Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Иммунобиологические свойства различных углеводсодержащих препаратов Haemophilus influenzae

о

4840463

ГОЛОВИНСКАЯ Ольга Вячеславовна

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РАЗЛИЧНЫХ УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИХ ПРЕПАРАТОВ НАЕМОРШЬ СЛУ ШП \JENZAE

14.03.09 - клиническая иммунологии, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2011

1 7 [¿др 2011

4840463

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Ястребова Наталия Евгеньевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Киселевский Михаил Валентинович

доктор биологических наук Мирошниченко Ирина Вадимовна

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Защита диссертации состоится «24» марта 2011 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, Москва, Малый Казённый пер., д.5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН

Автореферат разослан « оЦу> февраля 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного сове' кандидат биологических наук /

И.В. Яковлева

Актуальность темы. Инфекции, вызываемые Haemophilus influenzae, являются причиной заболеваемости и смертности в экономически развитых и развивающихся странах, прежде всего, среди детей раннего возраста [Л.М.Куртасова с соавт., 2010]. Установлена роль H.influenzae в этиологии гнойного менингита, гнойного эпиглоттита, сепсиса, хронического бронхита, пневмонии, среднего отита, синусита, конъюнктивита и др. Фактические данные, накопленные в последние годы, свидетельствуют о том, что эти заболевания имеют широкое распространение на территории России и являются актуальной проблемой здравоохранения [В.К.Таточенко, 2010].

Заболевания, вызываемые наиболее вирулентным капсульным штаммом H.influenzae типа b (Hib), имеют тяжелое течение с нередким развитием осложнений и высокую летальность. Вместе с тем, нельзя недооценивать медико-социальную значимость инфекций, вызываемых бескапсульными или нетипируемыми (NTHi) штаммами гемофильной палочки.

Если вопрос защиты от инфекций, вызванных капсульными штаммами H.influenzae, в настоящее время решается применением конъюгированных вакцин на основе капсульного полисахарида H.influenzae типа b (КПС Hib) и белков-носителей, то вакцины против инфекций, вызванных бескапсульными штаммами, до сих пор нет. В качестве основы для вакцинных препаратов, направленных на профилактику заболеваний, вызванных бескапсульными штаммами H.influenzae, за рубежом изучается роль белков наружной мембраны и липоолигосахаридов (JIOC) [A.R.Foxwell, М.К. Jennelle et al, 1998; W.E.Adhami, et al 1999]. Следует отметить, что JIOC бескапсульных штаммов H.influenzae имеют уникальную структуру. Обнаружено более 10-ти субтипов NTHi, различающихся по электрофоретической подвижности ЛОС [О.Е.Орлова, 2006; Х.Х. Gu et al., 1995].

Список сокращений - с.24

В нашей стране субтипирование циркулирующих бескапсульных штаммов не проводилось. Вместе с тем, решение этого вопроса может способствовать определению наиболее распространенных в популяции субтипов возбудителей с дальнейшим получением из них детоксицированных ЛОС, обеспечивающих перекрестную защиту от ЫТНь Не изучена также возможность создания вакцинного препарата на основе двух Т-независимых антигенов (КПС и ЛОС) Н.1п/1иепгае для одновременной защиты от капсульных и бескапсульных штаммов.

Цель. Получение углеводсодержащих антигенов Н.т/1иепгае и характеристика их иммунобиологических свойств.

Задачи исследования:

1. Провести выбор бескапсульных штаммов Н. ¡п/1иеп~ае, наиболее распространенных в популяции больных бронхолегочными заболеваниями (БЛЗ).

2. Получить препараты капсульного полисахарида ЬПЬ, гидроксил-аминовые препараты капсульного и бескапсульного штаммов НЛп/1иепгае, ЛОС ТЧТЖ и охарактеризовать их по химическим, физико-химическим и иммунохимическим свойствам.

3. Изучить влияние гидроксиламингидрохлорида, безводного гидразина, гидроксида натрия на жирнокислотный состав липида А липоолигосахарида бескапсульного штамма и его токсичность.

4. На основании результатов изучения иммунобиологических свойств антигенных препаратов Н.т/1иепгае определить наиболее перспективный препарат для разработки вакцины, направленной на профилактику заболеваний, вызываемых капсульными и бескапсульными штаммами НАп/1иепгае.

Научная новизна. Впервые при использовании БОБ-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) проведен скрининг ЛОС, выделенных из 62 бескапсульных штаммов Н.тАиепгае, циркулирующих на территории России (Москва) среди больных с бронхолегочными заболеваниями. По электрофоретической подвижности ЛОС выявлено 10 основных субтипов,

имеющих один электрофоретический компонент, и 13 дополнительных, включающих 2-3 основных компонента в различных сочетаниях. Наиболее распространены среди больных - VI (17,7±4,8%), VIII (12,9±4,3) и X (12,9±4,3) субтипы.

Впервые при использовании твердофазного ИФА на основе ЛОС 67 штаммов NTHi определена частота повышенного уровня ЛОС-специфическнх IgG-антител к H.injluenzae у больных бронхолегочными заболеваниями и здоровых доноров. Наиболее часто повышенный уровень антител наблюдали к 11 штаммам (16,7-54,8%), которые также имели признаки или принадлежали к трем основным субтипам (VI, VIII, X).

Выделены и охарактеризованы по химическим, физико-химическим и иммунохимическим свойствам три группы бактериальных антигенов: КПС 1095 Hib; ГАП 1095 Hib и 58 NTHi; ЛОС штаммов 45, 54, 58, 65 NTHi и 1095 Hib. По результатам иммунохимических исследований наиболее выраженной перекрестной активностью обладал ЛОС штамма 45 NTHi (X субтип).

Впервые проведено сравнительное изучение детоксицирующих свойств безводного гидразина (БГ), солянокислого гидроксиламина (ГА) и гидроксида натрия. На примере ЛОС 45 NTHi показано, что при использованных концентрациях БГ и ГА приводят к удалению основной массы жирных кислот из липида А, что, в свою очередь, ведет к уменьшению токсичности препарата в опытах на животных в 31,5-25 раз (1Л}50ЛОСисх=0,063 мкг; LD50 дЛОСБГ=1,99 мкг; 1Л}50дЛОСГА=1,58 мкг).

Изучение иммунобиологических свойств КПС, ГАП, ЛОС, дЛОС и смесей КПС с ЛОС 45 NTHi и КПС с дЛОСГА показало, что смесь КПС Hib (10 мкг) и дЛОСга 45 NTHi (0,1-10мкг) является наиболее перспективным углеводсодержащим препаратом в качестве основы для разработки новой вакцины против гемофильной инфекции, обусловленной как капсульными, так и бескапсульными штаммами. При испытанных дозах и схемах введения смесь указанных препаратов обладает низкой токсичностью, высокой перекрестной протективной активностью при заражении иммунизированных мышей

капсульным и бескапсульными штаммами Н.influenzae и вызывает активацию эффекторов системы врожденного и адаптивного иммунитета, приводя к повышению фагоцитарной способности лейкоцитов мышей, продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, увеличению числа Т-клеток, экспрессирующих молекулы CD4, активационные молекулы CD25 и MHCII, повышению продукции специфических IgG-антител к JIOC.

Практическая значимость. Установлено, что циркулирующие на территории России (Москва) NTHi штаммы по структуре ЛОС относятся к десяти основным субтипам, среди которых VI, VIII и X субтипы наиболее распространены у больных бронхолегочными заболеваниями. Предложенный способ субтипирования может быть использован для проведения эпидемиологического мониторинга штаммов в разных географических регионах России.

Высокая степень очистки и специфическая активность КПС 1095 Hib позволяет рекомендовать его использование в качестве референс-препарата, а также для создания современных диагностических и профилактических препаратов. В рамках выполнения федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 гг.» КПС 1095 Hib использовали для создания количественной иммуноферментной тест-системы для оценки поствакцинального иммунитета.

