровня иРА, может приводить к их дестабилизации с развитием клинической картины ОКС.

Исследование экспрессии иРА и РАН в АСБ коронарных артерий с помощью иммуногистохимического метода и в моноцитах крови с помощью метода проточной цитофлюориметрии

При морфологическом исследовании в 6 из 7 гистологических препаратов стенок коронарных артерий отмечались стабильные АСБ, в 1 случае (группа без ОКС) АСБ была отнесена к нестабильным (уязвимым).

При иммуногистохимическом (ИГХ) исследовании экспрессия иРА и РА1-1 отмечалась в клетках воспалительного инфильтрата и ГМК АСБ, интенсивность иммунопероксидазного окрашивания колебалась от слабого до выраженного (табл. 2). Более выраженная экспрессия иРА отмечалась в группе больных с ОКС по сравнению с больными без ОКС. При этом экспрессия иРА в ГМК в основных группах была выше нормы. Содержание РА1-1 в АСБ пациентов со стабильным течением ИБС, напротив, оказалось выше, чем у паци-

ентов с ОКС. При этом в норме экспрессия PAI-1 в ГМК не наблюдалась (см. табл. 2). Повышенный уровень PAI-1 отмечен у пациентов со стабильной ИБС и с ОКС в стенках пораженных атеросклерозом коронарных артерий. Это подтверждает, что PAI-1 может служить фактором риска развития тромбоза коронарных артерий (Salame M.Y.et al., 2000).

При сравнении плотности экспрессии иРА и PAI-1 в моноцитах этих больных иммуноцитофлюориметрическим методом не обнаружено достоверных различий между группами больных с ОКС и без ОКС. При этом во всех случаях плотность экспрессии PAI-1 оказалась выше, чем иРА, как и процент окрашенных антителами к PAI-1 клеток.

Таким образом, можно предположить наличие зависимости между нестабильностью АСБ (и, соответственно, развитием ОКС) и повышением уровня экспрессии PAI-1 в воспалительном инфильтрате АСБ, что приводит к снижению фибринолитической активности в области бляшки.

В то же время более выраженная экспрессия иРА в ГМК у больных с ОКС (по сравнению с PAI-1), возможно, тоже влияет на

Таблица 2

Экспрессия иРА и РА1-1 в АСБ коронарных артерий больных с ОКС и при стабильном течении ИБС

№ гистологического препарата иРА РАМ

воспалительный инфильтрат ГМК воспалительный инфильтрат ГМК

ла-1 (контроль) Отсутствует + Отсутствует -

Группа больных с ОКС

ка-1 ++ +++ + -

ка-4 ++ + +++ +

ка-5 Отсутствует +++ Отсутствует +

Группа больных без ОКС

ка-2 + ++ + +

ка-3 Отсутствует ++ Отсутствует +

ка-6 ++ +++ ++ ++

ка-7 + +++ ++ +++

Примечание. «-» - иммунопероксидазное окрашивание отсутствует; - слабое иммунопероксидазное окрашивание и/или окрашивание части клеток; «++» - умеренное иммунопероксидазное окрашивание; «+++» - выраженное иммунопероксидазное окрашивание; «Отсутствует» - воспалительный инфильтрат отсутствует.

стабильность АСБ. Согласно литературным данным, на поздних стадиях атерогенеза увеличение экспрессии иРА приводит к повышенному протеолизу в АСБ коронарных артерий. Вследствие превалирования содержания активатора плазминогена над его ингибитором становится возможным усиление активности данной протеиназы. Это, в свою очередь, приводит к разрыву АСБ с последующим образованием пристеночных тромбов в просвете сосуда (Brown N.J. et al., 2002).

Полученные данные позволяют заключить, что повышение экспрессии PAI-1 в моноцитах крови и также в воспалительном инфильтрате АСБ больных со стабильным течением ИБС может приводить к дестабилизации АСБ, а повышенная экспрессия иРА в ГМК - определять нестабильность АСБ на поздних стадиях атеросклероза.

Изучение уровня биохимических маркеров атерогенеза в сыворотке крови больных со стабильным течением ИБС и с ОКС

Маркеры воспаления - одно из важных направлений поиска биомаркеров ССЗ. Важную роль в атерогенезе, включая развитие повреждения сосудистой стенки, нестабильность АСБ и возникновение тромботических осложнений, играет воспаление, выраженность которого можно оценивать по изменению уровня СРБ и адипонектина. Уровень гормона жировой ткани адипонектина также связан с большинством метаболических проявлений и наиболее полно отражает тяжесть гормональных и метаболических нарушений у пациентов с атеросклерозом коронарных сосудов.

В связи с этим для установления связи развития осложнений ИБС в виде ОКС с механизмами развития атеросклероза сравнивали уровень адипонектина и СРБ в сыворотке крови больных со стабильным течением ИБС (п=131) и с ОКС (п=31).

Таблица 3

Уровень биохимических маркеров у больных ИБС и в контрольной группе

Показатель Больные с ОКС (п=31) Больные без ОКС (п=131) Контрольная группа (п=20) Р

СРБ, мкг/мл 14,99±19,96 7,93±9,44 2,03+1,81 0,004* 0,005**

Адипонектин, мкг/мл 8,86+3,55 11,58+5,92 14,83±1,81 0,01* 0,001**

Примечание. * - различия достоверны между показателями у больных без ОКС и в контрольной группе; ** — между показателями в основных группах.

Проведенные исследования показали, что содержание изучаемых маркеров в сыворотке крови обследованных контрольной группы соответствует норме и статистически значимо отличается от такового в основных группах; выявлены также статистически значимые различия между показателями у больных с ОКС и без ОКС (табл. 3).

Так, установлено достоверное увеличение концентрации СРБ (рис. 3 А) в сыворотке крови больных с ОКС по сравнению с таковой в группе больных без ОКС и в контрольной группе: соответственно 14,99+19,96, 7,93±9,44 (р=0,004) и 2,03+1,81 (р<0,005), а уровень адипонектина (рис. ЗБ) оказался достоверно более низким у больных с ОКС, чем без ОКС и в контрольной группе: соответственно 8,86±3,55; 11,58+5,92 (р=0,01) и 14,83+1,81 (р<0,001).

Анализ характеристической кривой для СРБ продемонстрировал хорошую диагностическую эффективность данного маркера в отношении ИБС у больных без ОКС и с ОКС. Так, площадь под кривой (AUC) равна соответственно 0,74 и 0,78, рассчитанное программой оптимальное пороговое значение «cut-off» составило > 4,4 и 5,5 мкг/мл, чувствительность - 57 и 61%, специфичность - 95 и 90%. При использовании порогового значения, указанного производителем диагностикума и равного 4 мкг/мл, чувствительность составила для обеих групп 61%, специфичность - 90%, диагностическая точность - 76%.

Адипонектин как потенциальный маркер для оценки состояния больных со стабильной ИБС при значении «cut-off» < И мкг/мл, продемонстрировал специфичность 95%, чувствительность - 54%, AUC = 0,6. В группе больных с ОКС этот

16-' * 14" CU с- 12" и ^ 10 о 0 6" § 4" 0) 1 2" л —' Ч I /ровень белков, усл.ед. JW^OiCOOM-f^O 1---^ 1 Inj

U Контр ОКС- ОКС+ U А Б онтр ОКС- OKC+

Рис. 3. Уровень С-реактивного белка (А) и адипонектина (Б) в периферической крови у здоровых добровольцев (контроль) и у больных со стабильным течением ИБС и с ОКС

маркер показал очень хорошую диагностическую эффективность: АиС = 0,85, специфичность - 95%, чувствительность - 83%.

Учитывая то, что у части больных были выявлены ожирение или СД 2, в рамках проведенного исследования изучено влияние этих заболеваний при ИБС на показатели СРБ и адипонектина в сыворотке крови.

Для этого в каждой группе были выделены 2 подгруппы: 1-е ожирением или СД 2, II - без указанных заболеваний. В I подгруппу вошли 12 (39%) больных с ОКС и 37 (28%) - без ОКС, во II - соответственно 19 (61%) и 94 (72%) пациентов (рис. 4 А, Б). Достоверных различий изучаемых показателей между подгруппами не обнаружено, хотя уровень СРБ при наличии ожирения или СД 2 был несколько выше, а адипонектина - ниже, чем во II группе (соответственно 10,78+4,86 и 11,85±1,54 мкг/мл у больных без ОКС и 8,27±2,95 и 9,26±3,94 мкг/мл -с ОКС). В то же время средние значения показателей достоверно отличались от таковых в контрольной группе (см. рис. 4 В, Г). Возможно, отсутствие статистически значимых различий исследуемых параметров в сравниваемых подгруппах объясняется недостаточной выборкой.

Рис. 4. Распределение больных ИБС по наличию ожирения и СД 2 среди больных с ОКС (А) и среди больных без ОКС (Б).

Уровень СРБ (В) и адипонектина (Г) у больных с ОКС и без ОКС с учетом наличия (I подгруппа) или отсутствия (II подгруппа) ожирения или СД 2; * - р<0,05, ** - р<0,001 по сравнению с контрольной группой

Полученные данные позволяют нам присоединиться к мнению G.K. Shetty и соавт. (2004), которые считают, что снижение содержания адипонектина и повышение уровня СРБ может явиться не только важным маркером риска возникновения, но и фактором риска прогрессирования ИБС, особенно у пациентов с ожирением и наличием СД 2.

Полученные результаты и тот факт, что при сопоставлении уровня адипонектина в сыворотке крови с метаболическими параметрами не выявлено четкой его зависимости от массы тела больных ИБС, указывают на то, что при ССЗ адипонектин является в большей степени маркером воспаления, а не метаболических проявлений, и также фактором риска прогрессирования воспалительных процессов у больных ИБС. Полученные данные позволяют также заключить, что наличие ожирения и СД 2, часто сопровождающих ИБС, не может приводить к ложноотрицательным результатам при использовании адипонектина в качестве биомаркера.

Таким образом, есть основания предполагать, что наряду с СРБ, уже применяемым для оценки риска по критериям Рейнольдса (Ridker P.M., Buring J.E. et al„ 2007; Ridker P.M., Paynter N.P. et al., 2008) и включенным в список маркеров риска ССЗ Европейской ассоциацией кардиологов (Graham I. et al., 2007), исследование уровня адипонектина может стать дополнительным критерием риска осложнений ИБС.

Анализ результатов парного корреляционного анализа позволил обнаружить взаимосвязь содержания адипонектина в сыворотке крови и концентрации СРБ: обнаружена обратная статистически значимая корреляция между этими показателями в группе больных без ОКС (г = - 0,21, р = 0,01, у = 12,65 - 0,13 х; рис. 5).

I 50-

ГО У= = 12,65-0,13х г--0,21

S ^ £ 30^ X I ■ р=0,01

| 20- лз а: 1 10i | о- X л ^äsrfei- и ■ ■ ■ ■ ■

0 10 20 30 40 50 60

Концентрация С-реактивного белка, мкг/мл

Рис. 5. Анализ корреляции уровня адипонектина с концентрацией СРБ в сыворотке крови больных со стабильным течением ИБС

Обнаруженная обратная статистически значимая корреляция концентрации в сыворотке крови адипонектина с уровнем СРБ свидетельствует о влиянии адипонектина на течение болезни путем активации воспалительного процесса, поэтому взаимосвязанное изменение этих показателей при стабильном течении ИБС может служить дополнительным критерием в оценке степени риска отдаленных неблагоприятных исходов у указанных больных.

Анализируя полученные данные с учетом биологической роли исследуемых маркеров, можно заключить, что высокое содержание СРБ и низкий уровень адипонектина могут являться значимыми показателями тяжести воспаления и, соответственно, важными критериями риска развития ОКС у больных ИБС. Наличие ожирения или СД 2 у этих больных, возможно, ассоциировано с более высокой вероятностью развития ОКС.

ПОИСК КЛЮЧЕВЫХ МАРКЕРОВ И РАЗРАБОТКА

ДНК-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРОТОКОЛОВ ДЛЯ РЯДА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Ключевые маркеры и ДНК-диагностические протоколы для СРП

Связь аллельных делеций генов УНЬ, В.А55Р1, РН1Тс прогнозом заболевания

Для СРП характерны аллельные делеции генов-супрессоров, локализованных в области хромосомы Зр, которые могут влиять на развитие злокачественного новообразования. Для установления прогностической значимости аллельных делеций генов-супрессоров в настоящем исследовании определена ПГ областей локализации генов УНЬ (подавляет экспрессию генов, активируемых при гипоксии), ЯА55Р1 (негативный регулятор клеточного цикла, участвует в индукции апоптоза), РШТ (негативный регулятор клеточного цикла) (рис. 6).

1Т Ш 2Т 2Ы ЗТ ЗЫ 4Ы 4Т 5Ы 5Т 6Ы 6Т

Рис. 6. Выявление ПГ:

А- результат электрофореза в 8% ПААГ маркера 0381234 гена РШТ; Т - опухолевая; N - нормальная ткань; 1 - гомозигота; 2 - ПГ в опухолевой ткани; 3 - нормальная гетерозигота.

Б - результат денатурирующего электрофореза в ПААГ микросателлита 0381568 (образцы нанесены на гель в обратном порядке); 4 - гомозигота; 5 - ПГ в опухолевой ткани (область гена ЙЛ5577/); 6 - нормальная гетерозигота

ПГ гена 7 обнаружена в 27,5% (22/80), ПИТ-в 35,6% (32/90)

и УНЬ - в 27,9% (24/86) информативных образцов СРП. Аллельные делеции хотя бы одного гена на Зр наблюдали в 56,4% (53/94), а в совокупности из 3 исследованных генов - в 60,6% (57/94) информативных случаев. Проведен сравнительный анализ встречаемости ПГ в парных клинических группах: по стадии заболевания, степени диф-ференцировки первичной опухоли, распространению первичной опухоли за пределы капсулы почки, наличию/отсутствию метастазов. Выявлена ассоциация аллельных делеций по 2 и более генам-су-прессорам, локализованным на коротком плече хромосомы 3, только с наличием метастазов на момент постановки диагноза: р = 0,036, СЖ = 1,49 (95% С1: 1,01-2,33). По всей видимости, ПГ 2 и более ге-нов-супрессоров, наиболее часто делегируемых при СРП, оказывает непосредственное влияние на способность первичной опухоли к ме-тастазированию при этом типе почечно-клеточных карцином.

Связъаномалъногометилированиягенов-супрессоровУНЬ,В.А58Р1, РН1Ти СБН1 с прогнозом заболевания

В образцах гистологически неизмененной почечной паренхимы гиперметилирование генов-супрессоров, локализованных в области Зр (УНЬ, КА5БР1 и РН1Т), а также гена СБН1, кодирующего Е-кад-герин, не выявлено, что позволило рассматривать метилирование в образцах опухолевой ткани как аберрантное. В опухолях аберрантное метилирование УНЬ определено в 14,2% случаев (18/127), ДА^Г - в 52,8% (67/127), РНП- в 54,3% (69/127) и СИН1 - в 41,7% (53/127), что совпадает с данными литературы (рис. 7).

Проведен сравнительный анализ частоты метилирования в парных клинических группах в зависимости от стадии заболевания, степени дифференцировки первичной опухоли и метастазирова-ния. Показана ассоциация метилирования СБН1 с прорастанием опухолью капсулы почки (р = 0,024; ОИ = 2,40; 95% С1: 1,13-5,08) и наличием метастазов на момент постановки диагноза (р = 0,001; СЖ = 5,98; 95% С1: 2,03-17,59). Продукт гена СИН1 Е-кадгерин участвует в обеспечении контактного торможения пролиферации в эпителиальных тканях, в том числе в эпителии почечных канальцев. Инактивацию гена СБН1 вследствие метилирования можно рассматривать как событие, способствующее инвазивному росту и метастазированию первичной опухоли. Также установлено, что метилирование КА8БР1 чаще встречается в умеренно-, чем в высо-кодифференцированных первичных опухолях (р = 0,047; ОИ = 2,58; 95% С1: 1,04-6,35). Это дает возможность предположить, что аберрантное метилирование /^557*7 ассоциировано с прогрессией первичной опухоли и может считаться потенциальным неблагоприятным маркером на ранних стадиях РП.

Рис. 7. Определение метилирования генов-супрессоров с помощью МЧ-ПЦР: М - маркер молекулярной массы (риС19/Мэр1); ОК - отрицательный, ПК - положительный контроль амплификации; К+ - внутренний контроль ПЦР (экзон 2 гена УНЬ); N и Т - соответственно нормальная и опухолевая ткань; 1-3 (А) и 1-4 (Б) - анализируемые образцы.

