Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Изучение индуцированного васкулогенеза в 3D культуре мультипотентных мезенхимных стромальных клеток пупочного канатика

005054462

На правах рукописи

ГОРКУН АНАСТАСИЯ АЛЕКСЕЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ИНДУЦИРОВАННОГО ВАСКУЛОГЕНЕЗА В ЗБ КУЛЬТУРЕ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПУПОЧНОГО КАНАТИКА

14.03.03 — Патологическая физиология 03.03.04 — Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 8 НОЯ 2012

Москва - 2012

005054462

Работа выполнена в Лаборатории клеточной биологии и патологии развития Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской академии медицинских наук

Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН Вадим Сергеевич Репин Доктор биологических наук Ирина Николаевна Сабурина

Официальные оппоненты: Александр Григорьевич Тоневицкий

Доктор биологических наук, профессор, член-корресподент РАН Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН Заведующий Лабораторией молекулярной физиологии

Ирина Анатольевна Василенко

Доктор медицинских наук, профессор

Филиал ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.К.Пирогова Минздравсоцразвития России «Научно-клинический центр геронтологии» Руководитель Лаборатории цитоморфометрии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится «_» _ 2012 года в _часов на

заседании Диссертационного совета Д 001.003.01 ФГБУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН, по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, дом 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИОПП» РАМН Автореферат разослан «_»_2012 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета кандидат медицинских наук

Л.Н. Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В основе многих патологических состояний лежит нарушение структуры кровеносной системы (Chappell J.С., Bautch V.L., 2010). Сосудистая сеть млекопитающих динамически перестраивается в течение всего онтогенеза в соответствии с потребностями окружающих тканей. Основными механизмами образования и роста кровеносных сосудов являются ангиогенез и васкулогенез. Васкулогенез — это сборка капилляров из отдельных разрозненных эндотелиальных прогениторов (ЭП), одновременно собирающихся в единую систему in vivo или in vitro. В отличие от васкулогенеза, при ангиогенезе эндотелиальные прогениторы направленно мигрируют из терминалей капилляров, формируя новый тяж (cord) вслед за ведущими клетками (tip cells). Изучение клеточных механизмов ангио- и васкулогенеза in vivo и in vitro позволило идентифицировать две субпопуляции ЭП: «ранние» ЭП (CD133+/CD34+/VEGF+ клетки) и «поздние» ЭП (CD31+/ Flk-l+/vWF+ клетки). Введение поздних ЭП в ишемизированные ткани (Asahara Т., 2007, Kim H. et al., 2010), в сердечную мышцу при инфаркте миокарда (Jujo К. et al., 2008, Chong J.J., 2012) и в ткань печени при хронической недостаточности (Ueno T. et al., 2006) приводило к восстановлению кровоснабжения и усилению регенерации. Регенерация печени сопровождалась снижением фиброза. Однако клиническое применение ауто-ЭП лимитировано их малым количеством в циркулирующей крови: 2-3 ЭП/мл (Asahara T. et al. 1997). Поэтому за последнее десятилетие возрос интерес к искусственному получению ЭП из доступных резервов, прежде всего из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) взрослых тканей. Было показано, что первичная культура ММСК, выделенная из Вартонова студня пупочного канатика (ПК), обогащена ранними ЭП в большей степени, чем аспират костного мозга взрослого организма (Wang W. et al., 2009, Semenov O.V., Brayman С., 2011). Добавление в ростовую среду VEGF индуцировало образование в 2D культуре ММСК ПК поздних CD31+/vWF+ ЭП (Chen M.Y. et al., 2009, Dai N. et al., 2012). Несмотря на то, что пупочный канатик является универсальным источником низкодифференцированных клеток различного фенотипа (Pelosi Е. et al., 2012), в 2D культуре не удается моделировать развитие ранних и поздних ЭП. Условия 3D культивирования лучше моделируют структуры нативной ткани и полноценный морфогенез. Однако до сих пор нет адекватных моделей васкуло- и ангиогенеза в 3D культуре ММСК, механизмы этих процессов остаются неизученными, так как исследования в этой области проводились в основном на эмбриональных ангиобластах (Jakobsson L. et al., 2007).

Цель исследования. Изучить индуцированные УЕСР ангиогенные и васкулогенные характеристики ММСК ПК в ЗБ культуре. Задачи исследования:

1. Получить и охарактеризовать стандартное сырье - клонированные мультипотентные мезенхимные стромальные клетки пупочного канатика (ММСК ПК).

2. Разработать и стандартизовать методику серийного масштабирования жизнеспособных аваскулярных и васкуляризованных ЗБ мезеносфероидов из стандартного 2Б сырья.

3. Изучить ЗБ динамику сфероидообразования ММСК ПК. Сравнить распределение экспрессии в 2Б и ЗБ культуре эпителиальных и мезенхимных маркеров, оценить пролиферативный потенциал клеток сфероида, исследовать структурные изменения на клеточном и ультраструктурном уровне.

4. Исследовать экспрессию маркеров ранних и поздних эндотелиальных прогениторных клеток в аваскулярных и васкуляризованных сфероидах ММСК ПК.

5. Осуществить ЗБ скрининг УЕОР-индуцированных сфероидов ММСК ПК к капиллярогенезу в ЗБ-матригеле.

6. Проверить возможность образования васкуляризованной микроткани при слиянии мезеносфероидов.

7. Исследовать поведение поздних ЭП из ЗБ культуры ММСК ПК при патологическом процессе на модели хронической печеночной недостаточности крыс.

Научная новизна. Работа является оригинальным экспериментальным исследованием, в котором впервые было осуществлено серийное масштабирование аваскулярных (неиндуцированных) и васкуляризованных (УЕОР-индуцированных) мезеносфероидов из стандартного 2Б сырья -клонированной культуры ММСК ПК.

Были впервые исследованы пластичность и перераспределение экспрессии мезенхимных и эпителиальных маркеров в клетках сфероидов ММСК ПК. Впервые были выявлены ранние ЭП в аваскулярных мезеносфероидах. Впервые показано, что УЕОР индуцировал появление в ЗБ культуре ММСК ПК поздних ЭП, способных к образованию люменов внутри сфероида и тубулоподобных структур в окружающем матриксе при помещении в матригель.

' Предложена оригинальная методика получения васкуляризованной микроткани путем слияния индуцированных мезеносфероидов с образованием единой капиллярной сети. Впервые показано, что трансплантированные в составе сфероида поздние ЭП выживали в поврежденной ксеногенной печени без

иммуносупрессии, встраивались в стенки сосудов реципиента и сохраняли экспрессию маркера ЭП.

Теоретическая н практическая значимость. Разработан метод получения неограниченного числа аваскулярных и васкуляризованных мезеносфероидов из стандартного источника — ММСК ПК. Было показано, что клонированная культура ММСК ПК способна к сфероидообразованию с включением в новообразующийся сфероид практически всех клеток в ЗЭ системе. Предложенный метод позволяет получить максимально возможное количество идентичных мезеносфероидов с минимальными потерями исходного числа клеток. Было установлено, что сфероидообразование ММСК ПК всегда сопровождается ламинацией сфероида на две функциональные зоны, ультраструктурными изменениями и перераспределением паттернов экспрессии мезенхимных и эпителиальных маркеров. Нестин+, цитокератин 19+ эпителиоподобные клетки располагались на поверхности сфероидов, тогда как коллаген 1У+ округлые клетки были сосредоточены в центральной части, но все клетки сфероида сохраняли экспрессию виментина, цитокератина 18 и ламинина. Были выявлены ранние и поздние ЭП в ЗО культуре ММСК ПК. Продемонстрирована новая клеточная модель васкулогенеза и ангиогенеза из одного типа клеток. Появление поздних ЭП было связано с влиянием УЕОР и сопровождалось образованием люменов и тубулоподобных структур в матригеле. Установлено, что сфероиды ММСК ПК способны к неограниченному слиянию с увеличением плотности клеток в объединенном сфероиде. Слияние васкуляризованных сфероидов приводило к сегрегации СБ31+ клеток с образованием единой капиллярной сети. Интеграция с тканями реципиента и сохранение экспрессии специфического маркера свидетельствовали о способности поздних ЭП из сфероидов ММСК ПК к участию в регенерации сосудистой сети поврежденной печени крыс. Разработанный метод получения васкуляризованных мезеносфероидов может найти применение в тканевой инженерии и регенеративной медицине. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Культивирование сфероидов ММСК ПК на агарозных планшетах позволяет с малыми трудозатратами получать из стандартного 20 сырья большие (достаточные для клинических трансплантаций) количества сфероидов.

