Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Изучение клинико-лабораторных показателей при экспериментальном легочном мелиоидозе

На правах рукописи

Ващанова Ирина Альбертовна

Изучение клинико-лабораторных показателей при экспериментальном

легочном мелиоидозе

14.00 46 - клиническая лабораторная диагностика 03 00 07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов-2007

Работа выполнена в ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители

доктор медицинских наук, профессор Яковлев Анатолий Трофимович,

доктор медицинских наук, профессор Алексеев Владимир Валерьевич.

Официальные оппоненты доктор медицинских наук,

профессор Гладилин Геннадий Павлович,

доктор медицинских наук,

профессор Самойлова Любовь Владимировна.

Ведущая организация - Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Казанская

государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится 2007 г. в час на заседании

диссертационного совета К 208 094.01 при ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава» по адресу. 410012, Саратов, ул. Большая Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава».

Автореферат разослан « » «_»2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Бородулин В Б.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Мелиоидоз занимает особое место в номенклатуре инфекционных заболеваний в силу своей способности вызывать у людей и животных тяжелое заболевание, характеризующееся септицемией с множественными некротическими поражениями внутренних органов, трудно поддающееся антибактериальной терапии (Беляков ВД с соавт, 1990, Тихонов Н Г , 1995, Propost А, Vigier М, 1960, Anuntagool A et al, 2000, Brett Р J, Woods DE, 2000, Fritz DL et al., 2000, Reckseidler SL etal, 2001, Atkins T et al, 2002, Miyagy К, Saito A , 2003, O'Brien G R, et al, 2003)

Среди многообразия клинических проявлений мелиоидоза, легочные формы этого заболевания занимают особое место, поскольку характеризуются, как правило, острым началом, быстрым развитием патологических явлений и высокой смертностью Кроме этого, больные легочной формой мелиоидоза представляют эпидемическую опасность, так как выделяют инфект в окружающую среду (Ковалев Г К, 1971, Кудрявцев А Е, 1986)

Легочная форма мелиоидоза встречается с такой же частотой, как и другие формы болезни, а заражение происходит воздушно-капельным путем от больных людей и животных (Кудрявцев АЕ, 1986, Stanton AT, Fletcher W , 1932) Однако исследователями подчеркивается, что независимо от путей заражения легочная патология при мелиоидозе является одним из ведущих клинических признаков (Bachet R, 1985, Leelarasamee А , Bovornkitty S , 1989) На территории Российской Федерации мелиоидоз не регистрировался, однако постоянно расширяющиеся торгово-экономические связи с эндемичными по данному заболеванию странами создают предпосылки для появления в нашей стране этой опасной инфекции

При мелиоидозе в патологический процесс вовлекаются различные системы организма дыхательная, мочеполовая, желудочно-кишечный тракт, опорно-двигательный аппарат, система кровообращения и т д (Тихонов Н Г, 1995, Кивокурцева ТЮ, 2002) Есть основания считать, что клинико-лабораторные исследования при мелиоидозе могут иметь не только

диагностическое, но и прогностическое значение при проведении лечебных мероприятий и их коррекции в зависимости от тяжести инфекционного процесса

Лабораторные показатели позволяют также выявить осложнения, к которым приводит неправильно выбранная тактика лечения Учитывая широкую вариабельность мелиоидоза по клиническим формам, устойчивость возбудителя к широкому спектру антибактериальных препаратов, представляется целесообразным изучение биохимических процессов, происходящих в макроорганизме при мелиоидозной инфекции, и динамики клинико-лаборагорных показателей

С учетом вышеизложенного, а также принимая во внимание отсутствие научно обоснованных схем клинической лабораторной диагностики, лечения и специфической профилактики, которые должны базироваться на знании механизмов развития мелиоидоза, представляется актуальным проведение научных исследований, которые позволяют выработать меры защитного характера

Учитывая немногочисленный фактический материал по клинико-лабораторным данным, нами была сделана попытка изучения изменений гематологических и биохимических параметров крови при различных клинических вариантах экспериментального мелиоидоза

Цель работы - изучить клинико-лабораторные показатели крови при экспериментальном легочном мелиоидозе, вызванном штаммами с различной вирулентностью

Задачи исследования:

1 Осуществить моделирование легочного мелиоидоза с различными клиническими вариантами

2 Провести гематологические исследования при экспериментальном легочном мелиоидозе

3 Провести изучение биохимических показателей крови экспериментальных животных с различной клинической формой легочного мелиоидоза

4 Провести сравнительный анализ клинико-лабораторных показателей крови инфицированных животных при экспериментальном легочном мелиоидозе с патоморфологическими данными

5 Разработать алгоритм патологических сдвигов клинико-лабораторных показателей при легочном мелиоидозе

Научная новизна исследования. Впервые проведен развернутый анализ крови экспериментальных животных, больных мелиоидозом с различным клиническим течением Установлено, что при экспериментальной острой форме мелиоидоза наблюдались эритроцитопения, высокий лейкоцитоз с угнетением клеток иммунного ответа лимфоцитов, моноцитов и базофилов. При легком течении легочного мелиоидоза гематологические показатели находились в пределах физиологических значений

Впервые изучены биохимические изменения крови в динамике у экпериментальных животных при легочной форме мелиоидоза. При остром процессе отмечены значительные изменения белкового, азотистого, углеводного обменов и активности ферментов (аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы и холинэстеразы), увеличение билирубина и тимоловой пробы, наблюдался значительный сдвиг электролитного обмена При легком течении легочного мелиоидоза биохимические показатели варьировали в пределах референтных величин

У животных, зараженных аэрогенно штаммом В рзеис!ота11е1 100 в дозе 5*102ж м кл /мл и антигенным вариантом В рхеис1ота11е1100-16-1 (Аг8~) в дозе 1,5x104 ж м кл/мл, фиксировались изменения со стороны газового состава и кислотно-щелочного равновесия крови, что свидетельствовало о возникновении у больных животных респираторного и метаболического ацидоза У экспериментальных животных, зараженных атипичным штаммом