А - аберрантное метилирование гена РН1Твыявлено в образцах опухолей 1 и 2; Б - аберрантное метилирование гена СЭН1 выявлено в образце опухоли 3

Таким образом, при СРП множественные аллельные делении генов-супрессоров, локализованных на коротком плече хромосомы 3, и метилирование гена СБН1 свидетельствуют о неблагоприятном влиянии на прогноз заболевания. В случае выявления ПГ 2 или 3 исследуемых генов вместе с аберрантным метилированием промотора СБН1 высок риск метастазирования первичной опухоли, что нужно учитывать при назначении адъювантной иммунотерапии.

Определение мутаций и метилирования гена УНЬ как предпосылка для таргетной терапии СРП

В последние годы при лечении метастатического РП применяют таргетные препараты, представляющие собой ингибиторы определенных тирозинкиназ или факторов роста. Наиболее универсальным в классе таргетных препаратов является Нексавар (Сорафе-ниб), который обладает активностью мультикиназного ингибитора (Алексеев Б.Я. и соавт., 2007).

Инактивация гена УНЬ встречается при наиболее распространенном гистологическом варианте рака почки - светлоклеточной карциноме. Показано, что более выраженный эффект применения таргетных препаратов достигается у пациентов с мутациями УНЬ в первичной опухоли, чем без них (Личиницер М.Р. и соавт., 2007). Мутации УНЬ были определены нами в 31,7% (39/123) случаев СРП. Все выявленные мутации соматические, т.е. присутствовали только в опухолевой ткани и не были обнаружены в соответствующих им образцах нормальной почечной паренхимы (рис. 8). Среди мутаций наиболее часто выявлялись делении, а также выявлены инсерции и дупликации, однонуклеотид-ные замены, комплексные мутации. Метилирование промотора гена УНЬ определено также только в образцах светлоклеточных карцином и не выявлено в гистологически нормальной ткани. Частота аберрантного метилирования составила 14,6% (18/123) случаев СРП.

При СРП I стадии соматические мутации в гене УНЬ выявлены в 35,4% случаев, ПГ - в 28,2% информативных случаев, аберрантное метилирование - в 20,0% образцов. В целом хотя бы одно

Рис. 8. Вверху - результат йБСР-анализа экзона 3 гена УНЬ. Внизу - прямое секвенирование ПЦР-продукта 5Т с обратного праймера: 1-6 - образцы; N и Т - соответственно нормальная и опухолевая ткань; ПЦР-продукт с аномальной подвижностью в образце 5Т

из нарушений гена VHL обнаружено у 53,8% больных. Полученные данные указывают на раннюю инактивацию VHL в светлок-леточных карциномах, что согласуется с предположением о ключевой роли этого события в раннем канцерогенезе при СРП. По разным оценкам, около 40% спорадических светлоклеточных карцином развиваются без ранней инактивации VHL, что позволяет условно разделять опухоли почки на VHL-зависимые и VHL-независимые.

Таким образом, разработанная нами медицинская технология позволяет выделять VHL-зависимые и VHL-независимые группы пациентов с СРП и, соответственно, оптимизировать тактику и эффективность лечения. Показан более выраженный ответ пациентов с соматическими мутациями гена VHL на терапию Сорафенибом, чем без мутаций, что демонстрирует целесообразность определения инактивации VHL при назначении подобных препаратов (Алексеев Б.Я., 2007).

Исследование полиморфных вариантов генов АВСВ1, TGFBR1, IL10 и VDR в норме и при спорадическом раке почки

Предрасположенность к РП может быть обусловлена аллельны-ми вариантами ряда генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, метаболизме ксенобиотиков и противоопухолевом иммунитете. Исходя из данных о полиморфных вариантах различных генов при РП, для настоящего исследования предрасположенности к РП были выбраны SNP в 4 генах: АВСВ1 (ген множественной лекарственной устойчивости), TGFBR1 (ген, кодирующий рецептор 1 типа трансформирующего фактора роста ß), IL10 (ген, кодирующий интерлейкин 10) и VDR (ген рецептора витамина D3). Сравнивали частоту аллелей и генотипов в контрольной группе и у больных РП, а также в различных клинических группах у пациентов со злокачественными опухолями почек, в том числе в многофакторном анализе.

Анализ полиморфизмов генов АВСВ1, TGFBR1, IL10 и VDR в лейкоцитах периферической крови и гистологически неизмененной почечной паренхиме

При анализе полиморфизмов генов АВСВ1, TGFBR1, IL10 и VDR использовали геномную ДНК, выделенную из лейкоцитов периферической крови (контрольная группа) и гистологически неизмененной почечной паренхимы (группа РП). Наблюдаемая частота генотипов в контрольной группе соответствовала закону Харди-Вейнберга. Достоверных различий в частоте аллелей (генотипов) между представителями того и другого пола в контрольной группе и у больных РП не выявлено.

Сравнительный анализ абсолютной частоты аллелей, генотипов и частоты встречаемости аллелей между исследуемыми группами

Выявлены достоверные различия частоты генотипов VDR у больных РП по сравнению с контролем (р = 0,025). В то же время различий между группами по частоте аллелей и встречаемости аллелей этого гена не обнаружено. Однако в группе РП наблюдали тенденцию к увеличению частоты встречаемости аллеля Т и снижению - аллеля С (генотип С/С - почти в 1,85 раза; 6% против 11,3%). Чувствительность критерия Фишера при оценке различий частоты встречаемости составила для аллеля Т 0,89 (95% CI: 0,83 - 0,93) и для аллеля С - 0,50 (95% СР. 0,42 - 0,59). Следовательно, объем выборок мог быть недостаточным для выявления снижения частоты аллеля С.

Аллель Т ассоциирован с пониженным уровнем активного витамина D3 в сыворотке крови больных РП и считается фактором предрасположенности к РП в некоторых популяциях. Возможно, снижение частоты протективного аллеля С и/или генотипа С/С связано с предрасположенностью к развитию РП в исследуемой популяции. Данные, подтверждающие протективную роль аллеля С, при наличии фактора риска - онкологического заболевания у родственников - получены и для популяций центральной и восточной Европы (Karami S. et al„ 2008).

При сравнительном анализе других исследуемых локусов различий в контроле и группе РП не выявлено.

Определение влияния полиморфных вариантов исследуемых генов на клинические особенности заболевания и характеристики первичной опухоли

Для определения возможного влияния полиморфных вариантов исследуемых генов на клинические особенности заболевания и характеристики первичной опухоли проведен сравнительный анализ частоты аллелей (генотипов) и частоты встречаемости аллелей АВСВ1, TGFBR1, IL10 и VDR в различных клинических группах пациентов. Парные клинические группы были сформированы по следующим признакам: начальным (I и II) и поздним (III и IV) стадиям заболевания, по степени дифференцировки первичной опухоли -группы G,.n и GIIJIV, по наличию (любое положительное значение N и/или М) и отсутствию (TXN-M0) метастазов на момент постановки диагноза.

Показано, что частота аллеля А гена TGFBR1 понижена у пациентов с регионарными и/или отдаленными метастазами: р = 0,012; OR = 0,80 (95% CI: 0,72 - 0,89). Также достоверно уменьшена в группе больных с метастазами встречаемость этого аллеля у гомо- и гетерозиготных носителей: р = 0,016; ОR = 0,81 (95% CI: 0,70 - 0,93).

Полученные данные не вполне согласуются с обнаруженной ранее ассоциацией аллеля А с повышенным относительно контроля риском РП (Chen Т. et al., 2004). Это может быть обусловлено, в частности, межпопуляционными различиями в частоте аллелей TGFBR1.

Выявление сочетаний аллелей исследуемых генов, влияющих на риск развития спорадического РПили прогрессию опухоли

С целью обнаружения сочетаний аллелей исследуемых генов, которые могут влиять на риск развития спорадического РП или прогрессию опухоли, проведен многофакторный регрессионный анализ встречаемости аллелей АВСВ1, TGFBR1, IL10 и VDR. Рассматривали комбинации из 2-4 полиморфизмов в контрольной группе и у больных РП, а также в парных клинических группах. Ассоциации сочетаний аллелей с риском развития РП и прогрессией первичной опухоли не выявлены.

Таким образом, в исследовании полиморфных вариантов генов АВСВ1, TGFBR1, IL10 и VDR в норме и при спорадическом РП показаны достоверные различия в частоте генотипов полиморфизма Taql гена VDR между контролем и группой РП, а также снижение частоты аллеля А полиморфизма int7G24A гена TGFBR1 у больных с метастазами на момент постановки диагноза. Результаты проведенного исследования могут способствовать формированию системы прогностических маркеров для спорадического РП.

Исследование молекулярной патологии при РПЖ и разработка ДНК-диагностических протоколов

Исследование ПГ и МН хромосомных районов 13q14u 16q23 при РПЖ

Гомозиготные и гетерозиготные делеции - одни из наиболее частых генетических изменений в эпителиальных опухолях, в том числе и при РПЖ. Для их детекции широко применяется микросателлит-ный анализ ПГ и МН. С целью оценки частоты генетических нарушений в опухолевом эпителии были выбраны хромосомные районы 13ql4 и 16q23 как наиболее часто повреждаемые при РПЖ. Делеции 13ql4 характерны для ранних стадий РПЖ, а потери хромосомного района 16q23 чаще встречаются на более поздних стадиях.

Высокая гетерогенность и мультифокальная природа РПЖ наряду с небольшим размером железы становятся серьезной проблемой для исследователей. В настоящей работе трудности получения гомогенного материала опухоли в достаточном для молекулярного анализа количестве преодолены с помощью лазерной микродиссек-ции ткани.

По полученным нами данным, 46 образцов опухолевого эпителия (91%) имели ПГ/МН, по крайней мере, по одному из маркеров. Частота аллельных нарушений в эпителии составила: 51% для маркера

0168534, 57% - для Б168422 (72% для локуса 16(\23 по совокупности 2 маркеров) и 37% - для локуса 13д14. В эпителиальном компоненте ПИН обнаружен меньший процент молекулярных перестроек (от 24 до 28%; табл. 4). При ДГПЖ структурных перестроек не выявлено.

Для сравнения частот ПГ/МН изученных локусов с прогрессией РПЖ были выбраны следующие клинические критерии: степень дифференцировки опухоли по классификации Глисона, стадия процесса и наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах. Обнаружены статистически достоверные ассоциации аллельных потерь в эпителии локуса 16д23 (маркер 0168534) со степенью дифференцировки опухоли, стадией злокачественного процесса и наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах. Положительные ассоциации со стадией заболевания показаны также для микросателлитов i?Б20гиí и Б168422 (табл. 5).

Использование системы прогностических маркеров ПГ/МН как дополнительного к гистологическому исследованию метода может помочь в диагностике и прогнозе РПЖ.

Таким образом, разработанная нами медицинская ДНК-технология направлена на определение делеций хромосомных районов 13д14 и 16q23 в биопсийных образцах больных с заболеваниями ПЖ

Таблица 4

Частота аллельных нарушений у пациентов с АКПЖ, ПИН и ДГПЖ

Маркер Частота ПГ/МН

АКПЖ ПИН ДГПЖ

0165534 26/51 (51%) 7/25(28%) 0/24

0168422 29/51 (57%) 6/25 (24%) 0/24

ЯВ1.20 19/51 (37%) 7/25 (28%) 0/24

Таблица 5

Ассоциации аллельных нарушений в опухолевом эпителии с клиническими параметрами

Маркер Корреляции

степень дифференцировки по классификации Глисона, р метастазиро-вание, р стадия РПЖ, Р

Б165534 0,01 0,04 0,02

Б165422 НД НД 0,04

ЯВ 1.20 НД НД 0,02

Примечание, р - вероятность; НД - недостоверное различие (р>0,05).

с целью выявления пациентов с начальными стадиями РПЖ, а также для определения прогноза гистологически подтвержденного РПЖ.

Исследование экспрессии химерного гена TMPRSS2/EGR4 при РПЖ

Особенностью канцерогенеза РПЖ являются образование химерных онкогенов, приводящих к активации факторов транскрипции семейства ETS. В результате исследований последних лет открыты химерные гены при РПЖ, образованные слиянием 5'-нетраслируемой области гена TMPRSS2 и генов семейства транскрипционных факторов ETS - таких, K&KERG4 (21q22.1), ETV1(7р21.2) и ETV4 (17q21). Конечным результатом всех перестроек ETS является аномальная гиперэкспрессия измененных вариантов транскрипционных факторов (Winnes М. et al., 2007). Активация факторов транскрипции семейства ETS вследствие хромосомных перестроек осуществляется с помощью андроге-ночувствительных промоторных и энхансерных элементов и является особенностью канцерогенеза при РПЖ. Идентификация андрогено-чувствительных и андрогенрезистентных генов-участников химерных онкогенов может помочь в определении мишеней для антигормональной терапии РПЖ.

В ткани ДГПЖ, взятой в качестве контрольных образцов, химерных транскриптов не обнаружено (0/10), что согласуется с результа-

тами работы J. Wang и соавт. (2006). Частота химерного транскрипта TMPRSS2/ERG4 в ткани РПЖ составила 50% (32/63). Подлинность химерного гена TMPRSS2/ERG4 подтверждена секвенированием исследуемого фрагмента кДНК (рис. 9).

Для анализа клинических ассоциаций перестройки TMPRSS2/ ERG4 с прогрессией РПЖ были выбраны следующие критерии: степень дифференцировки опухоли по классификации Глисона, стадия процесса и наличие гормонального лечения перед простатэктомией. При делении пациентов на 2 группы (проходящие гормональное лечение и не проходящие его), частота перестройки у пациентов без гормонального лечения составила 56% (25/45), а после него - 17% (2/12); различия статистически достоверны (р = 0,023). К сожалению, в представленной выборке не было гормонально-независимых опухолей для оценки частоты экспрессии TMPRSS2/ERG4 в андро-генрезистентных опухолевых клетках. Таким образом, экспрессия химерного гена TMPRSS2/ERG4 может служить маркером оценки ответа опухолевых клеток на гормональную терапию и их андроге-ночувствительности.

Нами также обнаружено достоверное различие между группами пациентов с РПЖ с поражением одной либо обеих долей ПЖ, т.е. между стадиями Т2а и Т2Ь. В группе больных с локализацией РПЖ в одной доле химерных перестроек не выявлено (0/10), у пациентов с поражением обеих долей они составили 48% (14/27; р = 0,005). В целом частота химерного гена увеличивается с про-грессированием заболевания: частота TMPRSS2/ERG4 на стадии II составило 40% (14/35), на стадии III - 62% (13/21), на стадии IV -71% (5/7) (табл. 6).

Достоверных ассоциаций между наличием химерного транскрипта и степенью дифференцировки опухоли по Глисону не обнаружено.

Таблица 6

Распределение частот химерной перестройки TMPRSS2/ERG4 на различных стадиях РПЖ

Стадия Число пациентов Частота TMPRSS2/EKG4, %

дгпж 10 0

I 0 -

II 35 40

III 21 62

IV 7 71

Таким образом, показано, что образование химерного гена TMPRSS2/ERG4 является частым опухолеспецифическим событием РПЖ. Экспрессия данного гена коррелирует с более агрессивными стадиями заболевания и может служить молекулярным маркером РПЖ, а также маркером оценки ответа опухолевых клеток на гормональную терапию и андрогеночувствительности опухолевых клеток. Преимуществом данного метода является возможность работать с образцами опухоли без выполнения микродиссекции, несмотря на выраженную гетерогенность РПЖ. Поиск других способов активации онкогенов и выявление возможных перестроек на стадии гормонально-резистентного РПЖ позволит объяснить механизмы резистентности опухолевых клеток к гормональной терапии и выработать новые стратегии лечения больных с поздними стадиями РПЖ.

Клинически значимые маркеры метилирования при РПЖ

Проведен анализ метилирования промоторных областей генов Р16 (ген-супрессор опухолевого роста), HIC1 (транскрипционный фактор), N33 (ген-супрессор) и GSTP1 (глутатион-Б-трансфераза) в образцах ткани АКПЖ, ПИН разной степени, ДГПЖ и неизмененной ПЖ, а также в смежных соединительнотканных образцах, расположенных рядом с фокусами аденокарциномы, ПИН высокой степени и ДГПЖ. Высокая частота метилирования установлена для аденокарциномы: HIC1 - 8/9 (89%); Р16 - 7/9 (78%); GSTP1 - 6/6 (100%); N33 - 2/6 (33%). Для ПИН высокой степени была характерна следующая частота: HIC1 - 5/7 (71%); Р16 - 4/7 (57%); GSTP1 - 5/7 (71%); N33 - 0/7. В близлежащей строме практически во всех анали-зируемыхобразцахвыявленометилирование,кромегенаА',.Я?:#/СУ-4/4; Р16 - 4/4; GSTP1 - 2/4; N33 - 0/4. В гиперпластически измененных и нормальных железистых структурах, в близлежащей строме метилирования не было обнаружено, за исключением гиперпла-зированных ацинусов на гистологических препаратах пациентов с метастазами. Для генов N33 и GSTP1 установлено статистически достоверное различие между пациентами с ПИН и аденокар-циномами.

