Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Клинико-диагностическая значимость ядерного полиморфизма лимфоцитов при аденомиозе

На правах рукописи

ГАДЖИЕВА ЗЕМФИРА ШИХСЕФИЕВНА

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ЯДЕРНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ЛИМФОЦИТОВ ПРИ АДЕНОМИОЗЕ

14.01.01 - Акушерство и гинекология (мед. науки)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2014

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении «Ставропольский государственный медицинский университет»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры акушерства и гинекологии факультета последипломного образования Ставропольского государственного медицинского университета С.А. ГАСПАРЯН

Официальные оппоненты:

Марченко Лариса Андреевна - доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник Федерального государственного учреждения «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И.Кулакова»

Леваков Сергей Александрович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России»

Ведущая организация: Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии»

Защита состоится « /Л» С/ и 2014 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.041.06, созданного на базе ГБОУ ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России по адресу: 127473, Москва, ул. Делегатская д. 20. стр. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке «Московского государственного медико-стоматологического университета имени А.И. Евдокимова» Минздрава России (127206, г. Москва ул. Вучетича, д. 10а).

Автореферат разослан__2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Л.В. Акуленко

РОССИЙСКАЯ Г ОСУЦЛРС i г.; L г: МАЯ

blîbJiulOILKA ..

Z014

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Гинекологическая заболеваемость является важным показателем репродуктивного здоровья. В современных социально-экономических условиях отмечается рост заболеваемости женского населения: эндометриозом - на 46%, воспалительными заболеваниями матки - на 25,5%, доброкачественными новообразованиями матки - на 12,1% [Адамян JI.B. с соавт., 2006; Сухих Г.Т., 2008; Радзинский В.Е. с соавт., 2011; Koninckx P.R. et al., 2012; Levy G. et al., 2013; Li L. et al., 2011].

Является очевидным, что залогом успешного лечения больных с гинекологическими заболеваниями является своевременная диагностика и оказание адекватного квалифицированного лечения. Правильная организация гинекологической помощи связана с разработкой надежных программ скрининга, повышением квалификации специалистов, использованием современных технологий, которые могут способствовать оптимизации диагностического процесса, устранению субъективных причин возможных диагностических ошибок.

Известно, что возникновение и прогрессирование эндометриоза (ЭМ) сопровождается сложными реакциями регулирующих гомеостатических систем, влекущими за собой изменения деятельности всего женского организма и характеризующими процесс его дезадаптации в новых условиях. Это вызывает резкое ухудшение общего состояния и качества жизни, а, нередко, приводит к инвалидизации женщин репродуктивного возраста [Радзинский с соавт., 2011; Унаян A.JI. с соавт., 2012; Jia S.Z. et al., 2012; Louis L.S. et al., 2012; Maheshwari A. et al., 2012].

Несмотря на пристальное внимание специалистов к изучению различных аспектов ЭМ, многие вопросы остаются не до конца разрешенными. Высказываются разнообразные, а подчас и противоречивые, мнения об этиологии, патогенезе заболевания, значении различных факторов и механизмов его развития.

Современные сведения о молекулярно-генетических особенностях различных вариантов эндометриоидных поражений позволяют рассматривать ЭМ как хроническое заболевание с признаками автономного роста гетеротопий, нарушением биологической активности клеток эндометрия. Такой автономный рост означает отсутствие контроля за пролиферацией и дифференцировкой клеток гетеротопий со стороны организма женщины.

Низкий апоптоз и повышенная пролиферативная активность клеток гиперплазированного эндометрия сопровождают процесс их перемещения в другие ткани и органы. Механизм апоптоза выработан в процессе эволюционного развития с появлением многоклеточных организмов и межклеточной регуляции отдельных функций клеток и глубоко физиологичен, так как направлен на сохранение генетически заданной численности клеток, стабилизацию границ близко соприкасающихся тканей (эндометрий-миометрий), предотвращение накопления и переноса

патологически измененной ДНК в другие клетки в процессе митотического деления.

Важная роль факторов иммунитета в развитии эктопического эндометрия убедительно подтверждена работами отечественных и зарубежных ученых [Посисеева JI.B. и соавт., 2008; Сорокина А.В. с соавт., 2012; Eisenberg V.H et al., 2012; Shrestha A., 2012; Herington J.L. et al., 2011]. При этом большинство исследователей считают, что нарушение регуляторных межклеточных взаимоотношений внутри иммунной системы, проявляющееся значительными изменениями процессов активации и апоптоза клеточных клонов, имеет при ЭМ основополагающее патогенетическое значение [Антонеева И.И., Петров С.Б., 2008; Разин C.B., 2009; Berbic M. et al., 2010; Taniguchi F. et al., 2011]. В связи с этим изучение вопросов регуляции пролиферативной активности и значение апоптоза в генезе данного патологического процесса остается, по-прежнему, важным и актуальным.

Сложности ранней диагностики ЭМ диктуют необходимость поиска новых методов и современных неинвазивных технологий. В последнее время широкое применение получил метод определения функционального состояния клеток на основе характеристики их ядерных структур, включая области ядрышкового организатора, которые отражают метаболическую и пролиферативную активность клеток, а также являются маркером злокачественной трансформации. Новые возможности, ассоциированные с развитием компьютерных технологий, ведут к решению комплексных медико-биологических и медицинских проблем. Поэтому стратегически важным является развитие и внедрение диагностических методов, позволяющих проводить анализ биообъектов на клеточном и субклеточном уровнях

В связи с вышеизложенным можно полагать, что комплексное и детальное исследование процессов пролиферации, будет способствовать получению новых сведений, позволяющих на современном уровне подойти к решению проблемы - совершенствованию диагностики, тактики ведения и лечения гинекологических больных с доброкачественными пролиферативными заболеваниями.

Цель исследования - повышение качества диагностики и оценки эффективности лечения больных аденомиозом с помощью дифференциально-диагностических цитологических критериев реактивных изменений ядерных структур иммунокомпетентных клеток.

Задачи исследования

1. На основе проспективного анализа оценить особенности преморбидного фона, клинической картины, результатов лабораторных и инструментальных исследований у больных с лейомиомой матки, аденомиозом и сочетанием этих патологических процессов.

2. Изучить в экспериментах in vitro особенности и закономерности качественных и количественных изменений ядерных структур лимфоцитов

периферической крови в процессе их активации митогеном фитогемагтлютинин.

3. Разработать цито диагностические критерии реактивных изменений ядер лимфоцитов на основе количественных морфометрических и электрокинетических показателей, отражающих динамику структурно-пространственной организации интерфазных ядер, связанной с изменением высоко упорядоченной структуры хроматина лимфоцитов в процессе их активации.

4. Установить особенности ядерного полиморфизма различных субпопуляций (CD4+, CD8+) Т-клеток периферической крови больных с аденомиозом, лейомиомой матки и их сочетанием по данным экспресс-анализа количественных показателей надмолекулярной организации интерфазного хроматина ядер лимфоцитов.

5. Оценить эффективность лечения обследованных больных с использованием дифференциально-диагностических морфометрических и электрокинетических критериев реактивных изменений ядерных структур лимфоцитов периферической крови.