В pseudomallei 100-16-1(Аг8") АД=1,5х102 жмкл/мл, показатели газового состава и кислотно-щелочного равновесия изменялись незначительно

Впервые проведен сравнительный анализ полученных клинико-лабораторных показателей с патоморфологическими данными при различных формах аэрогенного мелиоидоза, который показал соответствие нарушений гомеостаза организма с патоморфологическими изменениями

Впервые разработан алгоритм патологических сдвигов на основании клинико-лабораторных показателей при различных формах легочного мелиоидоза При обследовании больного мелиоидозом рекомендуется назначать клинико-лабораторные исследования на следующие диагностически-значимые параметры общий анализ крови, газовый состав, кислотно-щелочное состояние, электролиты крови, концентрацию общего белка, креатинина, мочевины, билирубина, исследование осадочных проб, активность следующих ферментов. аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, холинэстеразы, лактатдегидрогеназы (ACT, AJIT, ЩФ, ХЭ, ЛДГ) Применение предлагаемого алгоритма эффективно для оценки тяжести течения, прогноза исходов инфекционного процесса и коррекции патогенетической терапии Практическая значимость работы Разработанный алгоритм патологических сдвигов на основании клинико-лабораторных показателей при различных клинических вариантах легочного мелиоидоза может быть использован в специализированных лабораториях и в клиниках для подтверждения клинического диагноза мелиоидоза и оценки тяжести течения заболевания, мониторинга лечения и прогноза исходов заболевания наряду с бактериологическими и иммунологическими методами

Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, используются в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте при изучении экспериментального мелиоидоза

Материалы диссертации включены в лекционный материал, предназначенный для врачей, биологов и лаборантов учреждений санитарно-

эпидемиологического профиля и клинических диагностических лабораторий при проведении первичной специализации и курсов усовершенствования по вопросам специфической индикации, лабораторной диагностики особо опасных заболеваний, санитарной охраны территории и противодействия биотерроризму при ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

На основании полученных данных составлены «Методические рекомендации по клинико-лабораторной диагностике мелиоидоза» (Утверждены директором Волгоградского научно-исследовательского противочумного института, протокол заседания Ученого совета № 9 от 21 12 2005 г)

Основные положения, которые выносятся на защиту

1 Гематологические исследования экспериментальных животных с различными клиническими вариантами экспериментального легочного мелиоидоза позволяют определить состояние кроветворной системы макроорганизма

2 Изменение биохимических показателей макроорганизма свидетельствует о степени тяжести поражения и нарушения функциональной деятельности отдельных органов и систем

3 Степень гематологических и биохимических изменений соответствует тяжести патоморфологических проявлений в органах инфицированных животных

4 Разработанный алгоритм патологических сдвигов при клинико-лабораторном обследовании позволяет проводить скрининг и мониторирование состояния больного мелиоидозом Применение предлагаемого алгоритма эффективно для оценки тяжести течения, прогноза исходов инфекционного процесса и коррекции патогенетической терапии при мелиоидозе

Публикации По теме диссертации в печати опубликовано 7 научных работ, в которых отражены основные положения диссертации

Объем и структура работы. Работа изложена на 131 странице, иллюстрирована 2 рисунками, 10 таблицами Состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов Список используемой литературы включает 132 работы отечественных и 68 работ иностранных авторов

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В экспериментах использовали следующие штаммы возбудителя мелиоидоза

I. Высоковирулентный для лабораторных животных штамм В pseudomallei 100 Получен из коллекционного центра ВолгНИПЧИ ЛД50 при подкожном заражении этих животных - 10 ж м ют

2 Штамм В pseudomallei 100-16-1 - дефектный по продукции антигенного комплекса Аг8, полученный методом селекции из штамма В pseudomallei 100 и практически авирулентный для указанных выше животных при подкожном заражении (авторская коллекция НН Пивня 1985г)

В соответствии с эксперементальными задачами, были использованы 500 морских свинок массой 250 г, полученных из питомника Волгоградского НИПЧИ

Первую группу экспериментальных животных заражали аэрогенно культурой В pseudomallei 100 дозой 5x102 ж м кл/мл и В pseudomallei 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5><104м кл /мл, а динамику патоморфологических изменений, гематологических и биохимических показателей крови оценивали на 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9-е сутки после заражения

Вторую группу экспериментальных животных, с целью получения легкого течения легочного мелиоидоза, заражали аэрозолем В pseudomallei 100-16-1 (Аг8") в дозе 1,5 * 102 м кл /мл Наблюдение за этой группой велось на

1, 3, 5, 7, 14, 21, 35, 38, 56, 85-е сутки Все пробы обеззараживали добавлением мертиолята натрия (1 10000) с последующим контрольным высевом на стерильность (Санитарные правила Госсанэпиднадзор России, 1994)

Лабораторное исследование включало в себя клинический анализ показателей периферической крови больных животных, биохимический анализ крови (определение активности аминотрансфераз, билирубина, тимоловой пробы, общего белка, мочевины и креатинина, щелочной фосфатазы, холинэстеразы, электролитов, исследование газового состава и КЩС)

Измерения гематологических показателей (гемоглобин, эритроциты, лейкоциты, лейкоцитарная формула) производили на основании унифицированных методов (Медведев В В , Волчек ЮЗ , 1995; Бойдун Л.В , Логинов АВ, 1996, Назаренко ГИ, 1997, Карпищенко АИ, 1998, 1999, Данилова Л А , 2000, Лобзина Ю В , 2001)

Измерения биохимических показателей крови производили на программируемых фотометрах «MicroIab-200» и «Vitalab Eclipse» (Merck, Германия) после постановки реакции соответствующими диагностическими тест-наборами фирм «Lachema» Чехия) и «Ольвекс» (СПб) (Меньшиков В В , 1982, Алексеев В В с соавт, 1992, Назаренко ГИ, 1997, Тиц НУ., 1997, Колгаров И Ф с соавт, 1999, Маршал В Дж, 2000, Данилова Л А , 2003)

Исследование газового состава крови экспериментальных животных и КЩС определяли на автоматизированных анализаторах газового состава крови ABL 615/625 «Radiometer» (Дания).