2. ММСК ПК при сфероидообразовании разделяются на две популяции: нестин+/цитокератин19+ и нестин-/коллаген 1У+ клетки. Популяции отличаются не только иммуноцитохимическими, но и ультраструктурными особенностями.

3. При ЗО культивировании ММСК ПК происходит спонтанная дифференцировка в эндотелиальном направлении, сопровождающаяся новообразованием ранних ЭП. Добавление индукционного фактора УЕОР стимулирует появление поздних ЭП, формирующих люмены внутри

сфероида и тубулоподобные структуры в матригеле. При слиянии большого числа сфероидов, в новообразованной ткани развивается внутренняя сосудистая сеть.

4. Локальное введение васкуляризованных сфероидов в ткань поврежденной печени крыс приводит к интеграции поздних ЭП с тканями реципиента и их участию в регенерации сосудистой сети.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на: XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (2009г, Москва); VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (2009г, Москва); IX «High médical technologies in XXI Century: The modern achievements in cellular technologies and nanotechnologies» (20 Юг, Benidorm, Spain); X «High médical technologies in XXI Century: The modern achievements in cellular technologies and nanotechnologies» (2011r, Benidorm, Spain); 8th Swiss experimental surgery symposium "Animal Models for Organogenesis" (2012r, Geneva, Switzerland); 5 Всероссийский симпозиум с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (2012г, Уфа); 47th Annual Congress of the European Society for Surgical Research (2012r, Lille, France); 4th Expert Meeting Mesenchymal Stem Cells in Solid Organ Transplantation MISOT (2012r. Barselona, Spain).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 8 тезисов докладов на международных конференциях, 2 статьи в научно-практических медицинских журналах и 3 работы в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 42 рисунка и 7 таблиц. Список литературы включает 156 источников.

МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. 2D клеточные культуры

Исследование проводили на 6 образцах пупочного канатика, полученных из банка пуповинной крови «Гемабанк».

Выделение и культивирование эндотелиальных клеток пупочной вены (human umbilical cord vein endothelial cells — HUVEC). HUVEC изолировали из вены пупочного канатика по стандартному протоколу (Siow R.C., 2012). Клетки культивировали в плотности не менее 104 кл/см2 в полной ростовой среде 199 с добавлением L-глютамина (2мМ L), 1% пенициллина/стрептомицина, HEPES (1,5:100), NaHCOj (1,8:100), EGF (0,5:1000), bFGF (0,6:1000), гепарина (0,9:1000) и 20% эмбриональной телячьей сыворотки. Замену среды осуществляли каждые 2

суток, культуры пассировали с использованием 0,25% раствора трипсина в плотности I ООтыс.кл./см".

Выделение и культивирование ММСК ПК. Первичную культуру ММСК ПК выделяли из механически измельченных фрагментов пупочного канатика методом ферментативной дезагрегации в 0,075%, растворе коллагеназ I и IV типа. Клетки культивировали в полной ростовой среде: DMEM/F12 (1:1) с добавлением 2мМ L-глютамина, 50мкг/мл гентамицина, 1% ИТС и 10% FCS и высевали на чашки Петри в концентрации 50*103 кл/см2. Культивировали в стандартных условиях (37°С; 5%ССЬ), замену среды осуществляли каждые 2 суток, культуры пассировали с использованием 0,25% раствора трипсина в плотности 50тыс.кл./см2.

Плотность монослоя культуры клеток контролировали под микроскопом СКХ41 (Olympus, Япония), фоторегистрацию осуществляли с помощью цифровой камеры DP300 (Olympus, Япония). При каждом пассаже производили подсчет клеток с использованием автоматического счетчика клеток Countess (Invitrogen, США).

Клоналыюе культивирование ММСК ПК. После четвертого пассажа ММСК ПК высевали на новые чашки в плотности 3-4 кл/см'. Культивирование проводили в стандартных условиях (37°С; 5%ССЬ) в полной ростовой среде с добавлением 0,01% bFGF и 0,015% гепарина, замену среды осуществляли каждые 3 суток. Часть сформировавшихся колоний фиксировали, окрашивали раствором Гимза и анализировали под стереомикроскопом CZX16 (Olympus, Япония) и под микроскопом Axiovert 25 (Carl Zeiss, Германия). Фоторегистрацию осуществляли с помощью цифровых камер U-TV0.5XC-3 (Olympus, Япония) и AxioCam HRC {Carl Zeiss, Германия). Другие колонии пассировали на новые чашки и продолжали культивировать, после четырех пассажей клетки клонированной культуры переводили в 3D условия.

2. 3D культивирование HUVEC и ММСК ПК

Культивирование в системе «висячая капля». Для получения «висячих капель» из полученной суспензии на крышку чашки Петри наносили капли объемом ЗОмют, около 100 капель на одну крышку, для предотвращения испарения в чашку добавляли 5-6 мл ростовую среду DMEM/F12 (1:1) с добавлением 2мМ L-глютамина и 50мкг/мл гентамицина. Клетки культивировали в системе «висячая капля» в стандартных условиях (37°С, 5% ССЬ) в течение 7-9 суток, составляла 2тыс.кл. в «висячей капле». Динамику формирования сфероидов исследовали под стереомикроскопом SZX 16 (Olympus, Japan), с использованием цифровой камеры DP300 (Olympus, Japan).

Масштабированное культивирование ММСК ПК на агарозных планшетах. Для серийного получения 3D сфероидов ММСК ПК применяли также 3D культивирование в неадгезивных 256-луночных агарозных планшетах

(3D Petri Dishes, Microtissue, США). Концентрацию клеток 2700тыс.кл./мл выбрали, исходя из диаметра и числа лунок, желаемой плотности сфероидов.

Индукция васкулогенной дифференцировки в 3D культуре ММСК ПК. На четвертом пассаже клонированной культуре ММСК ПК в полную ростовую среду добавляли индуктор — фактор роста эндотелия сосудов, VEGF (Юнг/мл). Прикрепленную культуру ММСК ПК инкубировали с индукционной средой в течение 7 суток. Далее клетки культивировали в индукционной среде в 3D системе «висячая капля» в течение 7 суток в стандартных условиях (5% С02, 37°С).

Моделирование ангиогенеза в матригеле. Капли матригеля (BD Bioscience) наносили на дно предварительно охлажденных до -20°С чашек Петри с помощью холодной серологической пипетки, после полимеризации (ЗОмин, 37°С) инсулиновым шприцом вводили васкуляризованные мезенхимосфероиды в матригель. Чашки Петри с матригелем после введения сфероидов заливали индукционной средой и культивировали в течение 9 суток. Визуализацию роста тубулоподобных структур осуществляли с помощью фазово-контрастного микроскопа СКХ41 (Olympus, Япония), фоторегистрацию производили в программе DeltaPix, поставляемой с цифровой камерой Invenio3S (Olympus, Япония).

Слияние сфероидов. На 7 сутки 3D культивирования после завершения сфероидообразования, отдельные сфероиды помещали в общие «висячие капли» объемом ЗОмкл по 2, 3, 4 и 7 штук. Слияние единичных сфероидов наблюдали под инвертированным микроскопом СКХ41 (Olympus, Япония) в течение 7 суток. Для получения макросфероида 150 сфероидов помещали в центрифужную пробирку (15мл) в 4 мл полной ростовой среды ММСК ПК без добавления VEGF.

3. Изучение поведения клеток сфероидов ММСК ПК в ткани печени крыс на модели хронической печеночной недостаточности

Модель острой печеночной недостаточности. Модель токсического повреждения печени воспроизводилась на крысах породы Wistar по стандартному протоколу. Животным вводили ССЦ (2 мл/кг веса в 10% растворе растительного масла) внутрибрюшинно дважды в неделю в течение 6 недель.