Солянокислый гидроксиламин может быть использован в качестве детоксицирующего агента для ЛОС NTHi штаммов.

Смесь капсульного полисахарида Hib и детоксицированного ЛОС NTHi может быть использована в качестве основы для разработки вакцины с серотиповой (Hib) и видовой (NTHi) перекрестной протсктивной активностью.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Бескапсульные штаммы Н.influenzae, циркулирующие в популяции больных бронхолегочными заболеваниями людей, по электрофоретической

подвижности JIOC относятся к 10 основным субтипам, наиболее распространенными из которых являются VI, VIII и X.

2. Среди выделенных углеводсодержащих препаратов - КПС 1095 Hib, ГАП 1095 Hib и 58NTHÍ, ЛОС 45, 54, 58, 65 NTHi и 1095 Hib - высокой перекрестной серологической активностью обладают ГАП и ЛОС 45 NTHi.

3. Действие 1% водного раствора гидроксиламингидрохлорида приводит к удалению из липида А ЛОС NTHi 3-гидроксикаприновой, миристиновой, олеиновой и стеариновой кислот и снижению токсичности полученного дЛОС в 25 раз.

4. Низкая токсичность, высокая степень внутривидовой перекрестной защиты смеси КПС Hib и дЛОС NTHi, способность этой смеси активировать эффекторы врожденного иммунитета, а также инициировать процесс формирования адаптивного иммунитета является основанием для разработки новой вакцины, направленной на профилактику заболеваний, вызванных капсульными и бескапсульными штаммами Н.influenzae.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены и обсуждены: на Всероссийской научной конференции "Объединенный Иммунологический Форум", Санкт-Петербург, 2008; на конференции молодых ученых НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, 2009. Апробация работы состоялась на конференции отдела иммунологии НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН 18 ноября 2010 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 149 страницах компьютерного текста, иллюстрированы 18 рисунками и 20 таблицами, состоят из введения, четырех глав обзора литературы, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 109 источников, в том числе, 41 на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Штаммы микроорганизмов: Hib 1095 выделен в 2001 году от ребенка больного менингитом; 67 бескапсульных штаммов выделены в течение 2006 года от пациентов НЦЗД РАМН, страдающих различными бронхолегочными заболеваниями, и любезно предоставлены нам д.м.н., проф. Л.К.Катосовой.

Культивирование бактерий каждого штамма NTHi проводили на плотной сердечно-мозговой среде («Дифко», США) с добавлением в нее факторов роста - НАД (4 мл/л) и гемина (60 мл/л), и полусинтетической жидкой питательной среде, содержащей аминопептид. Длительность культивирования составляла 10-14 час при 37°С.

Сыворотки клинически здоровых доноров (п=40) получены со станции переливания крови г. Москвы в 2006 г. Средний возраст лиц, допущенных к донорству крови - 30,6 лет. Сыворотки крови больных (п=56) бронхолегочными заболеваниями детей (бронхиальная астма, хроническая пневмония, острый рецидивирующий обструктивный бронхит, синдром Картагенера, врожденный порок развития легких) получены из НЦЗД РАМН в 2006 г. Средний возраст обследуемых пациентов - 10,1 г. У 25 детей имелось бактериологическое подтверждение инфекции, вызванной NTHi штаммами. При этом от 14 детей имелись одновременно и штаммы и сыворотки. У 31 ребенка данные бактериологических исследований отсутствовали или были отрицательными.

Гипериммунные сыворотки кроликов получали после многократной иммунизации животных суспензией гретых бактерий различных штаммов Н. influenzae. Титр сывороток в реакции агглютинации составлял 1:800-1:1600.

Лабораторные животные. Для исследований использовали мышей белых беспородных (п=1386), линейных C57BI/6 (п=80) и Balb/c (п=350) массой 16-18 г и 18-20 г, самцы; кроликов породы «шиншилла» (п=18) массой 2-2,5 кг. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом в соответствии с

«Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Получение антигенных препаратов. Препараты ДОС получали с помощью фенольной экстракции из водной и фенольной фаз [О. Westphal et al, 1965]; лизиса бактерий с последующей обработкой протеиназой К [P.J.Hitchcock et al., 1983]; лизиса бактерий, депротеинизации ферментами и осаждения этанолом [Р.А. Jones et al, 2002]; экстракции 0,1М раствором NaCl с последующей очисткой ДНК-азой, РНК-азой, протеиназой К и ультрацентрифугированием [Л.Д. Варбанец, 2006]. КПС Hib выделен с помощью цетавлона [Е.С. Gotschlich et al, 1969]. ГАП получали из бактерий капсульного и бескапсульного штаммов с помощью солянокислого гидроксиламина [Н.И. Синяшин с соавт., 1964].

Детоксикацию липоолигосахаридов проводили с помощью безводною гидразина (БГ), 1% солянокислого гидроксиламина (ГА) и 0,1М щелочи в условиях, описанных Х.Х. Gu [1997, 2001] для БГ.

Химический состав полученных препаратов изучали, определяя содержание в них белка [О.Н. Lowry et al., 1951]; углеводов [М. Dubois et al., 1959]; рибозы [B.B. Мейбаум, 1945]; нуклеиновых кислот по величине оптической плотности при 260 нм [Л.Р. Остсрман, 1981].

Электрофорез в 10% и 15% полиакриламидиом геле проводили по методу Laemmli [1970] с окраской Coumassi Brilliant Blue R-250 или азотнокислым серебром.

Газожидкостная хроматография высших жирных кислот (ВЖК) была выполнена на хроматографе Hewlett-Packard 5890А (США), снабженном капиллярной колонкой HP-IMS и пламенно-ионизационным детектором (газ-носитель - азот). Содержание высших жирных кислот оценивали по площадям пиков соответствующих метиловых эфиров на хроматограммах и выражали в виде отношения к площади пика метилового эфира пальмитиновой кислоты (С 16:0), который имелся на хроматограммах всех образцов и площадь которого

принимали за единицу. Исследование выполнено совместно с сотрудниками НИИ Органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН.

ЯМР-спектроскопия КПС Hib выполнена на спектрометре DRX-500 («Вгикег», Германия). Исследование выполнено совместно с сотрудниками ГНЦ Института Иммунологии ФМБА.

Определение молекулярно-весовой гетерогенности препаратов осуществляли с помощью гель-фильтрации на колонке («LKB-Pharmacia») размером 70x1,5 см, заполненной сефарозой CL6B. Оптическую плотность каждой фракции определяли при длине волны 280 нм. Рассчитывали коэффициенты объемного распределения (Kav) фракций.

Определение серологической специфичности выделенных препаратов осуществляли в реакции преципитации в геле [О. Ouchterlony, 1953]; линейном иммуноэлектрофорезе [П.Грабар, 1961], ракетном иммуноэлектрофорезе (РИЭФ) [B.Weeke, 1973].

Для определения уровня IgG антител в сыворотках людей и экспериментальных животных использовали метод непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) с адсорбцией на носителе антигена. Для получения иммуносорбентов со штаммовой (по JIOC) и типовой (по КПС) специфичностью полистироловые пластины (производство ВНИИ «Медполимер», Россия) сорбировали каждым из антигенов в дозах 2,5-5 мкг/мл.

Торможение ИФА применяли для изучения перекрестной активности JIOC. Конкуренция за связывание антител происходила между антигеном, сорбированным на твердой фазе, и антигеном, добавленным в гипериммунную кроличью сыворотку в момент внесения ее рабочего разведения в лунку.

Определение фагоцитарной активности лейкоцитов проводили на мышах линии С57В1/6. Препараты вводили внутрибрюшинно в дозах 100 (ГАП) и 10 (другие препараты) мкг/мышь. Через 24 часа мышей заражали штаммом Wood 46 Staphylococcus aureus внутрибрюшинно в дозе 5х108 м.к./мышь в 0,4% агаре. Поглотительную способность фагоцитов крови оценивали по

фагоцитарному индексу и фагоцитарной активности через 4, 24 и 48 часов после заражения.

