Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Изучение клинико-лабораторных показателей при экспериментальном легочном мелиоидозе

На правах рукописи

'JtrOjJ/ ^

Ващанова Ирина Альбертовна

Изучение клинико-лабораторных показателей при экспериментальном легочном мелиоидозе

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика 03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов - 2008

Работа выполнена в ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Яковлев Анатолий Трофимович;

доктор медицинских наук, профессор Алексеев Владимир Валерьевич.

Официальные оппоненты' доктор медицинских наук,

профессор Гладилин Геннадий Павлович;

доктор медицинских наук,

профессор Самойлова Любовь Владимировна.

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Росздрава.

Защита состоится «Д» -с 2008 г. в час. на заседании

диссертационного совета К208.094.01 при ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава» по адресу 410012, Саратов, ул Большая Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава».

Автореферат разослан « /А> « Р? » 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Бородулин В.Б.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Мелиоидоз занимает особое место в номенклатуре инфекционных заболеваний в силу своей способности вызывать у людей и животных тяжелое заболевание, характеризующееся септицемией с множественными некротическими поражениями внутренних органов, трудно поддающееся антибактериальной терапии (Беляков В.Д. с соавт., 1990; Тихонов Н.Г, 1995, Propost А, Vigier М., 1960; Anuntagool A. et al., 2000; Brett P.J., Woods D.E, 2000; Fritz D.L. et al., 2000; Reckseidler S L. et.al., 2001; Atkins T. et al., 2002; Miyagy K., Saito A, 2003; O'Brien G.R, et al, 2003).

Среди многообразия клинических проявлений мелиоидоза, легочные формы этого заболевания занимают особое место, поскольку характеризуются, как правило, острым началом, быстрым развитием патологических явлений и высокой смертностью. Кроме этого, больные легочной формой мелиоидоза представляют эпидемическую опасность, так как выделяют инфект в окружающую среду (Ковалев Г.К ,1971; Кудрявцев А.Е., 1986).

Легочная форма мелиоидоза встречается с такой же частотой, как и другие формы болезни, а заражение происходит воздушно-капельным путем от больных людей и животных (Кудрявцев А.Е., 1986, Stanton AT., Fletcher W., 1932). Однако исследователями подчеркивается, что независимо от путей заражения легочная патология при мелиоидозе является одним из ведущих клинических признаков (BachetR, 1985; Leelarasamee A., Bovornkitty S., 1989).

На территории Российской Федерации мелиоидоз не регистрировался, однако постоянно расширяющиеся торгово-экономические связи с эндемичными по данному заболеванию странами создают предпосылки для появления в нашей стране этой опасной инфекции.

При мелиоидозе в патологический процесс вовлекаются различные системы организма, дыхательная, мочеполовая, желудочно-кишечный тракт, опорно-двигательный аппарат, система кровообращения и т.д. (Тихонов Н.Г., 1995; Кивокурцева Т.Ю., 2002). Есть основания считать, что клинико-лабораторные исследования при мелиоидозе могут иметь не только

диагностическое, но и прогностическое значение при проведении лечебных мероприятий и их коррекции в зависимости от тяжести инфекционного процесса.

Лабораторные показатели позволяют также выявить осложнения, к которым приводит неправильно выбранная тактика лечения. Учитывая широкую вариабельность мелиоидоза по клиническим формам, устойчивость возбудителя к широкому спектру антибактериальных препаратов, представляется целесообразным изучение биохимических процессов, происходящих в макроорганизме при мелиоидозной инфекции, и динамики клинико-лабораторных показателей.

С учетом вышеизложенного, а также принимая во внимание отсутствие научно обоснованных схем клинической лабораторной диагностики, лечения и специфической профилактики, которые должны базироваться на знании механизмов развития мелиоидоза, представляется актуальным проведение научных исследований, которые позволяют выработать меры защитного характера.

Учитывая немногочисленный фактический материал по ютинико-лабораторным данным, нами была сделана попытка изучения изменений гематологических и биохимических параметров крови при различных клинических вариантах экспериментального мелиоидоза.

Цель работы - выявить изменения клинико-лабораторных показателей крови при экспериментальном легочном мелиоидозе, вызванном штаммами с различной вирулентностью.

Задачи исследования:

1. Осуществить моделирование легочного мелиоидоза с различными клиническими вариантами.

2. Провести гематологические исследования при экспериментальном легочном мелиоидозе

3. Провести изучение биохимических показателей крови экспериментальных животных с различной клинической формой легочного мелиоидоза.

4. Провести сравнительный анализ клинико-лабораторных показателей крови инфицированных животных при экспериментальном легочном мелиоидозе с патоморфологическими данными

5. Разработать алгоритм патологических сдвигов клинико-лабораторных показателей при легочном мелиоидозе.

Научная новизна исследования. Впервые проведен развернутый анализ крови экспериментальных животных, больных мелиоидозом с различным клиническим течением. Установлено, что при экспериментальной острой форме мелиоидоза наблюдались эритроцитопения, высокий лейкоцитоз с угнетением клеток иммунного ответа лимфоцитов, моноцитов и базофилов. При легком течении легочного мелиоидоза гематологические показатели находились в пределах физиологических значений.

Впервые изучены биохимические изменения крови в динамике у экпериментальных животных при легочной форме мелиоидоза. При остром процессе отмечены значительные изменения белкового, азотистого, углеводного обменов и активности ферментов (аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы и холинэстеразы), увеличение билирубина и тимоловой пробы; наблюдался значительный сдвиг электролитного обмена. При легком течении легочного мелиоидоза биохимические показатели варьировали в пределах референтных величин

У животных, зараженных аэрогенно штаммом В.рзеиёота11е1 100 в дозе 5х102ж.м.кл./мл и антигенным вариантом В.рБеис1ота11е1100-16-1(Аг8") в дозе 1,5><104 ж.м.кл/мл, фиксировались изменения со стороны газового состава и кислотно-щелочного равновесия крови, что свидетельствовало о возникновении у больных животных респираторного и метаболического ацидоза. У экспериментальных животных, зараженных атипичным штаммом

В pseudomallei 100-16-1(Аг8") АД=1,5х102 ж.м.кл/мл, показатели газового состава и кислотно-щелочного равновесия изменялись незначительно.

Впервые проведен сравнительный анализ полученных клинико-лабораторных показателей с патоморфологическими данными при различных формах аэрогенного мелиоидоза, который показал соответствие нарушений гомеостаза организма с патоморфологическими изменениями.

Впервые разработан алгоритм патологических сдвигов на основании клинико-лабораторных показателей при различных формах легочного мелиоидоза При обследовании больного мелиоидозом рекомендуется назначать клинико-лабораторные исследования на следующие диагностически-значимые параметры: общий анализ крови, газовый состав, кислотно-щелочное состояние, электролиты крови, концентрацию общего белка, креатинина, мочевины, билирубина, исследование осадочных проб, активность следующих ферментов' аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, холинэстеразы, лактатдегидрогеназы (ACT, AJIT, ЩФ, ХЭ, ЛДГ). Применение предлагаемого алгоритма эффективно для оценки тяжести течения, прогноза исхода инфекционного процесса и коррекции патогенетической терапии Практическая значимость работы Разработанный алгоритм патологических сдвигов на основании клинико-лабораторных показателей при различных клинических вариантах легочного мелиоидоза может быть использован в специализированных лабораториях и в клиниках для подтверждения клинического диагноза мелиоидоза и оценки тяжести течения заболевания, мониторинга лечения и прогноза исхода заболевания наряду с бактериологическими и иммунологическими методами.

Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, используются в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте при изучении экспериментального мелиоидоза.

Материалы диссертации включены в лекционный материал, предназначенный для врачей, биологов и лаборантов учреждений санитарно-

эпидемиологического профиля и клинических диагностических лабораторий при проведении первичной специализации и курсов усовершенствования по вопросам специфической индикации, лабораторной диагностики особо опасных заболеваний, санитарной охраны территории и противодействия биотерроризму при ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

На основании полученных данных составлены «Методические рекомендации по клинико-лабораторной диагностике мелиоидоза» (Утверждены директором Волгоградского научно-исследовательского противочумного института, протокол заседания Ученого совета № 9 от 21. 12. 2005 г.)

Основные положения, которые выносятся на защиту

1. Гематологические исследования экспериментальных животных с различными клиническими вариантами экспериментального легочного мелиоидоза позволяют определить состояние кроветворной системы макроорганизма.

2. Изменение биохимических показателей макроорганизма свидетельствует о степени тяжести поражения и нарушения функциональной деятельности отдельных органов и систем.

3. Степень гематологических и биохимических изменений соответствует тяжести патоморфологических проявлений в органах инфицированных животных. Применение предлагаемого алгоритма патологических сдвигов при клинико-лабораторном обследовании эффективно для оценки тяжести течения, прогноза исхода инфекционного процесса и коррекции патогенетической терапии при мелиоидозе.

Публикации. По теме диссертации в печати опубликовано 7 научных работ, в которых отражены основные положения диссертации.

Объем и структура работы. Работа изложена на 132 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 3 рисунками, 9 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов Список используемой литературы включает 132 работы отечественных и 68 работ иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В экспериментах использовали следующие штаммы возбудителя мелиоидоза:

1. Высоковирулентный для лабораторных животных штамм B.pseudomallei 100. Получен из коллекционного центра ВолгНИПЧИ ЛД50 при подкожном заражении этих животных - 10 ж.м.кл.

2, Штамм B.pseudomallei 100-16-1 - дефектный по продукции антигенного комплекса Аг8, полученный методом селекции из штамма B.pseudomallei 100 и практически авирулентный для указанных выше животных при подкожном заражении (авторская коллекция H.H. Пивня 1985г.).

В соответствии с экспериментальными задачами, были использованы 500 морских свинок массой 250 г, полученных из питомника Волгоградского НИПЧИ.

Первую группу экспериментальных животных заражали аэрогенно культурой B.pseudomallei 100 дозой 5*102 ж.м.кл/мл и В pseudomallei 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5><104м.кл./мл, а динамику патоморфологических изменений, гематологических и биохимических показателей крови оценивали на 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9-е сутки после заражения.

Вторую группу экспериментальных животных, с целью получения легкого течения легочного мелиоидоза, заражали аэрозолем В pseudomallei 100-16-1 (Аг8") в дозе 1,5х 102 м.кл./мл. Наблюдение за этой группой велось на 1, 3, 5, 7, 14, 21, 35, 38, 56, 85-е сутки. Все пробы обеззараживали

добавлением мертиолята натрия (1:10000) с последующим контрольным высевом на стерильность (Санитарные правила. Госсанэпиднадзор России, 1994).

Лабораторное исследование включало в себя клинический анализ показателей периферической крови больных животных, биохимический анализ крови (определение активности аминотрансфераз, билирубина, тимоловой пробы, общего белка, мочевины и креатинина, щелочной фосфатазы, холинэстеразы, электролитов, исследование газового состава и КЩС).