Инъекция васкуляризованных сфероидов. Васкуляризованные мезеносфероиды в 200мкл физиологического раствора инъецировали с помощью инсулинового шприца в нижнюю долю печени во время открытой операции. Анестезию животных осуществляли с помощью золетила (0,5мл на 100 грамм веса). Исследование поврежденной печени производили через 1 и 6 месяцев после инъекции.

4. Методы гистологии, иммуногистохимии и молекулярной биологии

Проточная цитофлуометрия. С помощью 0,25% раствора трипсина и

раствора Версена получали суспензии диссоциированных клеток из 2D и 3D культуры и инкубировали их с антителами к CDllb, CD14, CD19, CD29, CD31,

8

CD45, CD90, CD 105 и CD133 (Beckman Coulter). Полученные результаты анализировали на проточном цитофлуориметре FC500 (Beckman Coulter, США) с помощью программы BD FACSDiva.

Фиксация 2D и 3D культур клеток и печени крыс. Для дальнейшего иммуноцитохимического анализа монослой клеток и сфероиды, предварительно очищенные от культуральной среды, фиксировали в 4% растворе параформальдегида в течение 20 минут. Сфероиды затем помещали в 20% раствор сахарозы (4часа, +4°С) и готовили серию срезов толщиной 10-20мкм на криотоме CM1850UV {Leica, Германия). Печень крыс фиксировали в 10% растворе формалина (24часа, +4°С), инкубировали в 20% растворе сахарозы (12часов, +4°С) и производили серию срезов толщиной Юмкм помеченного места локального введения сфероидов на вибротоме VT 1200 S (Leica, Германия).

Перед приготовлением препаратов для электронной трансмиссионной и сканирующей микроскопии сфероиды фиксировали 2.5% глютаровым альдегидом (1-2 часа, +25°С), дофиксировали 1% раствором 0s04 (2 часа, +4°С). После отмывки от OsC>4 сфероиды вновь помещали в 2,5% глютаровый альдегид и хранили при 4°С.

Иммуноцитохшшя. Фиксированные клетки 2D культуры и срезы сфероидов инкубировали с первичными антителами к CD 105 (Biological), виментину, нестину (Abeam), цитокератинам 18(Thermo Scientific) и 19 (Abeam), коллагену IV, ламинину, фибронектину, РАХ6, GATA6 (Abeam), CD31, vWF, Flk-1, VEGF (Thermo Scientific), а затем с видоспецифичными вторичными антителами, конъюгированными с флуорохромами FITC и DyLight594 (Thermo Scientific). Ядра докрашивали флуоресцентным красителем бис-бензимид -Hoechst 33258 (Serva). Полученные препараты накрывали покровным стеклом, и анализировали в видимом и ультрафиолетовом световых диапазонах под микроскопами Axiovert 25 (Carl Zeiss, Германия), Axiovert 200М и лазерным конфокальным микроскопом Olympus Fluoview FV10I (Olympus, Япония).

Срезы поврежденной печени крыс, полученные через 1 месяц после инъекции васкуляризованных мезеносфероидов, иммуногистохимически окрашивали антителами к human nuclei (Chemicon), FLk-1 и к альфа-фетопротеину (Thermo Scientific) и анализировали под флуоресцентным микроскопом Axiovert 25 (Carl Zeiss, Германия).

Белковый иммуиоблот. Исследование проводилось по стандартному протоколу. Клетки лизировали с помощью лизирующего буфера (Reporter Lysis Buffer, BDBioscience), белки экстрактов клеток разделяли с помощью электрофореза в 18% полиакриламидном геле (40мА, 29В 1,5 часа), перенос белков осуществляли на мембрану из поливинилденфторида (2мА/см2, 20В, 2 часа). Использовали первичные антитела к виментину, РАХ6, GATA6 (Thermo Scientific), ß-актину, цитокератину 18 и VEGF (Abeam), а также видоспецифичные

9

вторичные антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена (Thermo Scientific). Белки визуализировали с использованием коммерческого набора по инструкции производителя (Thermo Scientific).

Электронная трансмиссионная микроскопия. Сфероиды отмывали от фиксатора, проводили по ряду восходящих спиртов и обезвоживали в оксиде пропилена. После инкубации в смеси оксида пропилена и аралдита (90мин, +25°С) сфероиды переносили в аралдит (Зсуток, 60°С). Серийные полутонкие и ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-111 (Швеция). Полутонкие срезы окрашивали смесью (1:1:1:1) 0,25% водного раствора крезилового фиолетового, 0,5% водного раствора толуидинового синего, 1% водного раствора метиленового синего и 1% раствора метилового зеленого (8-10мин, 60°С). Ультратонкие срезы контрастировали в растворах уранилацетата и цитрата свинца, полученные препараты изучали с помощью электронного трансмиссионного микроскопа JEM-100B.

Сканирующая электронная микроскопия. Сфероиды отмывали от фиксатора, проводили по ряду восходящих спиртов и обезвоживали в ацетоне. Образцы высушивали методом перехода через критическую точку углекислого газа. Перед сеансом образец напыляли в вакууме коллоидным золотом, получая реплику (отпечаток), повторяющую контуры образца, которую впоследствии сканировали с использованием электронного сканирующего микроскопа CamScan (Япония).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение и характеристика ММСК ПК

В клетках, выделенные из Вартонова студня пупочного канатика, была изучена экспрессия кластера специфичных маркеров ММСК на 1 и 4 пассажах до и после клонального культивирования (таблица 1). При клональном культивировании клетки, выделенные из Вартонова студня пупочного канатика, формировали колонии (рис.1 А, цветная вставка 1), состоящие из фибробластоподобных клеток, 95-100% клеток которых экспрессировали маркеры ММСК, установленные международным комитетом по идентификации мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (Dominici М. et al., 2006): CD29/CD90/CD105, и не экспрессировали маркеры гемопоэтического и лимфоцитарного ряда (таблица 1). Кроме того, на разных пассажах клонированной культуры ММСК ПК коэкспрессировались маркеры незрелых мезенхимных (виментина, CD105) и эпителиальных (цитокератин 18, ламинин коллагена IV) клеток, маркер недифференцированных клеток нестин (рис.1 В, цветная вставка 1). Единичные клетки экспрессировали фибронектин, и белки раннего эмбриогенеза -РАХ6 и GATA6 (рисЛБ, цветная вставка 1).

Таким образом, 20 культивирование ММСК ПК позволяет нам получать стандартное сырье для дальнейших исследований с хорошо воспроизводимым смешанным мезенхимо-эпителиальным фенотипом. Полученный результат согласуется с ранее опубликованными работами по характеристике ММСК, выделенных из печени и пупочного канатика (Кое1% 5. й а1., 2006, Сатрагс! Б. й а1., 2008), и отражает мезенхимо-эпителиальную пластичность ММСК ПК, ранее показанную в исследованиях нашей лаборатории (Сабурина И.Н. и др., 2009).

Таблица I

Пммунофенотипнческнн анализ ММСК ПК в течение 2D культивирования (метод проточной ___цнтометрии)

Анализируемые маркеры Уровень экспрессии Клетки-мишени

Первичная культура Клонированная культура

Пассаж 1 Пассаж 4 Пассаж 1 Пассаж 4

Isotype IgG 0.109% 0.113% 0.100% 0.523% Автофлуоресценция

CDllb- 0.215% 0.116% 8.565% 5.743% Лейкоциты

CD14- 0.640% 0.208% 0.313% 2.439% Моноциты

CD19- 2.310% 4.215% 0.818% 5.702% В-лимфоциты

CD34- 5.529% 6.059% 3.300% 4.384% ЭП

CD45- 0.022% 1.685% 0.188% 0.111% Лейкоциты

CD133- 0.013% 0.456% 0.500% 0.354% ЭП

CD29+ 99.775% 99.975% 100.000% 95.330% ММСК

CD90+ 29.719% 99.322% 100.000% 98.907% ММСК

CD 105+ 87.763% 54.400% 91.435% 93.423% ММСК

2. Исследование сфероидов ММСК ПК

В 3D условиях (культивирование в системе «висячая капля» и на агарозных планшетах) ММСК ПК формировали сфероиды, лишь незначительная доля клеток не участвовала в образовании сфероида и погибала (рис.3, цветная вставка 2). В сфероидообразовании ММСК выделяют три стадии. Первая заключается в образовании рыхлого сфероида за счет взаимодействия интегринов и RGD последовательностей компонентов внеклеточного матрикса. В течение второй стадии происходит накопление Е-кадгерина на поверхности клеток, которое завершается третьей стадией — формированием плотного сфероида, клетки которого устанавливают между собой адгезивные контакты (Сабурина И.Н., Репин B.C., 2009). При исследовании динамики сфероидообразования для культуры ММСК ПК было установлено, что первая стадия проходит в течение первых часов культивирования, а третья — завершается к 7 суткам культивирования в 3D системе (рис.3, цветная вставка 2). Дальнейшая экспозиция клеток в 3D культуре не приводила к каким-либо морфологическим изменениям сфероидов. Динамика образования сфероидов в системе «висячая капля» и на агарозных планшетах была сходна, строение полученных сфероидов идентично.