Оценку цитокипового профиля мышей проводили в сыворотках после однократной внутрибрюшинной иммунизации исследуемыми препаратами в дозе 1,0 мкг. Забор крови проводили через 4, 8 и 24 часа. Определение цитокинов (GM-CSF, IFN-y, IL-la, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, TNF-a) проводили при использовании набора «Flow Cytomix» согласно инструкции производителя. Контролем служили показатели у интактных животных. Результаты учитывали на проточном цитометре FacsCalibur («Becton Dickinson», США).

Исследование экспрессии поверхностных маркеров мононуклеарных лейкоцитов (MJI) селезенок мышей проводили путем иммунофенотипирования с применением моноклональных антител («Caltag Laboratories», США) против соответствующих антигенов на проточном цитометре FacsCalibur («Becton Dickinson», США). На МЛ исследовали уровни экспрессии дифференцировочкых антигенов CD3, CD4, CD8, NK; активационных антигенов CD25, МНС II; а также маркеров В-лимфоцитов -CD 19. Контролем служили показатели у интактных животных.

Токсичность препаратов определяли на беспородных белых мышах, которым за день до иммунизации внутрибрюшинно вводили по 0,5 мл актиномицина Д в дозе 10 мкг/мышь с целью иммуносупрессии и увеличения чувствительности животных к препаратам. Препараты вводили внутрибрюшинно в дозах: 50,0; 10,0 и 2,0 мкг (ГАП); 10,0; 1,0 и 0,1 мкг (КПС) или 2,0; 0,2 и 0,02 мкг (ЛОС). Гибель животных учитывали на 2-5-е сутки после иммунизации. По окончании опыта рассчитывали LD50 по формуле [Б.Л. Ван дер Варден, 1960].

Протективную активность определяли путем предварительной иммунизации беспородных белых мышей кратными разведениями антигенных препаратов в различных дозах (от 50,0 до 0,1 мкг/мышь). Для изучения перекрестной защиты мышей иммунизировали двукратно с интервалом в одну

неделю. Мышей заражали на 14-е сутки культурой Н.influenzae типа b в дозе 1,5x109 м.к. на мышь, либо культурами штаммов 45, 58 и 65 NTHi (в опыте по изучению перекрестной защиты) в дозах 0,3x109, 1,0x109 и 1,5x109 м.к. на мышь, соответственно. Гибель мышей учитывали в течение 5 суток. По окончании опыта рассчитывали среднюю иммунизирующую дозу ED50 по формуле Ван дер Вардена.

Статистическую обработку проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Exel и Biostat и по методу Гланца [С. Гланц, 1998]. Данные представлены как М±ш. Различия рассматривались как значимые при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор наиболее распространенных в популяции субтипов бескапсульных

штаммов Н.influenzae

Определение субтиповой принадлежности ЛОС 62 штаммов NTHi проводили с помощью SDS-электрофореза в 15% ПААГ при окрашивании азотнокислым серебром. Как мы и ожидали, демицеллированные молекулы ЛОС находились в зоне низких молекулярных масс (<6,5 kDa), что совпадает с данным литературы [Х.Х. Gu et al., 1995]. Оценку результатов проводили для каждого из 62 исследованных препаратов по величине коэффициента подвижности (Rf). Следует отметить, что в отличие от принятого расчета Rf, мы делили расстояние до выявления пятен ЛОС на расстояние пробега апротинина - одного из компонентов калибровочной смеси с молекулярной массой 6,5 kDa. Это обеспечивало хорошую воспроизводимость результатов.

По величине Rf выявлено 23 субтипа NTHi (табл. 1). Из них 10 (1-Х) были основными, их ЛОС проявлялись в виде одного электрофоретического компонента с Rf от 1,01 до 1,11 (69,4%), остальные ЛОС (29,0%) были гетерогенными и имели 2-3 основных компонента в различных сочетаниях.

Таблица 1

Субтипы Л ОС (по результатам электрофореза в ПААГ)_

Субтип Rrотносительно апротинина (6,5 kDa) Мг ЛОС штаммов NTHi Всего, %±m

I 1,01 2 1,6±1,6

II 1,03 61 1,6±1,6

III 1,04 11, 84 3,2±2,2

IV 1,05 10 1,6±1,6

V 1,06 8,36,39,41 6,4±3,1

VI 1,07 1,3, 7, 9, 12, 16, 17, 23, 24, 37,47 17,7±4,8*

VII 1,08 21,72 3,2±2,2

VIII 1,09 26,31,34,38,49, 50,51,54 12,9±4,3*

IX 1,10 18,20,35,48, 86 8,1±3,5

X 1,11 5,28, 32,33,40,45,83,87 12,9±4,3*

I-VI 1,01; 1,07 53,58 3,2±2,2

I-VHI 1,01; 1,09 66, 67 3,2±2,2

I-VI-VIII 1,01; 1,07; 1,09 59 1,6±1,6

I-VII-VIII 1,01; 1,08; 1,09 71 1,6±1,6

II-VII 1,03; 1,08 60 1,6±1,6

II-V-VIII 1,03; 1,06; 1,08 55 1,6±1,6

III-VI 1,04; 1,07 15 1,6±1,6

IIl-VII 1,04; 1,08 63,64 3,2±2,2

III-X 1,04; 1,11 52 1,6±1,6

IV-X 1,05; 1,11 46 1,6±1,6

V-VII 1,06; 1,08 62, 69 3,2±2,2

V-VIII 1,06; 1,09 65, 68 3,2±2,2

VI-VIII 1,07; 1,09 70 1,6±1,6

*Примечание. Различия достоверны (р<0,05) по сравнению с 3,2±2,2% и 1,6±1,6%. В штамме № 6 NTHi низкомолекулярные компоненты не выявлены.

Наличие в составе одной бактериальной клетки нескольких отличающихся по подвижности JIOC, вероятно, можно объяснить тем, что при генетических изменениях, происходящих в процессе мутации штаммов, клетки продолжают синтезировать ДОС различной структуры.

Наиболее распространенными в популяции оказались штаммы, относящиеся к VI (17, 7%), VIII (12,9%) и X (12,9%) субтипам, а с учетом наличия субтипов, включающих несколько основных, их удельный вес в популяции составил 67,7%.

Для того чтобы установить, какие субтипы NTHi штаммов чаще всего вызывают бронхолегочные заболевания, в ИФА анализировали уровень IgG-AT в сыворотках крови больных различными бронхолегочными заболеваниями и здоровых доноров. Исследования показали, что к JIOC 11 из 67 штаммов в

сыворотках больных бронхолегочными заболеваниями достоверно чаще, чем у здоровых повышен уровень ^в-АТ (табл. 2).

Таблица 2

Частота выявления повышенного уровня ^в-антител к отдельным ЛОС N1111 у клинически здоровых доноров и больных бронхолегочными заболеваниями

№№ п/п Субтип ЛОС штаммов №№ Частота повышенного уровня IgG-AT (%)

здоровые (п = 40) больные БЛЗ (п = 42)

1 X 5 2,5 ± 2,5 16,7 ±5,7*

2 VI 23 2,5 ± 2,5 19,8 ±6,0*

3 VIII 26 2,5 ±2,5 16,7 ± 5,7*

4 н/о 44 2,5 ± 2,5 45,2 ±7,7**

5 X 45 5,0 ± 3,4 35,7 ± 7,4*

6 VIII 54 2,5 ±2,5 23,8 ±6,6*

7 II-V-VIII 55 2,5 ±2,5 26,2 ± 6,8*

8 I-VI 58 5,0 ± 3,4 54,8 ± 7,7**

9 V-V1II 65 2,5 ± 2,5 26,2 ± 6,8*

10 I-VIII 67 5,0 ± 3,4 19,8 ±6,0*

11 I-VII-VIII 71 2,5 ± 2,5 21,4 ±6,3*

Примечание. Достоверность различий по сравнению с клинически здоровыми

донорами: * р<0,05; ** р<0,01. Н/о-не определяли.