Измерения гематологических показателей (гемоглобин, эритроциты, лейкоциты, лейкоцитарная формула) производили на основании унифицированных методов (Медведев В В., Волчек Ю.З., 1995, Бойдун JI.B., Логинов А.В., 1996, Назаренко Г И., 1997; Карпищенко А И., 1998, 1999; Данилова Л.А., 2000, Лобзина Ю.В, 2001).

Измерения биохимических показателей крови производили на программируемых фотометрах «Microlab-200» и «Vitalab Eclipse» (Merck, Германия) после постановки реакции соответствующими диагностическими тест-наборами фирм «Lachema» Чехия) и «Ольвекс» (СПб) (Меньшиков В.В, 1982; Алексеев В.В. с соавт., 1992; Назаренко Г.И., 1997; Тиц H У., 1997; Колгаров И.Ф. с соавт., 1999; Маршал В.Дж., 2000, Данилова Л.А., 2003).

Исследование газового состава крови экспериментальных животных и КЩС определяли на автоматизированных анализаторах газового состава крови ABL 615/625 «Radiometer» (Дания).

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью компьютерной программы Microsoft Office Exel 2003 г.

Результаты исследований и их обсуждение

Аспирационный путь заражения мелиоидозом является одним из наиболее вероятных, вследствие чего часто развивается легочная форма инфекции. Больные с легочной формой мелиоидоза составляют большую часть среди людей, заразившихся в естественных условиях, их появление возможно

и в результате аварийных ситуаций в специализированных микробиологических учреждениях.

Указанные обстоятельства объясняют необходимость определения информативных параметров клинической лабораторной диагностики с целью установления тяжести заболевания по нарушениям параметров биохимических и гематологических процессов, происходящих в макроорганизме.

У морских свинок, зараженных В.р5еиёота1Ы 100 АД=5 хЮ2 ж.м.кл./мл и В.р5еис1ота11е1 100-16-1 (Аг8')АД = 1,5х104 ж.м.кл./мл, развивалась острая форма легочного мелиоидоза. Вскрытие животных в различные сроки после заражения показало, что первые макроизменения во внутренних органах обнаруживались уже через 24 часа: незначительное увеличение всех групп лимфоузлов, кровенаполнение печени и селезенки. На 2-е сутки в легких наблюдали образование множественных узелков с серозным содержимым размером 3-5 мм, гипертрофию лимфоузлов, увеличение в 1,5 - 2 раза печени и селезенки. Животные были малоподвижны, у всех особей - начальная стадия геморрагического ринита и конъюнктивита. Через трое суток в легких наблюдали развитие лобарной и долевой пневмонии с некротическими очагами. На 4 -5-е сутки отмечены усиление воспалительных и деструктивных процессов в легких и начало падежа животных. Гибель наступала от гнойной бронхопневмонии, а инфекционный процесс протекал по типу септицемии. Средняя продолжительность жизни составила 6-10 дней, летальность - 100%.

При аэрогенном заражении животных антигенным вариантом возбудителя мелиоидоза В рзеиск>та11е1 100-16-1 (Аг8") в дозе 1,5х104 ж.м.кл./мл и 1,5*102 ж.м.кл./мл у животных наблюдали два клинических варианта легочного мелиоидоза - острую форму и легкое течение заболевания. Острый вариант при аэрогенном заражении антигенным вариантом дозой 1,5x104 ж.м.кл./мл имел в целом, те же признаки, что и при заражении исходным штаммом В.рзеис1ота11е1100. Через 3-4 суток отмечено нарастание воспалительных явлений в легких - образование мелких множественных гнойных узлов на поверхности и в толще ткани, а в

дальнейшем (5-7 сут) - слияние их в обширные некротические очаги, вплоть до образования гнойной сливной пневмонии и их гибель через 9-13 дней после инфицирования. Процесс протекал по типу септицемии. Летальность достигала 80 - 90%

Второй вариант характеризовался легким течением с благоприятным исходом при заражении В.рзеис1ота11е1 100-16-1 (Аг8") АД = 1,5хЮ2 ж.м.кл /мл. Признаки начальной стадии мелиоидозной пневмонии и регионарного лимфаденита появлялись на 7-е сутки. Активное развитие пневмонии с образованием единичных или множественных гнойных узелков, преимущественно в верхних долях легких, происходило на 14 - 21-е сутки.

В последующие дни наблюдения отмечали плеврит, сращивание листков плевры. Отмечалось образование в печени и селезенке единичных гнойно-некротических узелков. Формирование в легких осумкованных абсцессов с гнойно-серозным содержимым диаметром до 5 мм происходило на 28 - 30-й день заболевания. По истечении 60 дней инфекционного процесса у большей части животных размеры абсцессов достигали 10 мм, отмечалось перерождение легочной ткани. Подобная патологоанатомическая картина сохранялась у животных до конца срока наблюдения (85 сут).

Таким образом, у животных, зараженных типичной культурой, возникала острая форма легочного мелиоидоза, приводящая через 5-7 дней к 100%-й гибели животных, а у морских свинок, инфицированных штаммом В.р5еи(1ота11е1 100-16-1(Аг8") в зависимости от дозы, наблюдали как острую форму мелиоидоза, так и легкое течение инфекции, которое заканчивалось выздоровлением 60 - 70% особей.

Гематологические показатели помогают выявить заболевания крови и отражают степень воспалительного процесса.

При аэрогенном заражении морских свинок взвесями культур В.рБеи<1отаМ 100 АД=5*102 ж м.кл./мл и В.р5еиёота11е1 100-16-1 (Аг8")АД = =1,5><104 ж.м.кл./мл отмечена тенденция к снижению количества эритроцитов с первых дней до конца срока наблюдения (от 3,8±0,17 до 3,3±0,22х1012 при

К=4,3±0,13х1012)(р<0,05). Эритроцитопения, возможно, была обусловлена выбросом в кровь макроорганизма токсинов в начале инфекционного процесса, нарушением эритроцитопоэза, разрушением эритроцитов, возникновением печеночной и почечной недостаточности, т.е. нарушением процесса утилизации. В то же время у морских свинок, зараженных штаммом В.р5еис1ота11е1 100-16-1 (Аг8") АД = 1,5хЮ2 ж.м.кл./мл, динамика изменения количества эритроцитов колебалась в пределах физиологически значимых величин (4,0±0,22 - 4,2±0,18х1012).

Изучение лейкоцитарной картины крови морских свинок, инфицированных В.рБеискипаМ 100 АД=5хЮ2ж.м.к./мл и 100-16-1 (Аг8") АД=1,5хЮ4 ж.м.кл./мл, дало информацию о ходе течения клинических проявлений в разные сроки. Количество лейкоцитов крови у экспериментальных животных, зараженных этими возбудителями, увеличивалось уже начиная со 2-го дня после заражения и к 13 суткам достигало высоких величин (19,2±0,31хЮ9 при К=9,8±0,54хЮ9)(р<0,05), что отражало степень остроты воспалительного процесса. Изменялась также морфология нейтрофилов: возникали клетки с дегрануляцией и вакуолизацией.

У морских свинок, зараженных В рзеис1ота11е1 100-16-1 (Аг8") АД =1,5х х 102 ж.м кл./мл, динамика изменения количества лейкоцитов в крови была без изменений и находилась в пределах физиологических показателей (от 8,8±0,07 до 9,3±0,22х109 при Н=9,8±0,54хЮ9).

Количество лимфоцитов увеличивалось в первые дни после заражения независимо от штамма микроорганизма, что, вероятно, связано с включением иммунных резервов макроорганизма в ответ на введение инфекта. У морских свинок, зараженных ВрБеи(1ота11е1 100 АД=5хЮ2 ж.м к/мл и В.рзеи<1ота11е{ 100-16-1 (Аг8") АД = 1,5х104 ж.м.кл./мл, концентрация лимфоцитов снижалась на 10-е сутки (до 32,7±1,09% при Ы=44,8±0,68%)(р<0,05), а у животных, зараженных В.р5еис1ота11е1 100-16-1 (Аг8") АД=1,5хЮ2 ж.м.кл./мл, количество лимфоцитов держалось на высоком уровне до 10-го дня наблюдения (76,0±2,87% при К=44,8±0,68%)(р<0,05).

В динамике показателей сегментоядерных нейтрофилов на 3-й сутки наблюдалось повышение их числа (от 44,±0,94 до 63,7±0,98% при Н=36,8±0,59%)(р<0,05), которое держалось на сравнительно высоком уровне до конца наблюдения у морских свинок, зараженных В.рзеис1ота1Ы 100 АД=5хЮ2ж.м.к./мл и В рвеисЬтаМ 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5*104 ж.м.кл /мл.

При патоморфологическом исследовании отмечалось соответствие с гематологическими данными. Выявляли полнокровие селезенки и диффузную инфильтрацию красной пульпы сегментоядерными лейкоцитами. В легких альвеолы были заполнены сегментоядерными нейтрофилами.

Штамм В.р5еш1ота11е1 100-16-1(Аг8') в дозе 1,5* 102 жмкл./мл, напротив, приводил к снижению концентрации сегментоядерных нейтрофилов на 3-й день (от 11,0±3,68% до 7,0=2,05% при К=36;8±0,59%)(р<0,05), и этот показатель приходил к норме физиологических величин после 15-го дня

Количество базофильных лейкоцитов при заражении В.р5еис1ота11е1 100 АД=5хЮ2 ж.м.к./мл и штаммом 100-16-1 (Аг8") в высоких дозах снижалось (0,33±0,27%, при Ы=0,8±0,15%)(р<0,05), что, вероятно, связано с развитием патологических процессов в органах иммунной системы, тогда как у морских свинок, зараженных штаммом 100-16-1(Аг8") в низких дозах, уровень базофилов колебался в физиологических пределах (от 0,7±0,27% до 1,0±0,00% при N=0^0,15%), что дало основание для предположения о том, что штамм В р$еис1ота11е1 100-16-1(Аг8") в низких аспирационных дозах не подавляет лейкопоэз.

Изменения концентрации моноцитов и эозинофилов при экспериментальном мелиоидозе, вызванном заражением различными штаммами, были сходными и характеризовались низким уровнем этих элементов крови, уровень моноцитов был низок (от 6,0±0,47% до 2,3±0,27% при К=8,8±0,49%)(р<0,05), что было вызвано, вероятно, присутствующими агрессивными компонентами возбудителя В.рзеи(1ота11е^ При заражении В.рзеисЗота11е1 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5хЮ2 ж.мкл./мл организм морских свинок после краткого периода угнетения восстанавливал свои основные

функции, и, по всей вероятности, с 10-го дня начиналась стимуляция моноцитопоэза (от 9,3±0,54% до 18,5±0,35% при №=8,8±0,49%)(р<0,05), т е. макроорганизм вновь активизировал свои защитные функции.