Научная новизна

Впервые компьютерными методами прижизненного имиджинга в экспериментах in vitro и в культуре изучены закономерности качественных и количественных изменений интерфазного хроматина ядер лимфоцитов периферической '-крови в процессе их активации митогеном фитогемагглютинин.

Показано, что интерфазный хроматин является высокоинформативным и чувствительным биосенсором ранних изменений морфофункционапьного состояния иммунокомпетентных клеток.

Предложены цитодиагностические критерии реактивных изменений ядер лимфоцитов на основе анализа динамики структурно-пространственной организации интерфазного хроматина. Выявлены наиболее информативные морфометрические (индекс функциональной активности ядра) и электрокинетические (амплитуда колебаний) показатели, характеризующие особенности ядерного полиморфизма у больных с лейомиомой матки, аденомиозом различной степени и сочетанием этих заболеваний.

Впервые для оценки эффективности лечения и выявления рецидивов аденомиоза использованы разработанные дифференциально-диагностические цитологические критерии экспресс-анализа реактивных изменений ядерных структур отдельных субпопуляций (CD4+, CD8+) лимфоцитов.

Научно-практическая значимость

Результаты работы позволяют уточнить и с новых позиций оценить некоторые аспекты патогенеза аденомиоза, связанные с иммунными нарушениями на системном уровне, в частности, с активацией различных популяций Т-лимфоцитов.

Предложенные цитодиагностические критерии морфофункционального состояния различных субпопуляций лимфоцитов на основе морфометрических и электрокинетических показателей позволяют

дифференцировать характер иммунного ответа у больных с аденомиозом, лейомиомой матки и их сочетанием.

Практическое использование компьютерных методов имиджинга интерфазного хроматина способствует оперативному получению важной информации о состоянии клеточного звена иммунитета, открывает новые возможности для оценки эффективности проводимых лечебных и реабилитационных мероприятий, а также ранней диагностики рецидивов аденомиоза.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Объективными количественными критериями активации лимфоцитов могут служить показатели структурно-пространственной организации хроматина интерфазных ядер, зарегистрированные компьютерными методами прижизненного имиджинга.

2. Прогрессирование аденомиоза и лейомиомы матки связано с активацией различных популяций Т-лимфоцитов, высокочувствительным биосенсором их активности является интерфазный хроматин, отражающий ранние изменения морфофункционального состояния иммунокомпетентных клеток.

3. Оценка ядерного полиморфизма различных субпопуляций лимфоцитов на основе морфометрических и электрокинетических показателей позволяет объективизировать отдаленные результаты лечения, способствует ранней диагностике рецидивов аденомиоза.

Внедрение результатов в практику

Основные результаты работы внедрены в практику врачей гинекологического отделения ГУЗ «Ставропольский краевой клинический центр специализированных видов медицинской помощи».

Материалы диссертации используются при чтении лекций и проведения практических занятий с курсантами на кафедре акушерства и гинекологии ФУВ ГБОУ ВПО Ставропольского государственного медицинского университета Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Публикации

Результаты исследований отражены в 10 публикациях (из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 8 тезисов докладов, представленных на международных и отечественных научных форумах).

Апробация работы

Материалы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всероссийском конгрессе «Амбулаторно-поликлиническая практика - новые горизонты» (Москва, 2010); Второй Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийской научно-практической конференции

«Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2011, 2012), IX, XI International conference «Innovative

Medical Technologies of XXI century» (Benidorm, Spain, 2010, 2012); IV Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2012).

Личное участие автора в разработке проблемы

Клинические и экспериментальные исследования, анализ и интерпретация данных проведены автором самостоятельно. Автор выражает глубокую признательность за практическую помощь сотрудникам гинекологического отделения Ставропольского краевого клинического центра специализированных видов медицинской помощи, лаборатории компьютерной цитоморфометрии и отдела биоинформатики и биоинженерии живых систем ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения России.

Структура и объем и диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав, содержащих собственные результаты, обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Список цитируемой литературы включает 84 отечественных и 71 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 19 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Контингент,^материал и методы исследования

Исследования проводились на базе кафедры акушерства и гинекологии ФПО ГБОУ ВПО Ставропольский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения РФ (ректор - д.м.н., профессор В.Н.Муравьева) с 2010 по 2013 годы.

В диссертации обобщены данные обследования 137 пациенток в возрасте с 24 до 49 лет (средний возраст 36,9 ± 3,5 лет), поступивших на стационарное лечение. В зависимости от заболевания все больные были разделены на следующие клинические группы: I группу составили 38 (27,7%) больных с лейомиомой матки (JIMM); II группа была представлена 31 (22,6%) больной с аденомиозом 1-2 стадии (AM I-II); III группа - 33 (24,1%) больных с аденомиозом 3-4 стадии (AM III-IV); IV группа - 35 (25,6%) больных с сочетанием лейомиомы матки и аденомиоза (АМ+ЛММ). Средний возраст пациенток с ЛММ составил 37,8 ± 3,3, с AM I-II стадии - 36,9 ± 2,6 и AM III-IV стадией - 38,5 ± 4,1, с AM и ЛММ - 41,1 ± 7,1.

Для определения показателей нормы нами была обследована группа (30 человек) практически здоровых небеременных женщин фертильного возраста (от 22 до 47 лет). Средний возраст в группе здоровых лиц составил 34,7 ±3,6 лет. В контрольную группу вошли женщины, не имевшие на момент обследования признаков обострения гинекологической и хронической соматической патологии, обратившиеся в клинику по вопросам контрацепции.

Изучены анамнестические данные, включавшие: особенности преморбидного фона, перенесенные и сопутствующие гинекологические заболевания, оперативные вмешательства, менструальную (возраст менархе,

особенности менструального цикла и его нарушения), половую и репродуктивную (число беременностей, их течение, исход) функции.

Клиническое обследование включало общий осмотр, оценку состояния сердечно-сосудистой, дыхательной, эндокринной, мочевыделительной и пищеварительной систем, состояние молочных желез. Гинекологический статус определяли на основании осмотра наружных половых органов, исследования влагалища и шейки матки с помощью зеркал, бимануального влагалищного исследования, по показаниям - прямокишечно-влагалищного исследования.

Из лабораторных методов исследования были использованы как рутинные (клинический анализ крови, общий анализ мочи, определение групповой и резус принадлежности крови, анализ биохимических параметров и гемостазиограммы, реакция Вассермана, тест на ВИЧ-инфекцию и НВ8-антиген, электрокардиограмма, рентгенография органов грудной полости, бактериоскопическое исследование влагалищного отделяемого), так и современные высокоинформативные специальные методы - ультразвуковое трансабдоминальное и трансвагинальное сканирование органов малого таза, магнитно-резонансная томография, гистероскопия, лапароскопия.