Для исследования возможности неинвазивной диагностики проведен анализ метилирования генов Р16, CD44 (участвует в клеточной адгезии), CDH1, N33 и GSTP1 в 64 образцах плазмы крови пациентов с РПЖ и пациентов с ДГПЖ, чтобы оценить диагностический потенциал выбранных эпигенетических маркеров. Достоверные различия в плазме крови у пациентов с предраковым состоянием и с РПЖ обнаружены только для гена GSTP1, хотя чувствительность данного маркера составляет лишь 28%. Действительно, по данным литературы, в сыворотке/

плазме крови прогностическим маркером пока можно считать только метилирование СБТР1, которое выявляется в 13 - 72% случаев РПЖ.

Таким образом, для генов N33 и С5ТР1 было показано статистически достоверное различие между группами пациентов с ПИН и аденокарциномами. Использование системы прогностических маркеров метилирования, в частности генов N33 и СБТР1, как дополнительного к гистологическому исследованию метода может помочь в диагностике и прогнозировании течения РПЖ.

Разработка системы эпигенетических маркеров для ранней диагностики РШМ

Одним из самых распространенных механизмов инактивации ге-нов-супрессоров опухолевого роста является аномальное метилирование СрС-островков промоторных и регуляторных областей этих генов. Идентификация гиперметилирования различных генов может служить молекулярным маркером ранней диагностики, мониторинга и клинического прогноза опухолей.

При фоновых изменениях шейки матки метилирование генов Р16, МЬН1 (участвует в репарации неспаренных участков ДНК) и N33 не менялось по сравнению с образцами, полученными у женщин

1р 1н 2р 2н Зр Зн 4р 4н м

Рис. 10. Пример определения аномального метилирования генов Р16 и N33 при дисплазии шейки матки:

р - ДНК после гидролиза НраП; н - ДНК негидролизованная Нра II; м - маркер молекулярной массы; дорожки 1 и 3 - наличие аномального метилирования соответственно генов N33 и Р16; дорожки 2 и 4 - отсутствие аномального метилирования; ХЬ3.2 - внутренний контроль гидролиза МЧ-рестриктазой и ПЦР

без гинекологической патологии. Высокая частота гиперметилирования определена для генов Р16 (58%), MLH1 (51%) и N33 (27%) при цервикальной интраэпителиальной неоплазии II — III степени (ЦИН II-III) (рис. 10).

В образцах ткани шейки матки, смежных с дисплазией, но морфологически не отличающихся от нормы, выявлена частота метилирования, близкая к таковой в диспластических образцах (Р16 -50%, MLH1 - 36%, N33 - 10%). Достоверных различий в частоте метилирования этих генов при ЦИН II-III и в морфологически неизмененной ткани не обнаружено. Высокий уровень метилирования в морфологически неизмененной ткани подтверждает, что оно является наиболее ранним маркером начавшихся злокачественных процессов в клетке, когда ее морфология еще не изменилась.

Наиболее высокая чувствительность определена для гена Р16 (54%), а наибольшая специфичность - для гена N33 (100%). Панель из 3 генов имеет чувствительность и специфичность до 85%, т.е. наличие гиперметилирования по крайней мере 1 из 3 генов обеспечивает 85% чувствительность и специфичность детекции ЦИН II-III в исследуемом материале шейки матки.

Таким образом, определение гиперметилирования генов Р16, MLH1 и N33 может использоваться для молекулярной диагностики злокачественного потенциала ЦИН II и III степени. Полученные результаты позволяют считать, что исследование генов-супрес-соров вместе с цитологическим исследованием и тестированием вируса папилломы человека может служить основой для скрининга тяжелой дисплазии при мониторинге женщин с риском развития РШМ.

Исследование молекулярной патологии при УМ и разработка ДНК-диагностических протоколов

Исследование аллелъных делеций в хромосоме 3 при увеалъной меланоме

Дифференциальной диагностике УМ способствует обнаружение потери копии хромосомы 3, так как это нарушение специфическое, не характерное для другой онкопатологии. Оптимальным методом в данном случае служит микросателлитный анализ, выявляющий аллельный дисбаланс в опухоли.

ПГ по маркерам хромосомы 3 определена в 51 (48%) из 107 исследованных образцов УМ, из них в 48 (45%) отмечена ПГ по всем информативным локусам хромосомы 3 (рис. 11).

Клиническая чувствительность метода составляет 45-55%, так как моносомия 3 присутствует в 45-55% образцов УМ. Клиническая специфичность метода чрезвычайно высока в связи с тем, что

в отличие от множества других опухолей, для которых характерны потеря только короткого плеча хромосомы 3 или структурные нарушения Зр, наиболее распространенным нарушением при УМ считается моносомия 3.

Аналитическая чувствительность системы (наличие как минимум 1 информативного маркера на каждом плече хромосомы 3) составляет 99,5%. Аналитическая специфичность оценивалась при использовании образцов условно-нормальной хориоидеи, в которых ПГ не выявлена.

Таким образом, разработанная методика предполагает исследование ПГ в ряде локусов короткого и длинного плеча хромосомы 3 с целью выявления потери 1 копии хромосомы 3 (моносомия 3), характерной для меланом увеального тракта.

Исследование ПГ для оценки прогрессии первичной опухоли при УМ

Потеря в опухолевых клетках 1 копии хромосомы 3 (моносомия 3), делеции локусов Зр25, 3(р14.2-р13) и 3(q24-q26), изодисо-мия 3 (результат потери одной из хромосом и дупликации оставшейся) - наиболее частые нарушения при УМ; они обладают наибольшей прогностической точностью в отношении развития метастазов (Harbour J.W., 2007). Также отмечено, что наличие перестроек в 1р, встречающееся примерно у 1/3 пациентов с УМ, служит признаком опухолевой прогрессии.

Н О н о н о

3q26_16TG

ПГ гом гет

1 .....i D3S1300

гет ПГ гом

------:.... ; 1 .. ч "' . „.- . D3S1568

гет ПГ гом

V, • ' . , * ... -л D3S1038

гет ПГ гом

Рис. 11. Оценка состояния некоторых микросателлитных маркеров в различных образцах УМ:

н - норма; о - опухоль; гет - маркер гетерозиготен (ПГ нет); гом - маркер гомозиготен (не информативен)

Информативность исследуемых маркеров составила: 01Б438 - 0,570, 0153669 - 0,731, ДШ07 - 0,769, 0151635 -0,600, Б152145 - 0,778, Б15243 - 0,817. Моносомия хромосомы 3 выявила ассоциацию (р < 0,0001) с наличием в опухоли эпителиоидных клеток (смешанно-клеточные и эпителиоидно-клеточные УМ), а также с локализацией меланомы в цилиар-ном теле (р = 0,001), что играет важную роль в развитии метастазов.

ПГ по маркерам, локализованным на коротком плече хромосомы 1, определена в 32 случаях УМ (29,9%). В 25 (23,4%) образцах ПГ обнаружена для всех информативных маркеров 1р36. Наибольшая частота аллельных потерь выявлена для маркеров, расположенных в самых дистальных из изучаемых локусов - Б15243 (1р36.33) и И152145 (1р36.31).

С помощью критерия Манна-Уитни была выявлена ассоциация аллельных потерь в 1р36 с размером опухоли (р = 0,012). Статистически значимая связь обнаружена между экстрасклеральной инвазией меланомы и ПГ по всем информативным маркерам 1р36 (р = 0,012). Экстрасклеральная инвазия считается характерным признаком агрессивности УМ, и ассоциация ее с нарушениями в хромосоме 1 свидетельствует о связи нарушений в 1р с опухолевой прогрессией.

Аналитическая чувствительность системы (наличие как минимум одного информативного маркера на каждом плече хромосомы 3) составляет 99,5% для маркеров хромосомы 3 и 99,9% - для системы маркеров 1р36. Аналитическую специфичность оценивали при использовании образцов условно-нормальной хориоидеи, где ПГ по указанным маркерам не выявлена.

Таким образом, разработанная нами методика, основанная на исследовании аллельных делений в хромосомах 3 и 1р36, представляет собой молекулярно-генетическое исследование для выявления молекулярных маркеров прогрессии УМ в дополнение к применяемым в настоящее время диагностическим методам.

Молекулярно-генетический анализ клональной внутриопухоле-вой гетерогенности в колоректальных карциномах

По данным морфологического анализа, в 9 из 11 адено-карцином толстой кишки имелась различная степень диф-ференцировки в разных участках. Опухолевые железистые комплексы в каждом из 4 сегментов одной и той же опухоли отличались по степени дифференцировки: в 8 случаях на-

блюдались фрагменты с умеренной и высокой дифференци-ровкой, в 1 - с умеренной и низкой. Кроме того, один и тот же фрагмент опухоли зачастую содержал атипичные железистые комплексы как умеренной, так и высокой степени дифференцировки.

В результате микросателлитного анализа полиморфных маркеров в локусах расположения генов-супрессоров Р16, Р15, Р19 (9р21), RB1 (регулирует переход G1—>S фазы клеточного цикла) (13р14), PTEN (10q23), ТР53 (17р13) в 9 из 11 образцов при коло-ректальном раке удалось определить аллельные делеции (81%). В 7 случаях найдены делеции 1 или более маркеров во всех 4 сегментах. В 4 опухолях делеции выявлены не во всех сегментах, что указывает на внутриопухолевую гетерогенность.

МН считали подтвержденной при появлении аллелей, длина которых отличалась от нормальных, определяемых в ДНК лимфоцитов периферической крови. К проявлению нестабильности отнесены 3 случая, в которых оказались нестабильны 2 или более маркеров (27%).

Изучение разных сегментов одной опухоли, помимо внутри-опухолевой гетерогенности, позволяет определить очередность появления и распространения молекулярно-генетических повреждений при возникновении колоректального рака. Если повреждение присутствует во всех сегментах опухоли, значит, оно более раннего происхождения. Повреждение первоначально возникает в материнском клоне, позже к нему присоединяются другие геномные нарушения, давая начало новым субклонам. В 5 случаях делеции локуса 9р21 (гены Р16, Р15, Р19) найдены во всех сегментах опухоли, как и аллельная потеря гена RB1, что позволяет сделать вывод о первичности повреждения регуляторного пути P16-RB1-u,ukruh D в генезе опухолей у этих больных и о более позднем присоединении делеций гена PTEN, которые выявлены лишь в части сегментов. Во всех сегментах других опухолей (2 случая) определена потеря гена ТР53, что можно рассматривать как более раннее событие, а делеции в других локусах - как более поздние события в генезе опухоли. При этом не выявлено опухолей, содержащих делеции 9р21 и 17р13 (ТР53) одновременно. Полученные результаты позволяют считать присоединение МН вторичным, более поздним событием. В одном из образцов присутствовала как аллельная делеция локуса 13ql4 (RB1), так и высокая степень МН, при этом нестабильность была более позднего происхождения, так как выявлена не во всех сегментах. В другом случае делеция гена PTEN являлась ранним событием канцерогенеза.

Активирующие мутации гена К-В.А5 (протоонкоген) во всех сегментах опухоли обнаружены у 4 из 11 больных, что подтверждает их более раннее появление.

Таким образом, при молекулярно-генетическом анализе кло-нальной внутриопухолевой гетерогенности в колоректальных карциномах подтверждена гетерогенность 9 из 11 опухолей (81%) не только молекулярными методами, но и при морфологическом исследовании. Изучая внутриопухолевую гетерогенность, можно определить очередность молекулярно-генетических событий, происходящих при развитии колоректального рака, проследить его механизм и связать молекулярные повреждения с клиническим поведением опухоли - агрессивностью, способностью к инвазии, метастатическим потенциалом, ответом на лекарственную терапию и т.д.

ВЫВОДЫ

1. Биологические и молекулярно-генетические маркеры сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний или их сочетание позволяют определить начальные стадии, прогноз развития и подобрать оптимальную тактику лечения этих заболеваний.

2. Высокий уровень экспрессии ингибитора активатора плазми-ногена 1 типа в моноцитах периферической крови больных ишеми-ческой болезнью сердца, независимо от уровня активатора плазми-ногена урокиназного типа, является показателем нестабильности атеросклеротических бляшек и маркером развития острого коронарного синдрома.

3. Установлено, что для больных как со стабильным течением ишемической болезни сердца, так и с острым коронарным синдромом характерны увеличение концентрации С-реактивного белка и снижение концентрации адипонектина. Выявленные взаимосвязи между показателем метаболических нарушений - адипонектином и маркером воспаления С-реактивным белком позволяют использовать этот гормон для дополнительной оценки степени тяжести воспалительного процесса у больных со стабильным течением ишемической болезни сердца, особенно при наличии метаболического синдрома.

4. Показано, что потеря гетерозиготности более чем одного из ге-нов-супрессоров (УНЬ, ЯА55Р1, БШТ) ассоциирована с наличием метастазов (р = 0,036), а метилирование гена СБН1 ассоциировано с прорастанием опухолью капсулы почки (р = 0,024) и наличием

метастазов на момент постановки диагноза (р = 0,001) у больных светлоклеточным раком почки. В случае обнаружения мутаций и метилирования гена УНЬ целесообразно назначение таргетных препаратов (Сорафениб).

5. При спорадическом раке почки показано достоверное снижение частоты протективного аллеля С и генотипа С/С полиморфизма Taql гена УйЯ (р<0,025), а также снижение частоты аллеля А полиморфизма т17С24А гена ТСРВШ (р<0,012) у больных с метастазами на момент постановки диагноза.

6. Установлено, что потеря гетерозиготности локуса 13ql4 ассоциирована с более ранними стадиями рака предстательной железы, а аллельные потери локуса 16q23 достоверно коррелируют со степенью дифференцировки опухоли, стадией злокачественного процесса и наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах. Для аномального метилирования генов N33 и показано статистически достоверное различие между группами пациентов с простатической интраэпителиальной неоплазией и адено-карциномами предстательной железы.

7. Установлено, что образование химерного гена ТМРР.8Б2/ЕВ.С4 является частым опухолеспецифическим событием рака предстательной железы, а его экспрессия коррелирует с более агрессивными стадиями заболевания и может служить молекулярным маркером рака предстательной железы, оценки ответа опухолевых клеток на гормональную терапию и андрогеночувствительности опухолевых клеток.

8. Исследование маркеров метилирования позволило разработать систему для ранней диагностики рака шейки матки; панель из 3 генов (Р16, МЬН1 и N33) имеет чувствительность и специфичность, равную 85%.

9. Разработана методика выявления аллельных делеций в хромосоме 3, являющихся специфическим молекулярным маркером увеальной меланомы; моносомия 3 и потеря гетерозиготности хромосомы 1р36 коррелируют с агрессивным течением и высоким риском метастазирования первичной опухоли.

10. Исследование разных сегментов одной опухоли, помимо внутриопухолевой гетерогенности, позволяет определить очередность появления и распространения молеку-лярно-генетических повреждений в генезе колоректального рака; мутации гена К-11А8 и повреждение регуляторного пути Р16-ЯВ1-циклин Б в генезе опухоли происходят раньше, чем развитие микросателлитной нестабильности и делеций гена РТЕК

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При обследовании больных ишемической болезнью сердца целесообразно определять уровень экспрессии ингибитора активатора плазминогена 1 типа в моноцитах периферической крови, так как данный биомаркер является показателем нестабильности ате-росклеротических бляшек и маркером развития острого коронарного синдрома.

2. Выявленные взаимосвязи между показателем метаболических нарушений - адипонектином и маркером воспаления С-реактивным белком позволяют использовать этот гормон для дополнительной оценки степени тяжести воспалительного процесса у больных со стабильным течением ишемической болезни сердца, особенно при наличии метаболического синдрома.

3. Исследование аллельных делеций генов-супрессоров опухолевого роста, расположенных в коротком плече хромосомы 3, и метилирования гена СИН1 представляет собой метод оценки прогрессии и способности к метастазированию первичной опухоли при светлоклеточном раке почки.

4. При светлоклеточном раке почки разработанная система моле-кулярно-генетических маркеров позволяет оптимизировать таргет-ную терапию. Для пациентов с мутациями и/или метилированием гена УШ, терапия таргетным препаратом Сорафениб, обладающим активностью мультикиназного ингибитора, представляется оптимальной.

5. Разработанная система молекулярных маркеров для определения потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности хромосомных районов 13ql4 и 16д23 в биопсийных образцах больных с заболеваниями предстательной железы позволяет выявлять пациентов с начальными стадиями РПЖ, а также прогнозировать развитие гистологически подтвержденного РПЖ.

6. При раке предстательной железы разработанная методика позволяет определять наличие химерного онкогена ТМРВ.552/Еа14 в ткани опухоли. Поскольку он является маркером неблагоприятного прогноза и андрогеночувствительности опухоли, появляется возможность оптимизировать тактику лечения рака предстательной железы и повысить его эффективность.