11

Благодаря мезенхимо-эпителиальной конверсии, ММСК ПК в составе сфероида разделялись на два типа клеток - поверхностные нестин+, цитокератин 19+ эпителиоподобные клетки и центральные коллаген IV+ клетки (рис.2, цветная вставка 1). Экспрессия виментина, цитокератина 18 и ламинина сохранялась во всех клетках сфероидов, в то время как экспрессия CD 105 незначительно убывала от периферии к центральной области сфероидов. В 2D культуре ММСК ПК единичные клетки экспрессировали белки раннего эмбриогенеза: маркер энтодермы - GATA6, и маркер плюрипотентности - РАХ6 (рис.1 Б, цветная вставка 1). Экспрессия этих белков в 2D культуре не была обнаружена методом белкового иммуноблота, однако она была выявлена в 3D культуре ММСК ПК в сфероидах. Подобное репрограммирование мезенхимных клеток в плюрипотентном направлении в составе сфероида было продемонстрировано и в других работах (Zaibak F. et al., 2009).

Изменение паттернов экспрессии мезенхимных и эпителиальных маркеров сопровождалось ультраструктурными изменениями в клетках 3D культуры ММСК ПК: появлением на поверхности клеток микроворсинок, накоплением секреторных гранул, образованием межклеточных контактов между соседними клетками наружного слоя сфероидов, гиперплазией аппарата Гольджи и развитием микровезикулярного аппарата в клетках центральной области (рис.4). Эти ультраструктурные изменения косвенно указывают на возможность гипоксии центральной области сфероида, показанную в работах других авторов (Alvarez-Pérez J. et al., 2005, Lin R.Z., Chang H.Y., 2008, Proulx-Bonneau S., Annabi В., 2011). Также данная ультраструктура свидетельствует о способности клеток в составе мезеносфероидов к восприятию и передаче эпигенетических сигналов. Было установлено, что микроворсинки на поверхности ММСК способны воспринимать механические и химические сигналы микроокружения, преобразовывая их в клеточный ответ, который обеспечивает выживаемость клеток и интеграцию их в ткани реципиента (Proulx-Bonneau S., Annabi В., 2011). Также уже во многих исследованиях было продемонстрировано ключевое участие микровезикул как в репарационных, так и в патологических процессах за счет эпигенетической регуляции с помощью горизонтального переноса РНК (Tetta et al., 2011). Разработанный нами метод серийного масштабирования ММСК ПК с использованием агарозных планшетов позволяет эффективно, быстро и в неограниченном количестве получать репрограммированные в плюрипотентном направлении модули, способные к восприятию эпигенетических сигналов и организованному клеточному ответу.

Фибронектин GATA 6

Рис.1. Характеристика 2D культуры ММСК ПК. А. Внешний вид колоний и морфология клеток на 1 и 4 пассаже клональной культуры ММСК ПК, окраска раствором Гимза. Световая .микроскопия Б. Экспрессия фибронектина, GATA6 и PAX 6 в отдельных клетках ММСК ПК. В. Экспрессия мезенхимных (виментин, нестин) и эпителиальных маркеров (цитокератин 18, коллаген IV, ламииин) на 4 пассаже. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Лазерная конфокальная флуоресцентная микроскопия

2 0mkm | lOOmkm

Рис.2. Экспрессия мезенхимных (CD105, виментин. нестин) и эпителиальных (цитокератин 19, коллаген IV, ламинин) на 7 день 3D культивирования. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий). Лазерная конфокальная флуореа/ентная микроскопия

30 имнут

ММСК щ

ПК

Зчзса 7 суток

'Ш ■ •

ш/т

зсуто*

Рис.3. Динамика образования сфероидов ММСК ПК в «висячих каплях» в течение 9 суток. Световая микроскопия

Очасов 2часа Зчаса 7суток

* -М •

ф

Рис.9. Слияние 2 (А), 7 (Б) и 150 (В) сфероидов ММСК ПК. Черными стрелками указаны точки инициации слияния. Световая микроскопия

Flk-l - CD31 vvJr., _ 4 * j, к - VEGF (

t * 2 Omkm r • » 2 Omkm 2 Omkm

Рис.6. Экспрессия маркеров поздних ЭП в васкуляризованной 3D культуре ММСК ПК. Красными

стрелками указаны люмены, образованные С031+клетками

Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий)

Лазерная конфокальная флуоресцентная микроскопия

50Omkm ¡¡¡j

Hz *■ «* ,f t .• 4,-, , v -v. : .■ <;•>. ■ / • ••'.'* ^ -Vi • . ^ЭДЙЗЙйй^ 5 Omkm Г ■• _ "VEGF • s f ' " ' ■ " V • , 5 % . ;. 5Omkm

Рис.10. Характеристика васкуляризованной микроткани, полученной слиянием индуцированных сфероидов ММСК ПК. А. Внешний вид макросфероида. Б. Гистологический анализ, зеленая стрелка указывает на сферический кластер клеток внутри сфероидов, красная - на крупный люмен в кластере. Световая микроскопия. В. Экспрессия С031(зеленый) и vWF (красный) в клетках макросфероида, сегрегация С031+клеток в сферические кластеры и формирования множества люменов (красные стрелки). Г. Экпрессия VEGF (красный) в клетках васкуляризованного макросфероида ММСК ПК. Ядра окрашены Hoechst 33258 (синий), Лазерная конфокальная флуоресцентная микроскопия

Читал пис1еч Нипчт писЫ

ЧогтИм

Л 10 Откт I] 5 0шкт

Нигпзп пис1е'| Нитлп пиЫе!

АРР Пк-1

НйесИл Но( !" »-

V, " V гч - "и

• ч ^

5 0ткт I" 5 Откт

Рис. 11. Распределение мигрировавших клеток из УБвР-индуцированных сфероидов ММСК ПК в ткани печени крыс через 1 месяц после введения. А, Б. Встраивание человеческих клеток (зеленый) в ткань реципиента. В. Клетки человека (зеленый) в стенке сосуда. Клетки печени экспрессируют альфафетопротеин (красный). Г. Обновление эндотелия в печени: клетки человека (зеленый), встроившиеся в стенку сосуда реципиента, эндотелиоциты которого экспрессируют Р1к-1 (красный). Флуоресцентная микроскопия

Контроль, Х100 .:'... : •••:• ч. ■ . V.' :г'. л; • ' ■:■■■:■■-'.' - л ' -•/■ч-.-1 у-'-Л/-- ■ ■:; ■НЯВВвжпНВНЯвН 11 1 I Опыт, Х100 , . / ; 'шшш^ушшщш

г 1Йнт|в6ль.ХЧОО *..;• - . г,- ) 'опмг'шоа. " ' .* ¿¿¡г ; я1. •Шк^ё ''Яш

Рис.12. Сравнительный гистологический анализ контрольной и экспериментальной групп через 6 месяцев после инъекции сфероидов. Стрелками указаны новообразованные кровеносные сосуды. Световая микроскопия

3. Выявление ранних и поздних ЭП в 3D культуре ММСК ПК

Сравнительный анализ иммунофенотипического профиля 2D и 3D культур ММСК ПК выявил увеличение экспрессии CD133+/CD34+ в аваскулярных мезеносфероидах (таблица 2). С помощью белкового иммуноблота в 3D культуре ММСК ПК была установлена экспрессия VEGF. Комбинация обнаруженных нами в мезеносфероидах маркеров совпадает с иммунопрофилем ранних ЭП (Shantsila Е. et al., 2008). Интересно, что экспрессия CD 133 также характерна для прогениторных клеток различного происхождения (Jászai J. et al., 2007, Harris J.R. et al., 2009) и раковых стволовых клеток (Currie M.J. et al., 2012).