Полученные данные указывали на более выраженную иммуногенность этих штаммов по сравнению с другими штаммами, принадлежащими к тем же субтипам.

В ходе выполнения данного раздела исследований получены также косвенные доказательства важной роли NTHi штаммов в возникновении ряда бронхолегочных заболеваний, т.к. повышенные уровни IgG-AT к ЛОС NTHi обнаружены у 73,2% больных и только у 32,5% здоровых лиц. Свидетельством частой смены субтипа возбудителя у больных бронхолегочными заболеваниями служил факт определения повышенного уровня IgG-AT (64,0% против 12,5% у здоровых лиц) к ЛОС разных субтипов одновременно (табл. 3).

Полученные результаты позволили выбрать для дальнейших исследований группу из 4-х NTHi штаммов, которые относились к VI, VIII, X субтипам или имели признаки этих субтипов и к которым в сыворотках больных наиболее часто определялся повышенный уровень IgG-антител (№№45, 54, 58, 65).

Таблица 3

Сравнительная характеристика уровня 1цС-АТ к ЛОС ЫТШ у клинически здоровых доноров и больных бронхолегочными

заболеваниями

Число ЛОС И-™, к которым определяли антитела Частота выявления антител среди группы обследуемых

Здоровые (п = 40) больные БЛЗ (п = 56)

с высевом ОТШ (п = 25) без высева ЫТШ (п = 31) всего

0 67,5 ± 2,5 4,0 ±3,9** 32,3 ± 8,4* 19,6 ±5,5*

1 15,0 ±5,6 16,0 ±7.3 6,4 ± 4,4 10,7 ±4,1

2-3 5,0 ± 3,4 16,0 ±7,3 35,5 ± 8,6* 26,8 ± 5.2*

>4 12,5 ± 5,2 64,0 ± 9,6* 25,8 ± 7,9 42,9 ± 6,6*

Примечание. Достоверность различий по сравнению с клинически здоровыми людьми

(* р < 0,05; **р< 0,01).

Характеристика химических, физико-химических и иммунохимических свойств углеводсодержащих препаратов НЛп$1иепгае

В ходе подбора оптимального метода выделения и очистки ЛОС было установлено, что наибольший выход препарата достигается экстракцией 0,1М раствором ЫаС1 с последующей его очисткой [Л.Д. Варбанец с соавт., 2006]. Эти препараты использовали для дальнейших исследований.

В химическом составе препаратов ЛОС преобладали углеводы (18,2-23,3)%. С помощью ГЖХ в них обнаружены высшие жирные кислоты (3-гидроксикаприповая, миристиновая, 3-гидроксимиристиновая, пальмитиновая, олеиновая и стеариновая), что соответствует данным литературы о жирнокислотном составе липида А [Е.К.Н.8с11\уес1а е1: а1,2003].

КПС содержал 39,8% рибозы, незначительную примесь белка (0,9%) и нуклеиновых кислот (1,2%) и проявлял свойства отрицательно заряженного антигена в линейном электрофорезе и РИЭФ. В ГАП преобладали вещества белковой природы (56,2-63,1)% (табл.4). В ГАП капсульного штамма содержание углеводов было выше за счет присутствия в препарате КПС, что подтверждено результатами РИЭФ, линейным электрофорезом и в реакции преципитации в геле по Оухтерлони с гипериммунной кроличьей сывороткой к НЛ штамму.

КПС ШЬ в реакции преципитации в геле по Оухтерлони с гипериммунными сыворотками кроликов к гомологичному и гетерологичным штаммам N1111 и №Ь демонстрировал только серотиповую специфичность. Наиболее выраженной специфической и перекрестной антигенной активностью обладали ЛОС 45 ЖШ (X субтип), ГАП1095 ШЬ и ГАП58 ЖШ. ГАП образовывали до 3-х дуг преципитации с гипериммунными сыворотками кроликов.

Таблица 4

Химический состав и серологическая специфичность антигенных препаратов

Н.influenzae

Название препарата Содержание, % Серологическая специфичность антигенов в реакции преципитации по Оухтерлони

белок нуклеиновые кислоты углеводы ШЫ095 бескапсульные, №№

45 54 58 65

ЛОС45]ЧТШ' 3,2±0,3 3,7±0,9 18,5±1,8 + + + + +

ЛОС54тН1' 2,1±0,3 3,4±0,3 20,8±2,3 + - + - -

ЛОС58МТ№' 4,3±0,6 2,4±0,6 23,3±1,8 + + + + -

nOC65NTHil 4,2±0,5 0,5±0,1* 18,2±1,3 + - + + +

КПС1095ШЬ 0,9±0,1* 1,2±0,3 39,8±2,3** + - - - -

ГАШ095ШЬ 56,2±3,3* 4,2±0,7 15,6±1,0 + + + + +

rAn58NTHi 63,1±4,8* 3,1 ±0,9 6,4±0,7* + + + + +

Примечание.

1 - жирнокислотный состав липида А ЛОС (3-гидроксикаприновая, миристиновая, 3-гидроксимиристиновая, пальмитиновая, олеиновая и стеариновая кислоты);

• - содержание рибозы - основного компонента КПС ШЬ;

* - достоверность различий (р<0,05) по сравнению с ЛОС 45 ЖГИ.

С помощью электрофореза в 10% ПААГ (рис. 1) в составе обоих ГАП были обнаружены электрофоретические компоненты с молекулярной массой близкой к молекулярной массе известных белков наружной мембраны Р1, Р2 и Р6 (М.м. 35-50; 36-42 и 16 Ша, соответственно).

235 k»a iff* . ' 225 кРа

Рис.1. Результаты SDS-электрофореза в 10% ПААГ гидроксиламиновых препаратов Н.influenzae в концентрациях 20 мг/мл.

Примечание. Окраска Coumassi Brilliant Blue R-250.

Изучение влияния различных детоксицирукнцих агентов на жирнокислотный состав и токсичность липоолигосахаридов H.influenzae

Известно, что ЛОС обладают высокой токсичностью, обусловленной наличием высших жирных кислот в составе липида A [I.M. Helander et al., 1988]. Учитывая данные о возможности использования солянокислого гидроксиламина [Н.Е. Захарова, 2001] и безводного гидразина [X.X.Gu et al., 1997, 2001] для детоксикации ЛПС, а также способность щелочных растворов удалять ВЖК липида А, было решено сравнить эти методы и оценить значимость гидроксиламина в детоксикации ЛОС 45 NTHi. Для этого в единых условиях эксперимента (37°С, 2 часа) на ЛОС воздействовали тремя реагентами: БГ, ГА и NaOH. В результате были получены препараты детоксицированного ЛОС (дЛОС). Изучение в сравнительном аспекте жирнокислотного состава исходного ЛОС и его детоксицированных производных с помощью ГЖХ показало, что полученные препараты в процессе детоксикации утратили часть ВЖК.

Как видно из табл. 5, обработка исходного препарата БГ и ГА привела к удалению 4-х из 6-ти ВЖК, за исключением 3-гидроксимиристиновой и пальмитиновой в первом случае, и миристиновой и пальмитиновой кислот во втором случае, что может объяснять более выраженную детоксицирующую активность БГ и солянокислого ГА, по сравнению с раствором гидроксида натрия, воздействие которым привело к удалению из препарата только олеиновой и стеариновой кислот. Таким образом, было показано, что механизм детоксикации ЛОС использованными реагентами различен.