При проведении хирургических вмешательств использовали телевизионные системы Telecam SL и Tricam SL, электрохирургические генераторы Autcon 200, Autcon 350 и стандартные моно- и биполярные инструменты (Karl Storz GmbH & С°., Германия); С02-лазерную установку Coherent 3000L (Coherent Inc., США); ультразвуковую хирургическую установку Ultracision Harmonic Scalpel System (Ethicon Endosurgery Inc., США); электрохирургический генератор для аргон-усиленной электрохирургии Force GSU (Valleylab Inc., США), (Karl Storz GmbH & С0., Германия); рентгенохирургический комплекс Integris V5000 (Philips Electronics, Голландия).

После операции проводили комплекс ранних реабилитационных мероприятий (антибиотикопрофилактика, симптоматическое

медикаментозное лечение, плазмаферез и др.). Контроль эффективности проведенного лечения осуществляли при динамическом обследовании больных через 3 и 12 месяцев после операции.

Оценку морфофункционального состояния лимфоцитов периферической крови проводили на основе аппаратно-программного комплекса БИОНИ (АПК БИОНИ, ООО «Ветгрейд ЛТД», Москва) методами компьютерной цитоморфометрии (модуль компьютерной фазово-интерференционной микроскопии «Биони-КФМ») и микроэлектрофореза (модуль микроэлектрофореза «Биони-МЭФ»), в качестве референтных методов оценки состояния ядерных структур лимфоцитов использовали конфокальную микроскопию клеток при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM 710 (Carl Zeiss, Германия) и метод ФГА-стимуляции. Методом двухцветной проточной цитофлюориметрии определяли поверхностный фенотип иммунокомпетентных клеток (FACScan,

Becton Dickinson, USA) с помощью моноклональных антител CD4 и CD8 (МедБиоСпектр, Москва).

Статистический анализ экспериментальных и клинических данных проводили с помощью математического пакета "Statistica 6". Стандартная обработка выборок включала подсчет значений средних арифметических величин, ошибок средних, а также величины дисперсии и среднего квадратичного отклонения. Различия между сравниваемыми группами рассчитывали по критериям Колмогорова-Смирнова или Стьюдента. Уровень значимости устанавливался равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Клинические проявления аденомиоза у обследованных больных оказались достаточно вариабельными.

При анализе психо-эмоционального состояния выявлено, что для большинства пациенток (71,5%) характерны раздражительность, неустойчивое настроение, эмоциональная лабильность (истерии), депрессии, нарушение сна.

Практически у всех больных выявлялись нарушения самочувствия общего характера. Пациентки жаловались на общую слабость, плаксивость, раздражительность, плохое настроение, потливость, нарушение трудоспособности^ Из жалоб общего характера наиболее частыми были немотивированная слабость (95,6%), недомогание (91,2%), повышенная утомляемость (74,4%), бессонница (78,1%). У 32 женщин (23,3%) указанные ощущения приводили к нарушению трудоспособности на 1-2 часа в день, что расценивалось как нарушение общего состояния I степени (01) согласно классификации, разработанной Л.В.Адамян и E.H. Андреевой (1997). У 42 (30,6%) подобные ощущения вызывали нарушение привычной трудоспособности в течение половины дня на протяжении 1-2 недель и были расценены нами как нарушения общего состояния II степени (02). Нарушением общего состояния III степени (03) считалось снижение обычной в прошлом трудоспособности в течение целого дня на протяжении недели при отсутствии других причин. Нарушения такого характера были обнаружены у 53 (38,7%) больных.

Основными причинами, побудившими женщин обратиться за квалифицированной медицинской помощью, были дисменорея, нарушение менструального цикла по типу гиперполименореи, пред- и постменструальные кровяные выделения из половых путей, хроническая тазовая боль различной интенсивности, диспареуния, изменение размеров матки в динамике менструального цикла (увеличение во второй половине, уменьшение по окончании менструации), отсутствие беременностей.

Наиболее частыми жалобами больных были: постоянные боли в нижних отделах живота, не связанные с менструальным циклом 57,9 70,9, 87,9 и 25,7% в группах ЛММ, AM I-II и AM III-IV, АМ+ЛММ, соответственно. Боли внизу живота, усиливающиеся во время менструации, выявлены у 47,4%, 54,8%, 96,9% и 60% больных, соответственно.

Диспареунию отмечали 26,3%, 32,2%, 66,7% и 45,7% женщин, соответственно. Тенезмы испытывали 10,5%, 16,1%, 18,2% и 14,3% больных, соответственно. Полименорея наблюдалась 31,6%, 32,2%, 57,6% и 93,9% пациенток, соответственно. Анализ представленных данных подтверждает мнение о зависимости частоты и выраженности дисменореи и болевого синдрома от глубины инвазии эндометриоидных гетеротопий в ткани лейомиометрия. При этом увеличение дней менструального кровотечения (более 7), наличие обильных выделений со сгустками, кровянистых выделений из половых путей до и после менструации четко коррелировало со стадией АМ.

При оценке интенсивности болей установлено, что наиболее тяжелый болевой синдром наблюдался у больных с тяжелый болевой синдром наблюдался у больных с АМ Ш-1У. При АМ 1-П и ЛММ+АМ болевой синдром носил, в основном, средне-тяжелый характер.

Болезненность, нагрубание молочных желез (в основном во второй фазе менструального цикла) отмечали 41 (51,9%) пациентка, из них у 13 (31,7%) до поступления в клинику были выявлены доброкачественные опухоли и гиперпластические процессы молочных желез.

Изучение семейного анамнеза показало, что отягощенную наследственность в виде новообразований половых органов имели 45 (32,8%) пациенток, гиперпластических процессов молочных желез - 22 (16%), опухолей экстрагенитальной локализации - 19 (13,8%), эндокринопатий -сахарный диабет, ожирение, тиреотоксикоз - 19 (11,6%). Отсутствие четкой информации о верификации диагноза эндометриоза у ближайших родственников не позволяет судить о четком наследственном характере этого патологического процесса.

26,3% (36) пациенток имели аллергические реакции по отношению к лекарственным препаратам и различным бытовым факторам, при этом чаще всего аллергия наблюдалась у больных с аденомиозом -22 женщины.

Изучение преморбидного фона с обращением особого внимания на заболеваемость в детстве, перенесенные в прошлом и сопутствующие в настоящее время заболевания, позволило выявить, что индекс здоровья обследованных больных был довольно низким.

Частота перенесенных детских инфекционных заболеваний составляла 70,8% среди всех обследованных. Наиболее часто - 80,6% и 69,7% - болели ими пациентки с АМ 1-П и Ш-ГУ стадии.

Острыми респираторными заболеваниями страдали большинство обследованных больных. Так, из 137 пациенток ОРЗ перенесли 61,3%, чаще всего болели пациентки с аденомиозом различной степени тяжести.

Аппендэктомия наблюдалась у 18,2% из всего числа обследованных больных, по клиническим группам - 15,8% в группе с ЛММ, 22,6%, 15,1% и 20% в группах с АМ 1-П, АМ 1Н-1У и АМ+ЛММ, соответственно.

Заболевания желудочно-кишечного тракта, печени и желчевыводящих путей отмечены у 42,3% обследованных с преобладанием в группе с АМ 1-П (45,25%).