Известно, что CD 133 наравне с Oct4, Nanog, Klf4 относится к генам, репрограммирующим прогениторы до плюрипотентных кластеров (Ruau D. et al., 2008, Réntala S., Mangamoori L.N., 2009). Переход ММСК ПК в статус ранних прогениторов связан с экспрессией CD 133, GATA6 и РАХ6. Таким образом, сфероидообразование является репрограммирующим механизмом, при котором ММСК спонтанно под воздействием эпигенетических факторов и собственного внеклеточного матрикса начинают экспрессировать маркеры ранних ЭП.

Поздние ЭП в культуре ММСК ПК мы получали, используя внешнее индукционное воздействие фактором роста эндотелия сосудов, VEGF. В 2D культуре ММСК ПК при культивировании в индукционной среде изменяли морфологию и уже на 4 сутки формировали кольцевые структуры - люмены,

Рис.4. Электронная трансмиссионная микроскопия сфероидов ММСК ПК. Появление микроворсинок (А, Х8 000) и формирование клеточных контактов (Б, Х10 000) в поверхностных клетках сфероида. В. Гиперплазия аппарата Гольджи (АГ), Х20 000. Г. Выброс микровезикул (МВ) в центральных клетках сфероида, Х40 000.

сопоставимые с 2Б-люменами, образованными контрольной культурой НЦУЕС (рис.5). НиУЕС - это культура поздних ЭП, сохраняющих при пересеве высокую экспрессию СВ31/Р1к-1/у\\Т/УЕОР и способных к образованию 2Э и ЗБ люменов в матригеле. Данная культура была выбрана в качестве положительного контроля для оценки функциональной активности УЕОР-индуцированной культуры ММСК ПК.

Таблица 2

Сравнительный нммунофеношпический анализ экспрессии поверхностных маркеров в 21) и ЗВ _культуре ММСК ПК (метод проточной цитометрии)

Анализируем ые маркеры Уровень экспрессии Клетки-мишени

Клонированная 20 культура ЗР культура

ММСК ПК ММСК ПК

Пассаж 4 7 день

ЬсНуре ^О 0.523% 0.184% Автофлуоресценция

СЭПЬ- 5.743% 0.024% Лейкоциты

С014- 2.439% 0.562% Моноциты

С019- 5.702% 3.256% В-лимфоциты

С045- 0.111% 0.090% Лейкоциты

СЭ29+ 95.330% 99.870% ММСК

С090+ 98.907% 58.136% ММСК

СО 105+ 93.423% 85.892% ММСК

СОЭ4+ 4.384% 17.921% ЭП

С0133+ 3.435% 26.341% ЭП

Рис.5. Образование Ю люменов в культурах ЬШУЕС (А) и ММСК ПК (Б) на 4 сутки культивирования в индукицонной среде. Сформированные люмены указаны черными стрелками. Фазовоконтрастнан микроскот/я

Проследить полноценный капиллярогенез в культуре невозможно, поэтому исследовали воздействие индуктора УБвР на ММСК ПК в условиях ЗБ культуры. На 7 сутки ЗЭ культивирования ММСК ПК в индукционной среде в сфероидах появлялись СВ31+/у\УР+/Р1к-1+/УЕОР+ ЭП (рис.6, цветная вставка 3). В васкуляризованных сфероидах выявлено повышенное содержание вакуолей и

ЗЭ люменов (рис.7), формирование люменов происходило за счет С031+ клеток. Таким образом, было показано, что \TEGF является эффективным стимулятором эндотелиальных прогениторов и в условиях ЗЭ культуры ММСК ПК нами были разделены стадии образования ранних и поздних ЭП. Формирование ЗЭ люменов внутри сфероидов позволяет использовать эту клеточную модель для изучения васкулогенеза в условиях, приближенных к нативной ткани.

Рис.7. Вакуолизация УЕвЕ-индуцированной культуры ММСК ПК и образование ЗЭ люменов (черные стрелки). Световая микроскопия, гистологический анализ

4. Образование тубулоподобных структур в матригеле

Образование капилляроподобных структур в матригеле является оптимальным функциональным тестом для отражения способности клеток к ангиогенезу (Cole R.W. et al., 2010). После помещения васкуляризованных сфероидов в матригель, в первые сутки культивирования наблюдали деградацию матрикса вокруг сфероидов. На вторые сутки выявили направленную миграцию клеток, формирующих новый тяж вслед за ведущей клеткой. На 5 сутки культивирования количество тяжей увеличивалось, наблюдали их ветвление, к 9 суткам — клетки сфероидов формировали разветвленный плексус (рис.8Б). Динамика формирования и морфология тубулоподобных структур васкуляризованными сфероидами (VEGF-индуцированной ММСК ПК) была сопоставима с капиллярогенезом HUVEC - истинными поздними ЭП (рис.8А). Таким образом, VEGF-индуцированная 3D культура ММСК ПК является не только моделью васкулогенеза и образования 3D люменов, но и может служить для исследования процессов ангиогенеза in vitro.

Рис.8. Формирование разветвленной капилляроподобной сети на 9 день культивирования в матригеле 31) культуры НЦУЕС (А) и V НО К - инду пир ов а н н о й культуры ММСК ПК (Б). Фсповоконтрастная микроскопия

5. Слияние сфероидов и получение васкуляризованной микроткани

Как неиндуцированиые (аваскулярные), так и индуцированные (васкуляризованные) сфероиды после завершения сфероидообразования были способны к слиянию друг с другом в количестве от 2 до 7 и даже 150 штук (рис.9). Следовательно, сфероиды не являются зрелой тканью (Hajdu Z. et al., 2010), что позволяет их использовать в качестве структурных единиц для создания искусственной ткани и как тестовые системы для определения тканевой зрелости. Важно, что способность сформированных сфероидов к слиянию в 3D культуре позволяет изучать 3D васкуло- и ангиогенез не только в пределах одного сфероида, но и в составе микроткани, полученной в результате слияние множества сфероидов.

В единичных сфероидах, CD31+ клетки располагались преимущественно между клетками поверхностной и центральной областей (рис.6, цветная вставка 3). При слиянии васкуляризованных VEGF-индуцированных сфероидов CD31+ клетки обособлялись, образуя сферические кластеры (рис. 10, цветная вставка 3) со множеством люменов, свидетельствующих о возникновении единой капиллярной сети внутри макросфероида. Вероятно, при агрегации в объединенный сфероид, клетки приобретают способность к организованному поведению и разделению функций. Расположение клеток в составе сфероида определяет их дальнейшие свойства, однако, при слиянии множества сфероидов в макросфероид, клетки перераспределяются в соответствии с приобретенными ранее функциями и стремятся к взаимодействию с однотипными клетками. Таким образом, формирование сфероида в 3D культуре позволяет получить структурную единицу, являющуюся эпителиомезенхимным репаративным модулем, а слияние сфероидов между собой приводит к формированию васкуляризованной примитивной микроткани.

6. Исследование поведения поздних ЭП васкуляризованных мезеносфероидов при инъекции в поврежденную ткань печени крыс

Исследовали поведение клеток васкуляризованных мезеносфероидов при патологическом процессе (хроническая печеночная недостаточность). Было установлено, что через месяц после инъекции сфероидов в поврежденную ткань единичные клетки сохраняли жизнеспособность даже без иммуносупрессии после ксеногенной трансплантации и встраивались в сосуды реципиента (рис.11). Клетки человека, несущие маркер Flk-1 находились в эндотелиальном слое, что указывает на регенераторное значение этого феномена. На сроке 6 месяцев был выявлен активный ангиогенез, сопровождавшийся появлением в печени отдельных долек с необычайно развитой (не встречающейся в контроле) сосудистой сетью (рис.12). Многочисленные срезы сосудов располагались в перицентральной зоне дольки, то есть в участке наибольшей деструкции, вызванной ССЦ. Исследование ангиогенеза в поврежденной печени рекомендуется как перспективная модель восстановления паренхиматозного органа (Ueno Т. et al., 2006). Отмеченный ангиогенез может способствовать обратному развитию фиброза органа, обусловленного ССЦ. Не только экспериментальные, но и ряд клинических наблюдений свидетельствуют о том, что при определенных условиях избыточно разросшаяся, фиброзная ткань может исчезнуть [цит. по Саркисов Д.С., 1977]. Полученный результат открывает новый подход к восстановлению печени и снижению фиброза через ангиогенез с применением мезеносфероидов.