Полученные результаты позволяют предположить, что клетками лейкоцитов - лимфоцитами, моноцитами, базофилами - обеспечивался защитный механизм организма, т. е. клеточный иммунитет.

Таким образом, при аэрогенном заражении типичным штаммом возбудителя мелиоидоза и штаммом 100-16-1 (Аг8") в высоких концентрациях отмечалась тенденция угнетения эритропоэза, которая, возможно, обусловлена воздействием токсинов микроорганизма и продуктов его метаболизма.

В то же время у животных, зараженных взвесью штамма 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5><102 ж.м.кл./мл, нарушения со стороны гематологических показателей были незначительны или при первоначальном изменении быстро восстанавливались до физиологических величин.

При исследовании биохимических показателей крови у экспериментальных животных, зараженных В.рзеи(1о1па1Ы 100 АД=5><102 ж.м.к./мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5хЮ4 ж.м.кл./мл, регистрировалось снижение концентрации белка на 1-е сутки (39,7±0,58г/л, при ^45,6±1,83г/л) (р<0,05), которое вероятно можно рассматривать как признак подавления метаболических процессов в организме, и затем возникновение некротических процессов в паренхиме печени при мелиоидозе, как и при других тяжелых инфекционных заболеваниях.

После заражения морских свинок штаммом В.рзеиёота11е1 100-16-1(Аг8") дозой 1,5*102 ж.м.кл./мл концентрация белка в крови оставалась в пределах физиологических норм. Незначительное повышение происходило на 5 - 7-е сутки (49,7±0,58г/л при Ы=45,6±1,83г/л) (р<0,05), по всей вероятности, как защитная реакция макроорганизма на введение инфекта, за счет повышения синтеза альбумина и различных классов иммуноглобулинов (табл. 1).

Заражение животных В.р5еис1ота1Ы 100 АД=5х102 ж.м.к./мл и штаммом 100-16-1(Аг8") дозой 1,5Х104 ж.м.кл./мл приводило к резкому нарушению азотистого обмена, прежде всего двух основных его параметров - креатинина и мочевины.

Показатели креатинина превышали норму уже на 2-е сутки, максимальные величины определяли на 5 - 7-е сутки (158,5±5,28 мкмоль/л при Н=67,8±6,59 мкмоль/л) (р<0,05), и держались на высоких уровнях до конца наблюдения. Устойчивое повышение уровня креатинина в крови шло параллельно с возрастанием концентрации мочевины (от 4,7±0,21 до 10,97±0,71 ммоль/л при №=2,9±0,52 ммоль/л) (р<0,05) и указывало на нарушение функции почечной фильтрации и реабсорбции, возможное поражение паренхимы почек, т. е. наступала выраженная интоксикация организма продуктами нарушенного азотистого обмена (табл.1).

Таблица 1

Показатели белкового и азотистого обменов при экспериментальном мелиоидозе

Параметры КГ Штамм В рвеийо-шяПе! Время наблюдения, сут, \: гп

1 2 3 5 7 10 13/15 20 35

Общин белок, г/л 45,641,83 100 39,740,58 42.fctO.91 55,542,11 40,842,12 61,940,62 *# 39,540,51 30,840,42 *# - -

100-16-1АгГ ина1 45,240,79 46Д41Д) 47,840,79 48,440,80 49,740,58 44,041,20 43,241,49 43,241,90 46,2041,90

Креатинин, мкмоль/л 67,846,59 100 60,543,31 121,845,2 140,340,78 143,245,66 158.545Д8 160,540,85 *# 184,847,62 - -

100-1б-1Аг8 62,543,25 '62,243,18 62,942,78 64,542,78 65,441,35 61,443,94 60,143,29 59,043,4» 57,544,72

Мочевина, ммоль/л 2,9=0,52 100 2.2340Д1 2,540,16 3,740,17 *# 4,740,21 7,0740,45 9,2040,09 10,9740,71 >* -

100.16.lArS 1^*10' 2,534Д,45 2,840,45 2,240,21 2,54А,ЗЭ 1,840,09 1,7К|,20 1,7440,12 1,70«0,Л 1,5540,18

Примечания:

* - статистически достоверные различия с показателями КГ (р< 0,05);

# - статистически достоверные различия с показателями 2-й группы (р<0,05); (-) - отсутствие результата.

В этот период патоморфологическими данными показано, что происходила дессиминация микробов в органах с одновременным началом элиминации возбудителя и бактериемии.

В группе экспериментальных животных, зараженных B.pseudomallei 100-16-1(Аг8") дозой 1,5 х 102 ж.м.кл./мл, клинико-лабораторные изменения со стороны белкового и азотистого обменов были незначительными и колебались в физиологических пределах (табл.1). Клинически инфекционный процесс протекал в легкой форме. В этот период бактериемию определяли у единичных животных на 5-е сутки.

В опытах на морских свинках, инфицированных B.pseudomallei 100 АД=5*102 ж.м.к./мл и штаммом 100-16-1(Аг8") дозой 1,5*104 жм.кл./мл, установлено повышение глюкозы уже на 2 - 3-й сутки после заражения (от 8,0±0,68 до 17,7±0,34 ммоль/л при N=4,9±0,52 ммоль/л) (р<0,05). Высокий уровень глюкозы держался 10 суток, а затем наблюдалось ее снижение. В то же время у морских свинок, зараженных B.pseudomallei 100-16-1 (Аг8") дозой 1,5х 102 ж.м.кл./мл, уровень глюкозы крови оставался в пределах нормальных физиологических показателей (от 4,0±0,05 до 4,7±0,03 ммоль/л при N=4,9±0,52 ммоль/л). Повышение концентрации глюкозы в крови у морских свинок первой группы вероятно связано с поражением функции поджелудочной железы.

У морских свинок, зараженных B.pseudomallei 100 АД=5х102 ж.м.кл /мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в концентрации 1,5*104 ж.м.кл/мл, происходили значительные нарушения активности ферментов. У основных ферментов, таких как аспартатаминотрансфераза (ACT), аланинаминотрансфераза (AJ1T), лактатдегидрогеназа (ЛДГ), участвующих в обмене аминокислот и углеводов, энзимная активность повышалась на 2 - 3-й сутки после инфицирования и держалась весь период наблюдения (ACT: от 0,33±0,02 до 1,69±0,16 мккат/л при N=0,26±0,07 мккат/л, АЛТ- от 0,37±0,01 до 1,09±0,29 мккат/л при N=0,22±0,03 мккат/л, ЛДГ: от 92,8±3,53 до 675,7±44,0 Ед/л при N=75,4±l,82 Ед/л) (р<0,05). Так как эти ферменты в норме содержатся в мышцах, сердце и печени, то увеличение их концентрации в крови свидетельствовало о некрозе и поражении тканей внутренних органов микроорганизмами (табл.2).

Таблица 2

Изучение активности ферментов крови, билирубина и тимоловой пробы

при экспериментальном легочном мелиоидозе

Параметры КГ Штамм В. pseudo-mallei Время наблюдения, cyr.Xlm

1 2 3 5 7 10 13-15 20 35

Щелочная фосфатага, tx.i, 50,513,83 100 49,614,26 S6.7J6JS 103,317,5« *# 151,2125,18 22«, 414,67 *# 298,4127,95 149,314,6 *# - -

100-16-1 Arffl^xlO1 51,714,20 52,714,25 53,914,09 57,314,9 50Д11.97 45,611,82 45,211,54 47,211,82 49,310,42

Холин-эстераэа, ('.v.l. 31,411,79 100 35,712,03 48,1±2,72 61Д14.33 •Я 77,113,49 •и 38,012,95 29,610,98 9,410,71 •Я - -

100-16-1 АгИ.гхЮ1 30,711,44 31,1±0,87 32,010,73 32,211,04 31,110,64 30,410,91 28Д11.19 27,911,37 29,311,17

Би.тр)бни, мкмоль/л, 2,911,08 100 2,910,35 6,6±0J1 13ДЮ.54 *# 15,010,45 5ДЮД6 3,810,12 3,2310,35 - -

100-16-1 ArSl^xlO2 3д«,83 3,2Ю,78 4,710,12 5,0310,14 • 5,0Ю,19 4.6ЮД6 4,51(1,24 4,7ЙД6 4,71032

Тимоловая проба, ед., 1,610,48 100 1,510,19 1,8Ю,07 2,10Ю,17 3,610,11 5JMJ1 6,810,14 *# 11,3U),43 - -

100-16-1 АГ8"1^«10! 1.510Д1 1.9ЮД5 1.9ШД6 2.07ЮДЗ 1,410,07 1,410,12 1,310,05 1,410,14 1,6±П,11

Аспартатами нотрамсфераз а, мккат/л, 0,2610,07 100 0,1410,01 0Д6Ю,02 0,3310,02 0,5010,04 0,7510,05 0,9710,03 •и 1,6910,16 - -

100-16-1 ArnjxlO1 0ДЗ±0,01 0Д7Ю.02 одэюде 0,3310,04 0,3310,02 ОДОЮ,01 0,1810,03 0,16Ю,02 0,1410,01

Аланнна-чино трансфераза. мккат/л, 0,22Ю,03 100 ОДОЮ,01 0Д5Ю,02 0,3710,01 0,6110,05 0,8310,04 1,0710,03 1.09ЮД9 •п -

100-16-1 ArH^xlO2 ОД5Ю.02 ОД7Ю.01 0,32Ю,02 0,3610,04 0,3510,02 0,1810,02 0,1410,02 0,1610,02 0,1510,01

Примечания.

* - статистически достоверные различия с показателями КГ (р< 0,05);

# - статистически достоверные различия с показателями 2-й группы (р<0,05); (- ) - отсутствие результата.

Из данных табл. 2 видно, что при аэрогенном заражении экспериментальных животных штаммом B.pseudomallei 100-16-1(Аг8") в концентрации 1,5х 102 ж.м.кл./мл активность ферментов крови (ACT, AJIT, ЩФ, ХЭ) оставалась в пределах нормы.

Полученные клинико-лабораторные показатели полностью соответствуют патоморфологическим у данной группы животных. Изменения в печени в виде слабо выраженного полнокровия, единичных внутридольковых инфильтратов, состоявших из макрофагов, лимфоидных клеток и нейтрофилов, носили однотипный характер.

Параметры активности холинэстеразы (ХЭ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) у животных первой группы повысились на 2-е сутки (ХЭ: от 48,1±2,72 до 77,1±3,49 Ед/л при N=31,4+1,79 Ед/л, ЩФ: от 103,3±7,56 до 298,4±27,95 Ед/л при Ы=50,5±3,83 Ед/л) (р<0,05), что возможно указывало на поражение паренхимы и возникновение застойных процессов в печени. В группе экспериментальных животных, инфицированных В.рБеи<}ота11еП00-16-1(Аг8~) в концентрации 1,5х102ж.м.кл./мл изменения параметров активности ХЭ и ЩФ не наблюдались.