Заболевания сердечно-сосудистой системы отмечены в среднем у 24,8% обследованных. Больший процент этой нозологической формы в группах AM III-IV и AM+JIMM (24,2% и 37,1%), по-видимому, связан со значимым представительством- в данной группе женщин более старшего возраста, а также более тяжелым течением заболевания этих пациенток. Заболевания мочевыделительной системы наблюдались в среднем у 13,9% больных.

Из приведенных данных следует, что низкий индекс здоровья обследованных больных может в значительной мере характеризовать неблагоприятный фон, который способствовал возникновению и прогрессированию заболевания.

Анализ становления менструального цикла выявил, что у большинства пациенток менархе наступило в среднем в возрасте 13,9±0,3 лет. Достоверной связи между возрастом начала менструации и клиническими вариантами AM не выявлено. У подавляющего большинства менструальный цикл установился сразу: 35 (92,1%), 29 (93,5%), 27 (81,8%) и 27 (77,1%) женщин, соответственно, в I, II, III и IV группах. В группе AM+JIMM у 2 (5,7%) женщин менструальный цикл так и не установился. Продолжительность менструального цикла во всех группах варьировала, в среднем, от 26 до 30 дней. У пациенток отмечалась неполноценность механизмов регуляции менструального цикла, прежде всего гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы. Нарушения менструального цикла приводили к изменению и ухудшали соматический статус и качество жизни больных до оперативного лечения.

Сравнительный анализ характера нарушений генеративной функции позволил выявить, что 3 и более родов было у 14,6%, больше 3 абортов - у 30,7% больных, бесплодие наблюдалось у 26,3%. Обращало внимание, что бесплодие у 15,3% больных наступило после искусственного прерывания беременности, осложнившегося воспалением матки и придатков, или после осложненных родов, сопровождавшихся ручным обследованием полости матки в связи с кровотечением. Эти данные могут свидетельствовать о том, что изменения, возникающие в периферических звеньях половой системы вследствие травмы или воспаления, являются благоприятным фоном для развития доброкачественных опухолей и гиперпластических процессов матки, в том числе и аденомиоза.

Из перенесенных гинекологических заболеваний наиболее часто (43,1%) отмечены воспалительные процессы матки и придатков. Эктопии шейки матки выявлены у 32,1% больных. Консервативная лейомиомэктомия была в анамнезе у 5,8% обследованных пациенток. Практически у каждой 10-й (11,7%) в анамнезе были резекция или удаление яичника по поводу эндометриоидной кисты, апоплексии или перекрута ножки кисты. Не исключено, что прогрессирование аденомиоза может быть связано либо с неполным удалением очага, либо с выраженной агрессивностью патологического процесса.

До поступления в стационар 85 (62%) больных получали длительное консервативное лечение, включающее лекарственную, в том числе гормональную, терапию и физические методы воздействия. Из них 30,7% находились на стационарном лечении, при этом половина из них -неоднократно.

Таким образом, клиническая картина заболевания у больных аденомиозом характеризуется следующими особенностями, в большей или меньшей степени выраженными при различных стадиях патологического процесса: наличием наследственной отягощенности, высокой частотой перенесенных (инфекционных, воспалительных) и сопутствующих заболеваний; нарушениями менструального цикла, как в период его становления, так и в момент обследования, снижением генеративной и изменениями половой функции; длительным гинекологическим анамнезом, выраженным болевым синдромом и неэффективностью консервативной терапии, включая гормональную.

При гинекологическом осмотре было выявлено, что у всех больных наружные половые органы развиты правильно. Гирсутизм не является характерным проявлением эндометриоза и отмечен как умеренно выраженный у 7 (5,1%) пациенток.

При осмотре в зеркалах и кольпоскопии слизистой оболочки влагалища и шейки матки кольпит выявлен в 1,4% случае . Псевдоэрозии шейки матки выявлены у 9 (6,6%) больных, остаточные явления эрозии в виде наботовых кисту 21 (15,3%).

Небольшое увеличение матки, соответствующее 5-6 недельной беременности, выявлено у 23 (23,2%), 7-8 недельной беременности - у 34 (34,3%), от 9 и до 16 недельной (в случае сочетания с лейомиомой матки) - у 42 (42,4%) больных аденомиозом. У 11,7% больных придатки с одной стороны были удалены при предыдущих операциях.

При исследовании влагалищных мазков у 70,8% больных выявлена III степень чистоты, у остальных - III степень, при этом микрофлора была представлена у 40,8% палочкой Дедерлейна, у 21,2% в мазках обнаружены дрожжевые грибки (Candida albicans).

Таким образом, анализ клинической картины заболевания обследованных больных с аденомиозом позволил выявить некоторые особенности клинических проявлений патологического процесса, которые, несомненно, оказывали отрицательное влияние на здоровье и качестве жизни пациенток до операции.

Экспериментальная разработка диагностических критериев оценки ядерного полиморфизма лимфоцитов

В основе прижизненной визуализации динамики внутриклеточных процессов лежит объективная оценка количественных и качественных признаков, характеризующих настоящее состояние клетки и субклеточных структур и отражающих динамику ее морфофункциональных характеристик во времени. Ядерный хроматин способен к сложным конформационным превращениям, изменяющим его физико-химические свойства. При этом

хроматин обнаруживает эффект двулучевого преломления - анизотропию. Величина анизотропии отражает структурную упорядоченность хроматина, который является основным носителем генетической информации в клетке. При этом конденсированный хроматин метаболически менее активен в отношении синтеза ДНК по сравнению с его диффузной формой. Является очевидным, чем выше анизотропия хроматина и, соответственно, фазовая высота, тем ниже активность ядра. Снижение уровня анизотропии может интерпретироваться как показатель, свидетельствующий о переходе гетерохроматина в эухроматин, что указывает на биологическую активацию хроматина, и является предпосылкой для появления матричной активности ДНК.

Для более эффективной характеристики функционального состояния лимфоцитов мы выделили 4 основных клеточных группы по величине их фазовой высоты: до 1,5 мкм, от 1,5 до 2,0 мкм, от 2,0 до 2,5 мкм и выше 2,5 мкм (Рис.1). Установлено, что в популяции циркулирующих лимфоцитов у здоровых добровольцев процент клеток с соответствующими значениями Н, в среднем, составляет 7, 21, 45, 27%. Для количественной оценки ядерного полиморфизма циркулирующей популяции лимфоцитов использовали показатель функциональной активности ядра (FAN- functional activity of the nucleus). При этом в субпопуляции интактных Т-клеток значение FAN составило 1,83±0,]'г в субпопуляции В-лимфоцитов -1,85±0,1.

Рис. 1. Витальная 3D реконструкция ядер лимфоцитов с различным уровнем функциональной активности. I, II, III, IV - клетки с фазовой высотой выше 2,5 мкм, от 2,5 до 2,0 мкм, от 2,0 до 1,5 мкм и ниже 1,5 мкм.

Для изучения морфофункционального состояния ядер при активации лимфоцитов в условиях эксперимента in vitro к взвеси клеток добавляли индуктор активации - митоген фитогемагглютинин (ФГА) в концентрации 100 мкг/мл. Исследования проводили через 1 час, через 2 часа и через 24 часа инкубации клеток с митогеном при 37°С.