Таблица 5

Токсичность детоксицированных производных препарата ЛОС 45 ЫТШ и

относительное содержание высших жирных кислот в них

Препарат Относительное содержание высших жирных кислот LD50 (мкг)

3-гидрокси-каприповая Мирис-тиновая З-гидрокси-миристиновая Пальмитиновая Олеиновая Стеариновая

ЛОС 45NTHi 0,15 0,30 0,35 1 0,23 0,18 0,06 (0,05-0,08)

дЛОСБГ - - 7,43 1 - - 1,99 (1,58-2,51)

дЛОСГА - 0,15 - 1 - - 1,58 (1,25-1,99)

дЛОС NaOH 0,59 0,38 0,86 1 - - 0,79 (0,59-1,05)

Очищенный ЛПС£.Со//055 н/о н/о н/о н/о н/о н/о 0,16 (0,12-0,21)

Примечание. Н/о - не определяли.

Для изучения степени влияния использованных детоксицирующих агентов на токсичность ЛОС были проведены опыты на мышах. Установлено, что наибольшей токсичностью обладает исходный ЛОС не подвергавшийся детоксикации (LD5o=0,063MKr) (табл. 5). Его токсичность в 2,5 раза выше токсичности препарата положительного контроля (E.coli 055). Токсичность ЛОС, детоксицированнго с помощью щелочи была ниже (LD5o=0,79MKr). Наименее токсичными были препараты дЛОСЕГ и дЛОС га (LD50=l,99MKr и 1,58мкг, соответственно). Их токсичность достоверно не отличалась. Это позволяет рекомендовать более широкое использование солянокислого гидроксиламина в качестве детоксицирующего агента. В дальнейших

исследованиях был использован дЛОСга, полученный в результате воздействия солянокислым гидроксиламином.

Таким образом, для выполнения основной задачи исследования было получено и охарактеризовано пять препаратов: ГАП 1095 ШЬ, ГАП 58 ШТП, КПС 1095 ШЬ, ЛОС 45 и дЛОСгл 45 ШТП, которые были дополнены двумя препаратами, представляющими собой смеси КПС 1095 ШЬ с ЛОС 45 и КПС 1095 ШЬ с дЛОСГА 45 ЫТНь В опытах на животных изучали влияние указанных препаратов на активацию врожденного и адаптивного иммунного ответа.

Изучение иммунобиологических свойств антигенных препаратов

Н.'ифиепгае

При изучении поглотительной способности нейтрофилов мышей показано, что через 4 часа все препараты стимулировали фагоцитарную активность, однако максимальные индексы активации нейтрофилов были получены при введении дЛОС 45, а также смесей КПС 1095 ШЬ с ЛОС 45 и с дЛОС 45 (табл. 6).

Таблица 6

Влияние препаратов Н.}п/1иепгае на показатели фагоцитарного индекса

№ Название препарата Доза мкг/ мышь Фагоцитарный индекс (%)

4 часа 24 часа 48 часов

1 КПС 1095 ЬПЬ 10 0,36 ¿0,04* 0,25±0,06* 0,35±0,03

2 ГАП 1095 НШ 100 0,27 ±0,07* 0,72±0,14* 0,65±0,04*

3 ГАП 58 ЫТН1 100 0,3 ±0,06* 0,63±0,17* 0,57±0,07*

4 ЛОС 45 ЫТН1 10 0,34 ±0,07* 0,36±0,08* 0,55±0,13*

5 дЛОС 45 N1111 10 0,47 ±0,06* 0,48±0,08* 0,46±0,14

6 КПС 1095 ШЬ +ЛОС45 10+10 0,46 ±0,1* 0,5±0,14* 0,74±0,22*

7 КПС 1095 №Ь+дЛОС45 10+10 0,47 ±0,11* 0,26±0,04* 0,69±0,17*

8 Контроль - 0,09 ±0,01 0,15±0,05 0,37±0,12

Примечание. * - указана достоверность различий (р<0,05) по сравнению с контролем.

Через 24 часа пика достигали фагоцитарные показатели при введении препаратов ГАП ШЬ и ЫТШ. Через 48 часов пики поглотительной способности были отмечены в группах, где вводили ГАП 1095 ШЬ, а так же смеси препаратов КПС 1095 ШЬ с ЛОС 45 и КПС 1095 ШЬ с дЛОС 45. При этом

максимальные значения фагоцитарных индексов снова были у смесей препаратов.

При изучении динамики продукции цитокинов установлено, что КПС и смесь КПС с ДОС и дЛОС ШТО приводили к достоверному увеличению содержания большинства исследованных цитокинов (табл. 7).

Таблица 7

Динамика** продукции цитокинов при введении препаратов НЛпАиепгае

Время Кратность увеличения уровня цитокинов в сыворотке крови мышей по

Препарат после сравнению с интактными животными

иммунизации 11.-1 а 1Ь2 11.-4 1Ь-5 1Ь-6 ОМ-СЭР [НО 1Н7 ТЫ Ра №N7

КПС 4ч 7* 8 19* 6 13* 11* 0 3 19* 6

№Ь 8ч 3 3 26* 7 4 8 3 8* 9 7*

1095 24ч 2 2 32* 2 0 2 4* 2 3 8*

ГАП 4ч 6 2 2 4 2 2 0 0 9 5

ШЬ 8ч 3 2 2 5 0 0 2 0 4 6*

1095 24ч 2 0 0 0 0 0 3 0 2 7*

ГАП 4ч 5 0 3 3 4 2 2 0 4 5,6

58 8ч 2 3 2 6 2 2 2 0 3 4

кгт 24ч 0 3 0 2 0 0 3 0 2 5

лос 4ч 5 0 13 6 9,7 3 2 0 4 7*

45 8ч 3 0 15 4 4 2 3 0 3 9*

ЫТШ 24ч 0 0 8 2 2 0 2 0 0 8*

дЛОС 4ч 5 4 25* 7 4 5 2 0 8 5

45 8ч 2 0 27* 5 2 2 3 0 4 6*

ЫТШ 24ч 2 2 20* 8 0 0 3 0 7 7*

КПС 4ч 8* 12* 14 13* 18* 12* 2 4 22* 7*

1095+ 8ч 2 5 12 14* 6 7 3* 8* 11 8*

ЛОС45 24ч 2 2 14 4 2 2 3* 3 2 5

КПС 4ч 10* 15* 17* 14* 17* 12* 2 9* 20* 6*

1095+ 8ч 4 4 13 13 7 6 3 5 8 8*

дЛОС45 24ч 2 2 17* 5 3 2 2 2 2 9*

Примечание.* - достоверно по сравнению с контролем; ** кратность отношения'

концентрации (пг/мл) цитокинов в опыте к данным в контроле (р<0,05); 0 - достоверных различий между опытом и контролем нет.

Смесь КПС с дЛОСга была более мощным активатором продукции цитокинов, чем другие препараты. Полученные данные свидетельствуют о значительном влиянии КПС ЬПЬ в смеси на активацию врожденного иммунитета. Препараты ГАП и ДОС не влияли на продукцию ИЛ-17 и оказывали слабое воздействие на синтез ИЛ-2.

Исследование экспрессии поверхностных маркеров МЛ селезенок мышей (табл. 8) показало, что большинство препаратов не вызывало существенного изменения фенотипа, активируя в основном СЭ25 (КПС 1ПЬ, ГАП, ЛОС и дЛОС , а МНО, СБ 19 (ЛОС и дЛОС, А N11 К) и МНС II (все препараты).

Отсутствие экспрессии поверхностных маркеров МЛ под действием ГАП, очевидно, связано с недостаточной иммунизирующей дозой. Наиболее заметную активацию врожденного иммунитета демонстрировали смеси КПС с ЛОС и КПС с дЛОСга (в большей степени), что проявлялось достоверным увеличением значений всех исследованных показателей.

Изучение протективной активности углеводсодержащих препаратов показало, что у животных, иммунизированных большинством указанных препаратов, формируется специфический серотиповой (против №Ь штамма) и видовой (против ЭТШ штаммов) иммунный ответ (табл. 9). Так, все препараты, содержащие КПС (КПС, ГАП НШ, смеси КПС и ЛОС), защищали 50% животных при введении небольших доз антигенов при заражении летальной дозой капсульного штамма (Е05о=0,32-1,26мкг).