Показатели ТП повышались уже на 5-е сутки (от 3,6±0,31 до 11,3±0,43 ед. при К=1,6±0,48 ед.) (р<0,05) и держались на высоком уровне до конца наблюдения. Динамика повышения активности ТП была плавная, и такая кривая в начальном периоде болезни прямо коррелировала со специфическим иммунным ответом макроорганизма на внедрение возбудителя инфекционной болезни, т е синтезом иммуноглобулинов класса М (Меньшиков В.В., 1987). В наших опытах показатели тимоловой пробы коррелировали с данными динамики лимфоцитов Дальнейшее стабильное повышенное ТП говорило о тяжелом органическом поражении печеночных клеток.

В первой группе морских свинок важным объективным признаком поражения печени являлось увеличение содержания общего билирубина в крови: билирубин повышался на 2-е сутки, достигал максимума на 5-е сутки (от 6,6±0,31 до 15,0±0,45 мкмоль/л при N=2,9+1,08 мкмоль/л) (р<0,05). Повышение билирубина связано, вероятно, с деструктивно-дистрофическими изменениями паренхимы печени, инфильтрацией в строме селезенки лейкоцитами и распадом эритроцитов (см.табл. 2). В группе животных, зараженных В рзеиёотаМ 100-1б-1(Аг8") в дозе 1,5><102 ж.м.кл/мл, концентрация билирубина менялась в сторону повышения с максимальными показателями с 3-х по 7-е сутки, в последующие сроки наблюдения уровень билирубина держался несколько выше физиологических показателей. Аналогичные изменения отмечены и в показателях ТП, что является благоприятным прогнозом исхода инфекционного процесса.

У морских свинок, зараженных В.рзеис1ота11е1100 АД=5х102 ж.м.к./мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5х104 жм.кл./мл, уровень мочевой кислоты увеличивался на 7-е сутки (от 373,1±14,21 до 534,0±53,02 при N=268,1 ±49,6 мкмоль/л) (р<0,05), что, вероятно, связано с усилением распада клеток, нарушением выделения мочевой кислоты с мочой и изменением эндокринной регуляции обмена пуриновых оснований - вторичная гиперурикемия

В то же время у экспериментальных животных при легком течении мелиоидоза концентрация мочевой кислоты в крови колебалась в незначительных пределах (от 215,5±14,03 до 229,б±22,32 при Ы=268,1±49,6 мкмоль/л), тем самым исключалось нарушение пуринового обмена и функции деятельности почек.

В организме морских свинок, зараженных В рБеш1ота11е1 100 АД=5*102 ж.м.к./мл и штаммом ВрвеиёотаИе! 100-16-1(Аг8") в концентрации 1,5хЮ4 ж.м.кл./мл, наблюдались значительные сдвиги электролитного обмена.

Концентрация ионов калия в плазме крови морских свинок первой группы повышалась резко уже на 2-е сутки. Острая гиперкалиемия наступала, вероятно, как результат острого инфекционного шока, снижения экскреции К+ почками, начального этапа почечной недостаточности и нарушения белкового обмена.

Уровень содержания ионов натрия в плазме крови морских свинок, зараженных вирулентным штаммом, повышался незначительно (140,0±0,21 ммоль/л при N=132,6±0,78 ммоль/л), что было связано с задержкой обмена ионов Ыа+ через почки в связи с нарушением их функции.

Содержание ионов магния в плазме морских свинок, зараженных В.рзеис1ота11е1 100 АД=5х102 ж.м.к./мл и штаммом В.рзеис1отаНе1 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5x104 ж м.кл./мл, увеличивалось на 5 - 7-е сутки (от 2,90±0,17 до 4,30±0,10 ммоль/л при Т<1-1,5±0,06 ммоль/л)(р<0,05),что приводило, возможно, к нарушению дыхательной функции за счет угнетения дыхательного центра и блокировки проводящей системы сердца.

В экспериментальных условиях на модели морских свинок показано, что при заражении их взвесью культур B.pseudomallei 100 АД=5><102 ж.м к./мл и штаммом B.pseudomallei 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5><104 ж.м кл./мл происходили существенные изменения биохимических процессов в организме экспериментальных животных. Это нарушения белкового, азотистого, углеводного обменов, ферментной системы, водно-солевого баланса. У морских свинок, зараженных штаммом B.pseudomallei 100-16-1 (Аг8~) в концентрации 1,5x102 жм.кл./мл биохимические показатели и картина крови существенно не отличались от показателей в контрольной группе лабораторных животных. Таким образом, вышеизложенные данные вполне могут быть использованы для коррекции тактики патогенетических и специфических лечебных мероприятий при мелиоидозе, в частности включения в схему лечения метода гемодиализа с целью освобождения из инфицированного организма продуктов деградации и токсинов.

В опытах с использованием вирулентного штамма B.pseudomallei 100 АД=5х102 ж.м.к./мл и штамма 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5*104 ж.м.кл./мл на 3-й сутки возникала острая форма легочного мелиоидоза. Прежде всего, повышалось парциальное давление СО2 (рС02) 55,9±4,2 mmHg (N= 48,3 ± 0,71)(р<0,05). Поскольку величина рН связана с рССЬ, то отмечено ее снижение до 7,0±0,02 (N=7,1). Параллельно снизилась концентрация бикарбоната плазмы с НСОз до 15,1 ± 1,32 ммоль/л (N=19,8 ± 1,50 ммоль/л) (р<0,05) и р02 до 69,7 (N=88,9±0,7 mmHg), т. е. появлялись признаки метаболического ацидоза, что подтверждено показателем «SBE - стандартный избыток оснований»: его величина снизилась в два раза - 0,8±0,02 ммоль/л (N= = 1,9 ± 0,42) (р<0,05).

Соответственно падала артериальная концентрация общего кислорода (ctCb) 16,1±0,43 (N=18,6±0,22) (р<0,05), что приводило к снижению возможности артериальной крови отдавать 02 тканям. Этот показатель подтверждался параметром «насыщения 02 артериальной крови» (S02), что позволяло оценивать процессы оксигенации и диссоциации гемоглобина, а

также критерии потенциального транспорта 02 (ОгНЬ, 74,0± 1,0% , N = 94,4 ± 1,68 %) (р<0,05).

Биохимические нарушения, приводящие к снижению оксигенации крови, приводили к снижению и емкости (^носителя ШЬ (124,6±1,61

140,3±1,23) (р<0,05), что коррелировало с данными общего анализа крови и снижением содержания 02 в крови.

Процессы, снижающие 02 в крови, закономерно повышали уровень карбНв (0,64 ± 0,22, 0,44 ± 0,10) )(р<0,05) и МеШв (0,7 ± 0,17, 0,4 ± 0,09)(р<0,05). В то же время в группе экспериментальных животных с легким течением мелноидоза, газовый состав крови и КЩС не изменялись Их показатели были аналогичны показателям газового состава и КЩС крови контрольных животных

Таким образом, при аэрогенном заражении вирулентным штаммом В р$еис1ота11е1100 АД-5Х102 ж.м.кл./мл и атипичным штаммом В.рзеис1ота11е1 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5*104 ж.м.кл./мл у экспериментальных животных на 3-и сутки развивались гипоксия и метаболический ацидоз за счет снижения рН и рС02, вследствие чего нарушалась оксигенация крови, увеличивалось содержание карбНв и метНв. Учитывая полученные результаты, представляется необходимым включение в схему лечения мелиоидоза искусственной вентиляции легких с оксигенацией 02 и лечебных мероприятий по устранению ацидоза крови.

ВЫВОДЫ

1 Экспериментальные модели легочного мелиоидоза, полученные при аэрогенном заражении животных типичными и атипичными штаммами и различными дозами мелиоидозных микробов, характеризуются специфическими различиями в клиническом течении инфекции и рядом гематологических и биохимических показателей. При заражении типичным штаммом В.р5еис1ота11е1 100 АД=5><102 ж.м.кл./мл развивалась острая форма легочного мелиоидоза, которая приводила к 100%-ной гибели животных, а у

морских свинок, инфицированных штаммом В pseudomallei 100-16-1(Аг8") в зависимости от дозы заражения, наблюдали как острое течение мелиоидоза, так и легкое течение инфекции, которое заканчивалось выздоровлением 60 -70% особей.

2. У животных, зараженных В.pseudomallei 100 АД=5><102 ж м кл./мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в концентрации 1,5х 104 ж.м.кл./мл, на 3-й сутки в легких обнаруживалась острая гнойная бронхопневмония с геморрагическим компонентом и выраженной интоксикацией. У животных, зараженных B.pseudomallei 100-16-1 (Аг8") в дозе 1,5*102 ж.м.кл/мл, отмечалась картина бронхопневмонии на 9-е сутки с менее выраженными показателями интоксикации.

3. Острая форма мелиоидоза сопровождалась эритроцитопенией, высоким лейкоцитозом с угнетением клеток иммунного ответа (лимфоцитов, моноцитов и базофилов). При легком течении легочного мелиоидоза динамика изменения гематологических показателей находилась в пределах физиологических значений

4. Легочный мелиоидоз у зараженных животных B.pseudomallei 100 АД=5*102 ж.м.кл./мл и штаммом 100-16-1 (Аг8") в концентрации 1,5><104 ж.м.кл./мл приводил к выраженным нарушениям со стороны белкового, азотистого и углеводного обменов, активности ферментов (ACT, АЛТ, ЛДГ, а-амилаза, ЩФ, ХЭ), билирубина, тимоловой пробы и электролитов (К+, NA+, Mg+, Fe2+). При легкой форме легочного мелиоидоза биохимические показатели варьировали в пределах физиологических величин.

5. Исследования крови экспериментальных животных при острой форме легочного мелиоидоза, зараженных типичным и атипичным штаммами в большой концентрации, показали нарушения со стороны газового состава крови и КЩС, которые приводили к метаболическому ацидозу. У больных животных, зараженных атипичным штаммом в низкой концентрации, показатели газового состава и КЩС изменялись незначительно.