Таким образом, в силу своих свойств 3D культура ММСК ПК позволяет получать ранние и поздние ЭП. Мезеносфероиды оказались пока единственной моделью образования люменов в тканеподобной структуре. Сегодня это наиболее естественный прототип новообразования и регенерации сосудистой сети in vivo. Способность сфероидов к слиянию позволяет получать васкуляризованные микроткани, что может послужить основой для получения тканеинженерных конструкций с функционирующей кровеносной системой. Наши результаты показывают, что VEGF индуцирует появление в сфероидах ММСК ПК поздних ЭП, способных принимать участие в регенерации сосудов поврежденного органа. Разработанный метод получения васкуляризованных мезенхимосфероидов может найти применение в тканевой инженерии и регенеративной медицине.

выводы

1. 2D культивирование первичной культуры мультипотентных мезенхимных стромальных клеток пупочного канатика в низкой плотности позволяет изолировать клетки со смешанным мезенхимным (CD105+/CD90+/CD29+/CD11Ь-/CD45-/CD34-, виментин+) и эпителиальным (цитокератин 18+, коллаген IV+, ламинин+) фенотипом. Этот фенотип стабильно (в свыше 95% клеток) воспроизводится при дальнейшем культивировании.

2. Мезеносфероиды образуются в первые 7 суток 3D культивирования в системе «висячая капля» и на агарозных планшетах. На их поверхности располагаются эпителиоподобные (связанные контактами, имеющие микроворсинки, нестин+, цитокератин 19+) клетки. Центр занимают нестин— /коллаген IV+ клетки с ультраструктурными изменениями, характерными для воздействия гипоксии. Экспрессия виментина, цитокератина 18 и ламинина сохраняется во всех клетках сфероида.

3. На 7 сутки 3D культивирования мезеносфероидов, в них экспрессируются маркеры ранних эндотелиальных прогениторов (CD133+, CD34+, VEGF+) без морфологических признаков ангио-васкулогенеза в сфероиде и маркеры раннего эмбриогенеза (GATA6, РАХ6).

4. Добавление васкулогенного индуктора VEGF в культуральную среду вызывает на 7 сутки 3D культивирования образование поздних эндотелиальных прогениторов (CD31+, Flk-1+, vWF+). Эти клетки внутри сфероида образуют кольцевые структуры - люмены.

5. Перенос мезеносфероидов с поздними эндотелиальными прогениторами в матригель индуцирует активный тубулогенез в окружающий матрикс. В течение 9 суток формируется первичная капиллярная сеть.

6. Слияние аваскулярных и васкуляризованных (содержащих люмены и тубулоподобные структуры) мезеносфероидов завершается образованием единой структуры — васкуляризованной микроткани.

7. Поздние эндотелиальные прогениторы из васкуляризованных мезеносфероидов способны превращаться в эндотелиоциты и участвовать в регенерации сосудистой сети при патологическом процессе ш vivo.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сабурина И.Н., Горкун А.А., Кошелева Н.В., Семенова МЛ., Пулин А.А., Репин B.C. Сопоставление поведения стромапьных клеток пупочного канатика и мультипотентных стромапьных клеток взрослого костного мозга в 2-D и 3-D культуре: моделирование стромальной регенерации. // Вестник новых медицинских технологий. - 2009. — №4. — С.9-11.

2. Gorkun А.А., Saburina I.N., Kosheleva N.V., Pulin A.A., Repin V.S., Skuratovskaya L.N. MMSC 3D culture: reparartion mechanisms research model // High medical technologies in XXI century: The modern achievements in cellular technologies and nanotechnologies. — Benidorm, Spain. — 24-31.10.2010. - P.51.

3. Kosheleva N.V., Pulin A.A., Gorkun A.A., Semenova M.L., Saburina I.N. Incorporation of xenogenic cells into the mouse blastocyst // High medical technologies in XXI century: The modern achievements in cellular technologies and nanotechnologies. — Benidorm, Spain. -24-31.10.2010. — P.50.

4. Ivanov D.V., Chadartsev A.A., Stankov D.S., Saburina I.N., Kosheleva N.V., Pulin A.A., Gorkun A.A., Subbotina T.I., Naumova E.M. Endometrial stem cells as a new source for myocardium restoration // High medical technologies in XXI century: The modern achievements in cellular technologies and nanotechnologies — Benidorm, Spain. - 24-31.10.2010. - P.56.

5. Сабурина И.Н., Горкун A.A., Орлов A.A. Исследование биобезопасности, биосовместимости и остеокондуктивной активности стоматологических титановых штифтов Apolonia (Laser) и Apolonia (RBM). // Медицинский алфавит: Стомалогия. - М.: ООО "Альфмед", 2010. - Т.2, №5. -С. 36-39.

6. Kosheleva N.V., Saburina I.N., Gorkun А.А., Zurina I.M., Repin V.S. Obtaining of chimeric structures in 3D culture conditions // High medical technologies in XXI century: The modern achievements in cellular technologies and nanotechnologies. — Benidorm, Spain. - 22-29.10.2011. - P.50.

7. Gorkun A.A., Saburina I.N., Kosheleva N.V., Pulin A.A., Kolokoltsova T.D., Skuratovskaya L.N., Repin V.S. Vasculogenesis induction in the regenerative module // High medical technologies in XXI century: The modern achievements in cellular technologies and nanotechnologies. - Benidorm, Spain. — 22-29.10.2011. — P.50.

8. Zurina I.M., Saburina I.N., Gorkun A.A., Kosheleva N.V., Pulin A.A., Kolokoltsova T.D., Repin V.S. Characterization of spheroids from murine adipose tissue derived stromal cells // High medical technologies in XXI century: The modern achievements in cellular technologies and nanotechnologies». - Benidorm, Spain. — 22-29.10.2011.-P.53.

9. Горкун A.A., Сабурина И.Н., Кошелева H.B., Пулин А.А., Комиссарова С.В., Репин B.C., Иванов Д.В. Индукция васкулогенеза в сфероидах из стромальных клеток пупочного канатика // Вестник новых медицинских технологий. - 2012. -№2. -С. 313-315.

10. Shagidulin M., Onishchenko N., Krasheninnikov M., Volkova E., Avramov P., Iljinsky I., Mogeiko N., Luneva O., Pulin A., Gorkun A., Saburina I., Demura Т., Perova N., Sevastjanov V., Gautier S. Treatment of chronic liver failure by transplantation of liver cells and bone marrow stem cells: 1 year experience // 47th Annual Congress of the European Society for Surgical Research. - Lille, France. - 6-9.06.2012.-P.39

11. Петерсен E.B., Трусова И.А., Зурина И.М., Кошелева Н.В., Горкун A.A., Гуллер А.Е., Пулин A.A., Сабурина И.Н., Репин B.C., Шехтер А.Б. Использование трансплантируемых мезенхимальнных клеток для лечения рубцов и коррекции возрастных изменений кожи. Механизм клинических эффектов. Клинико-лабораторное наблюдение. // Пластическая хирургия и косметология. — 2012. — №4.-С. 1-11

12. Шагидулин М.Ю., Онищенко H.A., Крашенинников М.Е., Ильинский И.М., Можейко Н.П., Шмерко Н.П., Андриянова A.A., Волкова E.H., Аврамов П.В., Бурлуцкий Я.П., Петраков К.В., Люндуп A.B., Сабурина И.Н., Пулин A.A., Горкун A.A., Перова Н.В., Севастьянов В.И., Готье С.В. Образование DE NOVO структуных единиц печени при сочетанной трансплантации донорских клеток печени и мезенхимальных стромальных клеток (экспериментальное исследование). // Вестник трансплантологии и искусственных органов - 2012. -T.XIV. - С.317-318.