Исключение составил ГАП Ш"№ (Е050=5,0мкг). При этом ни КПС, ни ГАП НШ не обладали защитным эффектом в отношении ЫТТП штаммов. Высокой перекрестной протективной активностью обладали препараты ЛОС и их смесь с КПС. Исследования показали, что, дЛОС га в составе смеси усиливает протективные свойства КПС (ЕВ50=О,32мкг против 1,26мкг).

Таблица 8

Действие различных препаратов Н.т/1иепгае на субпопуляционную структуру МЛ селезенок мышей

Назв. препарата Содержание клеток, экспрессирующих поверхностные маркеры, (М±т ), %

СБ 3 С04 СР8 С019 ЫК СОЗ/ ЫК С025 СБ4/ СР25 МНСП

КПС 1095 №Ь 20,6±1,4 12,2±1,0 11,4±1,5 22,5±1,7 15,5±1,3 2,3±0,2 3,7±0,1 * 1,3±0,3 31,9±3,9*

ГАП 1095 ШЬ 21,2±1,9 13,1±1,1 12,9±1,5 19,6±1,5 12,0±1,0 1,7±0,2 2,4±0,2 0,7±0,1 27,0±1,6*

ГАП 58 КТШ 18,9±2,5 9,9±0,8 8,7±0,7 18,9±1,7 11,1±0,7 1,4±0,1 3,5±0,2* 0,5±0,1 20,7±1,3*

ЛОС 45 ШТП 20,7±1,1 9,2±1,2 8,7±0,7 24,Ш,9* 11,7±0,7 1,б±0,1 3,0±0,2* 1,3±0,3* 21,4±1,3*

дЛОС 45 ЭТШ 20,3±1,0 10,5±1,6 10,9±0,9 29,2±1,1* 12,6±0,9 1,5±0,2 3,9±0,3* 1,6±0,2* 23,1±2,0*

КПС 1095 НЛ +ЛОС 45 ЭТИ 22,6±1,2* 14,8±1,4* 13,6±1,0* 29,9±1,4* 16,8±1,4* 2,8±0,4* 4,0±0,2* 1,9±0,3* 33,4±1,9*

КПС 1095 НЯ> +ДЛОС45 ЫТШ 26,8±1,2* 17,9±2,0* 14,4±1,4* 35,3±1,5* 17,4±1,7* 3,4±0,2* 4,5±0,3* 2,8±0,3* 32,3±2,5*

Контроль 18,2±1,1 9,6±0,9 9,2±0,9 16,9±1,7 11,3± 1,9 1,6±0,2 2,7±0,2 0,5±0,1 14,3±0,9

Примечание. *Различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с контролем.

Таблица 9

ГГротективная активность и токсичность препаратов Н. influenzae_

Название АГ ED50 (мкг)при заражении штаммами LDso (мкг)

1095 Hib 45 NTHi 58 NTHi 65 NTHi

КПС 1095 Hib 1,26 (0,9+1,8) >10,0* >10,0* >10,0* 1,58 (0,85-2,95) *

ГАП 1095Hib 0,8 (0,5-1,26) 100 (64,6-154,9)* 79,4 (41,7-51,3)* 125,9 (83,2-190,5) * 0,46 (0,25-Ю,85) *

ГАП 58NTHi 5,0 (2,9-8,7) 1,0 (0,5-2,1) * 0,63 (0,33-1,2)* 0,63 (0,33-1,2) 0,40 (0,22+0,72) *

ЛОС 45NTHi н/о 0,05 (0,03-0,076) 0,13 (0,07-0,24) 0,2 (0,1-0,38) 0,04 (0,023+0,07)

дЛОС 45NTHi н/о 0,2 (0,1-0,38) 0,2 (0,09-0,43) 0,13 (0,07-0,24) 1,28 * (0,46+1,57)

КПС 1095 +ЛОС 45 1,26 (0,8-2,0) 0,05 (0,03-Ю,076) 0,13 (0,07-0,24) 0,2 (0,1-Ю,4) 0,04 (0,023+0,069)

КПС 109 5 +ДЛОС45 0,32 (0,2-0,5) 0,13 (0,07-0,2) 0,2 (0,09-0,43) 0,08 (0,05+0,13) 1,26* (0,68+2,34)

Примечание. * - Различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с ЛОС 45 NTHi.

Помимо высокой иммуногенности, препараты очищенного КПС и его смеси с дЛОСгд обладали низкой токсичностью {табл.9), что, учитывая повышенную способность к активации врожденного и адаптивного иммунитета, делает его перспективным для разработки вакцины, направленной на защиту от инфекций, вызываемых наиболее распространенными в популяции капсульными и бескапсульными штаммами H.influenzae.

ВЫВОДЫ

1. Бескапсульные штаммы H.influenzae, циркулирующие на территории Москвы, по структуре ЛОС относятся к 10 основным субтипам, наиболее распространенными из которых являются VI, VIII и X.

2. Сыворотки больных бронхолегочными заболеваниями достоверно чаще, чем сыворотки клинически здоровых людей содержат повышенный уровень IgG-антител к ЛОС NTHi (что доказывает важную роль бескапсульных штаммов в инициации заболеваний).

3. Сыворотки больных бронхолегочными заболеваниями достоверно чаще, чем сыворотки клинически здоровых доноров, содержат повышенный

уровень IgG-антител к ДОС разных субтипов, что свидетельствует о частой смене субтипа возбудителя.

4. В сыворотках больных бронхолегочными заболеваниями, достоверно чаще, чем у клинически здоровых доноров определяется повышенный уровень антител к 11 бескапсульным штаммам Н.influenzae, относящимся к VI, VIII и X субтипам.

5. Установлено, что 3 группы антигенов, полученных из капсулыюго (1095) и бескапсульных (45, 54, 58 и 65) штаммов Н. influenzae, различны по химическому составу. В иммунохимических реакциях КПС Hib проявляет серотиповую специфичность; ГАП Hib и NTHi - серотиповую и видовую специфичность; ЛОС NTHi - внутривидовую специфичность, причем наибольшей перекрестной серологической активностью обладает ЛОС штамма 45 NTHi (X субтип).

6. Детоксикация ЛОС 1% раствором гидроксиламингидрохлорида приводит к удалению 4-х из 6-ти ВЖК липида А и 25-кратному снижению токсичности по сравнению с нативным препаратом ЛОС.

7. Установлено, что при испытанных дозах и схемах иммунизации КПС Hib, ГАП капсульного и бескапсульного штаммов и ЛОС Н.influenzae вызывают активацию эффекторов системы врожденного иммунитета, что проявляется в повышении фагоцитарной активности лейкоцитов мышей, продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, при этом смеси КПС Hib с ЛОС и КПС Hib с дЛОС 45NTHi обладают наиболее высокой стимулирующей активностью.

8. Смесь КПС Hib с ЛОС и дЛОС45Гд NTHi вызывает у мышей повышение количества клеток, экспрессирующих поверхностные маркеры (CD4, CD25, CD4/CD25, CD19, MHCII) в большей степени, чем введение монопрепаратов.

9. Смесь КПС Hib с дЛОС45ГА NTHi обладает более высокой протективной активностью при заражении вирулентным капсульным штаммом Н. influenzae типа b по сравнению с монопрепаратами ГАП и КПС

Hib. Наиболее выраженной внутривидовой перекрестной протективной активностью обладают ГАП NTHi, J10C и дЛОС45Гд NTHi, а также смеси КПС Hib с ЛОС 45 NTHi и КПС Hib с дЛОС45ГА NTHi.