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью компьютерной программы Microsoft Office Exel 2003 г Результаты исследований и их обсуждение Аспирационный путь заражения мелиоидозом является одним из наиболее вероятных, вследствие чего часто развивается легочная форма инфекции Больные с легочной формой мелиоидоза составляют большую часть среди людей, заразившихся в естественных условиях, их появление возможно

и в результате аварийных ситуаций в специализированных микробиологических учреждениях

Указанные обстоятельства объясняют необходимость определения информативных параметров клинической лабораторной диагностики с целью установления тяжести заболевания по нарушениям параметров биохимических и гематологических процессов, происходящих в макроорганизме

У морских свинок, зараженных В рзеис!ота11е1 100 АД=5Х102 ж м кл /мл и В рзеи£1ота11е1 100-16-1 (Аг8")АД = 1,5*104 ж м кл /мл, развивалась острая форма легочного мелиоидоза Вскрытие животных в различные сроки после заражения показало, что первые макроизменения во внутренних органах обнаруживались уже через 24 часа незначительное увеличение всех групп лимфоузлов, кровенаполнение печени и селезенки На 2-е сутки в легких наблюдали образование множественных узелков с серозным содержимым размером 3-5 мм, гипертрофию лимфоузлов, увеличение в 1,5-2 раза печени и селезенки Животные были малоподвижны, у всех особей - начальная стадия геморрагического ринита и конъюнктивита Через трое суток в легких наблюдали развитие лобарной и долевой пневмонии с некротическими очагами. На 4 -5-е сутки отмечены усиление воспалительных и деструктивных процессов в легких и начало падежа животных Гибель наступала от гнойной бронхопневмонии, а инфекционный процесс протекал по типу септицемии Средняя продолжительность жизни составила 6-10 дней, летальность - 100% При аэрогенном заражении животных антигенным вариантом возбудителя мелиоидоза В рзеис1отаНе1 100-16-1 (Аг8 ) в дозе 1,5><104 ж.мкл/мл и 1,5х102 жмкл/мл у животных наблюдали два клинических варианта легочного мелиоидоза - острую форму и легкое течение заболевания Острый вариант при аэрогенном заражении антигенным вариантом дозой 1,5*104 ж м кл /мл имел в целом, те же признаки, что и при заражении исходным штаммом В рзеис1ота11е! 100 Через 3-4 суток отмечено нарастание воспалительных явлений в легких — образование мелких множественных гнойных узлов на поверхности и в толще ткани, а в

дальнейшем (5-7 сут) - слияние их в обширные некротические очаги, вплоть до образования гнойной еливной пневмонии и их гибель через 9—13 дней после инфицирования Процесс протекал по типу септицемии Летальность достигала 80 - 90%

Второй вариант характеризовался легким течением с благоприятным исходом при заражении В рэеисЬтаПи 100-16-1 (Аг8~) АД = 1,5х102 жмкл /мл Признаки начальной стадии мелиоидозной пневмонии и регионарного лимфаденита появлялись на 7-е сутки Активное развитие пневмонии с образованием единичных или множественных гнойных узелков, преимущественно в верхних долях легких, происходило на 14 - 21-е сутки

В последующие дни наблюдения отмечали плеврит, сращивание листков плевры Отмечалось образование в печени и селезенке единичных гнойно-некротических узелков Формирование в легких осумкованных абсцессов с гнойно-серозным содержимым диаметром до 5 мм происходило на 28 - 30-й день заболевания По истечении 60 дней инфекционного процесса у большей части животных размеры абсцессов достигали 10 мм, отмечалось перерождение легочной ткани Подобная патологоанатомическая картина сохранялась у животных до конца срока наблюдения (85 сут)

Таким образом, у животных, зараженных типичной культурой, возникала острая форма легочного мелиоидоза, приводящая через 5 — 7 дней к 100%-й гибели животных, а у морских свинок, инфицированных штаммом В рзеис1ота11е1 100-16-1(Аг8") в зависимости от дозы, наблюдали как острую форму мелиоидоза, так и легкое течение инфекции, которое заканчивалось выздоровлением 60 - 70% особей

Гематологические показатели помогают выявить заболевания крови и отражают степень воспалительного процесса

При аэрогенном заражении морских свинок взвесями культур В рзеис1ота11е1 100 АД=5><102 ж м кл /мл и В ряеиск>та11е1 100-16-1 (Аг8")АД = =1,5хЮ4 жмкл /мл отмечена тенденция к снижению количества эритроцитов с первых дней до конца срока наблюдения (от 3,8±0,17 до 3,3±0,22хЮ12 при

N=4,3*0,13 х 1012)(р<0,05) Эритроцитопения, возможно, была обусловлена выбросом в кровь макроорганизма токсинов в начале инфекционного процесса, нарушением эритроцитопоэза, разрушением эритроцитов, возникновением печеночной и почечной недостаточности, те нарушением процесса утилизации В то же время у морских свинок, зараженных штаммом В рзеис1ота11е1 100-16-1 (Аг8") АД = 1,5* 102 жмкл/мл, динамика изменения количества эритроцитов колебалась в пределах физиологически значимых величин (4,0±0,22 - 4,2±0,18х 1012)