7. Использование системы прогностических маркеров метилирования, в частности генов N33 и 65ГР/, как дополнительного метода к гистологическому исследованию может помочь в диагностике и прогнозировании рака предстательной железы.

8. Молекулярные маркеры метилирования при раке шейки матки позволяют выявить начальные стадии злокачественного процесса

еще до того, как обнаруживаются морфологические изменения. Это дает возможность начать терапию заболевания на ранних сроках и избежать высокодозной химиотерапии, тяжелой инвалидизации и летального исхода.

9. Разработанная медицинская технология, основанная на исследовании потери гетерозиготности в хромосоме 3, представляет собой молекулярно-генетическое исследование для диагностики уве-альной меланомы в дополнение к применяемым в настоящее время диагностическим методам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Пальцева Е.М. Уязвимая атеросклеротическая бляшка: факторы, обусловливающие ее нестабильность // Мол. мед. — 2005. -№ 1. - С. 17-22.

2. Paltseva Е.М., Lysenko A.I., Belov Iu.V., Ivanov A.A., Paltsev M.A. Peculiarities of vulnerable plaque formation // Virch. Arch. - 2005. -Vol. 447, # 2. - P. 464.

3. Gusev D., Paltseva E. Serologic infection and inflammatory markers in coronary artery disease // Atherosclerosis supplements. - 2006. - Vol. 7, issue 3. - P. 287.

4. Kekeeva T.V., Popova O.P., Zavalishina L.E., Paltseva E.M., Andreeva Y.Y., Zaletaev D.V., Nemtsova M.V. Molecular genetic alterations in tumor epithelium and tumor-associated stromal cells of prostate cancer // Eur. J. Hum. Genet. - 2007. - Vol. 15, suppl. 1. - P. 168.

5. Mikhaylenko D., Kurynin R., Popov A., Karyakin O., Paltseva E., Enikeev M., Alyaev Y., Nemtsova M., Zaletayev D. Inactivation of the VHL gene in sporadic clear cell renal cancer // Eur. J. Hum. Genet. - 2007. -Vol. 15, suppl. 1. - P. 173.

6. Mikhaylenko D.S., Kurynin R.V., Paltseva E.M., Popov A.M., Zaletayev D.V. Molecular genetic aberrations of the genes VHL, RASSF1, FHIT in patients with renal cancer // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Kiev, Ukraine). Abstract book. - 2007. -P. 177.

7. Kekeeva T.V., Andreeva Y.Y., Frank G. A., Paltseva E.M., Zaletaev D.V., Nemtsova M.V. TMPRSS2/ERG4 fusion gene is a novel hormone refractory marker of prostate cancer // Eur. J. Hum. Genet. - 2008. -Vol. 16. - P. 233.

8. Mikhaylenko D.S., Popov A.M., Paltseva E.M., Kurynin R.V., Zaletayev D.V. Analysis of the molecular-genetic alterations in the genes VHL, RASSF1, and FHIT in clear cell renal carcinomas // Eur. J. Hum. Genet. - 2008. - Vol. 16. - P. 235.

9. Paltseva E., Rodina A., Andreev D., Ponomar E., Gusev D., Severin S., Syrkin A. Hypoadiponectinemia and increased C-reactive protein related to the progression of acute coronary syndrome //J. Clin. Lipidology. - 2008. - Vol. 2, # 5S. - P. S59-S60.

10. Аляев Ю.Г., Курынин P.B., Пальцева E.M., Михайленко Д.С., Залетаев Д.В. Молекулярные маркеры в диагностике и лечении рака почки // Мол. мед. - 2008. - № 4. - С. 24-28.

11. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Стрельников В.В., Бабен-ко О.В., Пальцева Е.М., Землякова В.В., Кузнецова Е.Б., Кекее-

ва Т.В., Михайленко Д.С., Манохина И.К. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в процессах канцерогенеза // Мол. мед. -

2008. - № 4. - С. 46-51.

12. Кекеева Т.В., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А., Пальцева Е.М., Попова О.П., Залетаев Д.В., Немцова М.В. Экспрессия химерного гена TMPRSS2/ERG4 при раке предстательной железы // Мол. мед. - 2008. - № 5. - С. 29-34.

13. Стрельников В.В., Землякова В.В., Белецкий И.П., Грановский И.Э., Пальцева Е.М., Залетаев Д.В. ДНК-микрочипы в диагностике онкологических заболеваний // Мол. мед. - 2008. - № 5. -С. 4-11.

14. Немцова М.В., Пальцева Е.М., Бабаян А.Ю., Михайленко Д.С., Бабенко О.В., Самофалова О.Ю., Царьков П.В., Залетаев Д.В. Молекулярно-генетический анализ клональной внут-риопухолевой гетерогенности в колоректальных карциномах // Мол. биол. - 2008. - Т. 42, № 6. - С. 1040-1047.

15. Михайленко Д.С., Попов А.М., Карякин О.Б., Курынин Р.В., Аляев Ю.Г., Пальцева Е.М., Любченко Л.Н., Немцова М.В., Залетаев Д.В. Полиморфные варианты генов АВСВ1, TGFBR1, IL10 и VDR в норме и при спорадическом раке почки // Мол. мед. - 2009. -№ 2. - С. 39-43.

16. Гусев Д.Е., Пальцева Е.М., Потиевский Б.Г., Родина А.В., Никифорова Е.В., Пономарь Е.Г., Раичевич Н., Сыркин А.Л. Молекулы адгезии sVCAM-1 и sICAM-1 при различных формах ишемической болезни сердца. // Кардиол. и серд.-сосуд. хирургия. - 2009. - № 2. - С. 11-14.

17. Валитова Р.М., Сыркин А.Л., Гусев Д.Е., Пальцева Е.М. Исследование С-реактивного белка и адипонектина у больных с различными формами ишемической болезни сердца // Тезисы итоговой научной студенческой конференции с международным участием «Татьянин день», посвященной 250-летию ММА им. И.М. Сеченова, Москва, 2009. - С. 38-39.

18. Rodina A.V., Paltseva Е.М., Andreev D.A., Ponomar E.G., Gusev D.E., Severin S.E., Syrkin A.L. Distribution of adiponectin in patients with coronary artery disease and its association with systemic inflammation, obesity and diabetes type 2 // 6th Metabolic Syndrome, Type II Diabetes and Atherosclerosis congress. Abstract book. - Berlin,

2009. - P. 74.

19. Пальцева E.M., Родина A.B., Андреев Д.A., Ермаков H.В., Пономарь Е.Г., Гусев Д.Е., Северин С.Е., Сыркин А.Л. Взаимосвязь уровней адипонектина и С-реактивного белка в крови при стабильном течении ишемической болезни сердца и остром коронарном синдроме // Мол. мед. - 2009. - № 4. -С. 33-37.

20. Пальцева Е.М., Константинова C.B., Северин С.Е. Новые биомаркеры: адипонектин в современной диагностике сердечно-сосудистых заболеваний // Кардиология. - 2009. - № 10. -С. 65-74.

21. Пальцева Е.М., Родина A.B., Попова О.Н., Андреев Д.А., Гусев Д.Е., Северин С.Е., Сыркин А.Л. Повышение уровня ингибитора активатора плазминогена 1 типа в моноцитах периферической крови больных ишемической болезнью сердца отражает степень тяжести заболевания // VI международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность». Научная программа, тезисы. - М„ 2009. - С. 175-177.

22. Пальцева Е.М., Родина A.B., Константинова C.B., Ермаков Н.В., Андреев Д.А., Сыркин A.JL, Северин С.Е. Прогностические, диагностические и терапевтические перспективы применения адипонектина в качестве биомаркера при сердечнососудистых заболеваниях // Рос. физиол. журн. - 2009. - Т. 95, № 10. - С. 1024-1040.

23. Пальцева Е.М., Кекеева Т.В., Залетаев Д.В., Немцова М.В. Системы молекулярных маркеров в диагностике тяжелых дис-плазий шейки матки // Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике онкологических заболеваний/ Под ред. М.А. Пальцева, Д.В. Залетаева // М.: Медицина, 2009. -С. 215-224.

24. Пальцева Е.М., Родина A.B., Андреев Д.А., Попова О.Н., Гусев Д.Е., Северин С.Е., Сыркин А.Л. Активатор плазминогена урокиназного типа и его ингибитор 1-го типа в диагностике развития осложнений ишемической болезни сердца // Клин. лаб. диаг. - 2010. - № 6. - С. 51-56.

25. Пальцева Е.М., Родина A.B., Северин С.Е. Возможность применения адипонектина в качестве биомаркера для клинической диагностики // Введение в молекулярную диагностику / Под ред. М.А. Пальцева. - Т. 1. - М.: Медицина, 2010.— С. 300-318.

Тираж 100 экз.

Оглавление диссертации Пальцева, Екатерина Михайловна :: 2011 :: Москва

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биомаркеры в диагностике и прогнозировании различных форм ишемической болезни сердца.

1.1.1. Введение.

1.1.2. Уязвимая атеросклеротическая бляшка: факторы, обуславливающие ее нестабильность.

Характеристика уязвимой атеросклеротической бляшки.

Роль макрофагов и дитокинов в формировании уязвимой атеросклеротической бляшки.'.

Роль матриксных металлопротеиназ в формировании уязвимой атеросклеротической бляшки.

Роль структурных белков в формировании уязвимой атеросклеротической бляшки.

Ангиогенез в уязвимой атеросклеротической бляшке.

1.1.3. Биомаркеры в развитии сердечно-сосудистых заболеваний.

1.1.4. Роль системы активатора плазминогена в развитии атеросклероза коронарных артерий.

1.1.5. Адипонектин в современной диагностике сердечно-сосудистых заболеваний.

Исследования адипонектина как потенциального биомаркера для прогнозирования риска сердечно-сосудистых заболеваний.

1.1.6. С-реактивный белок в современной диагностике сердечнососудистых заболеваний.

Роль С-реактивного белка в развитии атеросклероза.

С-реактивный белок как маркер для оценки риска развития сердечно-сосудистых заболеваний.

Введение диссертации по теме "Клиническая лабораторная диагностика", Пальцева, Екатерина Михайловна, автореферат

1.2.2. Двухударная модель канцерогенеза.65

1.2.3. Структурные (генетические) маркеры канцерогенеза.67

1.2.4.Функциональные маркеры канцерогенеза.71

1.2.5. Внутриопухолевая гетерогенность и теория полей канцеризации Слоттера.75

1.2.6. ДНК-диагностика в онкологии.77

1.2.7. Современные подходы к поиску новых молекулярных маркеров на платформе биологических микрочипов.86

1.2.8. Заключение.88

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.91

2.1. Биомаркеры в диагностике и определении прогноза ишемической болезни сердца.91

2.1.1. Обследование больных.91

2.1.2. Получение моноцитов из венозной крови.93

2.1.3. Исследование экспрессии РА1-1 и иРА в моноцитах человека с помощью иммуноцитохимического метода.93

2.1.4. Исследование экспрессии РА1-1 и иРА в моноцитах человека с помощью метода проточной цитофлюориметрии.95

2.1.5. Исследование экспрессии РА1-1 и иРА в атеросклеротических бляшках коронарных артерий с помощью иммуногистохимического метода и в моноцитах крови с помощью метода проточной цитофлюориметрии.96

2.1.6. Определение биохимических маркеров атерогенеза сыворотке крови методом.ИФА.97

2:116. Статистическая обраббтка,данных,.'.9812.2. Поиск ключевых маркеров и разработка ДНК-диагностических, протоколов для рядаюнкологических заболеваний . V.100'

2.2.1. Клинический материал ,..100.

212.2. Методы выделения ДНК и?РШС. .103

2.2.31 Методы анализа потери-гетерозиготности .104

2.2.4. Методы,анализашутаций .,.;.107

2:2.5; Исследование полиморфных вариантов генов .108;

2;216: Методьъанализа химерных генов .110

2.2.7: Методы,анализа метилирования..11В

2.2.8. Электрофорез ПЦР-продуктов ' , ' в 8%;П0лиакриламидн0м геле.114"

2.2.9: Статистическая ¡обработка данных .-. 114'

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 3. БИОМАРКЕРЫ В ДИАГНОСТИКЕ И ПРОГНОЗИРОВАНИИ

РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ ИШЕМИНЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА.116

3.1. Сравнительная характеристика больных ИБС с ОКС и без ОКС по основным ¡метаболическим параметрам. 116

3.2. Характеристика уровня и-РА п РА1-1 в моноцитах периферической крови методами иммуноцитохимического окрашивания и проточной цитофлюориметрии;. 117

3.3. Исследование экспрессии иРА и РА1-1 в атеросклеротических бляшках коронарных артерий с помощью иммуногистохимического* метода и в моноцитах периферической крови с помощью метода5 проточной цитофлюориметрии.125

3.4. Изучение уровня биохимических маркеров атерогенеза в сыворотке крови больных со стабильным течением ишемической г' болезни сердца и с острым коронарным синдромом.133

ГЛАВА 4. ПОИСК КЛЮЧЕВЫХ МАРКЕРОВ

И РАЗРАБОТКА ДНК-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРОТОКОЛОВ

ДЛЯ РЯДА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.144

4.1. Ключевые маркеры и ДНК-диагностические протоколы для светлоклеточного рака почки.144

4.1.1. Связь аллельных делеций генов VHL, RASSFI, FHIT с прогнозом заболевания.144

4.1.2. Связь аномального метилирования генов-супрессоров

VHL, RASSF1, FHIT и CDH1 с прогнозом заболевания.146*

4.1.3. Определение мутаций и метилирования гена VHL как предпосылка для таргетной терапии светлоклеточного рака почки. 151

4.2. Исследование полиморфных вариантов генов ABCBI, TGFBR1,

ILIO и VDR в норме и при спорадическом раке почки.154

4.2.1. Анализ полиморфизмов генов АВСВ1, TGFBR1, ILIO и VDR в лейкоцитах периферической крови и гистологически неизмененной почечной паренхиме.154

4.2.2. Сравнительный анализ абсолютных частот аллелей, генотипов и частот встречаемости аллелей между исследуемыми группами.155

4.2.3. Определение влияния полиморфных вариантов исследуемых генов на клинические особенности заболевания и характеристики первичной опухоли.157

4.2.4. Выявление сочетаний аллелей исследуемых генов, влияющих на риск развития спорадического рака почки или прогрессию опухоли.159

4.3. Исследование молекулярной патологии при раке предстательной железы и разработка ДНК-диагностических протоколов.160

4.3.1. Исследование потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности хромосомных районов 13ql4 и 16q23 при раке предстательной железы.160

4.3.2. Исследование экспрессии химерного гена TMPRSS2/EGR4 при раке предстательной железы.163

4.3.3. Клинически значимые маркеры метилирования при раке предстательной железы.168

4.4. Разработка системы эпигенетических маркеров для ранней диагностики рака шейки матки.170

4.5. Исследование молекулярной патологии при увеальной меланоме и разработка ДНК-диагностических протоколов.172

4.5.1. Исследование аллельных делеций в хромосоме 3 при увеальной меланоме.173

4.5.2. Исследование потери гетерозиготности для оценки прогрессии первичной опухоли при увеальной меланоме.174

4.6. Молекулярно-генетический анализ клональной внутриопухолевой гетерогенности в колоректальных карциномах.177

4.6.1.Морфологическое исследование.177

4.6.2. Молекулярно-генетическое исследование.177

4.6.3. Возникновение молекулярно-генетических повреждений при колоректальном раке.183

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ.187

ВЫВОДЫ.199

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.201

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.204

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АСБ - атеросклеротическая бляшка

В2М - р2-микроглобулин

ВГН - верхние границы нормальных значений

ВКМ — внеклеточный матрикс

ДГПЖ - доброкачественная гиперплазия предстательной железы

ИБС — ишемическая болезнь сердца

ИЛ - интерлейкин

ИМ - инфаркт миокарда

ИМТ - индекс массы тела

ИФА - метод иммуноферментного анализа

ЛИНИ - липопротеины низкой плотности

ММП — матриксные металлопротеиназы

МЛПК - мононуклеарные лейкоциты периферической крови

МС-ПЦР - метилспецифическая ПЦР

МЧ-ПЦР - метилчувствительная ПЦР

ОКС - острый коронарных синдром

ОТ-ПЦР - метод обратной транскрипции мРНК с последующей ПЦР ПААГ — поли акриламидный гель ПЖ - предстательная железа

ПИН - простатическая интраэпителиальная неоплазия

ПФ - параформальдегид

ПЦР — полимеразная цепная реакция

РП — рак почки

РПЖ - рак предстательной железы Р1ИМ — рак шейки матки СД 2 - сахарный диабет 2 типа СН — сердечная недостаточность СРБ - С-реактивный белок

СРП - светлоклеточный рак почки

ССЗ — сердечно-сосудистые заболевания

ТФ - тканевой фактор

УМ- увеальная меланома

ФНОа - фактор некроза опухолей а

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЦИН - цервикальная интраэпителиальная неоплазия dNTP - дезоксинуклеотидтрифосфат

ICAM-1 - межклеточная адгезивная молекула-1

МСР-1 - моноцитарный хемоаттрактантный белок-1

MIF - фактор ингибирования миграции макрофагов

PAI-1 - ингибитор активатора плазминогена 1 типа

РАРР-А - ассоциированный с беременностью плазменный протеин А ргоМВР - проформа эозинофильного главного основного протеина sCD40L - растворимый CD40 лиганд

SNP (single nucleotide polymorphism) - однонуклеотидные полиморфизмы

SSCP-анализ (single strand conformation polymorphism) - анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК

TIMP-1 - тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ-1 tPA - активатор плазминогена тканевого типа иРА - активатор плазминогена урокиназного типа uPAR - рецептор активатора плазминогена

VCAM-1 - адгезивная молекула клеток сосудов-1

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Усилия ученых направлены на идентификацию и характеристику молекулярных биомаркеров и разработку соответствующих тест-систем и методов оценки. Это одна из актуальных задач, решаемых молекулярной медициной. Определение комплекса биомаркеров позволяет выявить 1 молекулярные механизмы возникновения заболеваний, а также находит применение в клинической практике для диагностики широко распространенных социально значимых мультифакториальных заболеваний -таких, как онкологические и сердечно-сосудистые. [17].