13. Shagidulin М., Saburina I., Pulin A., Gorkun A., Kosheleva N., Zurina I., Repin V., Onishchenko N., Gautier S. Spheroid of Mesenchymal stromal cells: a novel method of chronic liver failure treatment // 4th Expert Meeting Mesenchymal Stem Cells in Solid Organ Transplantation MISOT. - Barselona, Spain. - 19-20.10.2012. - P.10

Gorkun Anastasiya Alekseevna

Research induced vasculogenesis in 3D culture of multipotent mesenchymal stromal cells of umbilical cord

Impairments of both regeneration mechanisms and blood system structure are considered as pathogenetic substrate of multiple diseases development. Umbilical cord derived multipotent mesenchymal stromal cells (UC MMSC) reprogramming in 3D system is new state-of-the-art technology of endothelial progenitor cells (EPC) expansion in conditions similar to native tissue. The aim of our work was research of angiogenic and vasculogenic characteristics of VEGF-induced UC MMSC in 3D culture in vitro and in vivo during pathological process - chronic liver failure.

It was shown for a first time in our work that among UC MMSC in spheroid during 3D cultivation spontaneously appear cells expressing markers of early EPC (CD133+, CD34+, VEGF+). Addition of VEGF to culture medium leaded to appearance of late EPC (CD31+, Flk-1+, vWF+, VEGF+) in 3D culture of UC MMSC. It was also proved that cells organize 3D structures similar to lumens. Late EPC formed capillarylike network inside spheroids during their fusion, representing vasculogenesis. After transfer into Matrigel EPC in spheroids formed tubular-like structures, which resembles angiogenesis. Late EPC in spheroids administered locally into damaged rat's liver integrated into endothelium in vivo and took part in reparation of recipient vasculature.

Hereby, 3D cultivation (considering it's features) of UC MMSC is mechanism of early and late EPC obtainment. As it comes from our results UC MMSC spheroids is the only model of lumen formation in tissue-like structure. Nowadays it is the most natural prototype of vascularization and vasculature regeneration in vivo. Developed technique of vascularized mesenchymal spheroids is significant for fundamental regeneration mechanisms research and pathophysiology. It is also essential for tissue engineering and regenerative medicine.

Актуальность темы

Формирование единой сети кровеносных сосудов является одним из ранних и сложных процессов морфогенеза в эмбриональном развитии млекопитающих. Выделяют два механизма образования и роста сосудов: васкулогенез и ангиогенез. Васкулогенез - это сборка капилляров из отдельных разрозненных эндотелиальных прогениторов (ЭП), одновременно собирающихся в единую систему in vivo или in vitro. В отличие от васкулогенеза, при ангиогенезе эндотелиальные прогениторы направленно мигрируют из терминалей капилляров, формируя новый тяж (cord) вслед за ведущими клетками (tip cells). Эмбриональный васкулогенез включает в себя формирование кровеносных сосудов в двух независимых областях эмбриона -провизорных органах и самом зародыше. Новообразование ангиобластов происходит благодаря индукционным взаимодействиям мезодермы и энтодермы [116]. Ангиобласты зародыша мигрируют на большие расстояния, чтобы дать начало вторичным плексусам (пучкам) в новых участках органогенеза [69]. До конца XX века считалось, что, в отличие от эмбриональной, во взрослой ткани рост и образование сосудов осуществляется только за счет ангиогенеза. Однако в 1997 году было установлено, что в крови взрослого человека циркулирует 2-3 ЭП/мл [21]. Эти ЭП имели «маркерную» комбинацию из 3 молекул: CD34+, Flkl+ и CD 133 [21] и были способны к заселению (реэндотелизации) синтетических протезов сосудов [134, 148]. Asahara сумел выделить «раннюю» и «позднюю» фракцию ЭП по скорости прикрепления и формирования характерных 2D колоний. Две группы исследователей [21, 133] показали по спектру маркерных белков, что постнатальные ЭП не имеют ничего общего с эмбриональными ангиобластами. Изучение клеточных механизмов ангио- и васкулогенеза in vivo и in vitro позволило идентифицировать две субпопуляции ЭП: «ранние» ЭП (CD 13 3 +/CD34+/VEGF+ клетки) и «поздние» ЭП (CD31+/Flk-l+/vWF+ клетки). Поздние ЭП также маркируются CD34+/CD45- [144] и имеют 77% общих РНК-транскриптов с мононуклеарной фракцией крови [99]. Поскольку 2 субпопуляции ЭП являются, по-видимому, единственным источником новых эндотелиальных клеток in situ/in vitro, резко возрос интерес к изучению и моделированию васкулогенеза с целью ангио-регенерации и клеточной терапии ишемических состояний [111]. Было показано, что ранние ЭП лишь стимулируют пролиферацию других эндотелиальных клеток за счет паракринного механизма, тогда как поздние ЭП активно участвуют в васкулогенезе и ангиогенезе, в том числе при различных патологических состояниях [7, 148, 136, 81]. Введение поздних ЭП в ишемизированные ткани [19, 80], в сердечную мышцу при инфаркте миокарда [75, 37] и в ткань печени при хронической недостаточности [147] приводило к восстановлению кровоснабжения и усилению регенерации. Регенерация печени сопровождалась снижением фиброза. Однако клиническое применение ауто-ЭП лимитировано их малым количеством в циркулирующей крови. Поэтому за последнее десятилетие возрос интерес к лабораторному получению ЭП из доступных резервов взрослого организма - из мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК). Например, мононуклеарная фракция из аспирата костного мозга содержит множество предшественников эндотелиальных клеток различной степени дифференцировки [112]. Ранние CD133+ ЭП клетки, которые появляются в прикрепленном состоянии в первые 4-7 суток культивирования имеют общие признаки с циркулирующими в крови ЭП, описанными Asahara [136]. Недавние исследования показали повышенное содержание ЭП в экстраэмбриональных тканях. В отличие от взрослой периферической крови, кровь пуповинной вены содержит «поздние» ЭП с необычайно высоким пролиферативным потенциалом - хороший источник для банка ЭП и клинического применения [111]. Первичная культура ММСК, выделенная из Вартонова студня пупочного канатика (ПК), обогащена ранними ЭП в большей степени, чем аспират костного мозга взрослого организма [151,131]. Кроме того, было установлено, что воздействие VEGF приводит к образованию в 2D культуре ММСК ПК поздних С031+/у\\Ф+ ЭП, сопоставимому с дифференцировкой 2Т) культуры ММСК КМ [35,43].

Несмотря на то, что пупочный канатик является универсальным источником низкодифференцированных клеток различного фенотипа [119], в 20 культуре не удается моделировать развитие ранних и поздних ЭП. Условия ЗО культивирования лучше моделируют структуры нативной ткани и полноценный морфогенез. Однако до сих пор нет адекватных моделей васкуло- и ангиогенеза в ЗО культуре ММСК, механизмы этих процессов остаются неизученными, так как исследования в этой области проводились в основном на эмбриональных ангиобластах [71].

Цель и задачи исследования

Изучить ангиогенные и васкулогенные характеристики индуцированных УЕОБ мультипотентных мезенхимных стромальных клеток пупочного канатика в ЗБ культуре.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить и охарактеризовать стандартное сырье - клонированные мультипотентные мезенхимные стромальные клетки пупочного канатика (ММСК ПК).

2. Разработать и стандартизовать методику серийного масштабирования жизнеспособных аваскулярных и васкуляризованных ЗО мезеносфероидов из стандартного 20 сырья.

3. Изучить ЗО динамику сфероидообразования ММСК ПК. Сравнить распределение экспрессии в 2Б и ЗБ культуре эпителиальных и мезенхимных маркеров, оценить пролиферативный потенциал клеток сфероида, исследовать структурные изменения на клеточном и ультраструктурном уровне.

4. Исследовать экспрессию маркеров ранних и поздних эндотелиальных прогениторных клеток в аваскулярных и васкуляризованных сфероидах ММСК ПК.