Изучение лейкоцитарной картины крови морских свинок, инфицированных ВрзеиёотаПи 100 АД=5х102жмк/мл и 100-16-1 (Аг8") АД=1,5><104 жмкл/мл, дало информацию о ходе течения клинических проявлений в разные сроки Количество лейкоцитов крови у экспериментальных животных, зараженных этими возбудителями, увеличивалось уже начиная со 2-го дня после заражения и к 13 суткам достигало высоких величин (19,2±0,31><109 при ]Ч=9,8±0,54хЮ9)(р<0,05), что отражало степень остроты воспалительного процесса Изменялась также морфология нейтрофилов возникали клетки с дегрануляцией и вакуолизацией У морских свинок, зараженных В.ряеис1ота11е1 100-16-1 (Аг8") АД =1,5х х 102 ж м.кл /мл, динамика изменения количества лейкоцитов в крови была без изменений и находилась в пределах физиологических показателей (от 8,8±0,07 до 9,3±0,22х109 при N-9,8+0,54*109)

Количество лимфоцитов увеличивалось в первые дни после заражения независимо от штамма микроорганизма, что, вероятно, связано с включением иммунных резервов макроорганизма в ответ на введение инфекта У морских свинок, зараженных В рзеис1ота11е1 100 АД=5х102 жм к/мл и ВрвеискипаИе! 100-16-1 (Аг8~) АД = 1,5х104жмкл /мл, концентрация лимфоцитов снижалась на Ю-е сутки (до 32,7±1,09% при N=44,8*0,68%)(р<0,05), а у животных, зараженных В рэеискнпаНе! 100-16-1(Аг8") АД=1,5*102 ж м кл /мл, количество лимфоцитов держалось на высоком уровне до 10-го дня наблюдения (76,0±2,87% при М=44,8±0,68%)(р<0,05)

В динамике показателей сегментоядерных нейтрофилов на 3-й сутки наблюдалось повышение их числа (от 44,±0,94 до 63,7±0,98% при М=36,8±0,59%)(р<0,05), которое держалось на сравнительно высоком уровне до конца наблюдения у морских свинок, зараженных В рзеис1ота11е1 100 АД=5><102ж м к /мл и В рзеиёота11е1100-16-1(Аг8") в дозе 1,5*104 жмкл /мл

При патоморфологическом исследовании отмечалось соответствие с гематологическими данными Выявляли полнокровие селезенки и диффузную инфильтрацию красной пульпы сегментоядерными лейкоцитами В легких альвеолы были заполнены сегментоядерными нейтрофилами

Штамм В рзеис!отаНе1 100-16-1 (Аг8) в дозе 1,5х102 жмкл /мл, напротив, приводил к снижению концентрации сегментоядерных нейтрофилов на 3-й день (от 11,0±3,68% до 7,0±2,05% при №36,8±0,59%)(р<0,05), и этот показатель приходил к норме физиологических величин после 15-го дня

Количество базофидьных лейкоцитов при заражении В рхеис1ота11е1 100 АД=5хЮ2 жм к/мл и штаммом 100-16-1 (Аг8") в высоких дозах снижалось (0,33±0,27%, при М=0,8±0,15%)(р<0,05), что, вероятно, связано с развитием патологических процессов в органах иммунной системы, тогда как у морских свинок, зараженных штаммом 100-16-1(Аг8~) в низких дозах, уровень базофилов колебался в физиологических пределах (от 0,7±0,27% до 1,0±0,00% при ММ).8±0,15%), что дало основание для предположения о том, что штамм В рзеис1ота11е1 100-16-1(Аг8") в низких аспирационных дозах не подавляет лейкопоэз

Изменения концентрации моноцитов и эозинофилов при экспериментальном мелиоидозе, вызванном заражением различными штаммами, были сходными и характеризовались низким уровнем этих элементов крови, уровень моноцитов был низок (от 6,0±0,47% до 2,3±0,27% при >)=8,8±0,49%)(р<0,05), что было вызвано, вероятно, присутствующими агрессивными компонентами возбудителя В рэеисЬтаПе! При заражении В рзеис1отаНе1 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5х102 жмкл/мл организм морских свинок после краткого периода угнетения восстанавливал свои основные

функции, и, по всей вероятности, с 10-го дня начиналась стимуляция моноцитопоэза (от 9,3±0,54% до 18,5±0,35% при Н=8,8±0,49%)(р<0,05), т е макроорганизм вновь активизировал свои защитные функции

Полученные результаты позволяют предположить, что клетками лейкоцитов - лимфоцитами, моноцитами, базофилами - обеспечивался защитный механизм организма, т е клеточный иммунитет

Таким образом, при аэрогенном заражении типичным штаммом возбудителя мелиоидоза и штаммом 100-16-1 (Аг8~) в высоких концентрациях отмечалась тенденция угнетения эритропоэза, которая, возможно, обусловлена воздействием токсинов микроорганизма и продуктов его метаболизма.

В то же время у животных, зараженных взвесью штамма 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5х102 ж м кл /мл, нарушения со стороны гематологических показателей были незначительны или при первоначальном изменении быстро восстанавливались до физиологических величин

При исследовании биохимических показателей крови у экспериментальных животных, зараженных В рзеис!ота11е1 100 АД=5*102 ж м к/мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5хЮ4 жмкл/мл, регистрировалось снижение концентрации белка на 1-е сутки (39,7±0,58г/л, при М=45,6±1,83г/л) (р<0,05), которое вероятно можно рассматривать как признак подавления метаболических процессов в организме, и затем возникновение некротических процессов в паренхиме печени при мелиоидозе, как и при других тяжелых инфекционных заболеваниях

После заражения морских свинок штаммом В рзеис1ота11е1 100-16-1(Аг8") дозой 1,5x102 жмкл./мл концентрация белка в крови оставалась в пределах физиологических норм Незначительное повышение происходило на 5 - 7-е сутки (49,7±0,58г/л при Ы=45,6±1,83г/л) (р<0,05), по всей вероятности, как защитная реакция макроорганизма на введение инфекта, за счет повышения синтеза альбумина и различных классов иммуноглобулинов (табл 1)