10. Способность смеси КПС 1095 Hib с дЛОС45ГА NTHi к активации систем врожденного и адаптивного иммунитета позволяет рекомендовать эту комбинацию в качестве основы для создания вакцины для профилактики инфекций, вызываемых капсульными и бескапсульными штаммами H.influenzae.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

Новикова О.В. = Головинская О.В.

1. О.В. Новикова. Иммунный ответ на липоолигосахариды Haemophilus influenzae у людей больных различными бронхолегочными заболеваниями / О.В. Новикова, Н.Е. Ястребова, Н.П. Ванеева, О.Е. Орлова, Н.Г. Калина, С.И.Елкина, Л.К. Катосова, Н.Н. Овечко // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2009. - №3 (46). - С.51-55;

2. О.В. Новикова. Влияние различных детоксицирующих реагентов на свойства ЛОС Haemophilus influenzae / О.В. Новикова, Н.П. Ванеева, С.И.Елкина, Н.Г. Калина, М.М. Токарская, Н.Е. Ястребова, О.Е. Орлова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - №5. - С.43-46;

3. Ю.С. Шевчик. Действие белка теплового шока на иммуногенную активность капсульного полисахарида Haemophilus influenzae типа b / Ю.С.Шевчик, О.В. Новикова, Н.К. Ахматова, П.Г. Свешников, Н.Е. Ястребова, Е.А. Курбатова // «Дни иммунологии в С.-Петербурге». Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11. - №4-5. - С.340-341.

4. Н.П. Ванеева. Распространенность субтипов липоолигосахаридов реди бескапсульных штаммов Haemophilus influenzae, выделенных от больных бронхолегочными заболеваниями / Н.П. Ванеева, О.В. Новикова , О.Е. Орлова,

Н.Г. Калина, С.И. Елкина, М.М. Токарская, Л.К. Катосова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2010. -№6.-С.93-95;

5. О.В. Новикова. Иммунобиологические свойства углеводсодержащих препаратов Haemophilus influenzae / O.B. Новикова, Н.Г. Калина, Н.П.Ванеева, С.И. Елкина, М.М. Токарская, Н.Е. Ястребова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2010. - №6. - С.95-98.

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

AT антитело

БГ безводный гидразин

БЛЗ бронхолегочные заболевания

ВЖК высшая жирная кислота

ГА гидроксиламин

ГАП гидроксиламиновый препарат

ГЖХ газожидкостная хроматография

дЛОС БГ липоолигосахарид, детокс. безводным гидразином

дЛОС ГА липоолигосахарид, детоксицированный гидроксиламином

дЛОС NaOH липоолигосахарид, детоксицированный гидроксидом натрия

ИФА иммуноферментный анализ

КПС капсульный полисахарид

ЛОС липоолигосахарид

ЛПС липополисахарид

М.к. микробные клетки

М.м. молекулярная масса

МЛ мононуклеарный лейкоцит

оп оптическая плотность

ПААГ полиакриламидный гель

РИЭФ ракетный иммунный электрофорез

ХИБ (Hib) Haemophilus influenzae тип b

ХОБЛ хроническая обструктивная болезнь легких

ЯМР ядерный магнитный резонанс

CD Cluster of différenciation (кластер дифференцировки)

TNFa Tumor necrosis factor а (Фактор некроза опухоли a)

IL Интерлейкин

МНС Major histocompatibility complex (главный комплекс

гистисовместимости)

NTHi Nontypable Haemophilus influenzae (нетипируемый

(бескапсульный) штамм гемофильной палочки)

Подписано в печать 21.02.2011 г. Тираж 100 экз. Заказ № 373 Отпечатано в типографии «АллА Принт» Тел. (495) 621-86-07, факс (495) 621-70-09 wvvvv.allaprint.ru

Инфекции, вызываемые Haemophilus influenzae, являются важной причиной заболеваемости и смертности в экономически развитых и развивающихся странах, прежде всего, среди детей раннего возраста [18, 35]. Фактические данные, накопленные в последние годы, свидетельствуют о том, что эти инфекции имеют широкое распространение на территории России и являются актуальной проблемой здравоохранения [36, 37].

Заболевания, вызываемые наиболее вирулентным капсульным штаммом Н. influenzae типа b - Hib - (гнойный менингит, гнойный эпиглоттит, пневмония, септический артрит, остеомиелит, целлюлит, бактериемия), имеют широкое распространение и тяжелое течение, вместе с тем, нельзя недооценивать медико-социальную значимость заболеваний, вызываемых бескапсульными или нетипируемыми (NTHi) штаммами гемофильной палочки (сепсис, средний отит, синусит, обострение хронического бронхита, конъюнктивит) [9, 87].

Если вопрос защиты от инфекций, вызванных капсульными штаммами H.influenzae, в настоящее время решается применением конъюгированных вакцин на основе капсульного полисахарида H.influenzae типа b (КПС Hib) и белков-носителей, то вакцины против инфекций, вызванных NTHi, до сих пор нет. В качестве основы для вакцинных препаратов, направленных на профилактику заболеваний, вызванных бескапсульными штаммами H.influenzae, за рубежом изучается роль белков наружной мембраны и липоолигосахаридов (ДОС) [3, 42, 51]. Следует отметить, что JIOC NTHi имеют уникальную структуру, и среди бескапсульных штаммов Н. influenzae обнаружено более 10-ти субтипов, различающихся по электрофоретической подвижности ДОС [28, 55].

В нашей стране субтипирование циркулирующих NTHi штаммов не проводилось. Вместе с тем, решение этого вопроса может способствовать определению наиболее распространенных в популяции субтипов возбудителей с дальнейшим получением из них детоксицированных JIOC, обеспечивающих перекрестную защиту от NTHi. Не изучена также возможность создания вакцинного препарата на основе двух Т-независимых антигенов (КПС и JIOC) H.influenzae для одновременной защиты от капсульных и бескапсульных штаммов.

Учитывая высокую эффективность вакцинных препаратов, получаемых из грамнегативных бактерий с помощью солянокислого гидроксиламина, содержащих в своем составе ЛПС, КПС и, вероятно, белки наружной мембраны [13, 14], представляется целесообразным включение гидроксил-аминового препарата Н. influenzae (ГАП) в состав изучаемых углеводсодержащих антигенов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является получение углеводсодержащих антигенов H.influenzae и характеристика их иммунобиологических свойств.

Задачи исследования:

1. Провести выбор бескапсульных штаммов H.influenzae, наиболее распространенных в популяции больных бронхолегочными заболеваниями (БЛЗ).

2. Получить препараты капсульного полисахарида Hib, гидроксил-аминовые препараты капсульного и бескапсульного штаммов H.influenzae, ЛОС NTHi и охарактеризовать их по химическим, физико-химическим и иммунохимическим свойствам.

3. Изучить влияние гидроксиламингидрохлорида, безводного гидразина, гидроксида натрия на жирнокислотный состав липида А липоолигосахарида бескапсульного штамма и его токсичность.

4. На основании результатов изучения иммунобиологических свойств антигенных препаратов Н.influenzae определить наиболее перспективный препарат для разработки вакцины, направленной на профилактику заболеваний, вызываемых капсульными и бескапсульными штаммами Н. influenzae.

Научная новизна

Впервые при использовании SDS-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) проведен скрининг ДОС, выделенных из 62 бескапсульных штаммов Н. influenzae, циркулирующих на территории России (Москва) среди больных с бронхолегочными заболеваниями. По электрофоретической подвижности ДОС выявлено 10 основных субтипов, имеющих один электрофоретический компонент, и 13 дополнительных, включающих 2-3 основных компонента в различных сочетаниях. Наиболее распространены среди больных - VI (17,7±4,8%), VIII (12,9±4,3) и X (12,9±4,3) субтипы.

Впервые при использовании твердофазного ИФА на основе ДОС 67 штаммов NTHi определена частота повышенного уровня ДОС-специфических IgG-антител к Н.influenzae у больных бронхолегочными заболеваниями и здоровых доноров. Наиболее часто повышенный уровень антител наблюдали к 11 штаммам (16,7-54,8%), которые также имели признаки или принадлежали к трем основным субтипам (VI, VIII, X).