Ранняя диагностика сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и необходимость создания систем быстрого определения риска их развития приобретают в последнее время все большую актуальность. ССЗ, в частности ишемическая болезнь сердца (ИБС) и ее осложнение — инфаркт миокарда (ИМ), продолжают оставаться главной причиной смертности мужчин и женщин в экономически развитых странах [18, 23, 259]. Ежегодно в странах Западной Европы они становятся причиной смерти 4 млн. человек, при этом почти в половине случаев смерть наступает в результате ИБС [23]. Болезнь коронарных сосудов — ведущая причина смертности среди населения США, составляющая более 25 % смертей людей старше 35 лет [140]. В Российской Федерации в 90-е годы в целом заболеваемость ИБС возросла на 24%, стенокардией - на 41%, острым ИМ — почти на 16%. Ежегодно в России от ССЗ умирают более 1 млн. человек. По данным ВОЗ, в структуре смертности от ССЗ на долю ИБС приходится47% [25].

Многочисленные исследования- последних лет ознаменовались определенными достижениями- в изучении, механизмов развития и прогрессирования ИБС. Создание новых групп фармацевтических препаратов и внедрение их в клиническую практику позволили снизить риск развития острой- кардиоваскулярной патологии. Тем не менее ИБС и прогрессирование коронарного атеросклероза остаются главными причинами смертности и инвалидизации населения. Современная стратегия ведения пациентов с ИБС включает в себя раннюю и точную' диагностику заболевания, стратификацию риска и прогноза, что требует поиска новых биологических маркеров и оценки их ассоциации с заболеванием. Наиболее важным представляется поиск ранних чувствительных и специфичных маркеров'развития нестабильности атеросклеротических бляшек, изменение уровня которых можно обнаружить до или в отсутствие повреждения клеток миокарда.

Исследование молекулярно-биологических причин возникновения рака - одна из наиболее актуальных проблем современной молекулярной медицины. Основной причиной злокачественной трансформации клетки являются генетические факторы. Молекулярно-генетические исследования генома злокачественной опухоли представляют собой фундаментальную проблему, разрешения которой требует клиническая практика. В связи с тем, что частота онкопатологии постоянно растет, а возраст манифестации заболевания уменьшается, все большую актуальность приобретает проспективная диагностика онкопатологии в рамках ежегодных диспансеризаций и в группах риска.

Поиск и характеристика; молекулярной патологии в злокачественных опухолях, является самостоятельным й очень важным направлением1 в молекулярной диагностике, так как позволяет расшифровать механизмы канцерогенеза, определить прогноз заболевания, тактику лечения и осуществлять. . мониторинг рецидивирования: Разработка методов обнаружения молекулярных маркеров: дает возможность создавать эффективные диагностические системы [17]. Нами разработаны и описаны в данной работе- системы: молекулярных маркеров для диагностики:, светлоклеточного рака почки- (СРП), рака предстательной железы (РПЖ). цервикальной интраэпителнальной неоплазии (ЦИН) и рака шейки матки: (РШМ), увеалыюй меланомы (УМ).

Злокачественная' трансформация клетки ; является процессом многоступенчатым, включающим накопление структурных и функциональных изменений в. геноме клетки. К структурным, или генетическим, маркерам относят все нарушения, изменяющие структуру ДНК. В первую очередь, это крупные аномалии - такие, как делеции целых хромосомных районов, содержащих гены-супрессоры опухолевого роста, и дупликации или амплификации . районов, содержащих клеточные протоонкогены, факторы роста и др.; транслокации и инверсии хромосомного материала, в . результате которых могут образовываться химерные гены с онкогенными функциями. Другим, результатом-структурных перестроек может оказаться ситуация, когда клеточный протоонкоген получает дополнительные активирующие регуляторные элементы и начинает гиперэкспрессироваться. И, наконец, к структурным аномалиям относят различные типы мутаций, которые могут активировать протоонкогены или инактивировать гены-супрессоры [4].

К функциональным маркерам относят все нарушения, которые не связаны с изменениями структуры ДНК, но приводят к изменениям в уровне экспрессии генов, участвующих в процессах канцерогенеза. Профиль экспрессии генов в опухоли кардинально изменен по сравнению с таковым в неизмененной ткани, поэтому определенные сочетания генов, теряющих свою экспрессию, или, наоборот, гиперэкспрессирующихся в определенном типе опухоли, могут являться диагностическими и прогностическими маркерами. Изменения в экспрессии гена без нарушения его нуклеотидной структуры относятся к эпигенетической регуляции. К таким функциональным нарушениям в первую очередь относят метилирование регуляторных районов генов-супрессоров опухолевого роста, что приводит к их полной инактивации [4].

Цель исследования

Поиск и характеристика ключевых молекулярных маркеров сердечнососудистых и некоторых онкологических заболеваний с целью разработки лабораторно-диагностических систем для ранней диагностики, прогноза развития и оценки эффективности терапии этих заболеваний.

Задачи исследования

1. Провести сравнительный анализ уровня экспрессии активатора илазминогена урокиназного типа (иРА) и ингибитора активатора плазминогена 1 типа (PAI-1) в моноцитах периферической крови больных со стабильным течением ИБС и больных с острым коронарным синдромом (ОКС) для*выявления связи уровня экспрессии этих белков со степенью тяжести заболевания.

2. Определить уровни;С-реактивного белка (СРБ) и адипонектина в крови больных со стабильным течением ИБС и с ОКС для оценки взаимосвязи этих показателей с риском возникновения ОКС.

3. Исследовать аллельные делеции генов-супрессоров VHL, RASSF1 и FHIT и метилирование гена CDH1 при СРП с целью поиска прогностических критериев этого заболевания; исследовать мутации и метилирование гена VHL для определения эффективности назначения таргетной терапии СРП.

4. Изучить полиморфные варианты генов АВСВ1, TGFBR1, ILIO и VDR для определения предрасположенности к развитию спорадического рака почки.

5. Исследовать потери гетерозиготности (ПГ) и микросателлитную нестабильность (МН) хромосомных районов 13ql4 и 16q23 при РПЖ с целью поиска диагностических и прогностических критериев данного заболевания.

6. Оценить частоту образования химерных транскриптов TMPRSS2/ERG4,

ТМРЯ882/ЕТУ1 и ТМРЯ882/ЕТУ4 при РПЖ и определить, их диагностический потенциал.

9. Изучить, морфологическую и молекулярно-генетическую внутриопухолевую гетерогенность колоректальных аденокарцином.

Научная новизна

Важное значение имеют впервые полученные методом проточной цитофлюориметрии'данные о характере изменения уровня экспрессии РА1-1 в моноцитах периферической' крови больных ИБС, так как одним из ее патогенетических факторов является снижение фибринолитической активности крови:

Впервые разработан метод определения молекулярно-генетических маркеров для оценки прогрессии первичной опухоли при СРП, а*также метод выявления среди пациентов с метастатическим СРП лиц, в • отношении которых наиболее эффективно назначение таргетных препаратов, действие которых связано с УНЬ-зависимыми патогенетическими механизмами.

Нами предложена молекулярно-генетическая методика выявления среди пациентов с различными заболеваниями предстательной железы лиц с РПЖ, а также прогноза гистологически подтвержденного РПЖ. Методика основана на определении ПГ и МН хромосомных районов 13ц 14 и \6q23 в ткани ПЖ. Впервые продемонстрировано, что при РПЖ наличие химерного онкогена ТМРЯ882/ЕЯ С 4 является частым, опухолеспецифическим событием, коррелирует с более агрессивными стадиями заболевания и может служить молекулярным маркером этого рака, а также маркером андрогеночувствительности опухолевых клеток и оценки ответа опухоли на гормональную терапию. Нами предложен способ определения экспрессии химерного онкогена ТМРЯ882/ЕЯС4 методом обратной транскрипции мРНК с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) с использованием специфических праймеров.

Впервые предложены методики определения молекулярных маркеров метилирования при ряде онкологических заболеваний. Нами разработана система ДНК-маркеров (маркеры метилирования генов р16, МЬН1 и N33) для ранней диагностики РШМ, характеризующаяся высокой чувствительностью и специфичностью. Полученные результаты позволяют считать, что определение гиперметилирования генов-супрессоров вместе с цитологическим исследованием и тестированием вируса папилломы человека может служить основой для мониторинга женщин с высоким риском развития РШМ. Разработан метод определения метилирования генов N33 и (/¿ТР/ при аденокарциномах предстательной железы (АКПЖ), что может помочь в диагностике данного заболевания.

Впервые продемонстрирована молекулярно-генетическая внутриопухолевая гетерогенность колоректальных аденокарцином.

Работа по определению молекулярно-генетических маркеров перечисленных онкологических заболеваний удостоена премии Правительства РФ 2009 г. в области науки и техники для молодых ученых («Разработка и внедрение методов ДНК-диагностики для раннего определения и прогноза некоторых онкологических заболеваний»).

Практическая значимость

Настоящая работа представляет практический интерес для диагностики и оценки прогноза таких социально значимых заболеваний, как ИБС и ряд злокачественных новообразований. На основании полученных данных выделен маркер развития ОКС, который' можно определить в моноцитах периферической крови, а также биомаркеры, которые можно использовать для дополнительной оценки степени тяжести воспалительного процесса у больных со стабильным течением- ИБС. Это позволяет предложить более детализированную программу диагностических мероприятий, и своевременно скорректировать проводимую терапию.

Исследование аллельных делеций генов-су прессоров- опухолевого роста, расположенных в коротком плече хромосомы 3, и метилирование гена С/Ж/ представляет собой метод оценки прогрессии и способности к метастазированию первичной опухоли при СРП. Полученные результаты легли в основу новой медицинской технологии. (Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/150).

Разработанная нами медицинская* ДНК-технология позволяет выделять УНЬ-зависимые и УНЬ-независимые группы пациентов с СРП и, соответственно, оптимизировать тактику и повысить эффективность лечения таргетными препаратами, действие которых связано с УНЬ-зависимыми патогенетическими механизмами. (Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/152).

Для выявления пациентов с начальными стадиями РПЖ, а также для прогноза гистологически подтвержденного РПЖ в целях подбора оптимальной терапии нами разработана медицинская ДНК-технология, направленная на определение делеций хромосомных районов 1^14 и 16д23 в биопсийных образцах больных. (Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/151).

При РПЖ разработанная методика позволяет определять наличие химерного онкогена в ткани опухоли. Поскольку он служит маркером неблагоприятного прогноза и андрогеночувствительности опухоли, i появляется возможность оптимизировать тактику и повысить эффективность лечения РПЖ. (Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/153).

Молекулярные маркеры метилирования (при РШМ, РПЖ) позволяют выявить начальные стадии злокачественного процесса еще до того, как обнаруживаются морфологические изменения. Это дает возможность начать терапию заболевания на ранних сроках и избежать высокодозной химиотерапии, тяжелой инвалидизации и летального исхода. (Разрешение на применение новой медгщинской технологии ФС №2008/154 (ранняя диагностика РШМ)).

При УМ разработанный метод исследования аллельных делеций в хромосоме 3 позволяет выявлять специфические молекулярные маркеры для верификации диагноза «увеальная меланома» в дополнение к применяемым в настоящее время диагностическим методам. (Разрешение на применение новой медгщинской технологии ФС №2009/319).

Описанное в данной работе исследование потери гетерозиготности в хромосомах 3 и 1р36 представляет собой метод оценки прогрессии первичной опухоли при УМ. (Разрешение ría применение новой медицинской технологии ФС №2009/318).

Внедрение результатов исследования

Полученные практические и теоретические выводы применяются в учебном процессе на кафедрах биохимии Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова* и МГУ им. М:В. Ломоносова, кафедре клинической лабораторной диагностики Российской медицинской академии последипломного образования.

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 25 печатных работ: 12 статей- и 11 тезисов, главы в книгах «Системы генетических и эпигенетических маркеров в диагностике онкологических заболеваний» и «Введение в молекулярную диагностику». Получено 7 разрешений на применение новых медицинских технологий (ФС №2008/150, ФС №2008/152; ФС №2008/151, ФС №2008/153, ФС №2008/154, ФС №2009/319, ФС №2009/318). Работа «Разработка и внедрение методов ДНК-диагностики для раннего определения и прогноза некоторых онкологических заболеваний» отмечена премией Правительства РФ 2009 года в области науки и техники для молодых ученых (распоряжение Правительства Российской Федерации от 1 марта 2010 года № 248-р, г. Москва).

Апробация работы

Апробация диссертации проведена 18 ноября 2010 г. на совместном заседании кафедр клинической лабораторной диагностики и биохимии. ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава, кафедры биохимии, лаборатории молекулярной генетики человека НИИ молекулярной медицины ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития РФ, лаборатории эпигенетики ГУ Медико-генетический научный центр-РАМН (протокол № 19).

Материалы диссертации доложены на 20-м Европейском конгрессе патологии (Париж, Франция, 2005 г.), Российском медицинском форуме (Москва, 2007), Конференции для молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007), на съездах Европейского общества генетики человека Е8НО (Ницца, Франция, 2007 г. и Барселона, Испания, 2008 г.), 7-м Международном симпозиуме по множественным факторам риска сердечно-сосудистых заболеваний (Венеция, Италия, 2008 г.), 6-м Конгрессе по метаболическому синдрому, диабету 11 типа и атеросклерозу (Берлин, Германия, 2009 г.), 6-й международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009).

Структура и объем диссертации

Заключение диссертационного исследования на тему "КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ РЯДА СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ"

ВЫВОДЫ

1. Биологические и молекулярно-генетические маркеры сердечнососудистых и онкологических заболеваний или их сочетание позволяют определить начальные стадии, прогноз- развития и подобрать оптимальную тактику лечения этих заболеваний.

2. Высокий уровень экспрессии ингибитора активатора плазминогена 1 типа в. моноцитах периферической крови больных ишемической болезнью сердца, независимо» от уровня активатора плазминогена урокиназного типа, является показателем нестабильности атеросклеротических бляшек и маркером развития острого коронарного синдрома.

3. Установлено, что для больных как со стабильным'течением-ишемической < болезни сердца, так и с острым коронарным* синдромом* характерны увеличение концентрации С-реактивного^ белка и снижение концентрации адипонектина. Выявленные взаимосвязи* между показателем метаболических нарушений - адипонектином и маркером воспаления С-реактивным белком позволяют использовать этот гормон для дополнительной оценки степени тяжести воспалительного процесса у больных со стабильным течением ишемической болезни сердца, особенно при наличии метаболического синдрома.

4. Показано, что потеря гетерозиготности более чем одного из генов-супрессоров (УНЬ, 11А88Г], РН1Т) ассоциирована1 с наличием^ метастазов (р = 0,036), а метилирование СПН1 ассоциировано с прорастанием опухолью капсулы почки (р = 0,024) и наличием метастазов на момент постановки диагноза (р = 0,001) у больных светлоклеточным раком почки. В случае обнаружения мутаций и метилирования гена УНЬ целесообразно назначение таргетных препаратов (Сорафениб).

5. При спорадическом раке почки показано достоверное снижение частоты, протективного аллеля С и генотипа С/С полиморфизма Тад1 гена УИЯ (р<0,025), а также снижение частоты аллеля А полиморфизма ш!7024А гена ЮРВШ (р<0,012) у больных с метастазами на момент постановки диагноза.

6. Установлено, что потеря гетерозиготности локуса 1^14 ассоциирована с более ранними стадиями рака предстательной железы, а аллельные потери локуса \6q23 достоверно коррелируют со степенью дифференцировки опухоли, стадией злокачественного процесса* и наличием метастазов" в регионарных лимфатических узлах. Для аномального метилирования! генов N33 и СЯТР! показано статистически достоверное различие между группами пациентов с простатической интраэпителиальной неоплазией и аденокарциномами предстательной железы.