Заражение животных В рзеис1ота11е1 100 АД=5х102ж м к /мл и штаммом 100-16-1(Аг8~) дозой 1,5x104 жмкл/мл приводило к резкому нарушению азотистого обмена, прежде всего двух основных его параметров - креатинина и мочевины

Показатели креатинина превышали норму уже на 2-е сутки, максимальные величины определяли на 5 - 7-е сутки (158,5±5,28 мкмоль/л при Ы=67,8±б,59 мкмоль/л) (р<0,05), и держались на высоких уровнях до конца наблюдения Устойчивое повышение уровня креатинина в крови шло параллельно с возрастанием концентрации мочевины (от 4,7±0,21 до 10,97±0,71 ммоль/л при К=2,9±0,52 ммоль/л) (р<0,05) и указывало на нарушение функции почечной фильтрации и реабсорбции, возможное поражение паренхимы почек, т е наступала выраженная интоксикация организма продуктами нарушенного азотистого обмена (табл 1)

Таблица 1

Показатели белкового и азотистого обменов при

экспериментальном мелиоидозе

Параметры КГ Штамм В рясиск) та11е1 Время наблюдения сут Х±ш

1 2 3 5 7 10 13/Ь 20 35

Общий белок г/л 45 б±1 83 100 39 7±0 :>8 42 610 91 55 5±2 11 40 8±2 12 619±062 Ч 39э±0 5| Ч 30 8±042 Ч - -

100-16-1Аг8" 1.5Х103 45 2±0,79 4б,2±1 33 47 8±079 48 4±0 80 49 7±0 58 44,0±1,20 43 2±1 49 43,2±1 90 46,20±190

Крсатанин мкмопь/т 67 8±б 59 100 60М3 31 121,8±5,2 Ч 140 3±0 78 Ч 143,2±5 6< Ч 1з8 5±5 28 Ч 1603±0 85 Ч 184 8±7 62 Ч -

100 16-1Аг8 1 5*10 62.5±3 25 6233,18 62 9±2 78 64,5*2,78 65 4±135 61 5±3 94 60,1±3 29 590±3 48 * 57 5±4,72

Мочевина ммоль/л 2 9±<Ъ2 100 2 23±0 21 2л±0 16 3 7±0 17 Ч 4 7±0 21 *# 7 07±0,45 Ч 9 20±0 09 Ч 10 9740,71 Ч - -

100 1б-1Аг8 I 2 э3±0 45 2 8±0 45 2,2±0,21 2 5±0 33 1 8±009 1 7±0 20 1 74±0 12 170±0 21 1 53±0 18

Примечания

* - статистически достоверные различия с показателями КГ (р< 0,05),

# - статистически достоверные различия с показателями 2-й группы (р<0,05), (--) - отсутствие результата

В этот период патоморфологическими данными показано, что происходила дессиминация микробов в органах с одновременным началом элиминации возбудителя и бактериемии

В группе экспериментальных животных, зараженных В pseudomallei 100-16-1 (Аг8") дозой 1,5*102 жмкл/мл, юшнико-лабораторные изменения со стороны белкового и азотистого обменов были незначительными и колебались в физиологических пределах (табл 1) Клинически инфекционный процесс протекал в легкой форме В этот период бактериемию определяли у единичных животных на 5-е сутки.

В опытах на морских свинках, инфицированных В pseudomallei 100 АД=5х102 жм.к/мл и штаммом 100-16-1(Аг8") дозой 1,5><104 жмкл/мл, установлено повышение глюкозы уже на 2 - 3-й сутки после заражения (от 8,0±0,68 до 17,7±0,34 ммоль/л при N=4,9±0,52 ммоль/л) (р<0,05) Высокий уровень глюкозы держался 10 суток, а затем наблюдалось ее снижение. В то же время у морских свинок, зараженных В pseudomallei 100-16-1 (Аг8") дозой 1,5х 102 ж м кл /мл, уровень глюкозы крови оставался в пределах нормальных физиологических показателей (от 4,0±0,05 до 4,7±0,03 ммоль/л при N=4,9±0,52 ммоль/л) Повышение концентрации глюкозы в крови у морских свинок первой группы вероятно связано с поражением функции поджелудочной железы

У морских свинок, зараженных В pseudomallei 100 АД=5х 102 ж м кл /мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в концентрации 1,5х104 жмкл/мл, происходили значительные нарушения активности ферментов У основных ферментов, таких как аспартатаминотрансфераза (ACT), аланинаминотрансфераза (АЛТ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ), участвующих в обмене аминокислот и углеводов, энзимная активность повышалась на 2 - 3-й сутки после инфицирования и держалась весь период наблюдения (ACT от 0,33±0,02 до 1,69±0,16 мккат/л при N=0,26±0,07 мккат/л, АЛТ от 0,37±0,01 до 1,09±0,29 мккат/л при N=0,22±0,03 мккат/л, ЛДГ от 92,8±3,53 до 675,7±44,0 Ед/л при N=75,4±l,82 Ед/л) (р<0,05) Так как эти ферменты в норме содержатся в мышцах, сердце и

печени, то увеличение их концентрации в крови свидетельствовало о некрозе и поражении тканей внутренних органов микроорганизмами (табл 2)

Таблица 2

Изучение активности ферментов крови, билирубина и тимоловой пробы

при экспериментальном легочном мелиоидозе

Параметры КГ Штамм В pseudo mallei Время наблюдения, сут, Х±т

1 2 3 3 7 10 13/15 20 35

Щелочная фоефзлш сд/л 50,3*3 83 100 496*4,26 56 7*6,35 103,3*7 56 ч Ы,2±25 18 Ч 226,4*4 67 Ч 298.4*27 95 Ч 149 3±4 6 »# - -