Через 1 час инкубации лимфоцитов с ФГА достоверно изменялись средние в популяции диаметр, периметр и площадь клеток на 12, 13 и 21%, соответственно. Фазовая высота, характеризующая конформационное состояние ядерного хроматина, снижалась на 8% по отношению к исходным показателям (Табл.1). Через 2 часа наблюдалась тенденция к незначительному увеличению геометрических параметров лимфоцитов, по-видимому, связанная с увеличением клеточных параметров в процессе их активации (изменением ядерно/цитоплазматического отношения).

t Таблица 1

Оценка влияния фитогемагглютинина (100 мкг/мл) на морфометрические показатели Т - лимфоцитов периферической крови практически здоровых лиц после инкубации в течение 1, 2 и 24 часов (М±а)

Группы сравнения Размерные показатели фазово-интерференционных образов Т- лимфоцитов

Диаметр (мкм) Периметр (мкм) Высота (мкм) Площадь (мкм2) Объем (мкмЗ)

Контроль 1 час 7,47±2,17 22,48±6,58 2,29±0,56 35,0120,71 34,85120,81

2 часа 7,40±1,54 22,38±5,92 2,34±0,61 34,2114,39 34,32119,55

24 часа 7,33±1,92 22,30±6,19 2,37±0,79 32,61117,18 34,78123,19

Инкубация с ФГА 100 мг/мл 1 час 6,5611,92* 19,44±5,58* 2,11 ±0,51 27,68116,97* 28,60117,92

2 часа 7,69±2,21 23,59±6,98 1,88±0,78* 37,14120,57 30,39122,26

24 часа 7,08±2,39* 20,54+7,15* 1,98+0,57* 31,02121,93* 25,27117,34

Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с показателями соответствующего контроля

12 3 4

Рис.2. Изображения Т-лимфоцитов до и после воздействия ФГА. 1 - интактные Т-лимфоциты (оптический канал); 2 -Т-лимфоциты + ФГА - инкубация 1 час (оптический канал); 3 - Т-лимфоциты + ФГА - инкубация 1 час (окрашивание мероцианином 540); 4 - Т-лимфоциты + ФГА - инкубация 1 час (окрашивание акридиновым оранжевым).

Фазовая высота достоверно снижалась практически на 18%. Через 24 часа по сравнению с соответствующим контролем геометрические показатели клеток (диаметр, периметр, площадь) достоверно не изменялись, в то время как фазовая высота лимфоцитов была снижена на 16,5% (Табл.1).

В контрольной группе соотношение клеток составило - 6:19:46:29%. Под действием ФГА прогрессивно повышался процент лимфоцитов с увеличенным активационным потенциалом ядер: через 1 час активации соотношение групп клеток составило 10:55:14:21%; через 2 часа -29:38:9:24%. Через 24 часа большинство клеток имели высокий и средний уровень активности: 10 и 75%, в то время как неактивированных лимфоцитов осталось лишь 15% от общего числа.

В качестве референтного метода мы использовали конфокальную микроскопию лимфоцитов (Рис. 2). При сравнительном изучении морфофункционального статуса клеток до и после активации ФГА лимфоциты окрашивали ядерным красителем акридиновым оранжевым и мембранным красителем мероцианином-540. Регистрацию проводили в трех каналах: в оптическом канале для анализа неокрашенных клеток, в диапазоне от 540 до 650 нм для акридинового оранжевого, 570-720 нм для мероцианина-540. По сравнению с интактными клетками после воздействия ФГА у лимфоцитов наблюдались увеличение площади цитоплазмы, увеличение площади ядра, изменение ядерно-цитоплазматического отношения.

В таблице 2 представлены результаты оценки биофизических показателей (электрофоретической подвижности) интактных Т-лимфоцитов обследованных доноров и Т-лимфоцитов, активированных ФГА. Через 1 час инкубации клеток с ФГА наблюдалось увеличение процента неподвижных клеток, по-видимому, в результате изменения их адгезивных свойств. Через 2 часа - процент неподвижных Т-лимфоцитов снижался, а амплитуда колебаний начинала увеличиваться. Через 24 часа - процент неподвижных лимфоцитов составлял 27,4%, средняя амплитуда колебаний достигала 3,5 мкм, величина стандартного отклонения также увеличивалась.

Таблица 2

Оценка влияния фитогемагглютинина (100 мкг/мл) на электрокинетические показатели Т - лимфоцитов периферической крови практически здоровых _лиц после инкубации в течение 1, 2 и 24 часов _

Группы сравнения Количество клеток Процент неподвижных клеток Средняя амплитуда колебаний Стандартное отклонение амплитуды

Интактные Т-лимфоциты 2109±135,6 13,87±4,1 6,61 2,66

ФГА 1 час 298±23,5 62,13±16,2* 3,15* 3,77

2 часа 70±28,4 45,71±12,9* 3,86* 2,81

24 часа 429±33,6 27,40±8,2* 3,50* 1,30

Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с показателями контроля

Корреляционный анализ полученных данных показал, что процент неподвижных клеток отрицательно коррелирует с величинами морфометрических параметров клеток (диаметром (г=-0,4), периметром (г=-0,4), площадью (г=-0,4) и объемом (г=-0,4)) и положительно с фазовой высотой клеток (г=-0,4). Средняя амплитуда колебаний имеет положительные корреляции с морфометрическими параметрами клеток (диаметром (г=0,4), периметром (г=0,4), площадью (г=0,4) и объемом (г=0,4) и отрицательно с фазовой высотой (г=-0,4), (р>0,05).

Полученные результаты показали, что морфометрические и электрокинетические параметры живых клеток могут служить количественными выражением уровня их активности, и в совокупности объективно характеризуют перестройку морфофункционального состояния лимфоидных клеток, отражая функциональный потенциал клеточного звена иммунитета.

На следующем этапе экспериментов изменение пролиферативной активности лимфоцитов здоровых добровольцев при ФГА стимуляции оценивали в культуре по включению 3Н-тимидина. Уже на первые сутки наблюдался подъем включения метки, индекс стимуляции составлял 14,53. Через 48 часов зарегистрирован резкий подъем включения метки, демонстрируя активность пролиферативных процессов в анализируемой популяции лимфоцитов. Известно, что именно в период от 24 до 48 часов происходит первая волна митозов: включение 3Н-тимидина в ДНК клеток по сравнению с исходными данными резко (в 40 и более раз) увеличивается (Рис.3).

По сравнению с соответствующим временным контролем в культуре ФГА-стимулированных лимфоцитов через 24 часа средняя в популяции фазовая высота снижалась на 10% (р<0,05). Через 2 суток культивирования данный показатель снижался уже на 22,6% (р<0,05).