6. При сравнительном анализе полученных клинико-лабораторных показателей наблюдалась взаимосвязь с патоморфологическими данными различных клинических вариантов легочного мелиоидоза. Увеличение количества лейкоцитов при острой форме легочного мелиоидоза сопровождалось образованием сливных очагов гнойной бронхопневмонии, выраженные биохимические нарушения сочетались с образованием гранулем и участков некроза в паренхиме печени. При легком течении легочного мелиоидоза незначительные гематологические и биохимические изменения сопровождались отсутствием специфических мелиоидозных гранулем и некроза в паренхиме печени, а в легких преобладали продуктивные процессы над деструктивными

7 Разработанный алгоритм патологических сдвигов на основании клинико-лабораторного обследования позволяет проводить скрининг и мониторирование состояния больного мелиоидозом. Применение предлагаемого алгоритма эффективно для оценки тяжести течения, прогноза исхода инфекционного процесса и коррекции патогенетической терапии

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ващанова, И А Показатели гомеостаза макроорганизма при легочном мелиоидозе / И.А. Ващанова, В В Алексеев, А.Т. Яковлев // Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации и социализации человека: Материалы 4-й Всерос. науч.-иракт. конф. -Волгоград, 2005. - С. 306 - 307.

2. Изменения биохимических процессов в макроорганизме при экспериментальном мелиоидозе / И.А. Ващанова, В В. Алексеев, А.Т. Яковлев, Н.Г. Плеханова // Состояние здоровья населения Волгоградской области и современные медицинские технологии его коррекции: Материалы науч.-практ. конф. - Волгоград, 2005. - С. 147 - 148.

3. Изучение изменения гомеостаза макроорганизма при экспериментальном мелиоидозе / И А. Ващанова, В.В. Алексеев, А.Т.

Яковлев, Н.Г. Плеханова // Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях. Материалы VI Межгос. науч -практ. конф. государств-участников СНГ. -Волгоград, 2005. - С.131 - 133.

4. Некоторые особенности механизма развития мелиоидоза у биопробных животных при аэрогенном заражении / И.А. Ващанова, В.В. Алексеев, А.Т. Яковлев, Н.Г. Плеханова // Санитарная охрана территорий государств- участников Содружества Независимых Государств- проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях: Материалы VI Межгос. науч.-практ. конф государств-участников СНГ. - Волгоград, 2005 - С. 133 - 134

5. Изучение изменений гематологических и биохимических показателей при экспериментальном легочном мелиоидозе / И А. Ващанова, В.В Алексеев, А.Т. Яковлев, НГ Плеханова // Опыт работы центров социально-психологической адаптации студентов: Материалы Всерос. науч.-практ. конф. - Волгоград, 2006 - С. 13-18.

6. Изменения газового состава и кислотно-щелочного состояния крови макроорганизма при экспериментальном легочном мелиоидозе / И А Ващанова, В.В. Алексеев, А.Т. Яковлев, Н.Г. Плеханова // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группа восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: Материалы VII Межгос., науч.- практ. конф. государств-участников СНГ. - Оболенск, 2006. - С. 141 - 142.

7. Изучение патоморфологических и клинико-лабораторных показателей макроорганизма при экспериментальном легочном мелиоидозе / И.А Ващанова, В.В. Алексеев, А.Т. Яковлев, Н.Г. Плеханова // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. - 2006. - № 4.-С. 31-34.

Подписано к печати 08.09.2008. Объем - 1печ.л. Тираж 100. Заказ № 829 Отпечатано в типографии 400011, г. Волгоград, ул. Электролесовская 55, ООО «Волгоградское научное издательство»

Вопросы санитарной охраны территории и обеспечения эпидемического благополучия включают в себя меры, направленные на раннее распознавание, лечение и профилактику инфекционных заболеваний, в том числе экзотических для Российской Федерации, таких как мелиоидоз. В настоящее время спорадические случаи среди людей и эпизоотии мелиоидоза постоянно регистрируются в пограничных странах [61; 63; 74]. Мелиоидоз уже не является региональной проблемой эндемичных территорий и зарегистрирован далеко за их пределами [9; 63; 64; 84].

Мелиоидоз занимает особое место в номенклатуре инфекционных заболеваний в силу своей способности вызывать у людей и животных тяжелое заболевание, характеризующееся септицемией с множественными некротическими поражениями внутренних органов, трудно поддающееся антибактериальной терапии [9; 73; 102; 138; 142; 146; 166; 182; 187; 190; 191].

Среди многообразия клинических проявлений мелиоидоза легочные формы этого заболевания занимают особое место, поскольку характеризуются, как правило, острым началом, быстрым развитием патологических, явлений и высокой смертностью. Кроме этого, больные легочной формой мелиоидоза представляют эпидемическую опасность, так как выделяют инфект в окружающую среду [60; 61; 155; 156; 164; 176; 188].

Легочная форма мелиоидоза встречается с такой же частотой, как и другие формы болезни, а заражение происходит воздушно-капельным путем [61; 114; 154; 155; 156; 193]. Однако исследователями подчеркивается, что независимо от путей заражения легочная патология при мелиоидозе является одним из ведущих клинических признаков [143; 177].

Есть основания считать, что легочная ткань имеет повышенную чувствительность к возбудителю мелиоидоза, а в совокупности с тем, что входными воротами для инфекта является весь дыхательный тракт, а не отдельные его участки, понятна та легкость, с которой происходит аэрогенное заражение людей и животных в природных и экспериментальных условиях [18; 143; 160; 177].

Существует классификация отдельных регионов, в которых встречается мелиоидоз [9; 151; 153]. Это, в первую очередь, страны Юго-Восточной Азии, где имеются эндемичные очаги естественного происхождения и постоянно регистрируется заболеваемость мелиоидоза среди людей и животных на высоком уровне. Вторую группу составляют страны, где имеются собственные природные очаги с меньшей активностью, возникшие позднее в результате заноса возбудителя из районов первой группы. Это Австралия, Иран, Турция, Африка и Южная Америка. Третья группа стран -США, Франция, где регистрируются случаи заболевания людей и животных после их пребывания в эндемичных районах. Четвертая группа - страны, где зарегистрированы отдельные случаи заболевания мелиоидозом (Великобритания, Дания, Нидерланды и др.).

На территории Российской Федерации мелиоидоз не регистрировался, однако постоянно расширяющиеся торгово-экономические связи с эндемичными по данному заболеванию странами создают предпосылки для появления в нашей стране этой опасной инфекции.

Исходя из изложенного, следует сделать заключение о том, что аэрогенное заражение играет существенную роль в эпидемиологии и эпизоотологии мелиоидоза в эндемичных регионах. Достаточно реальна возможность появления больных людей или животных с легочной формой мелиоидоза на территории России. В естественных условиях чаще всего не представляется возможным проследить способ заражения, для изучения особенностей механизма развития мелиоидоза при различных способах инфицирования используется метод экспериментального моделирования, позволяющий воспроизвести заболевание, изучить его на различных стадиях развития и в дальнейшем экстраполировать полученные результаты на человека.

При мелиоидозе в патологический процесс вовлекаются различные системы организма: дыхательная, мочеполовая, желудочно-кишечный тракт, опорно-двигательный аппарат, система кровообращения и т.д. [53; 72; 73; 141; 145; 147; 156]. Есть основания считать, что клинико-лабораторные исследования мелиоидоза могут иметь не только диагностическое, но и прогностическое значение при проведении лечебных мероприятий и их коррекции в зависимости от тяжести инфекционного процесса.

Лабораторные показатели позволяют также выявить осложнения, к которым приводит неправильно выбранная тактика лечения. Учитывая широкую вариабельность мелиоидоза по клиническим формам, устойчивость возбудителя к широкому набору антибактериальных препаратов, представляется целесообразным изучение биохимических процессов, происходящих в макроорганизме при мелиоидозной инфекции, и динамики клинико-лабораторных показателей.

С учетом вышеизложенного, а также принимая во внимание отсутствие научно обоснованных схем клинической лабораторной диагностики, лечения и специфической профилактики, которые должны базироваться на знании механизмов развития мелиоидоза, представляется актуальным проведение научных исследований, которые позволят выработать меры защитного характера.

Таким образом, учитывая немногочисленный фактический материал по клинико-лабораторным данным, нами было проведено изучение изменений в динамике гематологических и биохимических параметров крови при различных клинических вариантах экспериментального мелиоидоза.

Цель работы - выявить изменения клинико-лабораторных показателей крови при экспериментальном легочном мелиоидозе, вызванном штаммами с различной вирулентностью.

Задачи исследования

1. Осуществить моделирование легочного мелиоидоза с различным клиническим течением.

2. Провести гематологические исследования при экспериментальном легочном мелиоидозе.

3. Провести изучение биохимических показателей крови экспериментальных животных с различной клинической формой легочного мелиоидоза.

4. Провести сравнительный анализ клинико-лабораторных показателей крови инфицированных животных при экспериментальном легочном мелиоидозе с патоморфологическими данными.

5. Разработать алгоритм патологических сдвигов клинико-лабораторных показателей при легочном мелиоидозе.

Научная новизна

Впервые проведен развернутый анализ крови экспериментальных животных, больных мелиоидозом с различным клиническим течением. Установлено, что при экспериментальной острой форме мелиоидоза наблюдались эритроцитопения, высокий лейкоцитоз с угнетением клеток иммунного ответа лимфоцитов, моноцитов и базофилов. При легком течении легочного мелиоидоза гематологические показатели находились в пределах физиологических значений.

Впервые изучены биохимические изменения крови в динамике у экспериментальных животных при легочной форме мелиоидоза. При остром процессе отмечены значительные изменения белкового, азотистого, углеводного обменов и активности ферментов: аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы и холинэстеразы, увеличение билирубина и тимоловой пробы, наблюдался значительный сдвиг электролитного обмена. При легком течении легочного мелиоидоза биохимические показатели варьировали в пределах референтных величин.

У животных, зараженных аэрогенно штаммом B.pseudomallei 100 в дозе 5х10~ж.м.кл./мл и антигенным вариантом B.pseudomallei 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5x104 ж.м.кл./мл, фиксировались изменения со стороны газового состава и кислотно-щелочного равновесия крови, что свидетельствовало о возникновении у больных животных респираторного и метаболического ацидоза. У экспериментальных животных, зараженных атипичным штаммом B.pseudomallei 100-16-1 (Аг8~) АД=1,5хЮ2 ж.м.кл./мл, показатели газового состава и кислотно-щелочного равновесия изменялись незначительно.

Впервые проведен сравнительный анализ полученных клинико-лабораторных показателей с патоморфологическими данными при различных формах аэрогенного мелиоидоза, который показал соответствие нарушений гомеостаза организма с патоморфологическими изменениями.

Впервые разработан алгоритм патологических сдвигов на основании клинико-лабораторных показателей при различных формах легочного мелиоидоза. При обследовании больного мелиоидозом рекомендуется назначать клинико-лабораторные исследования на следующие диагностическизначимые параметры: общий анализ крови, газовый состав, кислотно-щелочное состояние, электролиты крови, концентрацию общего белка, креатинина, мочевины, билирубина, исследование осадочных проб, активность следующих ферментов: аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, холинэстеразы, лактатдегидрогеназы (ACT, AJIT, ЩФ, ХЭ, ЛДГ). Применение предлагаемого алгоритма эффективно для оценки тяжести течения, прогноза исхода инфекционного процесса и коррекции патогенетической терапии.