100 16 1 Аг8 1.5-10" з 1,7*4,20 52,7±4 25 53 9*4 09 57 3*4,9 50,2*1 97 45,6*1 82 45 2*1 34 47 2*1 82 49 3*0,42

Холин-зстераза сд/л 31,4*1,79 100 35,7*2,03 48 1*2 72 61,2*4 33 Ч 77,1*3,49 Ч 38,0*2,95 Ч 29 6*0 98 9 4*0,71 Ч - -

100 16-1 Аг8 13-10' 30,7*1,44 31,1+0,87 32 0±0 73 32 2*1 04 31 1±0 64 30,4*0,91 28 2*1 19 27 9*1.37 29 3*1 1/

Билирл'бик мкчоль/л 2,9*1 08 100 2 9*0 35 66*031 Ч 13it0p4 Ч 13 ОМ,43 Ч 5 2*0,26 * 3 8*0 12 3,23*0 35 - -

100 16 1 Аг8 1 5-102 3.2*0,83 3 2*0 78 4 7*0 12 5 03*0 14 5,0*0 19 * 4,6*0 26 4 з*0 24 * 4 7*0 26 4 7*0 32

Тимоловая проба сд 1 6*0 48 100 1 3*0 19 1 8*0 07 2 10±0 17 Ч 3 6*0 31 ч 5 3*0 31 ч 6,8*0 14 Ч 11,3*0 43 Ч -

100 16-1 Аг8 1 5-10- 1,5*0,21 1 9±0,2з 19*0.26 2 07*0 23 1 4*0 07 1,4*0 12 1,3*0 05 14*0 14 16*0 11

Аспартатамнн □трансферта мккат/л 0 26*0 07 100 0 14±0 01 0 26*0 02 0,33*0 02 0 50*0 04 Ч 0,75*0 Оз Ч 0 97*0,03 Ч 1 69*0 16 Ч - -

loo 16-1 Аг8 1 зхЩ2 0,23±0 01 0 27*0 02 0 29*0 02 0,33*0 04 0 33*0 02 0 20*0,01 018*0 03 0 16*0 02 0 14*001

Аланина миног рансфераза мккат/л, 0 22*0 03 100 0,20*0 01 0 2з*0 02 0 37*001 ч 0 61*0 05 ч 0 83*0 04 ч 1,07*0 03 ч 109*0 29 ч - -

100 16 1 Аг8 1 3-10 0_2э±0 02 0 27*0 01 0 32*002 0 36*0 04 0 3з*0 02 0 18*0 02 0 14*0 02 0 16*0,02 0 15*0 01

Примечания

* - статистически достоверные различия с показателями КГ (р< 0,05),

# - статистически достоверные различия с показателями 2-й группы (р<0,05), (-) - отсутствие результата

Из данных табл 2 видно, что при аэрогенном заражении экспериментальных животных штаммом В pseudomallei 100-16-1(Аг8") в концентрации 1,5x102 жмкл/мл активность ферментов крови (ACT, AJ1T, ЩФ, ХЭ) оставалась в пределах нормы

Полученные клинико-лабораторные показатели полностью соответствуют патоморфологическим у данной группы животных Изменения в печени в виде слабо выраженного полнокровия, единичных

внутридольковых инфильтратов, состоявших из макрофагов, лимфоидных клеток и нейтрофилов, носили однотипный характер

Параметры активности холинэстеразы (ХЭ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) у животных первой группы повысились на 2-е сутки (ХЭ от 48Д±2,72 до 77,1±3,49 Ед/л при №=31,4±1,79 Ед/л, ЩФ от 103,3±7,56 до 298,4±27,95 Ед/л при Ы=50,5±3,83 Ед/л) (р<0,05), что возможно указывало на поражение паренхимы и возникновение застойных процессов в печени В группе экспериментальных животных, инфицированных В рвеис1ота11еП00-16-1(Аг8") в концентрации 1,5><102ж м кл/мл изменения параметров активности ХЭ и ЩФ не наблюдались

Показатели ТП повышались уже на 5-е сутки (от 3,6±0,31 до 11,3±0,43 ед при N=1,6*0,48 ед) (р<0,05) и держались на высоком уровне до конца наблюдения Динамика повышения активности ТП была плавная, и такая кривая в начальном периоде болезни прямо коррелировала со специфическим иммунным ответом макроорганизма на внедрение возбудителя инфекционной болезни, т е синтезом иммуноглобулинов класса М (Меньшиков В В , 1987) В наших опытах показатели тимоловой пробы коррелировали с данными динамики лимфоцитов Дальнейшее стабильное повышенное ТП говорило о тяжелом органическом поражении печеночных клеток

В первой группе морских свинок важным объективным признаком поражения печени являлось увеличение содержания общего билирубина в крови билирубин повышался на 2-е сутки, достигал максимума на 5-е сутки (от 6,6±0,31 до 15,0±0,45 мкмоль/л при N=2,9*1,08 мкмоль/л) (р<0,05) Повышение билирубина связано, вероятно, с деструктивно-дистрофическими изменениями паренхимы печени, инфильтрацией в строме и распадом эритроцитов (см табл 2). В группе животных, зараженных В рзеи<1ота11е1 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5x102 ж м кл /мл, концентрация билирубина менялась в сторону повышения с максимальйыми показателями с 3-х по 7-е сутки, в последующие сроки наблюдения уровень билирубина держался несколько выше физиологических показателей Аналогичные изменения отмечены и в

показателях ТП, что является благоприятным прогнозом исхода инфекционного процесса