Т&яср»ш сути» еГАэтот* суя»

• <!.$л*1* ■ 1 5 'ткт ЯЮп&т в >2.Ъп-\гг,

1 2 3

Рис.3. Оценка показателей ФГА стимулированной пролиферативной активности лимфоцитов в культуре. 1 - включение 3Н-тимидина при двухсуточном культивировании (ось абсцисс- часы; ось ординат-ИС); 2 -динамика структуры популяции Т-лимфоцитов по величине фазовой высоты (%) в контроле (без ФГА-стимуляции); 3 - в эксперименте (с ФГА-стимуляцией)

Известно, что через 48 часов ФГА-стимуляции интенсивность синтеза белка достигает максимального уровня, при этом количество РНК в клетке

возрастает в 2 раза по сравнению с количеством, характерным для покоящихся клеток, а скорость трансляции и содержание белка в расчете на одну рибосому — в 10 раз. Увеличение количества полисом и активных рибосом, наблюдавшееся к 24 часу, сохраняется. Процент лимфоцитов с высотой менее 1,5 мкм, составляющий для популяции интактных клеток менее 10%, через 24 и 48 часов культивирования увеличивался в 3 раза и достигал 30% от общего количества клеток.

Таким образом, компьютерные методы клеточного имиджинга (витальной фазово-интерференционной микроскопии и микроэлектрофореза) позволяют осуществлять экспресс-диагностику степени изменения витального морфофункционального состояния лимфоцитов периферической крови в норме и при различных патологических состояниях.

Оценка эффективности лечения больных с аденомиозом на основе использования показателей ядерного полиморфизма лимфоцитов

Мы использовали методы КФМ и МЭФ для анализа морфофункционального состояния различных субпопуляций (CD4+, CD8+) Т-лимфоцитов пациенток с лейомиомой матки, аденомиозом и их сочетанием.

Подсчет FAN показал, что в норме для клеток с фенотипом CD4+ показатель составляет 1,88, а с фенотипом CD8+ - выше - 1,98, т.е. на 5,1% больше, что может свидетельствовать об исходно более высокой функциональной активности цитотоксических клеток.

Таблица 3

Морфометрические показатели лимфоцитов с фенотипом CD4+ и CD8+ в периферической крови обследованных пациентов

Клинические группы Анализируемые параметры

Диаметр, мкм Периметр, мкм Высота, мкм Площадь, мкм2 Объем, мкм3

К CD4+ 6,78±0,65 19,84±2,03 1,86±0,25 28,49±5,09 25,21±4,59

CD8+ 6,44±0,35 > 18,98±1,24 1,79±0,37 26,69±2,90 23,61±4,63

I CD4+ 6,71±0,73 19,70±3,11 1,83±0,24 28,3±6,17 25,08±3,94

CD8+ 6,89±1,08 21,11±2,05 1,65±0,21* 29,85±3,08 22,51±2,05

II CD4+ 7,03±1,94 21,72±2,35 1,73±0,15* 34,52±5,78 29,23±5,11

CD8+ 6,72±0,89 19,35±1,12 1,77±0,17 27,93±4,15 25,44±3,56

III CD4+ 7,82±1,65* 23,27±3,43* 1,69±0,13* 39,62±6,8* 35,82±9,1*

CD8+ 7,12±1,04 22,5±2,77 1,71±0,16 30,29±4,22 29,43±5,72

IV CD4+ 7,15±1,31 22,11±3,84 1,71±0,33* 35,98±6,8* 33,25±4,6*

CD8+ 6,97±1,08 20,11±2,05 1,68±0,16* 30,89±2,6* 26,11±2,05

Примечание: К-контроль,* - р < 0,05 по сравнению с показателями контроля

В группе пациенток с лейомиомой матки (I) параметры CD4+ лимфоцитов соответствовали контрольным значениям, в то время как у С08+клеток по сравнению со средними показателями здоровых добровольцев обнаруживалась тенденция к увеличению диаметра, периметра и площади (р>0,05), достоверно снижалась средняя фазовая высота (на 8,5%). FAN клеток с фенотипом CD4+ составил 1,85, а с фенотипом CD8+ - 2,02.

Морфометрические параметры CD4+ лимфоцитов периферической крови женщин с аденомиозом I—II стадии (II группа) отличались незначительно увеличенными средне-популяционными значениями диаметра, периметра и площади клеток (р>0,05) при достоверном снижении фазовой высоты (на 7,5%, р<0,05). Признаков функциональной активности CD8+ популяции не было выявлено. FAN клеток с фенотипом CD4+ составил 2,05, а с фенотипом CD8+ 1,96.

Для пациенток III группы с аденомиозом III-IV стадии отличительными признаками морфофункционапьного состояния лимфоцитов в популяции хелперов (CD4+) были достоверно увеличенные средние значения диаметра (на 13,3%), периметра (на 14,8%), площади (на 18,1%) и объема (на 29,7%) клеток при снижении фазовой высота (на 10%). В популяции Т-супрессоров/цитотоксических отмечалась тенденция к активации лимфоцитов: были незначительно увеличены значения диаметра, периметра, площади, снижена фазовая высота. FAN клеток с фенотипом CD4+ составил 2,17, а с фенотипом CD8+ 1,99.

В группе пациенток с сочетанием лейомиомы матки и аденомиоза (IV группа) выявлены признаки активации в обеих субпопуляциях. Однако достоверно были изменены только значения средней высоты (снижены на 10%), площади (увеличены на 28,1%) и объема (увеличены на 29,6%) CD4+ лимфоцитов; высоты (снижены на 6,5%) и площади (увеличены на 13,6%) CD8+ лимфоцитов. FAN клеток с фенотипом CD4+ составил 2,01, а с фенотипом CD8+ - 2,0.

В таблице 4 приведены данные анализа электрокинетических показателей лимфоцитов здоровых добровольцев и обследованных больных.

Обобщение полученных результатов показало, что в контрольной группе средняя амплитуда колебаний лимфоцитов в популяции CD4+ составляла 9,21± 1,20 мкм при доле неподвижных клеток - 5,22±1,04%; а в популяции CD8+ - 5,37±1,26 мкм при доле неподвижных клеток - 10,46±3,77. По-видимому, С04+лимфоциты обладают более высокой амплитудой колебаний по сравнению с С08+клетками. Не исключено, что этот феномен связан с особенностями рецепторного репертуара лимфоцитов данной субпопуляции.

У пациенток I группы не зарегистрировано изменений электрокинетических показателей С04+лимфоцитов, в то время как амплитуда С08+клеток увеличивалась практически в 2 раза, процент неподвижных лимфоцитов снижался (в 1,4 раза).

Во II группе выявлено увеличение средней амплитуды колебаний С04+лимфоцитов на 32,8%, а доли неподвижных клеток до 8,47% (в 1,6

раза). Электрокинетические показатели С08+лимфоцитов оставались в пределах значений контрольной группы.

У пациенток III группы в субпопуляции СВ4-позитивных лимфоцитов выявлено достоверное увеличение средней амплитуды колебаний клеток (в 1,9 раза) и снижение процента неподвижных клеток (почти в 2 раза). В субпопуляции CDe+лимфоцитов изменения были менее значительными: средняя амплитуда колебаний по отношению к контролю увеличивалась в 1,6 раза, в 2 раза снижался процент неподвижных клеток.