Выделены и охарактеризованы по химическим, физико-химическим и иммунохимическим свойствам три группы бактериальных антигенов: КПС 1095 Hib; ГАП 1095 Hib и 58 NTHi; ДОС штаммов 45, 54, 58, 65 NTHi и 1095 Hib. По результатам иммунохимических исследований наиболее выраженной перекрестной активностью обладал ДОС штамма 45 NTHi (X субтип).

Впервые проведено сравнительное изучение детоксицирующих свойств безводного гидразина (БГ), солянокислого гидроксиламина (ГА) и гидроксида натрия. На примере ДОС 45 NTHi показано, что при использованных концентрациях БГ и ГА приводят к удалению основной массы жирных кислот из липида А, что, в свою очередь, ведет к уменьшению токсичности препарата в опытах на животных в 31,5-25 раз (1Х>50ЛОСисх=0,063 мкг; 1ЛЭ50дЛОСБг=1,99 мкг; LD50 дЛОСГА=1,58 мкг).

Изучение иммунобиологических свойств КПС, ГАП, ЛОС, дЛОС и смесей КПС с ЛОС 45 NTHi и КПС с дЛОСГА показало, что смесь КПС Hib (10 мкг) и дЛОСга 45 NTHi (0,1-10мкг) является наиболее перспективным углеводсодержащим препаратом в качестве основы для разработки новой вакцины против гемофильной инфекции, обусловленной как капсульными, так и бескапсульными штаммами. При испытанных дозах и схемах введения смесь указанных препаратов обладает низкой токсичностью, высокой перекрестной протективной активностью при заражении иммунизированных мышей капсульным и бескапсульными штаммами H.influenzae и вызывает активацию эффекторов системы врожденного и адаптивного иммунитета, приводя к повышению фагоцитарной способности лейкоцитов мышей, продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, увеличению числа Т-клеток, экспрессирующих молекулы cd4, активационные молекулы cd25 и МНСИ, повышению продукции специфических IgG-антител к ЛОС.

Практическая значимость

Установлено, что циркулирующие на территории России (Москва) NTHi штаммы по структуре ЛОС относятся к десяти основным субтипам, среди которых VI, VIII и X субтипы наиболее распространены у больных бронхолегочными заболеваниями. Предложенный способ субтипирования может быть использован для проведения эпидемиологического мониторинга штаммов в разных географических регионах России.

Высокая степень очистки и специфическая активность КПС 1095 Hib позволяет рекомендовать его использование в качестве референс-препарата, а также для создания современных диагностических и профилактических препаратов. В рамках выполнения федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 гг.» КПС 1095 Hib использовали для создания количественной иммуноферментной тест-системы для оценки поствакцинального иммунитета.

Солянокислый гидроксиламин может быть использован в качестве детоксицирующего агента для JIOC NTHi штаммов.

Смесь капсульного полисахарида Hib и детоксицированного JIOC NTHi может быть использована в качестве основы для разработки вакцины с серотиповой (Hib) и видовой (NTHi) перекрестной протективной активностью.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Бескапсульные штаммы H.influenzae, циркулирующие в популяции больных бронхолегочными заболеваниями людей, по электрофоретической подвижности ДОС относятся к 10 основным субтипам, наиболее распространенными из которых являются VI, VIII и X.

2. Среди выделенных углеводсодержащих препаратов - КПС 1095 Hib, ГАП 1095 Hib и 58NTHÍ, ДОС 45, 54, 58, 65 NTHi и 1095 Hib - высокой перекрестной серологической активностью обладают ГАП и ДОС 45 NTHi.

3. Действие 1% водного раствора гидроксиламингидрохлорида приводит к удалению из липида А ДОС NTHi 3-гидроксикаприновой, миристиновой, олеиновой и стеариновой кислот и снижению токсичности полученного дЛОС в 25 раз.

4. Низкая токсичность, высокая степень внутривидовой перекрестной защиты смеси КПС Hib и дЛОС NTHi, способность этой смеси активировать эффекторы врожденного иммунитета, а также инициировать процесс формирования адаптивного иммунитета является основанием для разработки новой вакцины, направленной на профилактику заболеваний, вызванных капсульными и бескапсульными штаммами Н. influenzae.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены и обсуждены: на Всероссийской научной конференции "Объединенный Иммунологический Форум", Санкт-Петербург, 2008; на конференции молодых ученых НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, 2009. Апробация работы состоялась на конференции отдела иммунологии НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН 18 ноября 2010 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 149 страницах компьютерного текста, иллюстрированы 18 рисунками и 20 таблицами, состоят из введения, четырех глав обзора литературы, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 109 источников, в том числе, 41 на русском языке.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1.Бескапсульные штаммы H.influenzae, циркулирующие на территории Москвы, по структуре JIOC относятся к 10 основным субтипам, наиболее распространенными из которых являются VI, VIII и X.

2.Сыворотки больных бронхолегочными заболеваниями достоверно чаще, чем сыворотки клинически здоровых людей содержат повышенный уровень IgG-антител к ДОС NTHi (что доказывает важную роль бескапсульных штаммов в инициации заболеваний).

3.Сыворотки больных бронхолегочными заболеваниями достоверно чаще, чем сыворотки клинически здоровых доноров, содержат повышенный уровень IgG-антител к JIOC разных субтипов, что свидетельствует о частой смене субтипа возбудителя.

4.В сыворотках больных бронхолегочными заболеваниями, достоверно чаще, чем у клинически здоровых доноров определяется повышенный уровень антител к 11 бескапсульным штаммам Н. influenzae, относящимся к VI, VIII и X субтипам.

5.Установлено, что 3 группы антигенов, полученных из капсульного (1095) и бескапсульных (45, 54, 58 и 65) штаммов H.influenzae, различны по химическому составу. В иммунохимических реакциях КПС Hib проявляет серотиповую специфичность; ГАП Hib и NTHi - серотиповую и видовую специфичность; ДОС NTHi - внутривидовую специфичность, причем наибольшей перекрестной серологической активностью обладает ДОС штамма 45 NTHi (X субтип).

6.Детоксикация ДОС 1% раствором гидроксиламингидрохлорида приводит к удалению 4-х из 6-ти ВЖК липида А и 25-кратному снижению токсичности по сравнению с нативным препаратом ДОС.

7.Установлено, что при испытанных дозах и схемах иммунизации КПС Hib, ГАП капсульного и бескапсульного штаммов и ДОС H.influenzae вызывают активацию эффекторов системы врожденного иммунитета, что проявляется в повышении фагоцитарной активности лейкоцитов мышей, продукции провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, при этом смеси КПС Hib с ДОС и КПС Hib с дЛОС 45NTHi обладают наиболее высокой стимулирующей активностью.

8. Смесь КПС Hib с ДОС и дЛОС45ГА NTHi вызывает у мышей повышение количества клеток, экспрессирующих поверхностные маркеры (CD4, CD25, CD4/CD25, CD19, MHCII) в большей степени, чем введение монопрепаратов.

9. Смесь КПС Hib с дЛОС45ГА NTHi обладает более высокой протективной активностью при заражении вирулентным капсульным штаммом H.influenzae типа b по сравнению с монопрепаратами ГАП и КПС Hib. Наиболее выраженной внутривидовой перекрестной протективной активностью обладают ГАП NTHi, ДОС и дЛОС45ГА NTHi, а также смеси КПС Hib с ЛОС 45 NTHi и КПС Hib с дЛОС45ГА NTHi.

10. Способность смеси КПС 1095 Hib с дЛОС45ГА NTHi к активации систем врожденного и адаптивного иммунитета позволяет рекомендовать эту комбинацию в качестве основы для создания вакцины для профилактики инфекций, вызываемых капсульными и бескапсульными штаммами Н. influenzae.