5. Осуществить ЗБ скрининг УЕОБ-индуцированных сфероидов ММСК ПК к капиллярогенезу в ЗБ-матригеле.

6. Проверить возможность образования васкуляризованной микроткани при слиянии мезеносфероидов.

7. Исследовать поведение поздних ЭП из ЗБ культуры ММСК ПК при патологическом процессе на модели хронической печеночной недостаточности крыс.

Научная новизна

Работа является оригинальным экспериментальным исследованием, в котором впервые было осуществлено серийное масштабирование аваскулярных (неиндуцированных) и васкуляризованных (УЕОР-индуцированных) мезеносфероидов из стандартного 2Т) сырья -клонированной культуры ММСК ПК.

Были впервые исследованы пластичность и перераспределение экспрессии мезенхимных и эпителиальных маркеров в клетках сфероидов ММСК ПК. Впервые были выявлены ранние ЭП в аваскулярных мезеносфероидах. Впервые показано, что УЕОБ индуцировал появление в ЗЭ культуре ММСК ПК поздних ЭП, способных к образованию люменов внутри сфероида и тубулоподобных структур в окружающем матриксе при помещении в матригель.

Предложена оригинальная методика получения васкуляризованной микроткани путем слияния индуцированных мезеносфероидов с образованием единой капиллярной сети. Впервые показано, что трансплантированные в составе сфероида поздние ЭП выживали в поврежденной ксеногенной печени без иммуносупрессии, встраивались в стенки сосудов реципиента и сохраняли экспрессию маркера ЭП.

Теоретическая и практическая значимость

Разработан метод получения неограниченного числа аваскулярных и васкуляризованных мезеносфероидов из стандартного источника - ММСК

ПК. Было показано, что клонированная культура ММСК ПК способна к сфероидообразованию с включением в новообразующийся сфероид практически всех клеток в ЗБ системе. Предложенный метод позволяет получить максимально возможное количество идентичных мезеносфероидов с минимальными потерями исходного числа клеток. Было установлено, что сфероидообразование ММСК ПК всегда сопровождается ламинацией сфероида на две функциональные зоны, ультраструктурными изменениями и перераспределением паттернов экспрессии мезенхимных и эпителиальных маркеров. Нестин+, цитокератин 19+ эпителиоподобные клетки располагались на поверхности сфероидов, тогда как коллаген 1У+ округлые клетки были сосредоточены в центральной части, но все клетки сфероида сохраняли экспрессию виментина, цитокератина 18 и ламинина. Были выявлены ранние и поздние ЭП в ЗБ культуре ММСК ПК. Продемонстрирована новая клеточная модель васкулогенеза и ангиогенеза из одного типа клеток. Появление поздних ЭП было связано с влиянием УЕОР и сопровождалось образованием люменов и тубулоподобных структур в матригеле. Установлено, что сфероиды ММСК ПК способны к неограниченному слиянию с увеличением плотности клеток в объединенном сфероиде. Слияние васкуляризованных сфероидов приводило к сегрегации СБ31+ клеток с образованием единой капиллярной сети. Интеграция с тканями реципиента и сохранение экспрессии специфического маркера свидетельствовали о способности поздних ЭП из сфероидов ММСК ПК к участию в регенерации сосудистой сети поврежденной печени крыс. Разработанный метод получения васкуляризованных мезеносфероидов может найти применение в тканевой инженерии и регенеративной медицине.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Культивирование сфероидов ММСК ПК на агарозных планшетах позволяет с малыми трудозатратами получать из стандартного 2D сырья большие (достаточные для клинических трансплантаций) количества сфероидов.

2. ММСК ПК при сфероидообразовании разделяются на две популяции: нестин+/цитокератин19+ и нестин-/коллаген IV+ клетки. Популяции отличаются не только иммуноцитохимическими, но и ультраструктурными особенностями.

3. При 3D культивировании ММСК ПК происходит спонтанная дифференцировка в эндотелиальном направлении, сопровождающаяся новообразованием ранних ЭП. Добавление индукционного фактора VEGF стимулирует появление поздних ЭП, формирующих люмены внутри сфероида и тубулоподобные структуры в матригеле. При слиянии большого числа сфероидов, в новообразованной ткани развивается внутренняя сосудистая сеть.

4. Локальное введение васкуляризованных сфероидов в ткань поврежденной печени крыс приводит к интеграции поздних ЭП с тканями реципиента и их участию в регенерации сосудистой сети.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на:

• XVI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (2009г, Москва)

• VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (2009г, Москва)

• IX «High médical technologies in XXI century: The modem achievements in cellular technologies and nanotechnologies» (20 Юг, Benidorm, Spain)

• X «High médical technologies in XXI century: The modem achievements in cellular technologies and nanotechnologies» (2011 r, Benidorm, Spain)

• 8th Swiss experimental surgery symposium "Animal Models for Organogenesis" (2012r, Geneva, Switzerland)

• 5 Всероссийский симпозиум с международным участием «Актуальныевопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (2012г, Уфа)

• 47th Annual Congress of the European Society for Surgical Research (2012r, Lille, France)

• 4th Expert Meeting Mesenchymal Stem Cells in Solid Organ Transplantation MISOT (2012г. Barselona, Spain)

• The XI International Conference "Hight Medical Technologies XXI Century" (2012r. Benidorm, Spain)

Внедрение полученных результатов

Результаты диссертационного исследования используют для моделирования васкулогенеза и ангиогенеза in vitro, подготовки клеток к трансплантации в поврежденные ткани, получения васкуляризованной микроткани для тканеинженерных конструкций в лаборатории клеточной биологии и патологии развития ФГБУ НИИОПП РАМН и для исследования регенеративного и иммуномодулирующего воздействия мезеносфероидов на печень при развивающемся патологическом процессе в лаборатории биотехнологии стволовых клеток ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития России.

ВЫВОДЫ

1. Клонированные 2D культуры мультипотентных мезенхимных стромальных клеток пупочного канатика обладают смешанным мезенхимным (CD 105+/CD90+/CD29+/CD 11 b-/CD45 -/CD3 4-, виментин+) и эпителиальным (цитокератин 18+, коллаген IV+, ламинин+) фенотипом, который стабильно воспроизводится в свыше 95% клеток при дальнейшем культивировании.

2. Временные и количественные закономерности сфероидообразования в системе единичных сфероидов «висячей капле» и при масштабном культивировании на агарозных планшетах 3D Petri Dish идентичны. Сфероидообразование происходит в течение 7 суток 3D культивирования и сопровождается ламинацией на поверхностную и центральную зоны сфероидов, состоящие из различных типов клеток. Эпителиоподобные (нестин+/цитокератин19+) поверхностные клетки связаны межклеточными контактами и несут микроворсинки. Центральную часть сфероидов составляют нестин-/коллаген IV+ клетки с ультраструктурными изменениями, выражающимися в накоплении секреторных гранул, образовании центрических крист митохондрий, гиперплазии аппарата Гольджи, повышенном количестве микровезикул. Экспрессия виментина, цитокератина18 и ламинина сохраняется во всех клетках сфероида.

3. На 7 сутки 3D культивирования в мезеносфероидах экспрессируются маркеры раннего эмбриогенеза (GATA6, РАХ6) и маркеры ранних эндотелиальных прогениторов (CD133+, CD34+, VEGF+) без морфологических признаков ангио-, васкулогенеза в сфероиде.

4. Добавление васкулогенного индуктора VEGF в культуральную среду вызывает на 7 сутки 3D культивирования образование поздних эндотелиальных прогениторов (CD31+, Flk-1+, vWF+ клеток), образующих внутри сфероида кольцевые структуры - люмены.

5. Помещение мезеносфероидов с поздними эндотелиальными прогениторами в матригель индуцирует активный рост тубулоподобных структур в окружающий матрикс, завершающийся к 9 суткам культивирования формированием первичной капиллярной сети.

6. Слияние аваскулярных и васкуляризованных (содержащих люмены и тубулоподобные структуры) мезеносфероидов завершается образованием единой структуры - васкуляризованной микроткани.

7. Поздние эндотелиальные прогениторы из васку ляризованных мезеносфероидов способны дифференцироваться в эндотелиоциты и участвовать в регенерации сосудистой сети при патологическом процессе in vivo.