В IV группе зарегистрировано недостоверное увеличение амплитуды колебаний и CD4+ и СБв+лимфоцитов. Процент неподвижных незначительно снижался в обеих субпопуляциях.

Таблица 4

Электрокинетические показатели лимфоцитов с фенотипом CD4+ и CD8+ в периферической крови обследованных пациентов

Клинические группы Среднее количество клеток в пробе Процент неподвижных клеток Средняя амплитуда колебаний

Контроль CD4+ 85,3±15,2 5,22±1,04 9,21± 1,20

CD8+ 59,5±9,6 10,46±3,77 5,37±1,26

I CD4+ 67,1±11,8 7,38±4,15 8,73±2,15

CD8+ 48,7±9,9 7,35±2,84 10,66±1,15*

II CD4+ 56,2±5,7 8,47±2,33 12,24±2,59

CD8+ 49,7±6,3 9,95±2,14 4,97±1,05

III CD4+ 55,1±9,2 3,86±1,04 17,25±3,41*

CD8+ 44,6±9,1 7,55±2,38 8,41±0,89

IV CD4+ 51,2±7,6 4,62±1,41 12,38±2,75

CD8+ 39,5±9,8 8,33±2,07 10,59±1,06*

Примечание: * - р < 0,05 по сравнению с показателями контроля

Таким образом, является очевидным, что прогрессирования аденомиоза и лейомиомы матки непосредственным образом связано с активацией различных популяций Т-лимфоцитов, что приводит к индукции определенного типа иммунного ответа. У пациенток с аденомиозом выявлены преимущественно морфометрические и электрокинетические признаки активации С04+лимфоцитов: увеличение геометрических (диаметр, периметр, площадь) и снижение оптических (высота) параметров, увеличение показателя функциональной активности ядер; повышение средней амплитуды колебаний и снижение процента неподвижных клеток. Причем эти изменения имеют определенную корреляцию с тяжестью патологического процесса. Для пациенток с лейомиомой матки, напротив, основные изменения касаются субпопуляции Т супрессоров/цитотоксических лимфоцитов. Следовательно, учитывая объективность, оперативность и доступность использованных методов клеточной диагностики, может оказаться целесообразным и экономически оправданным их применение в

процессе мониторирования состояния пациенток с аденомиозом, оценки эффективности проведенного лечения и выявления признаков рецидивирования.

Все обследованные пациентки с аденомиозом получили соответствующее эндохирургическое лечение. Критериями его эффективности считались: устранение клинических симптомов, уменьшение объема матки по данным гинекологического и ультразвукового исследования. Динамическое наблюдение за показателями морфофункционального состояния иммунокомпетентных клеток после оперативного лечения проводили на разных этапах реабилитационных мероприятий - через 3 и 12 месяцев.

На рисунке 4 представлены результаты ретроспективного анализа динамики показателя FAN CD4+ и CD8+ лимфоцитов у 35 пациенток с аденомиозом до лечения и на разных этапах послеоперационного периода: группу А составили 28 пациенток с положительным исходом заболевания, группу В - 7 пациенток с признаками рецидивирования, подтвержденными данными гинекологического и ультразвукового исследования.

-CD4+A--CD4+B • CD8+A-CD8+ В

Рис. 4 Динамика показателя функциональной активности ядер (FAN) лимфоцитов периферической крови больных с аденомиозом (А - пациентки с положительным исходом заболевания; В - с рецидивом аденомиоза). 1-исходные данные до операции; 2-3 месяц наблюдения после операции; 3 -12 месяц наблюдения после операции.

Средняя величина показателя FAN до лечения в группе обследованных пациенток для С04+лимфоцитов составила 2,09, для СВ8+лимфоцитов -1,98. В группе пациенток с положительным исходом через 3 месяца величина FAN CD4+ клеток в обеих группах пациенток колебалась в пределах 1,90 и 1,92, соответственно. Через 12 месяце в подгруппе A FAN CD4+ клеток составил 1,87, а у пациенток с рецидивом - 2,05.

Величина FAN CD8+ лимфоцитов у пациенток как в подгруппе А, так и в подгруппе В оставалась достаточно стабильной на протяжении всего периода наблюдения.

Рисунок 5 иллюстрирует закономерности изменения электрокинетических показателей CD4 и СБв-позитивных лимфоцитов. Исходные значения амплитуды колебаний С04+лимфоцитов у пациенток с аденомиозом составили 16,9 мкм, к 3 месяцу после оперативного лечения амплитуда снизилась до 10,8 и 10,5 мкм в подгруппах с положительным исходом и с рецидивированием аденомиоза, соответственно. На 12 месяц наблюдения в подгруппе А значения средней амплитуды С04+лимфоцитов оставались в диапазоне 10 мкм, а в подгруппе В увеличивались до 13,2 мкм.

Динамика амплитуды колебаний С08+лимфоцитов в течение всего периода наблюдений у пациенток обеих подгрупп оставалась в диапазоне нормальных значений.

5,8

12 3 1 2 3 -С04* А--С04+В ------ СОВ*А------СОв» В

-С№А--СС44В-СОВ* А - СО0+В

1 2 Рис. 5. Динамика средней амплитуды колебаний и процента неподвижных лимфоцитов периферической крови больных с аденомиозом (А — пациентки с положительным исходом заболевания; В - с рецидивом аденомиоза). 1-исходные данные до операции; 2-3 месяц наблюдения после операции; 3 -12 месяц наблюдения после операции.

Изменение процента неподвижных лимфоцитов оказались недостаточно информативными в диагностическом плане. Так, процент неподвижных клеток в СБ4+субпопуляции до лечения составил 3,27, что практически в 2 раза ниже контрольных значений. Ретроспективный анализ этого электрокинетического показатели лимфоцитов выявил, что через 3 месяца у пациенток с положительным исходом процент неподвижных клеток составлял 6,55, а в группе с рецидивом заболевания - 6,03; через 12 месяцев -5,89 и 4,27%, соответственно.

Изменение процента неподвижных клеток в СБв+субпопуляции от исходных 7,95% к 3 месяцу после лечения увеличивался в обеих подгруппах пациенток до 8,03 и 8,18 (подгруппы А и В, соответственно), а к 12 месяцу -до 9,82 и 9,35%, соответственно.

Таким образом, для экспресс-оценки эффективности лечения внутреннего эндометриоза и диагностики рецидива заболевания мы предлагаем использовать морфометрические (показатель функциональной

активности ядра - FAN) и электрокинетические (амплитуда колебаний в переменном электрическом поле) показатели лимфоцитов в периферической крови. При увеличении значений морфометрического показателя FAN на 7% и более и электрокинетического- амплитуды колебаний - на 30% и более диагностируется внутренний эндометриоз.

Необходимость использования для прогнозирования исходов лечения новых информативных и оперативных методов диагностики является совершенно очевидной. При этом важное практическое значение имеют длительность выполнения метода, проведение объективного количественного анализа, оперативность получения данных.

Основываясь на полученных результатах, мы попытались определить значимость анализа морфометрических и электрокинетических показателей лимфоцитов для прогнозирования исхода лечения аденомиоза.