7. Установлено, что образование химерного гена ТМРК332/ЕЛС4 является частым, опухолеспецифическим событием рака предстательной* железы, а его экспрессия коррелирует с более агрессивными стадиями" заболевания и может служить молекулярным маркером рака предстательной железы, оценки ответа опухолевых клеток на гормональную терапию ^ и андрогеночувствительности опухолевых клеток.

8. Исследование маркеров метилирования позволило разработать систему для ранней диагностики-рака шейки матки; панель из 3 генов (Р16, МЬН1 и N33) имеет чувствительность и специфичность, равную 85%.

9. Разработана методика выявления аллельных делеций в хромосоме 3, являющихся специфическим молекулярным, маркером увеальной меланомы; моносомия 3 и потеря гетерозиготности хромосомы 1рЗб коррелируют с агрессивным течением и высоким риском метастазирования первичной опухоли.

10. Исследование разных сегментов одной опухоли, помимо внутриопухолевой гетерогенности, позволяет определить очередность появления и распространения молекулярно-генетических повреждений в генезе колоректального рака; мутации гена К-ЯАБ и повреждение регуляторного пути Р1б-КВ1-циклин О в генезе опухоли происходят раньше, чем развитие микросателлитной нестабильности и делеций гена PTEN.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При обследовании больных ишемической болезнью сердца целесообразно определять - уровень , экспрессии? ингибитора- активатора плзаминогена в моноцитах периферической крови; так как данный; биомаркер является? показателем» нестабильности; атеросклеротических бляшек и маркером развития острого коронарного синдрома.

2; Выявленные: взаимосвязи? между показателем* метаболических нарушений? - адипонектином и маркером воспаления С-реактивным белком, позволяют использовать этот гормон для4 дополнительной оценки степени тяжести воспалительного процесса; у больных» со стабильным • течением ишемической болезни сердца, особенно при наличии метаболического синдрома:.

3. Исследование аллельных делеций генов-супрессоров опухолевого роста, расположенных в коротком плече хромосомы 3, и метилирования гена CD HI представляет собой метод оценки прогрессии и способности к метастазированию первичной опухолишри светлоклеточном раке почки. Разработки легли в основу новой медицинской технологии.: Разрешение, на, применение новой-медицинской технологитФС №2008/150:

4. При светлоклеточном;раке почки разработанная система*: молекулярно-генетических маркеров: позволяет оптимизировать таргетную. терапию: Для;: пациентов с мутациями и/или метилированием гена VHL терапия таргетным препаратом Сорафениб, обладающим: активностью мультикиназного ингибитора, представляется оптимальной. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/152.

5. Разработанная система молекулярных маркеров для определения потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности хромосомных районов 13ql4 и 16q23 в биопсийных образцах больных с заболеваниями предстательной железы позволяет выявлять пациентов с начальнымистадиями РПЖ, а также прогнозировать развитие гистологически подтвержденного РПЖ. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/151.

6. При раке предстательной железы разработанная методика позволяет определять наличие химерного онкогена ТМРЯ882/ЕОК4 в ткани опухоли. Поскольку он является маркером неблагоприятного прогноза и андрогеночувствительности опухоли, появляется возможность оптимизировать тактику лечения рака предстательной железы и повысить его эффективность. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/153.

7. Использование системы прогностических маркеров метилирования, в частности генов N33 и 08ТР1, как дополнительного метода к гистологическому исследованию может помочь в диагностике и прогнозировании рака предстательной железы.

8. Молекулярные маркеры метилирования при раке шейки матки позволяют выявить начальные стадии злокачественного процесса еще до того, как обнаруживаются морфологические изменения. Это дает возможность начать терапию заболевания на ранних сроках и избежать высокодозной химиотерапии, тяжелой инвалидизации и летального исхода. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2008/154.

9. Разработанная медицинская технология, основанная на исследовании потери гетерозиготности в хромосоме 3, представляет собой молекулярно-генетическое исследование для диагностики увеальной меланомы в дополнение к применяемым в настоящее время диагностическим методам. Разрешение на применение новой медицинской технологии ФС №2009/319.

10.Исследование структурных и численных нарушений хромосомы 3 и 1р с помощью микросателлитного анализа может быть использовано вместе с другими необходимыми тестами при верификации диагноза увеальная меланома» и для оценки прогрессии опухоли. Разработки легли в основу новой медицинской технологии. Разрешение на. применение новой медицинской технологии ФС №2009/318.

204

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Пальцева, Екатерина Михайловна

1. Алексеев Б .Я., Шегай П.В. Таргетная терапия распространенного рака, почки. // Онкоурология. — 2007. Vol. 4. — Р. 6-11.

2. Бабенко О.В., Землякова В.В., Саакян C.B. и др. Функциональная патология генов RB1 и pió в ретинобластомах. // Мол. Биол> — 2002. -Т. 36(5).-С. 777-783.

3. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Бабенко О.В. Система генетических и эпигенетических маркеров в ДНК-диагностике злокачественных новообразований. В: Введение в молекулярную медицину. Под ред. М.А. Пальцева. // М.: «Медицина», 2004. С. 35-94.

4. Землякова В.В., Жевлова А.И., Зборовская И.Б. и др. Аномальное метилирование некоторых генов-супрессоров при немелкоклеточном раке легкого. // Мол. Биол. 2003. - Т. 37(6). - С. 983-988.

5. Землякова В.В., Жевлова А.И., Стрельников В.В. и др. Аномальное метилирование некоторых, генов-супрессоров при спорадическом раке молочной железы. // Мол. Биол. 2003. - Т. 37(4). - С. 696-703.

6. Кекеева Т.В., Жевлова А.И., Подоистов Ю.И. и др. Аномальное метилирование генов-супрессоров опухолевого роста и микросателлитная нестабильность в предраковых состояниях шейки матки. // Мол. Биол. 2006. - Т. 40(2). - С. 224-230.

7. Кекеева Т., Попова О., Шегай П., и др. Анализ потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности в стромальных и эпителиальных клетках рака предстательной железы. // Мол. Биол. 2007. — # 41. — С. 79-85.

8. Ю.Киселев Л. Л., Сенченко В.Н., Опарина Н.Ю. и др. Гены-супрессоры опухолевого роста, локализованные на коротком плече хромосомы 3 человека. // Молекулярная Медицина. 2005. - № 3. - С. 17-28.

9. П.Личиницер М.Р., Ганьшина И.П., Филоненко Д.А. Сутент® при светлоклеточном раке почки и гастроинтестинальных стромальных опухолях // Фарматека. 2007. - №1. - С. 22-25.

10. Логинов В.И., Базов И.В., Ходырев Д.С. и др. Районы потенциальных генов-супрессоров эпителиальных опухолей почки, молочной железы и яичников на хромосоме 3 человека // Генетика. 2008. - Т. 44. - № 2. -С. 250-256.

11. Лысова Н.Л., Трусов O.A., Щеголев, А.И., Мишнев О. Д. Патологическая анатомия нестабильной атеросклеротической бляшки при ишемической болезни сердца. // Арх. Патол. 2007. - № 4. — С. 2225.

12. Михайленко Д.С., Курынин Р.В., Попов A.M. и др. Инактивация гена VHL при спорадическом светлоклеточном раке почки. // Мол. Биол. -2008. Т. 42. - № 1. - С. 71-77.

13. Немцова М.В., Землякова В.В., Кузнецова Е.В. и др. Аллельные потери основных генов регуляторов клеточного цикла RB1, pió и р53 при спорадическом раке молочной железы. // Арх. Патол. — 2007. - Т. 69. — С. 3-6.

14. Немцова М.В., Михайленко Д.С., Кекеева Т.В и др. Молекулярно-генетические маркеры в онкоурологии. // Мол. Мед. — 2007. — № 3. — С. 43-54.

15. Пальцев М.А. Актовая речь. Молекулярная медицина: достижения и перспективы. М.: «Медицина», 2009.

16. Рагино Ю.И., Чернявский A.M., Волков A.M., Воевода М.И. Факторы и механизмы нестабильности атеросклеротической бляшки. — Новосибирск: Наука, 2008. С. 6.

17. Рагино Ю.И., Чернявский A.M., Волков* A.M., Воевода М.И. Факторы и-механизмы нестабильности атеросклеротической бляшки. -Новосибирск: Наука, 2008. — С. 7-12.

18. Рагино Ю.И., Чернявский A.M., Полонская Я.В. и др. Активность воспалительно-деструктивных^ изменений в процессе формирования нестабильной атеросклеротической бляшки. // Кардиология. 2007. -Т. 47(9).-С. 62-66.

19. Ройтберг Г.Е., Струтынский A.B. Внутренние болезни. Сердечнососудистая. система. М: Бином-пресс, 2007. (on-line версия: http://medbook.medicina.ru/index.php?id level=36)

20. Шевченко О.П., Мишнев О.Д. Ишемическая болезнь сердца. М.: Реафарм, 2005. С. 12-16.

21. Шлычков Т.П., Жданов В.С., Карпов Ю.А., Чумаченко П.В. Основные типы нестабильных атеросклеротических бляшек и их распространенность в коронарных артериях при остром инфаркте миокарда. // Арх. Патол. 2005. - № 3. - С. 24-28.

22. Щепин О.П., Коротких Р.В., Щепин В.О., Медик В.А. Здоровье населения основа развития здравоохранения. М.: Национальный НИИ общественного здоровья РАМН, 2009. — С. 83-136.

23. Эванс Т., Лерберге В.В. (ред.). Доклад ВОЗ о состоянии здравоохранения в мире. Первичная медико-санитарная помощь — сегодня актуальнее, чем когда-либо. — 2008. С.9.http://www.who.int/whr/2008/whr08 ru.pdf

24. Adamczak M., Wiecek A., Funahashi T. et al. Decreased plasma adiponectin concentration in patients with'essential hypertension. // Am. J. Hypertens. — 2003. Vol. 16(1). - P. 72-75.

25. Afar D.E., Vivanco I., Hubert R.S. et al.Catalytic cleavage of the androgen-regulated TMPRSS2 protease results »in its secretionby prostate and prostate cancer epithelia. // Cancer Res. 2001. - Vol. 61(4). - P. 1686-1692.

26. Ahmed I.A., Kelly S.B., Anderson J.J. et all The predictive value of p53 and p33(INGlb) in patients with Dukes'C colorectal cancer. // Colorectal Dis. — 2008.-Vol. 10(4).-P. 344-351.

27. Albert D.M., Polans A. Ocular Oncology, 1st edition. 2003., ISBN-10: 0824740165.

28. Alessi M.C., Juhan-Vague I. Contribution of PAI-1 in cardiovascular pathology. // Arch. Mal. Coeur Vaiss. 2004. Vol. 97 (6). - P. 673-678.

29. André P., Nannizi-Alaimo L., Prazad S.K. Platelet-derived CD40L. The switch hitting player of cardiovascular disease. // Circulation. — 2002. Vol. 106.-P. 896-899.

30. Anglim P.P., Galler G., Koss M.N. et al. Identification of a panel of sensitive and specific DNA methylation markers for squamous cell lung cancer. // Mol. Cancer. 2008. - Vol. 7. - P. 62.

31. Anwaruddin S., Askari A.T., Topol E.J. Redefining risk in acute coronary syndromes using molecular medicine. // J. Am. Coll. Cardiol. — 2007. Vol. 49.-P. 279-289.

32. Apple F.S., Wu A.H.B., Mair J. et al. Future biomarkers for detection ofischemia and risk stratification in acute coronary syndrome. // Clin. Chem. — 2005.-Vol. 51(5).-P. 810-824.

33. Arita Y., Kihara S., Ouchi N. et al. Paradoxical decrease of an adipose-specific protein, adiponectin, in obesity. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - Vol. 257(1). - P. 79-83.

34. Armani A., Becker R.C. The biology, utilization, and attenuation of C-reactive protein in cardiovascular disease: part II. // Am. Heart J. — 2005. — Vol. 149.-P. 977-983.

35. Armstrong E.J., Morrow D.A., Sabatine M.S. Inflammatory biomarkers in acute coronary syndromes. Part I: introduction and cytokines. // Circulation. 2006. - Vol. 113. - e72-e75.

36. Armstrong E.J., Morrow D.A., Sabatine M.S. Inflammatory biomarkers in acute coronary syndromes. Part IV: matrix metalloproteinases and biomarkers of platelet activation. // Circulation. — 2006. Vol. 113. — e382-e385.

37. Badreddine R., Wang K.K. Biomarkers in gastrointestinal cancers. // Am. J. Gastroenterol.- 2008.- Vol. 103(8).-P. 2106-2110.

38. Ballantyne C.M., Nambi V. Markers of inflammation and their clinical significance. // Atheroscl1. Suppl. 2005. - # 6. - P. 21-29.

39. Bastian P.J., Palapattu G.S., Lin X. et al. Preoperative serum DNA GSTP1 CpG island hypermethylation and the risk of early prostate-specific antigen recurrence following radical prostatectomy. // Clin. Cancer Res. — 2005. — Vol. 11(11).-P. 4037-4043.

40. Bauche I.B., Ait El Mkadem S., Rezsohazy R. et al. Adiponectin downregulates its own production and the expression of its AdipoR2 receptor in transgenic mice. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. — Vol. 345(4). - P. 1414-1424.

41. Baylin S.B., Lones P.A. Epigenetic determinants of cancer. In: Epigenetics. Ed. by Allis D., Jenuwein T., Reinberg D. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New-York. - 2007. - P. 457-476.

42. Belgore F., Blann A., Neil D. et al. Localisation of members of the vascular endothelial growth factor family and'their receptors in human atherosclerotic arteries. // J. Clin. Pathol. 2004. - Vol. 57. - P. 266-272.

43. Belinsky S.A., Nikula K.J., Palmisano W.A. et al: Aberrant methylation of pl6(INK4a) is an early event in lung cancer and a potential biomarker for early diagnosis. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1998. Vol. 95(20): - P. 11891-11896.

44. Beroukhim R., BrunetJ.-P., Di Napoli A. et al. Patterns of gene expression* and copy-number alterations in VHL disease-associated and sporadic clear cell carcinoma of the kidney. // Cancer Res. — 2009. — Vol. 69(11). — P. 4674-4681.

45. Biasucci L., Vitelli A., Liuzzo G. et al. Elevated levels of inteleukin-6 in unstable angina. // Circulation. 1996. - Vol. 94. - P. 874-877.

46. Blake G.J., Ridker P.M. C-reactive protein and other inflammatory risk markers in acute coronary syndromes. // J. Am. Coll. Cardiol. 2003. - Vol. 41. - 37S-42S.

47. Blaschke F., Bruemmer D., Yin F. et al. C-reactive protein induces apoptosis in human coronary vascular smooth muscle cells. // Circulation. — 2004. — Vol. 110.-P. 579-587.

48. Boland C.R. The molecular biology of gastrointestinal cancer: implications for diagnosis and therapy. // Gastrointest. Endosc. Clin. N. Am. — 2008. — Vol. 18(3).-P. 401-vii.

49. Bonanno E., Mauriello A., Partenzi A. et al. Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study. // Cytometry. 2000. - Vol. 39, Issue 2. - P. 158-165.

50. Boyle JUL Association of coronary plaque rupture and atherosclerotic inflammation. I I Ji.Pathoi: -1997: Vol: T8I, Issue 1L- E: 93-99;

51. Brekenhielm E., Veitonm,Li,ki N-, Gao. R; et al. Adiponectin-induced antiangiogenesis: and antitumor activity/ involve5 caspase-mediatcd endothelial!cells apoptosis.// Proc. Natl: Acad. Sci. U S>Al--2004i.-Voll 101(8).-P. 2476-2481.

52. Brown N.J:, Abbas F., Byrne D. et al. Comparative effects of estrogen and angiotensin-converting enzyme: inhibition: of plasminogen- activator inhibitor-1 in healthy, postmenopausal women: // Circulation. — 2002. — Vol. 105(3).-P. 304-309.

53. Burke A.P., Tracy R.P;, Kolodgi F. et al. Elevated C-reactive protein values and atherosclerosis: in sudden coronaiy death. Association with different pathologies. // Circulation. 2002. - Vol. 105.- P. 2019-2023.

54. BusyginaV., Bale A.E. Multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN!) as a cancer predisposition syndrome: clues into the mechanisms of MEN1-related carcinogenesis. // Yale J. Biol. Med: 2006. - Vol. 79(3-4). - P. 105-114.

55. Caff C.A., Kothapalli D., Azonobi I. et al. The adhesion receptor CD44 promotes atherosclerosis by mediating inflammatory cell recruitment and vascular cell activation. // J. Clin;.Invest: 2001, - Vol. 108, N 7. - P. 10311040:

56. Carbone G.L., Mauriello A., Christiansen M. et al. Unstable carotid plaque:biochemical and cellular marker of vulnerability. // Ital. Heart J. 2003. — Vol. 4 (5 Suppl.). - P. 398-406.