У морских свинок, зараженных В рБеис1ота11е1 100 АД=5х102ж м к /мл и штаммом 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5х104 жмкл/мл, уровень мочевой кислоты увеличивался на 7-е сутки (от 373,1±14,21 до 534,0±53,02 при М=268,1±49,6 мкмоль/л) (р<0,05), что, вероятно, связано с усилением распада клеток, нарушением выделения мочевой кислоты с мочой и изменением эндокринной регуляции обмена пуриновых оснований - вторичная гиперурикемия

В то же время у экспериментальных животных при легком течении мелиоидоза концентрация мочевой кислоты в крови колебалась в незначительных пределах (от 215,5±14,03 до 229,6±22,32 при N^268,1 ±49,6 мкмоль/л), тем самым исключалось нарушение пуринового обмена и функции деятельности почек

В организме морских свинок, зараженных В рзеис1ота11е1 100 АД=5х102 ж м к/мл и штаммом В рвеийотаНе! 100-16-1(Аг8") в концентрации 1,5><104 ж м кл./мл, наблюдались значительные сдвиги электролитного обмена

Концентрация ионов калия в плазме крови морских свинок первой группы повышалась резко уже на 2-е сутки Острая гиперкалиемия наступала, вероятно, как результат острого инфекционного шока, снижения экскреции К+ почками, начального этапа почечной недостаточности и нарушения белкового обмена

Уровень содержания ионов натрия в плазме крови морских свинок, зараженных вирулентным штаммом, повышался незначительно (140,0±0,21 ммоль/л при ]\И132,6±0,78 ммоль/л), что было связано с задержкой обмена ионов через почки в связи с нарушением их функции

Содержание ионов магния в плазме морских свинок, зараженных В рзеис1ота11е1 100 АД=5х]02 ж м к/мл и штаммом В рзеи<Зота11е1 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5х 104 ж м кл /мл, увеличивалось на 5 - 7-е сутки (от 2,90±0,17 до 4,30±0,10 ммоль/л при Ы=1,5±0,06 ммоль/л)(р<0,05),что приводило,

возможно, к нарушению дыхательной функции за счет угнетения дыхательного центра и блокировки проводящей системы сердца

В экспериментальных условиях на модели морских свинок показано, что при заражении их взвесью культур В pseudomallei 100 АД^5Х102 ж м к /мл и штаммом В pseudomallei 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5><104 ж м.кл /мл происходили существенные изменения биохимических процессов в организме экспериментальных животных Это нарушения белкового, азотистого, углеводного обменов, ферментной системы, водно-солевого баланса У морских свинок, зараженных штаммом В pseudomallei 100-16-1 (Аг8") в концентрации 1,5x102 ж м кл /мл биохимические показатели и картина крови существенно не отличались от показателей в контрольной группе лабораторных животных Таким образом, вышеизложенные данные вполне могут быть использованы для коррекции тактики патогенетических и специфических лечебных мероприятий при мелиоидозе, в частности включения в схему лечения метода гемодиализа с целью освобождения из инфицированного организма продуктов деградации и токсинов

В опытах с использованием вирулентного штамма В pseudomallei 100 АД=5х102 жм к/мл и штамма 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5*Ю4 ж м кл/мл на 3-й сутки возникала острая форма легочного мелиоидоза Прежде всего, повышалось парциальное давление С02 (рС02) 55,9±4,2 mmHg (N= 48,3 ± 0,71)(р<0,05) Поскольку величина рН связана с рС02, то отмечено ее снижение до 7,0±0,02 (N=7,1) Параллельно снизилась концентрация бикарбоната плазмы с НС03 до 15,1 ± 1,32 ммоль/л (N=19,8 ± 1,50 ммоль/л) (р<0,05) и р02 до 69,7 (N=88,9±0,7 mmHg), т е появлялись признаки метаболического ацидоза, что подтверждено показателем «SBE - стандартный избыток оснований» его величина снизилась в два раза - 0,8±0,02 ммоль/л (N= = 1,9 ±0,42) (р<0,05)

Соответственно падала артериальная концентрация общего кислорода (сЮ2) 16,1 ±0,43 (N=18,6±0,22) (р<0,05), что приводило к снижению возможности артериальной крови отдавать 02 тканям Этот показатель

подтверждался параметром «насыщения Ог артериальной крови» (§02), что позволяло биохимически оценивать процессы оксигенации и диссоциации гемоглобина, а также критерии потенциального транспорта 02 (02НЬ, 74,0± 1,0%, N = 94,4 ± 1,68 %) (р<0,05)

Биохимические нарушения, приводящие к снижению оксигенации крови, приводили к снижению и емкости 02 носителя ШЬ (124,6±1,61 ф,

И= 140,3±1,23) (р<0,05), что коррелировало с данными общего анализа крови и снижением содержания 02 в крови

Процессы, снижающие 02 в крови, закономерно повышали уровень карбНв (0,64 ± 0,22, Ы= 0,44 ±0,10) )(р<0,05) и МеШв (0,7 ±0,17, И= 0,4 ± 0,09)(р<0,05) В то же время в группе экспериментальных животных с легким течением мелиоидоза, газовый состав крови и КЩС не изменялись Их показатели были аналогичны показателям газового состава и КЩС крови контрольных животных

Таким образом, при аэрогенном заражении вирулентным штаммом В ряеисЗ-отаИе! 100 АД=5*Ю2ж м кл /мл и атипичным штаммом В ряеиёотаПа 100-16-1(Аг8") в дозе 1,5х]04 ж м кл /мл у экспериментальных животных на 3-и сутки развивались гипоксия и метаболический ацидоз за счет снижения рН и рС02, вследствие чего нарушалась оксигенация крови, увеличивалось содержание карбНв и метНв Учитывая полученные результаты, представляется необходимым включение в схему лечения мелиоидоза искусственной вентиляции легких с оксигенацией 02 и лечебных мероприятий по устранению ацидоза крови