Практическая значимость

Разработанный алгоритм патологических сдвигов на основании клинико-лабораторных показателей при различных формах легочного мелиоидоза может быть использован в специализированных лабораториях и в клиниках для установления клинического диагноза мелиоидоза, тяжести течения заболевания, мониторинга лечения и прогноза исхода заболевания наряду с бактериологическими и иммунологическими методами.

Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, используются в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте при изучении экспериментального мелиоидоза с различной формой и тяжестью течения.

Материалы диссертации включены в лекционный материал, предназначенный для врачей, биологов и лаборантов учреждений санитарно-эпидемиологического профиля и клинических диагностических лабораторий при проведении первичной специализации и курсов усовершенствования по вопросам, специфической индикации, лабораторной диагностики особо опасных заболеваний, санитарной охраны территории и противодействия биотерроризму при ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

На основании полученных данных составлены «Методические рекомендации по клинико-лабораторной диагностике мелиоидоза». (Утверждены директором Волгоградского научно-исследовательского • противочумного института, протокол заседания Ученого совета № 9 от 21.12.2005 г.)

Основные положения, выносимые на защиту

1. Гематологические исследования при экспериментальном легочном мелиоидозе с различными клиническими вариантами позволяют определить состояние кроветворной системы макроорганизма.

2. Изменение биохимических показателей макроорганизма свидетельствует о степени тяжести поражения и нарушения функциональной деятельности отдельных органов и систем.

3. Степень гематологических и биохимических изменений соответствует тяжести патоморфологических проявлений в органах инфицированных животных. Применение предлагаемого алгоритма патологических сдвигов при клинико-лабораторном обследовании эффективно для оценки тяжести течения, прогноза исхода инфекционного процесса и коррекции патогенетической терапии при мелиоидозе.

Публикация и апробация работы

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. Результаты исследований доложены на научно-практических конференциях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института (Волгоград, 3 — 5 октября 2005 г., 10 - 11 октября 2006 г.), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Волгоград, 13-14 сентября 2005 г.), научно-практической конференции «Состояние здоровья населения Волгоградской области и современные медицинские технологии его коррекции» (Волгоград, 2005 г.), VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Оболенск, 3-5 октября 2006 г.).

Объем и структура работы

Работа изложена на 132 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 3 рисунками, 9 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов. Список использованной литературы включает 132 работы отечественных и 68 работ иностранных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментальные модели легочного мелиоидоза, полученные при аэрогенном заражении животных типичными и атипичными штаммами и различными дозами мелиоидозных микробов, характеризуются специфическими различиями в клиническом течении инфекции и рядом гематологических и биохимических показателей. При заражении типичным штаммом B.pseudomallei 100 АД=5Х 10" ж.м.кл./мл развивалась острая форма легочного мелиоидоза, которая приводила к 100%-ной гибели животных, а у морских свинок, инфицированных штаммом B.pseudomallei 100-16-1(Аг8") в зависимости от дозы заражения, наблюдали как острое течение мелиоидоза, так и легкое течение инфекции, которое заканчивалось выздоровлением 60 — 70% особей.

2. У животных, зараженных B.pseudomallei 100 АД=5х10~ ж.м.кл./мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в концентрации 1,5x104 ж.м.кл./мл, на 3-й сутки в легких обнаруживалась острая, гнойная бронхопневмония с геморрагическим компонентом и выраженной интоксикацией. У животных, зараженных B.pseudomallei 100-16-1 (Аг8") в дозе 1,5x10" ж.м.кл./мл, отмечалась картина бронхопневмонии на 9-е сутки, с менее выраженными показателями интоксикации.

3. Острая форма мелиоидоза сопровождалась эритроцитопенией, высоким лейкоцитозом с угнетением клеток иммунного ответа (лимфоцитов, моноцитов и базофилов). При легком течении легочного мелиоидоза динамика изменения гематологических показателей находилась в пределах физиологических значений.

4. Легочный мелиоидоз у зараженных животных B.pseudomallei 100 АД=5хЮ2 ж.м.кл./мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в концентрации 1,5x104 ж.м.кл./мл приводил к выраженным нарушениям со стороны белкового, азотистого и углеводного обменов, активности ферментов (ACT, АЛТ, ЛДГ, а-амилаза, ЩФ, ХЭ), билирубина, тимоловой пробы и электролитов (К+,

NA+, Mg+, Fe2+). При легкой форме легочного мелиоидоза биохимические показатели варьировали в пределах физиологических величин.

5. Исследования крови экспериментальных животных при острой форме легочного мелиоидоза, зараженных типичным и атипичным штаммами в большой концентрации, показали нарушения со стороны газового состава крови и КЩС, которые приводили к метаболическому ацидозу. У больных животных, зараженных атипичным штаммом в низкой концентрации, показатели газового состава и КЩС изменялись незначительно.

6. При сравнительном анализе полученных клинико-лабораторных показателей наблюдалась взаимосвязь с патоморфологическими данными различных клинических вариантов легочного мелиоидоза. Увеличение количества лейкоцитов при острой форме легочного мелиоидоза сопровождалось образованием сливных очагов гнойной бронхопневмонии, выраженные биохимические нарушения сочетались с образованием гранулем и участков некроза в паренхиме печени. При легком течении легочного мелиоидоза незначительные гематологические и биохимические изменения сопровождались отсутствием специфических мелиоидозных гранулем и некроза в паренхиме печени, а в легких преобладали продуктивные процессы над деструктивными.

7. Разработанный алгоритм патологических сдвигов на основании клинико-лабораторного обследования позволяет проводить скрининг и мониторирование состояния больного мелиоидозом. Применение предлагаемого алгоритма эффективно для оценки тяжести течения, прогноза исхода инфекционного процесса и коррекции патогенетической терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Аэрогенный механизм передачи мелиоидозной инфекции играет такую же роль, как и заражение через кожу [175]. Интерес исследователей к проблеме легочных форм мелиоидоза объясняется не только тяжестью течения заболевания, значительно худшим прогнозом исхода, чем при других клинических формах, но и тем, что такие больные представляют значительную эпидемическую опасность, так как выделяют возбудитель в окружающую среду [135]. Мелиоидоз является проблемой не только для эндемичных регионов, но и для любой страны, в том числе России, имеющей экономические и другие связи со странами, где эта инфекция постоянно присутствует. Поэтому разработка средств диагностики, защиты, профилактики и лечения должна базироваться на знании особенностей механизма возникновения и развития заболевания. Эти вопросы в определенной мере решены для инфекции, вызванной типичными по антигенному составу штаммами возбудителя мелиоидоза.

Больные пневмониями, вызванными иными этиологическими факторами, в наши дни составляют значительный процент, так как заболеваемость остается высокой и имеет место тенденция к увеличению летальности от пневмонии. В течении воспалительных процессов в легких, вызываемых различными микробами, есть общие черты, но весьма важны те отличительные особенности, которые характерны для определенных возбудителей. В литературе описаны изменения клинико-лабораторных показателей при пневмониях, но эти описания носят ограниченный характер без детализации при различных формах и тяжести течения [58; 87; 105; 115]. Относительно легочной формы мелиоидоза нам не удалось найти данных по динамическому изучению течения данной инфекции.

Целью настоящей работы явилось выявление изменений клинико-лабораторных показателей крови макр о организма при экспериментальном легочном мелиоидозе, вызванном штаммами с различной вирулентностью.

Изучение распространения возбудителя в организме зараженных животных показало существенные различия в динамике этого процесса при использовании различных штаммов.

Диссеминация клеток вирулентного штамма B.pseudomallei 100 АД=5х10" ж.м.кл./мл и атипичного штамма B.pseudomallei 100-16-1( Аг8") в дозе 1,5x104 ж.м.кл./мл имела сходные закономерности: локализация возбудителя в месте внедрения инфекта - легких, трахее, далее - в регионарных лимфоузлах, развитие бактериемии, задержка микроба в органах системы мононуклеарных фагоцитов, интенсивное размножение возбудителя в органах с максимальной концентрацией перед гибелью животных. В небольшой дозе штамма 100-16-1 (Аг8") 1,5x102 ж.м.кл./мл закономерность распространения была иной. В этом случае отмечены значительно более низкая инвазивность возбудителя, преимущественная его локализация в месте внедрения и регионарных лимфоузлах, со слабо выраженной бактериемией. При переходе острой формы инфекции в легкое течение процесс ограничивался только легкими, что подтверждалось патоморфологическими исследованиями.

Сравнительное изучение патоморфогенеза мелиоидозной инфекции, вызванной полноценным и дефектными по Аг8 штаммами, показало значительные отличия в морфологических проявлениях инфекции. Так, при аэрогенном заражении животных полноценным штаммом развивалась острая легочная форма мелиоидоза. На 2-е сутки после заражения отмечено формирование в легких очагов воспаления, а в последующие дни -генерализация инфекции, появление в печени и селезенке метастатических очагов некроза, сильная обсемененность внутренних органов специфической микрофлорой. Специфическим морфологическим субстратом мелиоидозной инфекции являлись преимущественно экссудативного характера гранулемы в печени и селезенке с выраженными дегенеративными изменениями и частичным распадом в составляющих их клетках. В легочной ткани патология характеризовалась обширными воспалительными очагами, где преобладали процессы альтерации, экссудации, некроза и деструкции. Резко выраженная гипоплазия (у некоторых животных аплазия) лимфоидной ткани в селезенке свидетельствовала о подавлении иммунных процессов и неспособности организма сопротивляться инфекции.

Патоморфологическая картина у животных, зараженных дефектным по Аг8 штаммом B.pseudomallei, была иной. Отличия заключались в отсутствии специфических гранулем в печени и селезенке, в легких преобладали продуктивные процессы над деструктивными и были направлены на отграничение и рассасывание очагов; морфологические изменения в селезенке отражали достаточную напряженность иммунных процессов и иллюстрировали способность организма бороться с инфекцией.

Наряду с морфологическими и физиологическими сторонами патогенеза большое значение придается биохимическим и гематологическим аспектам инфекционного процесса, а симптомокомплекс многих заболеваний в ряде случаев объясняют преимущественно с биохимических позиций.

Экспериментальных животных первой группы заражали 24-часовой культурой В. peseudomallei 100 аэрогенно дозой 5x10" ж.м.кл./мл и штаммом 100-1б-1(Аг8") в дозе 1,5x104 ж.м.кл./мл. Динамику биохимических и гематологических показателей крови оценивали на 1, 2, 3, 5, 7, 10, 13/15-е сутки после заражения.

Вторую группу морских свинок заражали культурой В. pseudomallei 100-16-1 (Аг8") аэрогенно дозой 1,5x10" ж.м.кл./мл. Наблюдение за этой группой велось на 1, 2, 3, 5, 7, 13/15, 20, 35-е сутки.