По предлагаемому способу было проспективно обследовано 29 женщин. У 8 женщин были выявлены значения FAN, превышающие норму на 7% и более, а значения амплитуды колебаний - на 30%, диагноз рецидива аденомиоза был подтвержден у 6 из них. У 21 пациентки значения FAN оставались в диапазоне нормы, из них диагноз аденомиоза был установлен у 3 женщин. Следовательно, диагностическая чувствительность метода составила - 75%, диагностическая специфичность - 90%.

ВЫВОДЫ

1. Больные аденомиозом, по сравнению с пациентками с лейомиомой матки, отличаются наличием неблагоприятного преморбидного фона, связанного с высокой частотой перенесенных воспалительных (27,335,5%), сопутствующих экстрагенитальных (81-93%) и наследственных заболеваний (58,1-67,7%), а также отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом. Клинические проявления характеризуются болевым синдромом (болевой индекс 5,4-9,9), нарушением менструального цикла (61,2-97,0%) и репродуктивной функции (бесплодие первичное 16,115,5%; вторичное 9,7-12,1). Выявленные особенности и симптомы наиболее выражены при сочетании аденомиоза и миомы матки.

2. При активации лимфоцитов в условиях эксперимента in vitro происходит перестройка структурно-пространственной организации интерфазного хроматина, особенности и закономерности которой объективно отражают морфометрические и электрокинетические показатели: снижается фазовая высота ядра (на 8-18%), увеличивается процент неподвижных клеток (на 13,5-48,2%), снижается амплитуда их колебаний (на 47,7-52,9%).

3. В качестве биосенсора морфофункционального состояния иммунокомпетентной клетки может служить интерфазный хроматин ядра. Критериями динамики его структуры, плотности упаковки и функционального состояния являются морфометрический индекс функциональной активности ядра (FAN) и электрокинетические показатели (амплитуда колебаний, процент неподвижных лимфоцитов), изменения

которых взаимосвязаны и в совокупности объективно отражают функциональный потенциал клеточного звена иммунитета.

4. Для больных с аденомиозом по сравнению с показателями здоровых добровольцев является характерной активация С04+лимфоцитов (FAN составляет 2,05-2,17 против 1,88; амплитуда колебаний увеличивается в 1,3-1,9 раза); в СБ8+популяции достоверных изменений не выявлено. У пациенток с лейомиомой матки параметры С04+лимфоцитов соответствуют контрольным значениям, однако имеются признаки активации CDe+клеток (FAN 2,02 против 1,98). При сочетании лейомиомы матки и аденомиоза выявлены признаки активации в обеих субпопуляциях: FAN клеток с фенотипом CD4+ составляет 2,01, с фенотипом CD8+ 2,0; амплитуда колебаний увеличена в 1,3 и 2,0 раза, соответственно.

5. Критериями эффективности лечения внутреннего эндометриоза и риска рецидива заболевания служат морфометрические (показатель функциональной активности ядра - FAN) и электрокинетические (амплитуда колебаний в переменном электрическом поле) показатели лимфоцитов периферической крови. При увеличении значений FAN на 7% и более, а амплитуды колебаний - на 30% и более диагностируется внутренний эндометриоз.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для диагностики эндометриоза необходим комплексный подход, включающий применение общеклинических, лабораторных и инструментальных методов. При этом отдельное внимание должно уделяться динамике иммунологических показателей пациенток.

2. Прогрессирование аденомиоза и лейомиомы матки непосредственным образом связано с активацией различных популяций Т-лимфоцитов, что приводит к индукции определенного типа иммунного ответа.

3. Практическое использование современных компьютерных методов имиджинга для мониторинга функциональной активности иммунокомпетентных клеток дает ряд существенных преимуществ перед другими методическими подходами: техническая доступность, минимальная инвазивность, высокая чувствительность, оперативность анализа функционального статуса лимфоцитов, выявление ранних признаков активации лимфоцитов, возможность получения в количественном эквиваленте качественно новой информации, связанной с изменением метаболических процессов в клетке.

4. Для диагностики рецидива аденомиоза из комплекса морфометрических и электрокинетических параметров живых клеток рекомендуется использовать показатель функциональной активности ядер лимфоцитов и амплитуду их колебаний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гаспарян С.А., Василенко И.А., Гаджиева З.Ш. Компьютерная морфометрия клеток крови при эндометриозе. // Материалы Всероссийского конгресса «Амбулаторно-поликлиническая практика - новые горизонты» (Москва, 29 марта - 4 апреля, 2010). - С.129-130.

2. Vasilenko I.A., Tychinsky V.P., Vishenskaya T.V., Metelin V.B., Makarova D.V., Berezina A.B., GadzievaZ.Sh. Visualization of lymphocyte nuclear structure by method of coherent phase-interference microscopy in real time. // Book of abstracts «Innovative Medical Technologies of XXI century» (2431 October 2010, Benidorm, Spain). - P.78-79.

3. Гаспарян С. А., Гаджиева З.Ш. Применение витальной компьютерной морфометрии лимфоцитов в диагностике эндометриоза. // Материалы III всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 13-14 мая 2010. - С.13-15.

4. Метелин В.Б., Артемов Д.В., Макарова Д.В., Рустембекова С.А., Иванюта И.В., Гаджиева З.Ш. Витальная компьютерная морфоденситометрия как новая информационная биотехнология в решении клинико-диагностических задач. // Сб. трудов Второй Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт_Петербург, Россия, 26-28 октября 2011). - 2011. -Т.2. - С.232-234

5. Тычинский В.П., Вышенская Т.В., Терпигорев С.А., Василенко И.А., Метелин В.Б., Гаджиева З.Ш. Исследование активации лимфоцитов методом когерентной фазовой микроскопии в реальном времени. // Вестник РАМН. -2011. - №11. -С.42-48

6. Гаспарян С.А., Василенко И.А., Гаджиева З.Ш. Методы имиджинга лимфоцитов в диагностике эндометриоза» // Проблемы репродукции. - 2012. - Спец. вып. - С.150-151

7. Гаспарян С.А., Василенко И.А., Гаджиева З.Ш. Возможности использования методов имиджинга лимфоцитов в диагностике эндометриоза. // Сб. «Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 18 мая, 2012. - С.25-27.

8. Metelin V.B., Vasilenko I.A., Ignatiev P.S., Artemov D.V., Makarova D.V., Gadzhieva Z.Sh. Possibility of a new technology in the study of mechanisms of cell activation // XI International conference «High medical technologies in XXJ. century» (Benidorm, 20-27.10.2012 Spain) -P.75

9. Metelin V.B., Makarova D.V., Vasilenko I.A., Belyakov V.K., Artemov D.V., Gadzhieva Z.Sh. «Real-time vizualization of living cell nuclei as a new approach in lymphocyte activity estimation» Swiss Russian Health Forum // British Journal of Medicine - 2012. - № - P.

Отпечатано в РИО МГМСУ 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1. Заказ № 371. Тираж 100 экз.

5 39 8

2014066472