ВЫВОДЫ

1 При аэрогенном заражении экспериментальных животных типичным и атипичным штаммами и различными дозами мелиоидозных микробов отмечалось специфическое различие в клиническом течении инфекции При заражении типичным штаммом В рзеи<Зота11е1 100 ЛД=5 * 107 ж м кл /мл развивалась острая форма легочного мелиоидоза, которая приводила к

100%-ной гибели животных, а у морских свинок, инфицированных штаммом В pseudomallei 100-16-1 (Аг8") в зависимости от дозы заражения, наблюдали как острое течение мелиоидоза, так и легкое течение инфекции, которое заканчивалось выздоровлением 60 - 70% особей

2 У животных, зараженных B.pseudomallei 100 АД=5хЮ2ж м кл /мл и штаммом Ю0-16-1(Аг8") в концентрации 1,5* 104 жмкл/мл, на 3-й сутки в легких обнаруживалась острая гнойная бронхопневмония с геморрагическим компонентом и выраженной интоксикацией У животных, зараженных В pseudomallei 100-16-1 (Аг8 ) в дозе 1,5* 102 ж м кл /мл, отмечалась картина бронхопневмонии на 9-е сутки с менее выраженными показателями интоксикации

3 Острая форма мелиоидоза сопровождалась эритроцитопенией, высоким лейкоцитозом с угнетением клеток иммунного ответа (лимфоцитов, моноцитов и базофилов) При легком течении легочного мелиоидоза динамика изменения гематологических показателей находилась в пределах физиологических значений

4 Легочный мелиоидоз у зараженных животных В pseudomallei 100 АД=5 х 102 ж м кл /мл и штаммом 100-16-1(Аг8) в концентрации 1,5x104 ж м кл /мл приводил к выраженным нарушениям со стороны белкового, азотистого и углеводного обменов, активности ферментов (ACT, АЛТ, ЛДГ, а-амилаза, ЩФ, ХЭ), билирубина, тимоловой пробы и электролитов (К+, NA , Mg+, Fe ) При легкой форме легочного мелиоидоза биохимические показатели варьировали в пределах физиологических величин

5 Исследования крови экспериментальных животных при острой форме легочного мелиоидоза, зараженных типичным и атипичным штаммами в большой концентрации, показали нарушения со стороны газового состава крови и КЩС, которые приводили к метаболическому ацидозу У больных животных, зараженных атипичным штаммом в низкой концентрации, показатели газового состава и КЩС изменялись незначительно

6 При сравнительном анализе полученных клинико-лабораторных показателей прослеживалась взаимосвязь с патоморфологическими данными различных клинических вариантов легочного мелиоидоза Увеличение количества лейкоцитов при острой форме легочного мелиоидоза сопровождалось образованием сливных очагов гнойной бронхопневмонии, выраженные биохимические нарушения сочетались с образованием гранулем и участков некроза в паренхиме печени При легком течении легочного мелиоидоза незначительные гематологические и биохимические изменения сопровождались отсутствием специфических мелиоидозных гранулем и некроза в паренхиме печени, а в легких преобладали продуктивные процессы над деструктивными

7 Разработанный алгоритм патологических сдвигов на основании клинико-лабораторного обследования позволяет проводить скрининг и мониторирование состояния больного мелиоидозом Применение предлагаемого алгоритма эффективно для оценки тяжести течения, прогноза исходов инфекционного процесса и коррекции патогенетической терапии

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Ващанова, И А Показатели гомеостаза макроорганизма при легочном мелиоидозе / И.А Ващанова, В В Алексеев, А Т. Яковлев // Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации и социализации человека Материалы 4-й Всерос науч -практ конф -Волгоград, 2005 - С 306-307

2 Изменения биохимических процессов в макроорганизме при экспериментальном мелиоидозе / И А Ващанова, В В Алексеев, А Т Яковлев, НГ Плеханова // Состояние здоровья населения Волгоградской области и современные медицинские технологии его коррекции Материалы науч-практ конф - Волгоград, 2005 -С 147-148

3 Изучение изменения гомеостаза макроорганизма при экспериментальном мелиоидозе / И А Ващанова, В В Алексеев, А Т Яковлев, Н Г Плеханова // Санитарная охрана территорий государств-

участников Содружества Независимых Государств проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях Материалы VI Межгос науч -практ конф государств-участников СНГ -Волгоград, 2005. - С 131 - 133

4 Некоторые особенности механизма развития мелиоидоза у биопробных животных при аэрогенном заражении / И А Ващанова, В В Алексеев, А Т Яковлев, Н Г Плеханова // Санитарная охрана территорий государств- участников Содружества Независимых Государств проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях. Материалы VI Межгос науч -практ конф государств-участников СНГ. - Волгоград, 2005. - С 133-134

5 Изучение изменений гематологических и биохимических показателей при экспериментальном легочном мелиоидозе / И А Ващанова, В В Алексеев, А Т Яковлев, Н Г Плеханова // Опыт работы центров социально-психологической адаптации студентов Материалы Всерос науч -практ конф - Волгоград, 2006 - С 13-18

6 Изменения газового состава и кислотно-щелочного состояния крови макроорганизма при экспериментальном легочном мелиоидозе / И А Ващанова, В В Алексеев, А Т. Яковлев, Н Г Плеханова // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группа восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств Материалы VII Межгос, науч - практ конф государств-участников СНГ - Оболенск, 2006 - С 141-142

7 Изучение патоморфологических и клинико-лабораторных показателей макроорганизма при экспериментальном легочном мелиоидозе / И А Ващанова, В В Алексеев, А Т. Яковлев, Н Г Плеханова // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета - 2006 - № 4 -С 31 -34

Подписано к печати 17 09.2007 Объем - 1печ л Тираж 100 Заказ № 795 Отпечатано в типографии 400011, г Волгоград, ул Электролесовская 55, ООО «Волгоградское научное издательство»