57. Chen T., Jackson C., Costello B. et al: An intronic variant of the TGFBR1 gene is associated with carcinomas of the kidney and bladder. // Int. J. Cancer. 2004. - Vol. 112(3). - P. 420-425.

58. Cheung H.-H., Lee T.-L., Rennert O.M., Chan W.-Y. DNA methylation of cancer genome. // Birth. Defects Res. C. Embryo Today. 2009. - Vol. 87(4).-P. 335-350.

59. Chow W.S., Cheung B.M., Tso A.W. et al. Hypoadiponectinemia as a predictor for the development of hypertension: a 5-year prospective study. // Hypertension. 2007. - Vol. 49(6).-P. 1455-1461.

60. Conover C.A., Harrington S.C., Bale L.K., Oxvig C. Surface association of pregnancy-associated plasma protein-A accounts for its colocalization with activated macrophages. // Am. J. Physiol. Heart Circr Physiol. 2007. - Vol. 292.-H994-1000.

61. Costa V.L., Henrique R., Ribeiro F.R. Quantitative promoter methylation analysis of multiple cancer-related genes in renal cell tumors. // BMC Cancer. -2007. — Vol. 7.-P. 133-139.

62. Cozen A.E., Moriwaki H., Kremen M. et al. Macrophage-targeted overexpression of urokinase causes accelerated atherosclerosis, coronary occlusions, and premature death. // Circulation. 2004. Vol. 109 (17). - P. 2129-2135.

63. Cross N.A., Ganesh A., Parpia M., et al. Multiple locations on chromosome 3 are the targets of specific deletions in uveal melanoma. // Eye. 2006. -Vol. 20, №4.-P. 476-481.

64. Cui Y.H., Liu T.S., Zhuang R.Y. et al. Polymorphism of thymidylate synthase gene and chemosensitivity of 5-fluorouracil regimen in metastatic gastrointestinal cancer. // J. Dig^ Dis. 2009. - Vol. 10(2). - P. 118-123.

65. Damato B., Duke C., Coupland S.E. et al. Cytogenetics of uveal melanoma: a 7-year clinical experience. // Ophthalmology. 2007. - Vol. 114, № 10. -P. 1925-1931.

66. Di Stefano R., Felice F., Balbarini A. Angiogenesis as risk factor for plaque vulnerability. // Cult. Pharm. Des. 2009. - Vol. 15(10). - P. 1034-1037.

67. Diaw L., Woodson K., Gillespie-J.W. Prostate cancer epigenetics: a review on gene regulation. // Gene Regul. Syst. Bio. 2007. - Vol. 1. - P. 313-325.

68. DiMascio L., Voermans C., Uqoezwa M. et al. Identification of adiponectin as a novel hemopoietic stem cell growth factor. // J. Immunol. 2007. — Vol. 178(6). — P. 3511-3520.

69. Ding G., Qin Q., He N. et al. Adiponectin and its receptors are expressed in adult ventricular cardiomyocytes and upregulated by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. // J. Mol. Cell. Cardiol. -2007. Vol. 43(1). - P. 73-84.

70. Esteller M:,,G6m PiGi, Baylin S.B:, Hërman J;G; A gene hypermethylation profile of human cancer. // Cancer res. 2001. - Vol. 61(8). - P. 3225-3229.

71. Falkenberg M., Tjarnstrom Ji, OrtenwalWP; et al. Localization of fibrinolytic activators andanhibitors: in: nonnahandt atherosclerotic vessels; // Thromb. ITacmost. 1996. - Vol. 75 (6). - P. 933-938. .

72. Fantuzzi G., Mazzone T. Adipose : tissue and atherosclerosis: exploring the connection. // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol; 2007. - Vol: 27(5).- - P. 996-1003.

73. Fasshauer M.,. Klein J., Neumann S; et al: Adiponectin gene: expressions is inhibited by- beta-adrenergic stimulation; via protein kinase A in 3T3-L1 adipocytes: // FEBSEetti 200- Vol: 507(2): - P:, 142-146.

74. Fasshauer M., Klein J., Neumann S. et: al. Hormonal regulation of adiponectin gene, expression in; 3T3-El: adipocytes. // Biochem: Biophys. Res. Commun. — 2002. — Vol: 290(3). — PM084-1089.

75. Fasshauer M., Kralisch S., Klier Mi et al. Adiponectin gene expression and secretion is inhibited by interleukin-6;in:3T3-Ll adipocytes:.// Biochem. Biophys. Res. Commun. -2003. -Vol. 301(4). P. 1045-1050.

76. Feng Q., Balasubramanian A., Hawes S. et al. Detection^ of hypermethylated genes: in;women with and without cervical neoplasia. // J. Natl. Cancer Inst. 2005. - Vol. 97. - P. 273-282.

77. Fleiner M., Kummer M., Mirlacher Mi et al; Arterial neovascularization and inflammation in vulnerable patients: early and late signs of symptomatic atherosclerosis. // Circulation. 2004. - Vol. 110. - P. 2843-2850:

78. Folsom A.R. Hemostatic risk factors for atherothrombotic disease:; an epidemiologic view. // Thromb. Haemost. 2001. - Vol. 86(1). — Pi 366373.

79. Fromm M.F. Genetically determined differences in P-glycoprotein function: implications for disease risk. // Toxicology. 2002. - Vol. 181-182: - P. 299-303.

80. Frystyk J., Berne C., Berglund L. et al. Serum adiponectin is a predictor of coronary heart disease: a population-based 10-year follow-up study in elderly men. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2007. - Vol1. 92(2). - P. 571576.

81. Fu Y., Luo N., Klein R.L., Garvey W.T. Adiponectin promotes adipocyte differentiation, insulin« sensitivity, and lipid* accumulation. // J. Lipid. Res. -2005.-Vol. 46(7).-P. 1369-1379.

82. Funayama H., Ishikawa San-e, Kubo N. et al. Increases in interleukin-6 and matrix metalloproteinase-9 in the infarct-related coronary artery of acute myocardial infarction. // Circ. J. 2004. - Vol. 68. - P. 451-454.

83. Furge K.A., Lucas K.A., Takahashi M. et al. Robust classification of renal cell carcinoma based on gene expression data and! predicted cytogenetic profiles // Cancer Research. 2004. - Vol. 64. - P. 4117-4121.

84. Furge K.A., Tan M.H., Dykema K. et al. Identification of deregulated oncogenic pathways in renal» cell carcinoma: an integrated oncogenomic approach based on gene expression profiling. // Oncogene. — 2007. — Vol. 26(9).-P. 1346-1350.

85. Futterman L.G., Lemberg L. Novel markers in the acute coronary syndrome: BNP*, IL-6, PAPP-A. // Am. J. Crit. Care. 2002. - Vol. 11. - P. 168-172.

86. Garcia J.M., Rodriguez R., Silva J. et al. Intratumoral heterogeneity in microsatellite alterations in BRCA1 and PTEN regions in sporadic colorectal cancer. //Ann. Surg. Oncol. -2003. Vol. 10(8). - P. 876-881.

87. Giannessi D., Maltinti M., Del Ry S. Adiponeetin circulating levels: a new emerging biomarker of cardiovascular risk. // Pharmacol. Res. — 2007. — Vol. 56(6).-P. 459-467.

88. Gidron Y., Gilutz H., Berger R. et al. Molecular and cellular interface between behavior and acute coronary syndromes. // Cardiovasc. Res. 2002. -Vol. 56,N1.-P. 15-21.

89. Gotto A.M. Role of C-reactive protein in coronary risk reduction:focus on primary prevention. // Am. J. Cardiol. 2007. - Vol. 99. - P. 718i725.

90. Graham I., Atar D., Borch-Johnsen K. et al. European guidelines on cardiovascular disease prevention in clinical practice: Executive summary. // Atherosclerosis. 2007. - Vol. 194(1). - P. 1-45.

91. Gronwald J. Selected aspects of genetic counselling for BRCAl mutation carriers. // Hered. Cancer Clin. Pract. 2007. - Vol. 5(1). - P. 316.

92. Gualillo O., Gonzalez-Juanatey J.R., Lago F. The emerging role ofsadipokines as mediators of cardiovascular function: physiologic and clinical perspectives. // Trends Cardiovasc. Med. 2007. - Vol. 17(8). - P. 275-283.

93. Hanley J.A. The meaning and use of the area under a receiver operating characteristic (ROC) curve. // Radiology. 1989. - Vol. 143 (1). -P. 29 - 36.

94. Hara K., Yamauchi T., Imai Y. et al. Reduced adiponectin level is associated with severity of coronary artery disease. // Int. Heart J. 2007. — Vol. 48(2).-P. 149-153.

95. Harbour J.W. Molecular prognostic testing in uveal melanoma: has it finally come of age? // Arch. Ophthalmol. 2007. - Vol. 125, № 8. - P.l 1221123.

96. Harkonen P., Kyllonen A., Nordling S., Vihko P. Loss of heterozygosity in chromosomal region« 16q24.3 associated with progression of prostate cancer // Prostate. 2005. - Vol. 62. - P. 267-274.

97. Hashimoto N., Kanda J., Nakamura T. et al. Association of hypoadiponectinemia in men with early onset of coronary heart disease and multiple coronary artery stenoses. // Metabolism. — 2006. — Vol. 55(12). P. 1653-1657.

98. Hawwa A.F., Collier P.S., Millership J.S. et al. Population pharmacokinetic and pharmacogenetic analysis of 6-mercaptopurine in paediatric patients with acute lymphoblastic leukaemia. // Br. J. Clin. Pharmacol. 2008. -Vol. 66(6). - P. 826-837.

99. Hayden M.R., Tyagi S.C. Arteriogenesis: angiogenesis within unstable atherosclerotic plaque — interactions with extracellular matrix. //

100. Iieeschen C., Dimmelcr S., Hamm'C., van den Brand M. et al. Soluble CD40L in acute coronary syndromes.// N. Eng.* J. Med. 20031 - Vol. 348. -P; 1104-1111. .

101. Herder C., Baumert J., Thorand B. et al. Chemokines and incident coronary heart disease: results from the MONICA/KORA Augsburg case-cohort study, 1984-2002.1! Arterioscler. Thi-omb. Vase. Biol. 2006. Vol. 26.-P. 2147-2152.

102. Herrmann J., Lerman L.O., Mukhopadhyay D. et al. Angiogenesis in atherogenesis. // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. — 2006. — Vol. 26. — P. 1948-1957.

103. Hesson L.B., Cooper W.N., Latif F. The role of RASSF1A, methylation in cancer // Dis. Markers. 2007. - Vol: 23. - P. 73-87.

104. Hong S.J., Park C.G., Seo H.S. et al. Associations among plasma^ adiponectin, hypertension, left ventricular diastolic function and' left ventricular mass index. // Blood Press. 2004. - Vol. 13(4). - P. 236-242.

105. Hughes C., Murphy A., Martin C. et al. Molecular pathology of prostate cancer. // J. Clin. Pathol. 2005. - Vol. 58(7). - P. 673-684.

106. Huo Y., Hafezi-Moghadam A., Ley K. Role of vascular cell adhesion molecule-1» and fibronectin connecting segment-1> in monocyte rolling and adhesion.on early atherosclerotic lesions. // Circ. Res. 2000. - Vol. 87. - P. 153-159.

107. Iglseder B., Mackevics V., Stadlmayer A. et al. Plasma adiponectin levels and sonographic phenotypes of subclinical carotid' artery atherosclerosis: data from the SAPHIR Study. // Stroke. 2005. - Vol. 36(12).-P. 2577-2582.

108. Ikuyama T., Hamasaki T., Inatomi H. et al. Association of vitamin D receptor gene polymorphism with renal cell carcinoma in Japanese. // Endocr. J. 2002. - Vol. 49(4). - P. 433-438.

109. Iwashima Y., Katsuya T., Ishikawa K. et al. Hypoadiponectinemia is an independent risk factor for hypertension. // Hypertension. 2004. - Vol.43(6).-P. 1318-1323.

110. Jabs W.J., Theissing E., Nitschke M. et all Local generation of* C-reactive protein in diseased coronary artery venous bypass grafts and>normal vascular tissue. // Circulation. -2003. Vol. 108. - P. 1428-1431.

111. Jain S., Xu R., Prieto V.G, Lee P. Molecular classification, of soft tissue sarcomas and' its clinical applications. // Int. J. Clin: Ex.p Pathol. — 2010. Vol. 3(4). - P. 416-429.

112. Jiang Y., Zhang W., Kondo K. et al. Gene expression profiling in-a renal cell carcinoma cell* line: dissecting VHL and. hypoxia-dependent pathways. // Molec. Cancer Res. 2003. - Vol. 1. - P. 453-462.

113. Jin Y.M., Li B.J., Qu B., Du Y.J. BRAF, K-ras and BAT26 mutations in colorectal polyps and stool. // World J. Gastroenterol. 2006. — Vol., 12(32).-P. 5148-5152.

114. Kajiwara K., UedaH., Yamamoto H. et al. Tenascin-C is associated with coronary plaque instability in« patients with acute coronary syndromes. // Circ. J. 2004. - Vol. 68. - P. 198-203.

115. Kannel W.B. Prevalence, incidence, and mortality of coronary heartdisease. In:. Fuster V., Topolk E.J<, Nabel E.G. Atherothrombosis andjcoronary artery disease. Lippincott Williams & Wilkins, 2 ed; 2005. - P. 15-22.

116. Kao P.C., Dhiesh S-C., Wu T-J. Serum C-reactive protein as a marker of wellness assessment. // Ann. Clin. Lab. Sci. 2006. - Vol. 36, # 2. - P. 163-169.

117. Kappes A., Luffler G. Influences of ionomycin, dibutyryl-cycloAMP and tumour necrosis factor-alpha on intracellular amount and secretion of apMl in differentiating primary human preadipocytes. // Horm. Metab. Res. 2000. - Vol. 32(11-12). - P. 548-554.

118. Karami S., Brennan P., Hung R.J. et al. Vitamin D receptor polymorphisms and renal cancer risk in Central and Eastern Europe. // J. Toxicol. Environ. Health A. 2008. - Vol. 71(6). - P. 367-372.

119. Kaski J.C., Holt D.W. Pregnancy-associated plasma protein-A and? cardiovascular risk. // Eur. Heart J: 2006. - Vol: 27. - P. 1637-1639.

120. Kavsak P.A., MacRae A.R., Newman A.M. et al. Elevated'C-reactive protein in acute coronary syndrome presentation is an independent predictor of long-term mortality and- heart failure. // Clin: Biochemistry. — 2007. — Vol. 40.-P. 326-329.'

121. Kawagoe Jl, Imamura T., Date H. et al: Reciprocal production-of adiponectin and C-reactive protein in coronary circulation of patients with? and without"coronary artery disease. // Horm: Metab. Res. 2008i - Vol. 40, #8.-P. 578-580.

122. Kerner A., Gruberg L., Goldberg A. et' al. Relation of C-reactive protein to coronary collaterals in-patients with' stable angina pectoris and1 coronary artery disease: // Am. J. Cardiol. 2007. - Vol-. 99: - P. 509-512.

123. Kienast J:, Padro T., Steins M. et' al. Relation* of urokinase-type plasminogen activator expression to presence and.severity of atherosclerotic lesions in human coronary arteries. // Thromb. Haemost. 1998. Vol. 79 (3). -P. 579-586.

124. Kim W.-J., Park S., Kim Y.-J. Biomarkers in »bladder cancer: present* status and perspectives. // Biomark Insights. 2007. - Vol. 2. — P: 95-105.

125. Kleemann R., Zadelaar S., Kooistra T. Cytokines and atherosclerosis: a comprehensive review of» studies in mice. // Cardiovasc. Res. 2008. -Vol. 79.-P. 360-376.

126. Knobloch R., Konrad L., Barth P. et al. Genetic pathways and new progression markers for prostate cancer suggested by microsatellite allelotyping. // Clin. Cancer Res. 2004. - Vol. 10. - P. 1064-1073.

127. Knuutila S., Aalto Y., Autio K. et al. DNA copy number losses in human neoplasms. // Am. J. Pathol. 1999. - Vol. 155, №1. - P. 683-694.

128. Koenig W., Khuseynova N. Biomarkers of atherosclerotic plaque instability and rapture. // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2007. - Vol. 27.-P. 15-26.

129. Kojima S., Funahashi T., Sakamoto T. et all The variation of plasma concentrations of a novel, adipocyte derived protein, adiponectin, in patients with acute myocardial infarction. // Heart. 2003. — Vol. 89(6). - P." 667668.

130. Kolodgie F.D., Burke A.P., Farb A. et al. Differential accumulation of* proteoglycans and hyaluronan in culprit lesions. Insights into plaque erosion. // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2002. - Vol. 22. - P. 1642-1648.