При заражении морских свинок аэрозолем клеток B.pseudomallei 100

1 4

АД=5хЮ" ж.м.кл./мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5x10 ж.млсл./мл отмечена тенденция к снижению количества эритроцитов с первых дней до

12 конца срока наблюдения (от 3,8±0,17 до 3,3±0,22x10 при N=4,3±0,13xl012)(p<0,05). Эритроцитопения, возможно, обусловлена выбросом в кровь макроорганизма токсинов в начале инфекционного процесса, нарушением эритроцитопоэза, разрушением клеток эритроцитов и возникновением печеночной и почечной недостаточности, то есть нарушением процесса утилизации. В то же время у морских свинок,

Г) зараженных штаммом B.pseudomallei 100-16-1 (Аг8") в дозе 1,5x10" ж.м.кл./мл, динамика изменения количества эритроцитов колебалась в пределах физиологически значимых величин (4,0±0,22 - 4,2±0,18хЮ12 при N=4,3±0,13xl012).

Изучение особенностей лейкоцитарной картины крови морских свинок, инфицированных B.pseudomallei 100 АД=5х102 ж.м.кл./мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5x104 ж.м.кл./мл, дало ценную информацию о ходе течения клинических проявлений в разные сроки. Количество лейкоцитов крови у экспериментальных животных увеличивалось уже начиная со 2-го дня после заражения и к 13 суткам достигало высоких величин (19,2±0,31хЮ9, при N=9,8±0,54xl09)(p<0,05), что отражало степень остроты воспалительного процесса. При этом повышенные значения лейкоцитов в первые дни наблюдались за счет суммарного увеличения лимфоцитов и палочкоядерных нейтрофилов. Изменялась также морфология нейтрофилов: возникали клетки с дегрануляцией и вакуолизацией.

У морских свинок, зараженных B.pseudomallei 100-16-1 (Аг8") в низких дозах, изменение количества лейкоцитов в крови было незначительным и находилось в пределах физиологических показателей (от 8,8±0,07 до 9,3±0,22хЮ9 npnN=9,8±0,54xl09).

Количество лимфоцитов увеличивалось в первые дни после заражения независимо от вида штамма микроорганизма, что, вероятно, связано с включением иммунных резервов макроорганизма на введение инфекта. У морских свинок, зараженных B.pseudomallei 100 АД=5хЮ" ж.м.кл./мл, концентрация лимфоцитов снижалась на 10-е сутки (до 32,7±1,09% при N=44,8±0,68%)(p<0,05), а у животных, зараженных B.pseudomallei 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5x104 ж.м.кл./мл., количество лимфоцитов держалось на высоком уровне до 13-го дня наблюдения (76,0±2,87% при N=44,8±0,68%)(p<0,05). Клеточный ответ лимфоцитами, по всей вероятности, связан со специфическим узнаванием клетками иммунной системы антигенов, расположенных на поверхности клеток, так как именно за специфичность иммунитета отвечают лимфоциты.

В динамике показателей сегментоядерных нейтрофилов наблюдалось повышение их числа на 3-й сутки (от 44,±0,94% до 63,7±0,98% при N=36,8±0,59%)(p<0,05), которое держалось на сравнительно высоком уровне до конца наблюдения у животных, зараженных B.pseudomallei 100 АД=5><102 ж.м.кл./мл и штаммом 100-16-1 (Аг8") в дозе 1,5*104ж.м.кл./мл.

Штамм B.pseudomallei 100-16-1 (Аг8~) в дозе 1,5*102 ж.м.кл./мл, наоборот, приводил к снижению концентрации сегментоядерных нейтрофилов на 3-й день (от 11,0±3,68% до 7,0±2,05% при N=36,8±0,59%)(p<0,05), и этот показатель приходил в пределы физиологических значений после 15-го дня.

Количество базофильных лейкоцитов при заражении вирулентным и атипичным штаммами в высоких концентрациях снижалось (0,33±0,27% при N=0,8±0,15%)(p<0,05), что, вероятно, связано с развитием патологии -в иммунной системе, тогда как у морских свинок, зараженных атипичным штаммом в низких концентрациях, уровень базофилов колебался в физиологических пределах (от 0,7±0,27% до 1,0±0,00% при N=0,8±0,15%), что дало основание для предположения о том, что штамм B.pseudomallei 100-16-1(Аг8") в низких аспирационных дозах не подавляет лейкопоэз.

Установлено угнетение продукции моноцитов и эозинофилов при экспериментальном мелиоидозе, вызванном заражением различными штаммами.

Причину снижения продукции моноцитов (от 6,0±0,47% до 2,3±0,27% при N=8,8±0,49%) (р<0,05), вероятно, можно объяснить воздействием агрессивных компонентов возбудителя B.pseudomallei. При заражении B.pseudomallei 100-16-1 (Аг8~) в дозе 1,5x10" ж.м.кл./мл организм морских свинок после краткого периода угнетения восстанавливал свои основные функции, и, по всей вероятности, с 10-го дня начинался синтез моноцитов (от

9,3±0,54% до 18,5±0,35% при N=8,8±0,49%)(p<0,05), то есть организм вновь активизировал свои защитные функции. Таким образом, клетками лейкоцитов — лимфоцитами, моноцитами и базофилами осуществлялась защита макроорганизма с помощью клеточного иммунитета.

Диагностический аспект клинической биохимии образует неразрывное целое с клиническими проявлениями. Все виды обмена веществ в макроорганизме взаимосвязаны друг с другом. Однако при конкретных нозологических формах на первый план выступает картина нарушения определенного обмена веществ, поэтому изучение этих процессов позволяет понять механизмы развития болезни.

Определение биохимических параметров крови морских свинок, зараженных аэрогенно вирулентным штаммом B.pseudomallei 100 АД=5х102 ж.м.кл./мл и штаммом 100-16-1(Аг8~) в дозе 1,5x104 ж.м.кл./мл, показало значительный сдвиг белкового обмена. Регистрировалось снижение концентрации белка на 1-е сутки (39,7±0,58г/л при N=45,6±l,83r/tf)(p<0,05), а с 3-го дня наблюдения после введения инфекта отмечалось его повышение (от 55,5±2,11 г/л до 61,9±0,62 г/л при Ы=45,6±1,83г/л)(р<0,05), что соответствовало острой фазе инфекционного процесса. Гиперпротеинемия сохранялась с 3-го по 7-й день заболевания, затем концентрация белка снижалась.

Нарушение белкового обмена следует рассматривать как защитную реакцию организма на внедрение инфекта, а потери белка после 7-го дня болезни - как следствие возникновения некротических процессов в паренхиме печени и других органах. Следовательно, имели место нарушения метаболических процессов в организме и дисбаланс коллоидно-осмотического давления плазмы.

После заражения морских свинок штаммом B.pseudomallei 100-16-1(Аг 8") в дозе 1,5x10" ж.м.кл./мл концентрация белка в крови оставалась стабильной. Незначительное повышение происходило на 5 — 7-е сутки (49,7±0,58г/л при N=45,6=Ы ,83г/л)(р<0,05) как адаптационная реакция макроорганизма на введение инфекта, не имеющего одного из основных факторов патогенности.

При заражении штаммом B.pseudomallei 100 АД=5*102 ж.м.кл./мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5x104 ж.м.кл./мл происходило резкое нарушение азотистого обмена в макроорганизме, прежде всего, таких основных показателей, как креатинин и мочевина. Показатели креатинина превышали норму уже на 2-е сутки, достигали максимума на 5-е сутки (158,5±5,28 мкмоль/л при N=67,8±6,59 мкмоль/л)(р<0,05) и держались на высоких уровнях до конца наблюдения. Резкое увеличение концентрации креатинина можно рассматривать как ранний показатель развивающейся недостаточности функции почек. Устойчивое повышение уровня креатинина в крови одновременно с возрастанием концентрации мочевины (от 4,7±0,21 до 10,97±0,71 ммоль/л при N=2,9±0,52 ммоль/л)(р<0,05) указывало на нарушение реабсорбционной функции почек, развитие патологических процессов в паренхиме почек.

Инфицирование морских свинок B.pseudomallei 100 АД=5х102 ж.м.кл./мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5x104 ж.м.кл./мл приводило к увеличению концентрации мочевины в крови, что подтверждало клинический синдром интоксикации - уремию. Являясь осмотически активным веществом, мочевина во многом обусловливает нарушение обменных процессов на клеточном уровне, ухудшая функционирование жизненно важных органов и систем, прежде всего сердечно-сосудистой. Мочевина как конечный продукт метаболизма белков экскретируется почками, поэтому повышение ее концентрации имеет место при остром нефрите, канальцевом некрозе и обтурации мочевых путей [73; 98; 117; 121]. Результаты патоморфологических исследований подтверждали наличие патологических процессов в этих органах.

У морских свинок, инфицированных B.pseudomallei 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5x10" ж.м.кл./мл, концентрация креатинина и мочевины оставалась в пределах физиологических показателей. Клинически инфекционный процесс протекал в легкой форме. В это же время бактериемию определяли у единичных животных на 5 и 9 сутки.

В сыворотке крови животных, зараженных B.pseudomallei 100 АД=5*102 ж.м.кл./мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5x104 ж.м.кл./мл, отмечено значительное нарушение углеводного обмена: на 2 - 3-й сутки после заражения содержание сахара повышалось более чем в 3 раза и держалось на этом уровне до 10-го дня (от 8,0±0,68 до 17,7±0,34 ммоль/л при N=4,9±0,52 ммоль/л)(р<0,05). В то же время у морских свинок, зараженных B.pseudomallei 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5x10" ж.м.кл./мл, концентрация глюкозы в крови оставалась в пределах вариации нормальных физиологических показателей (от 4,0±0,05 до 4,7±0,03 ммоль/л при N=4,9±0,52 ммоль/л).

Инфицирование морских свинок B.pseudomallei 100 АД=5хЮ2 ж.м.кл./мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5x104 ж.м.кл./мл приводило к значительному изменению активности ферментов, участвующих в различных биохимических процессах организма. У таких ферментов, ' как аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза, лактатдегидрогеназа, участвующих в обмене аминокислот и углеводов, энзимная активность повышалась на 2-3-и сутки после инфицирования и держалась весь период наблюдения (ACT: от 0,33±0,02 до 1,69±0,16 мккат/л при N=0,26±0,07 мккат/л (р<0,05), АЛТ: от 0,37±0,01 до 1,09±0,29 мккат/л при N=0,22±0,03 мккат/л (р<0,05), ЛДГ: от 92,8±3,53 до 675,7±44,0 Ед/л при N=75,4±l,82 Ед/л)(р<0,05). Поскольку эти ферменты содержатся в печени, то увеличение их количества в крови свидетельствовало о некротическом поражении ткани этого органа. В наших опытах коэффициент Де Ритиса (соотношение АсТ/АлТ) составил ^ 1, что подтверждало высокую степень поражения печени при заражении морских свинок B.pseudomallei 100 и штаммом 100-16-1(Аг8") в больших дозах. Следует отметить, что культуру мелиоидозного микроба выделяли из печени и селезенки уже на 3-й день заболевания. При патоморфологическом исследовании отмечено поражение паренхимы печени с образованием гнойных абсцессов. Резкое повышение концентрации ЛДГ подтверждало указанные выше результаты наблюдений.

Повышение параметров активности холинэстеразы и щелочной фосфатазы, начиная со 2-го дня, у животных первой группы (ХЭ: от 48,1 ±2,72 до 77,1±3,49 мккат/л при N=31,4±l,79 мккат/л (р<0,05), ЩФ: от 103,3±7,56 до 298,4±27,95 Ед/л при N=50,5±3,83 Ед/л)(р<0,05) также указывало на поражение паренхимы печени и объясняло возникновение уремии. Так как ХЭ синтезируется в печени, контроль за ее активностью следует рассматривать как важный лабораторно-диагностический тест, отражающий функциональное состояние печени на различных стадиях инфекционного процесса. В частности, снижение активности ХЭ в терминальной фазе заболевания отражало глубокое поражение гепатоцитов и, как следствие, тяжесть течения инфекционного процесса. Повышение активности ЩФ шло одновременно с ХЭ и указывало на развитие холестаза, то есть закупорку внутрипеченочных желчных протоков и возникновение застойных процессов. В группе экспериментальных животных, инфицированных B.pseudomallei sy

100-16-1(Аг8") в дозе 1,5*10" ж.м.кл/мл, изменения параметров активности ХЭ и ЩФ не наблюдали.

Тяжелое нарушение функциональной деятельности печени у морских свинок, зараженных B.pseudomallei 100 АД=5*10" ж.м.кл./мл и штаммом 100-16-1(Аг8~) в дозе 1,5*104 ж.м.кл./мл, подтверждали два других биохимических теста - тимоловая проба и содержание билирубина в крови. Показатели ТП достоверно превышали норму на 5-е сутки инфекции (от 3,6±0,31 до 11,3±0,43 ед. при N=l,6±0,48 ед.) (р<0,05) и постоянно повышались в течение всего срока наблюдения (15 сут), что отражало степень тяжести органического поражения клеток печени. Повышение содержания билирубина отмечено на 2-е сутки, а максимальные показатели — на 5-е сутки (от 6,6±0,31 до 15,0±0,45 мкмоль/л при N=2,9±l,08 мкмоль/л) (р<0,05), что связано с развитием деструктивно-дистрофических изменений паренхимы печени, инфильтрацией в строме и распадом эритроцитов. Застой билирубина способствовал резкому снижению метаболических процессов в пораженных гепатоцитах, которые теряли способность нормально выполнять различные биохимические и физиологические функции.

В группе животных, зараженных B.pseudomallei 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5x102 ж.м.кл./мл, изменения активности ферментов были незначительными. Из печеночных проб лишь концентрация билирубина менялась в сторону повышения с максимальными показателями с 3 по 7-е сутки (от 4,7±0,12 до

5,0±0,19 мкмоль/л при N=2,9±l,08 мкмоль/л) (р<0,05). В последующие сроки i уровень билирубина держался незначительно выше физиологических показателей. Аналогичные изменения отмечены pi в показателях ТП, что является благоприятным прогнозом исхода инфекционного процесса.

Фермент поджелудочной железы а-амилаза незначительно меняла свою активность в сторону повышения и носила временный характер (4,1±0,23 мккат/л при N=2,7±0,35 мккат/л) (р<0,05). У морских свинок, зараженных B.pseudomallei 100 АД=5хЮ ж.м.кл./мл и штаммом 100-16-1(Аг8~) в дозе 1,5x104 ж.м.кл./мл, на 5-е сутки происходило угнетение ее активности (от 2,1±0,26 до 1,2±0,14 при N=2,7±0,35 мккат/л)(р<0,05), что связано с функциональной недостаточностью поджелудочной железы под воздействием интоксикации.

В организме морских свинок, зараженных B.pseudomallei 100 АД=5хЮ~ ж.м.кл./мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5x104 ж.м.кл./мл, наблюдался значительный сдвиг электролитного обмена. Среди микроэлементов особого внимания заслуживали изменения содержания ионов калия и натрия, имеющие диагностическое значение. Концентрация ионов калия в сыворотке крови морских свинок значительно повышалась уже на 2-е сутки (от 8,0±0,37 до 13,7±1,11 ммоль/л при №=3,3±0,12 ммоль/л) (р<0,05). Острая гиперкалиемия, которая является угрожающей для макроорганизма, наступала, вероятно, как результат анафилактического инфекционного шока, а снижение экскреции К+ почками следовало рассматривать как начальный этап развития почечной недостаточности.

Уровень содержания ионов натрия в сыворотке крови морских свинок, зараженных вирулентным штаммом, повышался незначительно (140,0±0,21 ммоль/л при N=132,6±0,78 ммоль/л) (р<0,05) и связан с задержкой обмена ионов Na+ через почки в связи с нарушением их функции.

Концентрация ионов Mg в сыворотке крови морских свинок повышалась со 2-го дня заболевания (от 2,90±0,17 до 4,30±0,10 ммоль/л при N=l,5±0,06 ммоль/л) (р<0,05) с положительной динамикой, что приводило к нарушению функции дыхательного центра и сердечной проводимости.

Увеличение ионов Fe связано с началом распада эритроцитов на 2 - 3-й сутки (от 12,2±2,15 до 27,6±2,31 мкмоль/л при N=6,1 ±0,21 мкмоль/л) (р<0,05), а также снижением утилизирующей функции печени и выделительной системы организма.

В организме морских свинок, зараженных штаммом B.pseudomallei 100

•у

16-1(Аг8") в концентрации 1,5x10" ж.м.кл./мл, динамические изменения электролитного состава варьировали в пределах физиологических показателей.

Газовый состав крови играет важную роль в оценке состояния организма. При аэрогенном заражении морских свинок прослеживалась динамика развития инфекционного процесса по таким гемодинамическим показателям, как определение ионов водорода (рН), парциальное давление углекислого газа (рС02), парциальное давление кислорода (р02), концентрация гемоглобина в крови (tHb), насыщение кислородом артериальной крови (s02) и кислотно-щелочной состав (КЩС).

У животных, зараженных B.pseudomallei 100 АД=5хЮ2 ж.м.кл./мл и штаммом 100-16-1 (Аг8") в дозе 1,5x104 ж.м.кл./мл, уже на первые сутки появились изменения со стороны газового состава крови: увеличилось парциальное давление со стороны С02 (pC02) 55,9±4,2 mmHg (N= 48,3 ± 0,71) (р<0,05). Произошло соответственно снижение парциального давления 02 (69,7±0,30 при N=88,9±0,70) (р<0,05). Вследствие этих процессов происходило снижение общего гемоглобина, который является мерой потенциальной емкости кислородоносителя и определяет способность артериальной крови к транспорту О2, что приводило к развитию тканевой гипоксии. Низкая концентрация Нв приводила к снижению насыщения кислородом артериальной крови s02 (87,6 ± 1,1, N= 98,5 ± 0,84) (р<0,05).

В крови у экспериментальных животных снизилась артериальная концентрация общего 02 (ct 02). Низкие уровни (ct 02) обусловливали риск снижения доставки кислорода к тканям. Это состояние усугублялось снижением оксигенирования молекулы Нв (СЬ Нв 74,0 ± 1,10 , N= 94,4 ± 1,68) (р<0,05), что связано с поражением легочной ткани, приводящим к нарушению поступления 02 и увеличению нефизиологичных фракций метгемоглобина и карбгемоглобина (MetHB и СОНв). Снижение общего Нв приводило к увеличению содержания в крови фракции СО Нв (0,64±0,22, N= 0,44±0,10) )(р<0,05) и Met Нв (0,7±0,17, N= 0,4±0,09)(р<0,05), которые, в свою очередь, приводили к уменьшению переносчиков 02 в крови. В ходе продолжающегося инфекционного процесса снижался уровень КЩС, что приводило к сдвигу рН крови в кислую сторону. По нашим данным наблюдалось снижение рН (7,0±0,02, N=7,l±0,09) с увеличением рС02 (55,9±4,1, N= 48,3±0,71) (р<0,05) и снижение показателей стандартного избытка оснований (SBE), что свидетельствовало о возникновении метаболического и респираторного ацидоза у больных животных. Развитие респираторного ацидоза подтверждают показатели уровня сНС03 (15,1 ± 1,32, N= 19,8 ± 1,50) (р<0,05).

У больных животных, зараженных штаммом B.pseudomallei 100-16-1 (Аг8") в дозе 1,5x10" ж.м.кл./мл, показатели дыхательного гомеостаза изменялись незначительно. Парциальное давление С02 находилось в пределах физиологических отклонений (50,5 ± 0,82, N = 48,3 ± 0,71), как и парциальное давление 02 (86,7 ± 2,33, N =88,9 ± 0,70). Концентрация общего Нв снижалась незначительно, фракции его также находились в пределах физиологических показателей (СОНв: 0,51±0,02, N=0,44±0,10%), (МеШв: 0,50±0,18, N=0,4±0,09%). Исходя из данных клинико-лабораторных показателей, у этой группы экспериментальных животных не было большого нарушения со стороны гомеостаза и дисбаланса со стороны системы насыщения органов и тканей 02 и транспорта С02 из них.

В результате полученных данных у экспериментальных животных, зараженных B.pseudomallei 100 АД=5хЮ ж.м.кл./мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5x104 ж.м.кл./мл, наблюдалось тяжелое поражение системы дыхательного гомеостаза с проявлениями респираторного и метаболического ацидоза. У второй группы животных, зараженных B.pseudomallei 100-16-1(Аг8~) в дозе 1,5x10 ж.м.кл./мл, были фиксированы лишь незначительные клинико-лабораторные изменения, которые не приводили к тяжелым клиническим последствиям.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что при аэрогенном заражении экспериментальных животных штаммами B.pseudomallei 100 АД=5хЮ2 ж.м.кл./мл и 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5x104 ж.м.кл./мл в макроорганизме происходили существенные необратимые сдвиги белкового, азотистого и углеводного обменов, нарушения ферментативной активности, печеночных проб, электролитного обмена, газового состава крови и КЩС, которые приводили к патологическим изменениям в органах дыхания, сердечно-сосудистой, выделительной системах, что может быть использовано при определении тактики лечебных мероприятий, в частности включение в схему лечения метода гемодиализа с целью освобождения из инфицированного организма продуктов деградации и токсинов.

109