131. Kong Y.Z., Huang X-R., Ouyang X. et al. Evidence for vascular macrophage migration inhibitory factor in destabilization of human atherosclerotic plaques. // Cardiovasc. Res. 2005. - VoF. 65. - P. 272-2821

132. Kong Y.Z., Yu X., Tang J J. et al. Macrophage migration inhibitory factor induces MMP-9 expression: implications for destabilization of human atherosclerotic plaques. // Atherosclerosis. 2005. - Vol. 178(1). - P. 207215.

133. Krasnikova T.L., Parfyonova Y., Alekseeva I.A. et al. Urokinase plasminogen activator system in humans with stable coronary artery disease. // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1999. Vol. 26 (4), - P. 354-357.

134. KrKcki R., Droid'i J., Szczetbniak P. et al. Novel atherogenesis markers for identification of patients with a multivessel coronary artery disease. // Kardiol Pol. 2008. - Vol. 66(11).-P. 1173-1180.

135. Kuwai T., Kitadai Y., Tanaka S. et al. Mutation of the von Hippel-Lindau (VHL). gene in human colorectal carcinoma: association with cytoplasmic accumulation of hypoxia-inducible factor (HIF)-l alpha. // Cancer Sci. 2004. - Vol. 95(2). - P. 149-153.

136. Kvasha S., Gordiyuk; V., Rondratov A. et all I Iypermehtylation of the 5'CpG island of the FHIT gene in clear cell renal; carcinomas; // Cancer Letters. 2008. - Vol. 265. - P. 250-257.

137. Landegren U., Laboratory protocols fon mutation; detection. Oxford,. 1996.-P. 127. .

138. Libby Pi Heart disease:; a textbook of cardiovascular medicine. -Philadelphia;,2001v R; 995-1009;.

139. Lim D.L., Ko< R;, Pautler S^E. et al. Current understanding of the molecular mechanisms of kidney cancer: a primer for urologists. // Can. Urol. Assoc. J. 2007. - Vol. 1 (2Suppl). - SI 3-S20.

140. Lloyd-Jones D.M., Liu K., Tian L., Greenland P. Narrative review: assessment of G-reactive protein in risk prediction for cardiovascular disease. // Ann. Intern. Med. 2006. - Vol. 145. - P. 35-42.

141. Lo P.-K., Sukumar S. Epigenomics and breast cancer. // Pharmacogenomics. — 2008. — VTL 9(12). -P: 1879-1902.

142. Lodish M.B., Stratakis C.A. RET oncogene in MEN2; MEN2B, MTC, and other forms of thyroid cancer: molecular genetics and therapeutic advances. // Expert Rev. Anticancer Ther. 2008.Vol. 8(4). - P. 625-632.

143. Loftus I.M:, Naylor A.R., Goodall S. et al. Increased- matrix metalloproteinase-9 activity in unstable carotid.plaques: A potential" role in acute plaque disruption. // Stroke. 2000. - Vol. 31. - P. 40-47.

144. Lohmann D:, Horssthemke B.,Gillessen K.G. et al. Detection of small RBI gene deletions in retinoblastoma by multiplex per and high-resolution gel electroforesis. // Hum. Genet. 1992. - Vol. 89. - P: 49-53.

145. Losi L., Baisse B., Bouzourene H., Benhattar J. Evolution of intratumoral genetic heterogeneity during colorectal cancer progression. // Carcinogenesis. 2005. - Vol. 26(5). - P^ 916-922.

146. Lund' A.H., van Lohuizen M. Epigenetics and cancer. // Genes Dev. — 2004.-Vol. 18 (19).-P. 2315-2335.

147. Lundgren C.H., Sawa H., Sobel B1E., Fujii S. Modulation of expression of monocyte/macrophage plasminogen activator activity and its implications for attenuation of vasculopathy. // Circ. 1994. — Vol. 90. — P. 1927-1934.

148. Lurje G., Manegold P.C., Ning Y. et al. Thymidylate synthase gene variations: predictive and prognostic markers. // Mol. Cancer Ther. 2009.

149. Mallat Z., Corbaz A., Scoazec A. et. al. Expression of interleukin-18 in human atherosclerotic plaques and relation to plaque instability. // Circulation.-2001.-Vol. 104.-P. 1598-1603.

150. Marini F., Falchetti A., Del Monte F., et al. Multiple endocrine neoplasia type 2. // Orphanet J. Rare Dis. 2006. - Vol. 1 (45):

151. Martin M. Molecular biology of breast cancer. // Glin. Transl. Oncol. 2006. - Volt 8(1). - P. 7-14.

152. Mastracci T*.L Boulos F.I., Andrulis I.L., Lam W.L. Genomics and premalignant breast lesions: clues to the development and progression'of lobular breast cancer. // Breast Cancer Res. 2007. - Vol-. 9(6). - P: 215.

153. McRonald F.E., Morris M.R., Gentle D: et al. CpG methylation profiling in VHL related and VHL unrelated-renal cell carcinoma. // Mo.l Cancer. 2009. - Vol. 8 (31).

154. Mehra R., Tomlins S.A., Shen R. et al. Comprehensive assessment of TMPRSS2 and ETS family gene aberrations in clinically localized prostate cancer. // Mod. Pathol. 2007. - Vol. 20(5). - P. 538-544.

155. Melamed J., Einhorn J. and- Ittmann M. Allelic loss on chromosome 13q, in human prostate carcinoma // Clin. Cancer Res. 1997. Vol. 3. - V. 1867-1872.

156. Miller V.M., Redfield M.M., McConnell J.P. Use of BNP and CRP as biomarkers in assessing cardiovascular disease: diagnosis versus risk. // Curr. Vase. Pharmacol. 2007. - Vol. 5. - P. 15-25.

157. Mitelman F. Recurrent chromosome aberrations in cancer. // Mutat. Res. 2000. - Vol. 462(2-3). - P. 247-253.

158. Murphy J., Dorudi S., Bustin S.A. Molecular staging of colorectal cancer: new paradigm or waste of time? // Expert: Gpin. Med. Diagn; -2007.-Vol. 1(1). -P. 31-45.

159. Ohlmann P., Jaquemin L., Morel O. et al. Prognostic value of C-reactive protein and cardiac troponin I in primary percutaneous interventios for ST-elevation myocardial infarction. // Am. Heart J. 2006: - Vol. 152. -P. 1161-1167.

160. Ouchi N;, Shibata R., Walsh; K. Cardibprotectiom by adiponectin; // Trends Cardiovasc. Med: 2006. - Vol: 16(5): — PL141-146:

161. Packard R.R., Libby P. Inflammation:in atlierosclerosis: from vascular biology to biomarker discovery and risk prediction; // Clin. Chem. 2008. -Vol. 54(1).-P. 24-38.

162. Paffen E., deMaat M.P.M. C-reactive protein in; atherosclerosis: a causal factor? // Cardiovasc. Res. 2006. - Vol. 71. - P. 30-39.

163. Panteghini M. Role and importance of biochemical markers in clinical: cardiology. // Eur. Heart J. 2004. - Vol. 25. - PI 1187-1196.227 ■

164. Pischon TV, Girman C.J;, Hotamisligil G.S. et al. Plasma adiponectin levels and risk of myocardial infarction in men; // JAMA. — 2004. — Vol. 291(14).-P. 1730-1737.

165. Rasmussen A., Alonso E., Ochoa A. et al: Uptake of genetic testing and long-term tumor surveillance in von Hippel-Lindau disease. // BMC Med. Genet. 2010. - Vol. 11 (4).

166. Rathmell W.K., Wright T.M., Rini B. Molecularly targeted therapy in renal cell carcinoma. // Exp. Rev. Anticancer Therapy. 2005. - Vol. 5. - P. 1031-1040.228': ■ '

167. Salame M.Y., Samani N.J'., Masood I., deBono DIP. Expression of the plasminogen activator system in the vascular wall.// Atherosclerosis. 2000:1. Vol. 152(1).-P. 19-28.

168. Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3-rd Ed., New York, 2001.

169. Schober A., Berhagen J., Weber C. Chemokine-like functions of MTF in atherosclerosis. // J. Mol. Med. 2008. - Vol. 86(7). - P. 761-770.

170. Schonbeck U., Libby P. CD40 signalling and plaque instability. // Circ. Res. 2001. - Vol. 89.-P: 1092-1103.

171. Schwedler S.B., Amann K., Wernicke K. et al. Native C-reactive protein increases whereas modified C-reactive protein reducesatherosclerosis in apolipoprotein E-knockout mice. // Circulation. — 2005. — Vol. 112.-P. 1016-1023.

172. Sell H., Dietze-Schroeder D., Eckardt K., Eckel J. Cytokine secretion by human adipocytes is differentially regulated by adiponectin, AICAR, and troglitazone. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. - Vol. 343(3). -P. 700-706.

173. Shen G.X. Vascular cell-derived fibrinolytic regulators and atherothrombotic vascular disorders. // Int. J. Mol. Med. 1998. Vol. 1(2). -P. 399-408.

174. Singh A.D., Damato B., Howard P., Harbour J.W. Uveal melanoma: genetic aspects. // Ophthalmol. Clin. North Am. 2005. - Vol. 18, №1. - P. 85-97.

175. Singh S.K., Suresh M.V., Voleti B., Agrawal A. The connection between C-reactive protein and atherosclerosis. // Ann. Medicine. 2008. -Vol. 40.-P. 110-120.

176. Singhal S., Vachani A., Antin-Ozerkis D. et al. Prognostic implications of cell cycle, apoptosis, and angiogenesis biomarkers in non-small cell lung cancer: a review. // Clin. Cancer Res. 2005. — Vol. 11(11). -P. 3974-3986.

177. Slaton J.W., Inoue K., Perrotte P. et al. Expression levels of genes that regulate metastasis and angiogenesis correlate with advanced pathological stage of renal cell carcinoma // Am. J. Pathol. 2001. - Vol. 158. - P. 735743.

178. Smits K.M., Schouten L.J., Dijk B. et al. Genetic and epigenetic alterations in the von Hippel-Lindau gene: the influence on renal cancer prognosis. // Clin. Cancer Research. 2008. - Vol. 14. - P. 782-787.

179. Sobel B.E. Increased plasminogen activator inhibitor-1 and vasculopathy: a reconcilable paradox. // Circulation. — 1999. Vol. 99. — P. 2496-2498.

180. Soller M.J., Isaksson M., Elfving P. et al. Confirmation of the high frequency of the TMPRSS2/ERG fusion gene in prostate cancer. // Genes Chromosomes Cancer. 2006. - Vol. 45(7). - P: 717-719.

181. Strachan T., Read A. Human Molecular genetics John Wiley & Sons, Inc.-2003.-P. 696.

182. Strausberg R.L., Simpson A.J, Old L.J., Riggins G.J. Oncogenomics and the development of new cancer therapies. // Nature. 2004. - Vol. 429 (6990).-P. 469-474.

183. Sugiyama S., Okada Y., Sukhova G. et al. Macrophage myeloperoxidase regulation by granulocyte macrophage colony-stimulating factor in human atherosclerosis and implications in acute coronary syndromes. // Am. J. Pathol. 2001. - Vol. 158. - P. 879-891.

184. Sukhova G.K., Zhang Y., Pan J-H. et al. Deficiency of cathepsin S reduces atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice. // J. Clin. Invest. -2003. Vol. 111, N 6. - P. 897-906.

185. Suzuki H., Kusuyama T., Sato R. et al. Elevation of matrix. . metalloproteinases and interleukin-6 in the culprit coronary artery ofmyocardial infarction. // Eur. J. Clin. Invest. — 2008. Vol. 38(3). — P. 166173.'

186. Tabor M.P:, Brakenhoff R.H., Ruijter-Schippers II.J: et al. Multiple head and5 neck tumors frequently originate from a single preneoplastic lesion.//Am. J. Pathol. 2002. - Vol. 161(3).-P. 1051-1060;

187. Tomlins S.A., Laxman B., Dhanasekaran S.M. et al. Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic • ETS gene fusions in prostate cancer. // Nature. 2007. - Vol. 448(7153). - P. 595-599.

188. Tomlins S.A., Mehra R., Rhodes D.R. et al. Integrative molecular concept modeling of prostate cancer progression. // Nat. Genet. — 2007. — Vol. 39(1).-P. 41-51.

189. Tomlins S.A., Mehra R., Rhodes D.R. et al. TMPRSS2/ETV4 gene fusions define a third molecular subtype of prostate cancer. I I Cancer Res. — 2006. Vol. 66(7). - P. 3396-3400.

190. Tomlins S.A., Rhodes D.R., Perner S. et al. Recurrent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes in prostate cancer. // Science.- 2005. Vol. 310(5748). - P. 644-648.

191. Toning N., Borre M., S0rensen K. D. et al. Genome-wide analysis of allelic imbalance in prostate cancer using the Affymetrix 50K SNP mapping array. // Br. J. Cancer. 2007. - Vol. 96(3). - P. 499-506.

192. Trepels T., Zeiher A.M., Fichtlscherer S. Acute coronary syndrome and inflammation. Biomarkers for diagnostics and risk stratification. // Herz.- 2004. Vol. 29(8). - P. 769-776.

193. Tsimikas S., Mooser V. Molecular Biology of Lipoproteins and Dislipidemias. In: Molecular basis of cardiovascular disease. A companion to Braunwald's Heart Disease. Saunders, Elsevier Inc., 2nd ed. 2004. - P. 365-384.

194. Tsimikas S., Willerson J.T., Ridker P.M; C-reactive protein and other emerging blood biomarkers to optimize risk stratification of vulnerable patients. // J: Am. College Cardiol. 2006. - Vol. 47, # 8. - Suppl. C. 19-31.

195. Varo N., de Lemos J., Libby P. et al. Soluble CD40L: risk prediction after acute coronary syndromes. // Circulation. — 2003. — Vol. 108. — P. 1049-1052.

196. Velickovic M., Delahunt B., Storkel S., Grebe-S.K. VHL and FHIT locus loss of heterozygosity is common in all renal cancer morphotypes but differs in pattern and prognostic significance. // Cancer Research. — 2001. -Vol. 61.-P. 4815-4819.

197. Waksman R., Seruys P.W. Handbook of the vulnerable plaque. -Taylor and Francis, 2004. P. 1-14.

198. Waksman R., Seruys P.W. Handbook of the vulnerable plaque. -Taylor and Francis, 2004. P. 15-32.268;, Waksman R., Scruys P.W. Handbook of the vulnerable plaque. -Taylor: andFrancis, 2004. P: 33-48.

199. Weinberg M.D., Hooper W.C., Dangas G. Cardiac biomarkers for the prediction and diagnosis of atherosclerotic disease: and its complications. // Curr. Moll Medicine. 2006. - Vol. 6. - P: 557-569.

200. Westman J;A. Medical genetics, for the modern clinician. Lippincott Williams &; Wilkins, 2006: 57-76.

201. Widschwendter A., Muller H., Fiegl I-I. et al. DNA methylation in serum and tumors of cervical cancer patients.// Clin, cancer research. — 2004.-Vol. 10.-P. 565-571,

202. Wierzbicki P.M:,, Adrych K., Kartanowicz D. et al. Fragile histidine triad (FHIT) gene is overexpressed in colorectal cancer. // J. Physiol. Pharmacol. 2009. - Vol. 60, Suppl 4. - P. 63-70.

203. Wolf A;M., Wolf D., Rumpold H. ét al. Adiponectin induces the antiinflammatory cytokines IL-10 and IL-IRA in human leukocytes. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. Vol: 323(2). - P: 630-635.

204. Zhang K.Q., Salzman S.A., Reding D.J. et al. Genetics of prostate cancer. // Clin. Med: Res. -2003. Vol. 1(1). - P. 21-28.Q

205. Zhang R., Brennan M.L., Fu X. et al. Association between myeloperoxidase levels and risk of coronary artery disease. // JAMA. — 2001. Vol. 286. - P. 2136-2142.

206. Zoccali C., Mallamaci F., Tripepi G. et al. Adiponectin, metabolic risk factors, and cardiovascular events among patients with end-stage renal disease. // J. Am. Soc. Nephrol. 2002. - Vol. 13(1). - P. 134-141.

207. Zweig M.H. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: A fundamental evaluation tool in clinical medicine. // Clin. Chem. — 1993. — Vol. 39 (4).-P. 561 -577.

208. Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития РФ05201150592

209. Пальцева Екатерина Михайловна

210. КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ РЯДА СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ РЯДА СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Автореферат диссертации по медицине на тему КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ РЯДА СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Оглавление диссертации Пальцева, Екатерина Михайловна :: 2011 :: Москва

Введение диссертации по теме "Клиническая лабораторная диагностика", Пальцева, Екатерина Михайловна, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ РЯДА СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ"

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Пальцева, Екатерина Михайловна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций