Функции белков теплового шока в популяциях лимфоидных клеток

Сапожников, Александр Михайлович

Диссертации по медицине → Аллергология и иммулология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Функции белков теплового шока в популяциях лимфоидных клеток

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Сапожников, Александр Михайлович Москва 2003 г.

Ученая степень: доктора биологических наук

ВАК РФ: 14.00.36

Автореферат диссертации по медицине на тему Функции белков теплового шока в популяциях лимфоидных клеток

На правах рукописи

Сапожников Александр Михайлович

ФУНКЦИИ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА В ПОПУЛЯЦИЯХ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание утеяой степени доктора биологических наук

Москва, 2004

! "Ч

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный консультант:

Академик РАН, дотер медицинских наук, профессор Р.В.Петров

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук А.В.Филатов

Доктор биологических наук, профессор Н.А.Константинова

Доктор медицинских наук, профессор В.Ф.Семенков

Ведущая организация:

Московский НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМИ

Защита диссертации состоится 2004 г. в^ часов на заседа-

нии диссертационного совета Д 208,017,01 в Государственном научном центре Институте иммунологии Федерального управления медико-биологических и ?к<~гр ■■■-мальных проблем при Минздраве России по адресу: 115478, г. Москва, Кашире кг* шоссе, дом 24, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного и-:; тра Института иммунологии Федерального управления меднко-биологических и экстремальных проблем при Минздраве России.

Автореферат разослан «

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Л.С.Сеславина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Семейство белков теплового шока (БТШ) состоит из большой группы высококонсервативных протеинов, способствующих выживанию клеток в неблагоприятных условиях и интенсивно экспрессирующихся пол действием разнообразных стрессирующнх факторов. Защитное действие БТШ обусловлено их протектнвнымн свойствами, направленными на сохранение нормальной конформацыя и функциональной активности внутриклеточных протеинов, предотвращение их денатурации и агрегации. В нормальных условиях, в отсутствии стрессирующнх воздействий, в клетках синтезируется значительно меньшее количество молекул БТШ. Эти, постоянно присутствующие в клетках, конститутивные БТШ выполняют в основном так называемые шаперошше, вспомогательные функции, обеспечивая процессы фолдинга, транспорта, репарации и утилизации внутриклеточных протеинов.

БТШ экспрессируюгся всеми типами клеток. У млекопитающих уровень экспрессии БТШ в разных тканях различается и не является стабильным, а зависит от широкого спектра факторов. Вариации уровня экспрессии БТШ могут быть связаны как с процессами нормальной жизнедеятельности клеток, так и с их защитными реакциями на те или иные, периодически возникающие изменения внешней среды. Очевидно, что лимфоидная ткань, характеризующаяся интенсивным клеточным обновлением и постоянным присутствием пулов мигрирующих и циркулирующих клеток, подвержена значительным метаболическим перестройкам и регулярным воздействиям изменяющихся условий микроокружения, в том числе и неблагоприятным для жизнедеятельности. С этих позиций очевидно, что для клеток лимфоидной ткани роль БТШ, обеспечивающих нормальное протекание большинства внутриклеточных процессов н обладающих протективнымн функциями, весьма значительна. Наряду с этим известно, что БТШ обладают регулирующим действием на развитие программированной клеточной гибели, поэтому значимость функций БТШ в популяциях лимфоцитов связана также с важностью процессов апопгоза лимфоидных клеток дня нормального функционирования иммунной системы.

поверхности. Поверхностная локализация БТШ зарегистрирована, в частности, у инфицированных, трансформированных и алоптозных лимфоцитов. Было продемонстрировано, что БТШ, экспонированные на клеточной поверхности, активируют цито-токсические эффекторы иммунной системы, т.е. поверхностные БТШ могут являться для системы иммунологического надзора маркерами клеток, подлежащих элиминации. Причины и механизмы транслокацнн БТШ на клеточную поверхность пока не установлены, однако не вызывает сомнений, что появление в организме таких поверхностных протеинов вызывает реакцию иммунной системы, в частности лимфо-идных клеток. Кроме этого, наряду с явлением необычной локализации БТШ на плазматической мембране, в настоящее время установлено, что во многих случаях БТШ могут находиться вне клеток в виде растворимого пула, попадающего в том числе и в кровоток. Вместе с тем известно, что экзогенные, внеклеточные БТШ способны взаимодействовать с клетками и проникать во внутриклеточное пространство. Причем, такие интернализованные БТШ сохраняют свои протективные функции и защищают клетки от гибели. В связи с этим очевидно, что наряду с внутриклеточными и поверхностными БТШ, внеклеточная форма этих протеинов также может оказывать влияние на функционирование популяций лямфоидных клеток.

В настоящее время интенсивно изучается иммуномоду лирующее действие экзогенных БТШ в связи с обнаружением у этих протеинов уникальных адьювантных и иммуностимулирующих свойств. Установлено, что одни из механизмов данного эффекта БТШ связан с активацией антигенпредставляющих клеток. В то же время, анализ описанных эффектов БТШ указывает на то, что зарегистрированные иммуномо-дотирующие свойства экзогенных БТШ могут быть связаны с действием этих протеинов не только на антигенпредегавляющие клетки, но и на популяции лимфоцитов.

Таким образом, накопленные в последнее время данные свидетельствуют о том, что молекулы БТШ участвуют во многих иммунных процессах, в том числе связанных с функционированием популяций лимфоидных клеток, и обладают при этом полифункциональной активностью. Однако в настоящее время эта тематика остается малоизученной. С целью расширения существующих представлений о функциях, выполняемых БТШ в лимфовдной ткани, и механизмах реализации данных функций в настоящей работе были проведены исследования вовлеченности БТШ в процессы, протекающие в популяциях лимфоцитов. Основное внимание уделялось одному из

главных представителей большого семейства БТШ, протеину с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70).

Цель исследования: анализ вовлеченности БТШ в процессы активации и программированной гибели лимфоидных клеток, выявление поверхностного и внеклеточного пулов БТШ в культурах лимфоцитов и изучение взаимодействия этих протеинов с клетками иммунной системы.

Задачи исследовании;

1. В экспериментальной модели с использованием мышей разных линий провести анализ содержания БТШ70 в клетках различных лимфоидных органов.

2. Проанализировать изменение уровня экспрессии БТИ170 в процессе активации лимфоцитов.

3. Провести сравнение содержания БТШ в живых и апоггтозньк лимфоидных клетках.

4. Провести исследование взаимосвязи содержания и локализации БТШ70 в лимфоцитах с ключевыми внутриклеточными событиями их программированной гибели на последовательных этапах ее развитая.

5. Провести анализ поверхностной локализации БТШ в культурах лимфоидных клеток и исследование причин и механизмов транслокации этих протеинов на клеточную поверхность.

6. Изучить влияние физиологических медиаторов стресса - катехоламинов и глю-кокортикоидов на уровень экспрессии БТШ70 лимфоидаыми клетками.

7. Протестировать присутствие внеклеточного пула БТШ70 в культурах лимфоидных клеток и проанализировать механизмы продукции этих протеинов в межклеточное пространство.

8. Охарактеризовать возможные функции внеклеточного пула БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток.

Научная новизна. Впервые было продемонстрировано различие уровня экспрессии БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток различной органной локализации. Обнаружено изменение уровня экспрессии БТШ70 в лимфоцитах под действием фи-

биологических медиаторов стресса катехоламинов и глкжокортккоидов, а также охарактеризовано изменение этого уровня при воздействии на клетки различными стрес-сирующими факторами микроокружения. Разработан оригинальный цитофлуоримет-рнческий подход к анализу последовательных этапов апогггоза лимфоидных клеток, и с помощью данного подхода изучена взаимосвязь экспрессии БТШ70 с основными внутриклеточными событиями на разных стадиях развития программированной гибели лимфоцитов. Проанализирован процесс транслокации цитоплазм этических БТШ70 на поверхность лимфоцитов. Наряду с перечисленными данными, характеризующими внутриклеточный и поверхностный пулы БТШ, были получены свидетельства о продукции БТШ70 в межклеточное пространство в культурах активированных Т-лимфоцитов и опухолевых лимфоидных клеток. Обнаружено парадоксальное влияние ингибиторов аппарат Гольджн зависимой секреции протеинов на экзоцитоз БТШ70 и их транслокацию на поверхность лимфоидных клеток, свидетельствующее о неклас-снческом пути транспорта и секреции этих протеинов. Впервые продемонстрировано взаимодействие внеклеточных экзогенных БТШ70 с лимфоцитами различного органного происхождения, заключающееся в адсорбции этих протеинов на клеточной поверхности и их последующей интернализации живыми клетками. Получены свидетельства о протективных свойствах внеклеточных БТШ70 в популяциях лимфоцитов.

Практическая значимость. Полученные результаты расширяют существующие представления о роли БТШ в функционировании иммунной системы. Высоким уровнем значимости для экспериментальной и клинической иммунологии обладают оригинальные данные о регулирующем действии адреналина и дексаметазона на интенсивность синтеза БТЩ70 в популяции лимфоцитов. Зарегистрированные эффекты свидетельствуют о вовлеченности БТШ70 в механизмы нейроэндокринной регуляции иммунной системы. Весьма существенным для практической значимости данной работы является охарактеризованный процесс транслокацни внутриклеточных БТШ на поверхность погибающих клеток и полученные свидетельства о выходе этих протеинов в межклеточное пространство. Эти результаты, вместе с существующими сведениями об участии БТШ в развитии целого ряда аутоиммунных патологий, могут лечь в основу создания новых подходов к диагностике и терапии различных иммунологических заболеваний. Значительный интерес для возможного практического примене-

ния имеют также полученные в работе данные о продукции БТШ70 активированными лимфоцитами в окружающую среду. Они указывают на один из возможных источников внеклеточного пула ЕТШ70, обладающего выраженным влиянием на развитие иммунных реакций. Можно предположить, что направленный контроль экзощпоза БТШ70 лимфоидными клетками будет служить основой для разработки нового подхода к проблеме иммунорегуляции. Парад' с этим, охарактеризованное в работе взаимодействие экзогенных БТШ70 с лимфоидными клетками может явиться основой для использования данных протеинов с целью направленной коррекции иммунного ответа.

Положения, выносимые на защиту;

1. Уровень экспрессии БТШ лимфоидными клетками зависит от их органной локализации и изменяется под действием активации лимфоцитов, физиологических медиаторов стресса и стрессирующих факторов микроокружения. По уровню содержания БТШ70 клетки разных лимфоидных органов различаются и характеризуются увеличением этого показателя в ряду тимус<селезенка<лимфатические узлы<костныЙ мозг, КонА-активацня Т-лимфоцитов сопровождается усилением экспрессии БТШ70. Физиологические медиаторы стресса адреналин и глюхокортнкоиды изменяют уровень экспрессии БТШ70 лимфоцитами, причем адреналин стимулирует синтез этих протеинов, а дексаметазон его ингибирует.

2. Процесс программированной гибели лимфоидных клеток сопровождается транслокацией цигоплазматических БТШ па клеточную поверхность. Клетки лимфо-мы ЕЬ-4 и КоыА-активированные Т-лимфоциты, исходно экспрессирующие поверхностные БТШ, значительно усиливают уровень этой экспрессии в процессе апоптоэа. Неактивированные лимфоциты, выделенные из разных лимфоидных органов, характеризуются присутствием БТШ только на поверхности клеток, погибших по программе апоптоза. Уровень экспрессии внутриклеточных и поверхностных БТШ70 различается доя разных стадий клеточной гибели, достигая максимума на необратимом этапе апоптоза, характеризующемся деполяризацией митохондрий. Это свидетельствует об участии БТШ в реализации программы клеточной гибели на ее терминальных стадиях.

3. Клетки лимфомы ЕЬ-4 и КонА-активированные Т-лимфоциты продуцируют БТШ70 в межклеточное пространство. Об этом свидетельствует присутствие данных протеинов в супернатанте кулыур указанных клеток. Продукция внеклеточного пула БТШ70 является активным процессом и не связана с возможной примесью в культуре разрушенных некротических клеток. Интенсивность экзоцитоза БТШ70 клетками ЕЬ-4, культивируемыми в стандартных условиях, равна примерно 5-10 мкг на 106 клеток за 24 часа. Пул внеклеточных БТШ70 содержит как конститутивную, так и индуцируемую форму этих протеинов.

4. Ингибиторы аппарат Гольджи зависимого пути секреции протеинов монен-син и брефелдин А не блокируют, а существенно усиливают транслокацию БТШ70 на клеточную поверхность и интенсивность экзоцитоза данных протеинов. Это свидетельствует о неклассическом, аппарат Гольджи независимом пути транспорта цито-плазматических БТШ70 из клеток. Механизм формирования внеклеточного пула БТШ70 может быть связан со сбрасыванием («шеддингом») этих протеинов с клеточной поверхности в окружающую среду и с продукцией лимфоидными клетками в межклеточное пространство экэосом.

5. Поверхностные и внеклеточные БТШ70 взаимодействуют с клетками иммунной системы. Об этом свидетельствует направленная реакция цигстоксических лимфоцитов на опухолевые клетки, экспонирующие на своей поверхности БТШ70, а также связывание и последующая интернализация экзогенных БТШ70 различными типами лкмфоидных клеток. Интернализация внеклеточных БТШ70 защищает лимфоциты от спонтанного и индуцированного апоптоза и от стрессирующего воздействия дефицита аутокрннных факторов. Активное взаимодействие внеклеточного пула ВТШ70 с популяциями лимфоидных клеток является одним из механизмов иммуно-модулирующего действия данных протеинов.

Апробация работы

2002), на международных иммунологических летних школах им. Дж, Хэмфри (Пущине, 1998, 2000, 2002), на научных конференциях "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 1999,2000,2001, 2002, 2003), на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), на 11-ом международном иммунологическом конгрессе (Стокгольм, 2001), на шкалах-конференциях «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2001,2002).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 работы.

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы {главы 1-4), материалы и методы (глава 5), результаты исследований и их обсуждение (главы 6-11), выводы, список литературы. Работа изложена на 224 страницах машинописного текста, содержит 55 рисунков, 4 таблицы. Список литературы включает 257 источников, из которых 253 иностранных.

Материалы и методы исследования

В экспериментах использовали самок мышей ннбредных линий C57BL/6, СВА, BALB/c из питомника экспериментальных животных (ФИБХ РАН, г. Пущино, МО) в возрасте 8-12 недель и с исходной массой 16-18 грамм.

Костный мозг (КМ), лимфатические узлы (ЛУ), селезенку и тимус выделяли общепринятым способом из мышей, забитых методом цервикальной дислокации. Приготовление клеточных суспензий проводили по стандартному протоколу при температуре таящего льда в среде RPMI 1640. Жизнеспособность клеток определяли с помощью 0,1% раствора трнпанового синего в PBS.

Клетки лимфоидных органов мыши и клетки лимфомы EL-4 культивировались в 24-луночных планшетах {"Nunc", США) и в культуральных флаконах (25 см2,75 см2 и 162 см2 фирмы 'Costar", США) в питательной среде RPMI 1640 ("Sigma", США), содержащей 5% фетальной сыворотки (FCS), 20 мМ HEPES, 0,2% NáHCOj, 50 мкг/мл гентамнцнна (все фирмы "Sigma") в 5% СО? при 37°С. Клетки линии CTLL-2 культивировались аналогичным образом с добавлением в полную питательную среду (ППС) 100 ед/мл ИЛ-2 и 50 мкМ 2-меркапгоэтанола. При проведении экспериментов по изу-

ченню влияния экзогенных БТШ70 на энергетический метаболизм клеток использовали бессывороточную среду, приготовленную на основе среды RPMI-1640 с добавлением 0,5 мг/мл р-циклодекстрина, 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 5 мкг/мл инсулина, 25 мкг/мл трансферрина, 5x10"7 М путресцина, 2 мМ L-глутамина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина (все фирмы "Sigma") и 100 ед/мл ИЛ-2 (Ohmori, 1988).

Для культур КонА-активированных Т-лимфоцитов использовали клетки тимуса и селезенки. В разных опытах время КонА-активации Т-лимфошпов варьировало. Для получения длительных культур активация Т-клеток проводилась в течении 2 суток в присутствии КокА в концентрации 3 мкг/мл. После этого остатки КонА элиминировались с помощью а-метилманнозида. Затем клетки отмывались и культивировались в концентрации 3-4 млн/мл. Клеточная культура периодически освобождалась от погибших клеток с помощью центрифугирования на градиенте фнколла.

В опытах использовали моноклональные антитела фирмы "Sigma" к БТШ90 (клон АС-16), БТШ70 (клон BRM-22), БТШ60 (клон LK.-1), БТШ25 (клон IAP-28); фирмы "StressGen" к конститутивной (клон SPA815) и индуцируемой (клон SPA810) формам БТШ70; фирмы "PbarMmgen" к нативному, пемутантному мышиному р53 (клон РаЬ240) и к мышиному Ьс1-2 (клон 3F11), В ряде экспериментов использовали ФИТЦ-меченные моноклональные антитела к H-2Db (молекула ГКГСI класса) ("Cal-tag"), к CD25 (IL-2 Ra) и к CD90.2 (Thyl.2) (оба "PbarMingen"). В качестве вторых антител к первым немеченым антителам использовались ФИТЦ- или фиквдритрин-меченые Fab-фрагменты anti-mouse IgG, anti-rat IgG и anti-hamster IgG (все фирмы "Sigma"). Во всех экспериментах использовали антитела для изотипического контроля.

Анализ морфологических характеристик клеток (размер - переднее малоугловое светорассеяние, FS; гранулярность - боковое светорассеяние, SS) и уровня экспрессии на их поверхности исследуемых протеинов проводился на приборах EPICS ELITE и EPICS XL ("Coulter Corporation", США). Окрашивание образцов проводилось по стандартной методике. Внутриклеточного содержания БТШ оценивали после предварительной обработки фиксированных (0,5% раствором параформальдегида в PBS в течение 30 минут) клеток детергентом Тритон Х-100 (в течение 5 мин при 4°С) и последующего их окрашивания первыми и вторыми антителами в РВА (PBS с

0,05% НаНз и 1% BSA) и отмывками » PBS с 0,1% Тритона X-10Û (DaizSnkewich et at., 1994). Количественную оценку уровня экспрессии протеинов проводили по изменению средней интенсивности флуоресценции клеток в образцах, обработанных антителами к этим молекулам, по сравнению со свечением контрольных клеток (обработанных контрольными антителами соответствующего изотнпа). В каждом образце измеряли не менее 5х103 клеток.

Цкгофлуориметрическая регистрация процентного содержания апопгозных клеток в образцах осуществлялась с помощью анализа внутриклеточного содержания ДНК с использованием ДНК-специфичного флуоресцентного красителя пропидийно-двда (PI) (Telford et al., 1994). При исследовании процесса апонтоза, в ряде экспериментов интенсивность экспрессии БТШ на поверхности клеток измерялась при их одновременном окрашивания annexin V-FITC и PI. В этих случаях клетки вначале окрашивались шта-БТЩ антителами к вторыми антителами, коньюгированными с фн-коэритрином (РЕ), а затем annexin V-FITC и Pl.

Внутриклеточная концентрация перекисных форм кислорода анализировалась с использованием флуоресцентного зонда 5,6-карбокси-2',7'-

дихлорфлуореецниндиацетат (DCFH-DA, "Molecular Probes") (Baki etat., 1999).

Трансмембранный потенциал митохондрий регистрировался с помощью флуоресцентных красителей Rhodamin 123 (Rhol23), Nonylacridine Orange (NAO) и 5,5\6,6'-тетрахлор-1,1%3,31-тетраэтилбензимидазолокарбоксиамина Кодид (JC-1) ("■Molecular Probes") (Baki et al, 1999).

Для определения активности каспазы-3 (СРР32) использовался флуоресцентно-меченый тетрапептнд DEVD (PhilPhiLux-G [Dj). являющийся субстратом для протеа-зы СРР32. Цитофлуориметрический анализ проводили в соответствии с инструкцией фирмы-производителя ("Oncolmmun Inc.", США),

Статистический анализ результатов шггометрических измерений выполнялся с применением t-критерия Стьюдента с помощью встроенного пакета статистических программ "WinMdi" и "Elite" для обработки полученных гистограмм. Для этих гистограмм вычислялись средние значения интенсивности флуоресценции (Mean), стандартные отклонения (SD) и стандартные ошибки (SE).

Для флуоресцентной и лазерной конфокальной микроскопии клетки окрашивали по стандартной методике с использованием вторых антител, конъюгированных с

флуорохромом Alexa Fluor 488 (AF-488, "Molecular Probes", США), затем суспензию клеток в капле специальной полимериэующейся гелеобразной среды, сохраняющей морфологию клеток и предохраняющей флуорохром от выгорания («Biomeda», США), наносили на предметное стекло и оставляли в темноте до микроскопического анализа. Фотографирование клеток проводили на флуоресцентном микроскопе ORTHOPLAN ("Leitz", Германия), используя набор светофильтров дня флуорохрома AF-488. Анализ препаратов с помощью лазерной конфокальной микроскопии проводился в Национальном Институте Здоровья (NIH, США),

Для анализа цитотоксичности лимфоцитов применялась незначительная модификация метода с использованием МТТ-анализа (van de Loosdrecht et a]., 1991). Для проверки корректности такого подхода в нашей модели, в ряде экспериментов для параллельной оценки цитотоксичности использовалась стандартная тест-система (Су-toTox, "Proroega", США), основанная на высвобождении лактатдегидрогеназы (ЛДГ) из разрушенных клеток (Decker, Lohmann-Mattes, 1988). Для удаления цитотоксиче-ских СП8-позитивньк клеток из популяции эффекторов (спленощггов мышей C57BL/6) применялся метод магнитной сепарации с использованием магнитных микросфер, покрытых стрептавидином (Dynabeads М-280, "Dynaî"), и биотинилирован-ных анти-CDS моноклональных антител (клон 53-6,7, "PharMingen"), В ряде экспериментов по анализу клеточной цитотоксичности мы предварительно инкубировали клетки-мишени в течение 1 часа при 4°С с насыщающими концентрациями моноклональных антител для экранирования на поверхности клеток EL-4 молекул ГКГС I класса (клоны НВ11, НВ51), БТШ70 (клон BRM22), антигена Thyl.2 (клон 53-2.1).

В качестве стимулов, индуцирующих программированную гибель клеток лим-фомы EL-4, использовали тепловой шок (инкубация клеток при 43°С в течение 40 мин.) и актиномицин D (5 мкг/мл, «Sigma»). Для индукции апогггоза тимоцитов применяли дексаметазон («Sigma») в концентрации 10_í и 10"6 М. В некоторых экспериментах использовали адреналина гидрохлорид в концентрации от 50 до 500 мкМ.

В экспериментах по анализу механизмов транслокации БТШ70 на клеточную поверхность и высвобождения этих протеинов в межклеточное пространство использовали моненсин и брефелдин A («Sigma»), блокирующие классический путь транслокации протеинов на клеточную поверхность и их секреции (Dinter, et ai., 1998). В

разных экспериментах применяемые концентрации ингибиторов варьировали от 0,1 до 10 мкг/мл.

Модуляцию проводимости хлорных каналов клеточных мембран осуществляли их селективными ингибиторами (ИХК) - 4,4-di isotiiiocyanostilbene-2Д'-disulphoni с acid (DIDS) и 4-acetamido44sothiocyanatostilbene-2,2'-disulphonic acid (SITS, оба фирмы "Sigma"). Использованные концентрации ИХК находились в диапазоне 10-200 мкМ. Ингибиторы вносились в культуры клеток EL4 после завершения формирования клеточного монослоя.

Тест на ре-экспрессию белков клеточной поверхности проводился по методике Wiest et al. (1997). Суспензия клеток EL-4 (5х106 кл./мл) культивировалась 15 мин при 37° С в р-ре Хенкса в отсутствии (контроль) и в присутствии 1 мг/мл проназы ("Sigma"). Обработку проназой останавливали равным объёмом ледяного р-ра Хенкса дополненного 5% FCS и \00 мкг/мл ДНКаэы. После трех отмывок в присутствии 5% FCS, клетки инкубировали 10 минут с 0,5 мМ ингибитора протеаз PMSF при 0°С для инактивации оставшейся проназы. Затем клетки культивировали 4 часа в нормальных условиях в отсутствии (контроль) и присутствии брефелдина А или моненсина. После культивирования клетки использовались для цитофлуориметрического анализа уровня экспрессии протеинов клеточной поверхности.

Для анализа содержания внеклеточной формы БТШ70 в супернатанте культур клеток лимфомы EL-4 и КонА-бласгов клетки переводились в бессывороточную среду RPMI1640 и культивировались 24 часа при начальной концентрации 1-3x106 кл./мл. Такая 24 часовая инкубация активированных клеток в бессывороточной среде не снижала их жизнеспособность. Полученные образцы супернатанта очищали от дебриса путем центрифугирования при lOxlO^g. Затем супернатант днализирсвали против дистиллированной воды (pH 9), измеряли концентрацию белка и лиофилизи-ровали. Полученные образцы концентрированного супернатанта использовали для Вестерп-блст-анализа в количестве 10-50 мкг на лунку. Вестерн-блст-аиалщ проводили по стандартной методике {Burnette, 1981).

Аффинное выделение БШ170 из кондиционированного супернатанта осуществляли на колонке с АТФ-агарозой, Это подход основан на способности молекул БТШ70 к прочному связыванию с молекулами АТФ (Welch, Feramisco, 1985).

Продуцируемые в межклеточное пространство экзосомы выделяли по описанному в литературе методу {Mathew et а!., 1995) из кондиционированного супернатан-та, полученного после стандартного культивирования клеток EL-4 в течение 24-48 часов при начальной концентрации ЗхЮ5 кл7мл.

В экспериментах по изучению взаимодействия экзогенного пула БТШ70 с клетками иммунной системы использовалась биотинилированная форма рекомби-нантных БТШ70 человека. При проверке протективных свойств экзогенных БТШ70 также применялись рекомбинангные БТШ70 человека («StressGen». Канада) в диапазоне концентраций от 1 до 10 мкг/мл.

Для исследования влияния экзогенных БТШ70 на энергетический метаболизм клеток применяли экспериментальную модель, описанную в работе Луценко и др. (2003). Содержание АТФ в клетках определяли люциферин-люциферазным методом с использованием стандартного набора для определения АТФ ("Sigma") на биолтоми-нометре БЛМ-8703М (СКТБ «Наука», Красноярск).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Экспрессия БТШ различными лнмфовднымн клетками

ЦитометрическиЙ анализ уровня экспрессии БТШ70 в популяциях тнмоцитов, спленоцитов, клеток ЛУ и КМ показал, что содержание данных протеинов в исследуемых клетках сильно варьирует. У разных особей одного возраста и одной линии величина этого показателя для клеток одинаковой органной локализации может отличаться весьма существенно (более, чем на 100%). Такие сильные индивидуальные различия свидетельствуют о значимости данного показателя для характеристики статуса каждой отдельной особи, однако эти вариации не позволяют выявить достоверные межлинейные различия уровня экспрессии БТШ70 лимфоидными клетками. В то же время, у животных всех испытанных линий наблюдаются значимые различия в экспрессии БТШ70 между клетками разных лимфоидных органов (рис. 1).

Для исследования влияния процесса активации лимфоцитов на экспрессию этих протеинов мы проанализировал и содержание БТШ70 на поверхности и в цитоплазме Т-клеток, активированных in vitro. В результате оказалось, что митоген-индуцированная активация Т-лимфоцитов приводит к увеличению уровня экспрессии БТШ70 и к транспорту части внутриклеточного пула данных протеинов на клеточную

поверхность (рис. 2). Мы предполагаем, что зарегистрированное явление транслокации БТШ70 на поверхность активированных Т-клеток связано с процессом стабилизации их плазматических мембран.

55 250 V

"5 20о I 5

§ 1 с :

5 о 1.1.....

Тим. Сеп. ЛУ КМ

Рнс. I. Относительный уровень экспрессии БТШ70 в «.четках различной органной локализации, Приведены данные нитофлуориметрического анализа внутриклеточного содержания БТ1П70 в лимфощных органах мышей одного возраста линий С57Виб, ВАЬВ/с, СВА.

Ксктр. 3 сут. 7 сут. 12 сут.

10* 10г Н5Р70

Рис. 2, А Зависимость уровня экспрессии внутриклеточных БШ170 и поверхностных С025 в популяции тимошггов от продолжительности их культивирования в модели КонА-индуцнрованной активации. Б - Гистограммы уровня экспрессии БТШ70 на поверхности тимошггов. Заштрихованная гистофамма - контроль.

Необычная локализация БТШ «а клеточной поверхности была обнаружена также в культуре клеток лимфомы ЕЬ-4, что было использовано нами для последующего анализа данного явления. С помощью метода проточной цитофлуориметрии было зарегистрировано, что жизнеспособные культивируемые клетки Е1.-4 постоянно

экспонируют на своей поверхности основные разновидности БТШ, а именно БТ1Ш5, БТШ60, БПП70 и БТШ90 {рис. 3).

Число клеток

; БТШ90

; БТШ60

! БТШ25

Контроль

БТШ70

Экспрессия БТШ (РГГС)

Рнс. 3. Результаты цитофлуорнметрической регистрации БТШ на поверхности клеток мышиной лимфомы Е1^4. Приведены типичные гистограммы интенсивности флуоресценции клеток ЕЬ-4 после их иммунофлуоресцентного окрашивания моио-клональными антителами к БТШ25. БТШ60, БТШ70 и БТШ90.

Присутствие БТШ70 на поверхности клеток ЕЬ-4 было зарегистрировано также с помощью флуоресцентной и лазерной конфокальной микроскопии (рис. 4). Использование моноклональных антител, связывающихся только с индуцируемой или конститутивной формой БТШ70, позволило установить, что на поверхности клеток ЕЬ-4 экспонированы обе разновидности молекул данных протеинов. Это было зарегистрировано как методом проточной цитофлуорнметрни, так и с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 5).

В этой же серии экспериментов, наряду с анализом уровня экспрессии клетками лимфомы ЕЬ-4 поверхностных БТШ70, мы провели регистрацию внутриклеточного содержания данных протеинов. Как и ожидалось, было обнаружено, что внутриклеточное содержание обеих изоформ БТШ70 значительно превышает таковое на клеточной поверхности. Об этом свидетельствуют как данные цитометрических измерений, так и результаты флуоресцентно-микроскопического анализа (рис. 6). Сопоставление интенсивности флуоресценции поверхностных и внутриклеточных БТШ70, показало, что в разных экспериментах на поверхности клеток ЕЬ-4 присутствовало от 5 до 20% суммарного пула молекул БТШ70 каждой изоформы.

Рис. 4, Визуализация БТ11170 на поверхности клеток лимфомы Е1,-4, выполненная с помошью флуоресцентной микроскопии (А) и конфокальной лазерной микроскопии (Б), 1-10 - последовательность оптических срезов, полученная с помощью конфокальной лазерной микроскопии при перемещении фокальной плоскости по глубине анализируемого образца.

Рнс. 5. Прш очно-штгометрический и флуоресцентно-микроскопический анализ экспрессии конститутивной и индуцируемой форм БТШ70 на поверхности к!еток лимфомы ЕЬ-4. А, Г - клетки окрашены антителами к обеим изоформам БТШ70: Б, Д ■■ клетки окрашены антителами к индуцируемым КТШ70; В, Е - клетки окрашены антителами к конститутивным БТШ70.

Рнс. 6. Проточно-шггометрическиЙ и флуоресцентно-микроскопический анализ экспрессии конститутивной и индуцируемой форм внутриклеточных БТШ70 клеток лимфомы А, Г - клетки окрашены антителами к обеим изоформам БТШ70; Б, Д - клетки окрашены антителами к индуцируемым БТШ70; В, Е - клетки окрашены антителами к конститутивным БТШ70.

2. Феномен транслокации БТШ на поверхность апоптозны! клеток

При проведении шшэфлуориметрического анализа культивируемых клеток ЕЬ-4 было обнаружено, что в анализируемых образцах, наряду с живыми клетками, всегда присутствует заметная примесь апоптозкых клеток. Это указывает на протекание в данной культуре процесса спонтанного апоптоза. Результаты измерений свидетельствовали о том, что пул апсигшишх клеток ЕЬ-4 характеризуется повышенной экспрессией БТШ на клеточной поверхности. Данное обстоятельство явилось основанием для подробного исследовали явления транслокацни БТШ иа поверхность лимфо-пдяых клеток а процессе тс программированной гибели.

В мотели спонтанного апоптоза клеток ЕЬ-4 мы. провели анализ взаимосвязи транслокацни БТШ70 на клеточную поверхность с некоторыми важными для пронесен программированной гибели внутриклеточными событиями. Методически существенным для данных исследований явилась продемонстрированная нами возможность использования проточной иитометрии для идентификации в одном анализируемом образце трех последовательных стадий клеточной гибели. Это достигается с помощью использования морфологических характеристик клеток (переднее и боковое светорассеяние, ГЗ и и учета проницаемости их плазматических мембран для Р1. К 1-ой, наиболее ранней из выявляемых данным способом стадий апоптоза, относятся

клетки «перешейка», соединяющего морфологически различающиеся области живых и апоптозных клеток; на 2-ой, промежуточной стадии апоптоза, находятся клетки, обладающие морфологическими признаками апоптозных, но неокрашивающиеся Р1; к 3-Й, терминалыюй стадии аиоптоза, относятся апогггозные клетки, позитивные по окрашиванию Р1 (рис, 7).

Регион Ш, алоптозные клетки

Регион ir. стадия 1, клетки «перешейка»

Клетки региона III стадия з

Рис. 7, Стадии ало птоза, идентифицируемые с помошью проточной Ш!тофл>ч> риметрии в культуре клеток лимфомы ЕЬ4. А - регионы живых и апоптозных клеток, выделяемые по морфологическим признакам (характеристикам светорассеяния) клеток. Е - вторая и третья стадии апоптоэа, выявляемые по интенсивности окрашивания апоптозных клеток {регион III) крогсиднпиодщом (Р1).

Оценка уровня экспрессии поверх»¡оеткых Б1ТП70 (пБТШ70) в анализируемых образцах клеток BL.-4 свидетельсгвовалл о росте этого показателя на начальной и промежуточной стадиях аиоптоза е последующ*!« его снижением на терминальной стадии клеточной гибели (рис. 8, А). Анализ изменения -гранемембранного потенциала митохондрий при развитии програм мированной тбели клеток EL-4 показал, что первый этап ашшоза (клетки «перешейка») характеризуется достоверным увеличением этого потенциала. а на втором и третьем этапах апоптоза наблюдается деполяризация митохондрий (рис. 8, Б). Сравнение зарегистрированных изменений потенциала митохондрий с вариациями уровня БТШ70 (рис. 8, А) свидетельствует о том, irro в данной модели гранслокация БТШ70 на клеточную поверхность не только продолжается, но ц усиливается после перехода клеток в необратимую фазу шюптоза (после деполяризации митохондрий). Это указывает на то, что после запуска аиоптоза БТШ70 не препятствуют клеточной гибели, а участвуют в реализации программы апотоза на этапах деградации а утилизации внутриклеточных протеинов.

0 12 3 0 1 2 3

Этапы апотгозэ Этапы апоптоза

Рис- 8. Изменение уровня экспрессии поверхностных БТ1Х170 (А), трансмембранного потенциала митохондрий (Б), активности каспазы-Э (В) и внутриклеточной концентрации активных форм кислорода (АФК) (Г) на последовательных стадиях программированной гибели клеток лимфомы ЕЬ-4.

Цитометрнческий анализ активности одной нз эффекгорных протеаз программированной клеточной гибели - каспазы-3 выявил выраженные изменения этой активности в процессе программированной гибели клеток ЕЬ-4. Начальному этапу апоптоза сопутствовало лишь незначительное увеличение активности этого фермента. Переход же клеток в следующую, промежуточную стадию апоптоза сопровождался резким ростом активности каспазы-3. На терминальной стадии апоптоза уровень ферментативной активности каспазы-3 существенно снижался, но оставался выше, чем у живых клеток (рис. 8, В). Зарегистрированная синхронность изменений активности каспазы-3 и уровня экспрессии пБТЦ.170 указывает на вовлеченность БТШ70 в деградацию и утилизацию внутриклеточных протеинов на заключительных этапах апоптоза, т.к. каспаза-3 является одной из ключевых протеаз, запускающих процессы протеолиза в погибающих клетках.

При цитометрическом анализе внутриклеточного содержания активных форм кислорода также была обнаружена взаимосвязь изменения этого показателя с развитием программированной гибели клеток ЕЬ-4, Характер этой взаимосвязи был аналогичен таковому для пБТШ70 (рис. 8. Г). Корреляция уровня экспрессии лБТШ70 с со-

держанием в клетках перекисных форм кислорода согласуется с существующими представлениями о том, что окислительный стресс, повреждающий внутриклеточные протеины, является фактором, индуцирующим экспрессию протектнвных БТШ.

В следующей серии экспериментов было установлено, что у живых клеток ЕЬ-4 основная часть молекул БТШ70 сосредоточена во внутриклеточном пространстве (рис. 9, А, Б, этап 0). Вступление клеток ЕЬ4 на путь апоптоза сопровождается достоверным увеличением концентрации молекул БТШ70 как в цитоплазме, так и на поверхности плазматической мембраны (рис. 9, А, Б, этап 1). Переход клеток ЕЬ-4 в очередную стадию программированной гибели приводит к значительному повышению плотности молекул БТШ70 на клеточной поверхности и небольшому росту их содержания в цитоплазме (рис. 9, А, Б, этап 2). Последней фазе апоптоза сопутствует падение концентрации БТШ70 на поверхности и в цитоплазме клеток ЕЬ-4, причем наиболее сильно это проявляется для внутриклеточных протеинов (рис. 9, А, В, этап 3). Указанное увеличение поверхностной составляющей суммарного пула БТШ70 на терминальной фазе апоптоза (рис. 9, Б, этап 3) вероятнее всего связано с повышением интенсивности транслокации этих протеинов на клеточную поверхность, что можно объяснить их способностью стабилизировать плазматические мембраны. Очевидно, что такая способность может быть существенной для защиты мембран от разрушения на этапах деградации цитоскелета погибающих клеток. Падение же общего содержания в клетках БТШ70 на терминальной стадии апоптоза можно объяснить сбрасыванием поверхностного пула этих протеинов в окружающую среду.

Рнс. 9. Цитометрнческий анализ поверхностной и внутриклеточной экспрессии БТШ70 (А) на последовательных этапах апоптоза клеток лкмфомы ЕЬ-4. Б - изменение соотношения размеров поверхностного (пБТШ70) и внутриклеточного (внБТШ70) пулов БТШ70 в этой модели.

0 12 3

Этапы апоптоза

0 12 3

Этапы апоптоза

Зарегистрированное нами явление транслокации БТШ на поверхность клеток EL-4, погибающих по программе апоптоза, вероятнее всего свойственно не только этой линии трансформированных лимфоидных клеток, но и нормальным клеткам иммунной системы. Действительно, в литературе имеются сведения о присутствии БТШ на поверхности апоптозных лимфоцитов. Мы предположили, что транспорт БТШ на поверхность погибающих клеток является неотъемлемым этапом процесса апоптоза во всех популяциях лимфоцитов. С целью проверки данного предположения, мы провели большую серию экспериментов с покоящимися и активированными лимфоцитами разного органного происхождения. Результаты этих экспериментов подтвердили нате предположение. Действительно, во всех использованных моделях программированной гибели лимфоцитов, на поверхности апоптозных клеток присутствовали БТШ. Закономерности появления поверхностных БТШ в процессе апоптоза, спектр и уровень их экспрессии был подобен для лимфоцитов различной локализации. В частности, в модели спонтанного апоптоза тимоцитов с помощью проточной цигометрии мы обнаружили, что на поверхности апоптозных клеток присутствуют БТШ70. Оказалось также, что апозтгозные клетки обладают повышенной концентрацией внутриклеточных БТШ70 по сравнению с живыми. Содержание этих протеинов у погибших тимоцитов превышает таковое для живых более, чем в 2 раза для всех использованных линий мышей (рис. 10, А). На поверхность апоптозных тимоцитов транспортируется не более 5% молекул БТШ70 от их общего содержания в погибших клетках (рис, 10, Б). Таким образом, в процессе апоптоза тимоцитов происходит усиление синтеза БТШ70, что приводит к повышению содержания данных протеинов в апоптозных клетках и сопровождается транслокацией БТШ70 па клеточную поверхность.

1-вМ

S m I :р™8Ь«—; 1||з- Й g I ;

' В _Н —В '■алотсоиые | § & f 2 ■ H H H Матюгпозные

1П.П.1Т ¡ч;-J, J. J,~~

CS7BL СБА ВАШс 6 CS7BL CBA BALSA;

g § 100

15 80 ïî 6°

^ a ri

Рис 10. Результаты цитофлуориметрического анализа уровня экспрессии внутриклеточных (А) и поверхностных (Б) БТШ70 у живых и погибающих тимоцитов в модели их спонтанного апоптоза.

Наряду с моделью спонтанного апоптоза в культуре неакшвированных тимоцитов мы использовали также модель спонтанного апоптоза в культуре КонА-актавированных тимоцитов. В результате было обнаружено, что на поверхности аполтозных клеток в культуре активированных тимошггов (и в культуре КонА-активиро ванных слленоцигов) присутствуют все основные разновидности БТШ (БТШ25, БТШ60, БШ170, БТШ90). С помощью использования моноклональных антител, связывающихся только с одной формой БТШ70, мы обнаружили, что на поверхности апоптозных тимоцитов присутствуют в основном конститутивные БТШ70 и лишь незначительное количество молекул индуцируемой формы этих протеинов. Как и в модели спонтанного апоптоза клеток EL-4, программированная гибель активированных тимоцитов характеризовалась увеличением поверхностной экспрессии БТШ, но не других мембранных протеинов, в частности молекул CD25 (рис. 11). Это служит еще одним свидетельством того, что транспорт конститутивных цитоплазма-тичесхих БТШ70 на клеточную поверхность является одной из составляющих сложного процесса апоптоза лимфондных клеток.

6ТШ70 0025

Рнс. 11. Сравнение относительного уровня экспрессии БТШ70 и С025 на поверхности живых и апоптозных клеток в культуре КонА-акгивированных тимоцитов.

В модели спонтанного апоптоза тимоцитов мы провели аналогичное изложенному выше для клеток ЕЬ-4 сопоставление экспрессии и локализации БТШ70 с ключевыми для апоптоза внутриклеточными событиями. В этих исследованиях мы несколько видоизменили подход к анализу последовательных этапов апоптоза. Принцип этого анализа, как и прежде, был основан на известных изменениях характеристик светорассеяния клеток в процессе их продвижения по пути апоптоза. Различия морфологии живых и погибающих тимошггов обусловливают при цигометрическом из-

мере ни» смеси живых и апоптозных клеток формирование двух различных областей на цитограмме, построенной в координатах FS/SS (рис. 12). Продвижение на данной шгтограмме клеток в сторону уменьшения их размера (понижение FS) и увеличения гранулярности (рост SS) можно условно рассматривать как «траекторию» апоптоза тимоцитов. Основываясь на этом, мы анализировали измеряемые нами характеристики в узких зонах цитограммы, на которые была разделена вся область, занимаемая клетками (рис. 12). Для анализа мы использовали 21 участок, пронумеровав их справа налево и обозначив как условные этапы апоптоза, хотя очевидно, что реально начало процесса апоптоза можно ожидать лишь в регионах, совпадающих с «перешейком» между пятнами живых и апоптозных клеток (участки 10-12; клетки «перешейка»), тогда как зоны с 1 по 9 соответствуют области живых клеток, а зоны с 12 по 21 - основной области апоптоза.

21 12

1Ü In10 1

< Е

U 1

Рис. 12. Использование цитограммы в координатах FS/SS, полученной при ци-тометрическом анализе тимоцитов (образце, содержащем живые и апопгозиые клетки), для выделения условных этапов продвижения тимоцитов по «траектории» апоптоза.

Результаты проведенного анализа показывают, что рост внутриклеточного содержания БТШ70 и транслокация этих протеинов на клеточную поверхность начинаются одновременно на этапе «И», т.е. у клеток «перешейка». При последующем развитии апоптоза уровень экспрессии в нутрио сточных и поверхностных БТШ70 увеличивается, достигая максимума на 18 этапе. На терминальных стадиях программи-

рованной гибели тимоцитов (этапы 19-21) количество внутриклеточных и поверхностных БТШ70 снижается (рис. 13).

В следующей серии экспериментов в этой модели было проанализировано изменение трансмембранного потенциала митохондрий тимоцитов на последовательных стадиях их спонтанной программированной гибели. Как и ожидалось, в области апогггозных клеток было зарегистрировано снижение потенциала (деполяризация) митохондрий. Однако на стадии вступление тимоцитов в апопгоз, оцениваемое по начальному уменьшению их размера (этапы 11-13), наблюдалась, как и в модели клеток ЕЬ-4, достоверная гиперполяризация трансмембранного потенциала митохондрий (рис. 14, А).

Условные этапы профдвижения клеток по пути

аполтоэа

Условные этапы продвижения клеток по пути апопгоэа

Ряс. 13. Изменение внутриклеточного содержания БТШ70 (А) и уровня экспрессии поверхностных БТШ70 (Б) на последовательных стадиях развития спонтанной программированной гибели тимоцитов.

Цитофлуориметрический анализ активности основной эффекгорной протеина-зы апоптоза, каспазы-3, выявил резкое увеличение этой активности на начальной фазе

программированной гибели тимоцитов (этапы 11, 12) н последующее медленное снижение активности каспазы-3 вплоть до терминальных этапов апогггоза (рис. 14, Б). Полученные данные свидетельствуют о синхронности изменений активности каспа-зы-3 и уровня экспрессии БТШ70 на начальной стадии развития апогггоза тимоцитов. Указанную синхронность можно рассматривать как еще один аргумент в пользу нашего предположения о вовлеченности БТШ70 в процессы протеолиза, протекающие в лимфоцитах, погибающих по программе апоптоза.

Условные этапы продвижения клеток по пути апоптоза

Условные этапы продвижения клеток по пути апогггоза

Рис. 14. Результаты щггофлуориметри чес кого анализа изменений трансмембранного потенциала митохондрий (А) и активности каспазы-3 (Б) на последовательных этапах развития спонтанной программированной гибели тимоцитов.

Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали отчетливую взаимосвязь кинетики апоптоза клеток Е1>-4 н тимоцитов с внутриклеточным содержанием БТШ70 и с транслокацией этих протеинов на клеточную поверхность. Полу-

ченные данные свидетельствуют о важной роли БТШ70 в реализации программы апоптоза у лнмфоидных клеток.

3. Возможные механизмы транслокацни БТШ на поверхность лнмфондных клеток

Несмотря на достаточно большое число работ, продемонстрировавших феномен необычной поверхностной локализации внутриклеточных БТШ и иммунологическую значимость таких протеинов, причины и механизмы транспорта этих протеинов на клеточную поверхность в настоящее время неизвестны. Мы провели серию экспериментов, направленных на выяснение механизмов транслокации БТШ70 на поверхность клеток ЕЬ-4,

Известно, что транспорт протеинов на клеточную поверхность осуществляется в клетках через сеть эндоплазматического ретикулума и аппарат Гольджи. Этот процесс может быть блокирован с помощью ингибиторов секреции протеинов - моненеи-на и брефелдина А. Мы провели исследование влияния данных ингибиторов на процесс транслокации БТШ70 на клеточную поверхность в культуре клеток лимфомы ЕЬ-4. Оказалось, что ингибиторы в нашей модели обладают парадоксальной активностью. Это заключается в том, что они не блокируют, а стимулируют транспорт БТШ70 на поверхность клеток (рис. 15, А).

Коинтршп ишбнщни Концантрамин тгибиторов

Рис. 15. Влияние разных доз моненсина и брефелдина А на уровень экспрессии поверхностных БТН170 (А) и на процентное содержание апоптозных клеток (Б) в культуре клеток лимфомы ЕЬ-4,

Парадоксальное действие ингибиторов транспорта и секреции внутриклеточных протеинов на интенсивность транслокации БТШ70 на клеточную поверхность

проявилось также в модели ре-экспрессин мембранных протеинов. В этих опытах клетки EL-4 были обработаны проназой, отщепляющей от клеточной поверхности основную массу протеинов. После удаления проназы из питательной среды и инактивации ее остатков, клетки культивировались в нормальных физиологических условиях в присутствии или отсутствии (контроль) рабочих доз моненсина или брефелдина А. Цитофлуорнметрический анализ поверхностных БТШ70 и Thy 1-антигена показал, что использованная в наших опытах ферментативная обработка клеток EL-4 значительно снижает плотность данных протеинов на клеточной поверхности (рис. 16). Эффективность восстановления уровня их экспрессии в отсутствии ингибиторов различалась, но была ожидаемой. Присутствие же моненсина и брефелдина в культурах обработанных клеток почти полностью блокировало процесс восстановления уровня поверхностной экспрессии Thy-1 антигена, но в то же время стимулировало транспорт на клеточную поверхность молекул БТШ70. Данная серия экспериментов продемонстрировала, что в отличие от большинства протеинов, транслокация БТШ70 иа клеточную поверхность осуществляется с использованием неклассического механизма, т.е. в обход эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи.

Контроль Обр. Пронээой Родкспрессин

Контрогщ, 06р. пронеэой Ре-э*ет|рвссия

Рис. 16. Влияние моненсина и брефелдина А на ре-экспрессию поверхностных БТШ70 (А) и Thy-1 антигена (Б) на клетках лимфомы EL-4 после их обработки проназой.

Мы предположили, что одна из причин усиленной транслокацни БТИ170 на поверхность клеток Е1,-4 под действием ингибиторов транспорта и секреции протеинов связана с нарушением клеточного ионного гомеостаза, Действительно, данные ингибиторы блокируют нормальное обновление мембранных белковых структур, выполняющих разнообразные функции. Очевидно, что одна из наиболее важных для жизнедеятельности клеток функция осуществляется протеинами, образующими ионные

каналы плазматических мембран и обеспечивающими солевой баланс между внутриклеточным содержимым и микроокружением. Обусловленное ингибиторами нарушение процесса обновления ионных каналов может привести к дефектам в работе данного эвена системы клеточного ионного гомеостаза. В настоящее время существуют достоверные свидетельства о способности БТШ образовывать в липидкых бислойных мембранах селективные ионные каналы. В дополнение к этому, было показано, что БТШ способны активировать уже существующие ионные каналы плазматических мембран. Вполне вероятно, что указанные свойства БТШ, в частности БТШ70, могут использоваться клетками для коррекции тех или иных нарушений функционирования специализированных ионных каналов. Мы провели проверку данного предположения в модели блокирования хлорных каналов плазматических мембран с помощью их синтетических ингибиторов SITS и D.1DS. Оказалось, что инкубация клеток EL-4 в течение 4-8 часов в присутствии рабочих доз этих ингибиторов приводит к достоверному увеличению уровня экспрессии БТШ70 на клеточной поверхности (рис. 17). Это можно рассматривать как подтверждение нашего предположения о связи транспорта БТШ на клеточную поверхность с нарушением ионного гомеостаза.

Рнс. 17. Влияние ингибиторов хлорных каналов плазматических мембран ОШЭ и ЗГГв (50 мкМ) на уровень экспрессии БТШ70 на поверхности клеток лимфомы ЕЬ-4, Время инкубации клеток с ингибиторами 4 ч. По оси ординат - среднее относительное увеличение уровня экспрессии поверхностных БТШ70 в процентах по отношению к контролю.

О взаимосвязи поверхностной локализации БТШ70 с нарушениями клеточного ионного равновесия свидетельствовала также серия экспериментов с обработкой клеток ЕЬ4 нефизиологическими значениями рН, дезорганизующей мембранные протеины и в том числе структуры, образующие ионные каналы. Оказалось, что кратковременная обработка клеток ЕЬ-4 изотоническим солевым раствором с рН 4 и рН II приводит к достоверному увеличению поверхностной экспрессии БТШ70 (рис. 18). Наряду с демонстрацией взаимосвязи транспорта БТШ70 на клеточную поверхность с

повреждением структуры мембранных протеинов, результаты этих опытов свидетельствуют о существенном гидрофобном взаимодействии поверхностных молекул БТШ70 с плазматической мембраной. Действительно, ионные связи чувствительны к рН среды, поэтому использованная обработка должна приводить к диссоциации молекул, адсорбированных на клетках за счет электростатических сил. Зарегистрированное гидрофобное взаимодействие БТШ70 с клеточной поверхностью не вызывает удивления, т.к. липофильные свойства активного центра БТШ70 хорошо известны.

ИНД. БТШТО нонет. БТШ70 инд. БТШТО конст. БТШ70

Рис. 18. Влияние кратковременной инкубации клеток ЕЬ-4 в среде с рН 4 (А) и рН 11 (Б) на уровень экспрессии индуцируемых (инд.) и конститутивных (конст.) БТШ70 на клеточной поверхности. Приведены данные измерений контрольных клеток (рН 7), клеток сразу после стресса (рН 4 и рН ! 1), и клеток, проинкубированных после действия стресса в нормальных физиологических условиях в течение 2 часов (Восстановлен ие).

4. Влияние физиологических медиаторов стресса на экспрессию БТШ70

лимфоцитами

БТШ являются стресс-индуцируемыми протеинами, интенсивность их синтеза значительно увеличивается под действием широкого спектра повреждающих клетки факторов. Для нелимфоидных тканей показано, что индукция усиленной экспрессии БТШ наблюдается не только при прямых воздействиях неблагоприятных факторов на клетки этих тканей, но и под действием нейроэндокринных сигналов, продуцируемых при стрессе всего организма. С целью проверки возможного влияния медиаторов стресса на интенсивность синтеза лимфоцитами БТШ70 мы проанализировали содержание БТШ70 у тимоцитов, проинкубированных в присутствии адреналина или агониста глюкокортикондов - дексаметазона.

Оказалось, что адреналин эффективно стимулирует синтез БШ170 в тимоци-тах, Этот эффект был дозозависимым и наблюдался уже через 4 часа после внесения адреналина в клеточную культуру {рис. 19, А). Все использованные концентрации адреналина вызывали программированную гибель части популяции тимоцитов, однако количество апоптшных клеток не превышало 50% от общего числа тимоцитов даже при максимальной дозе препарата (рис. 19, В). Влияние адреналина на внутриклеточное содержание БТШ70 в субпопуляции апоптозных клеток было более выраженным по сравнению с живыми тимоцитами (рис. 19, А). Наряду с этим, адреналин в диапазоне высоких концентраций существенно стимулировал экспрессию БТШ70 на поверхности апоптозных тимоцитов, и вызывал лишь незначительную экспрессию поверхностных БТШ70 у живых клеток (рис. 19, Б).

£ n

t: ^uo-i

|г |й 150-

i к щ 100-

s s 50-

а о-

i t

rfi.rfl.ril.il

40 100 250 500

1е %1

IF 10 ■

С и) 8-

i ь Я 8 ь 4 ■

п о 20-

-Л

¡□аполтоэиые

о 40 100 250 50g концентрация адреналину миМ

I S 00» i

5 5 ю-

ОЛИ

о 40 100 250 500 концентрация адреналина, мкМ

Рис. 19. Влияние разных доз адреналина на внутриклеточное содержание БТШ70 у живых и апоптозных тимоцитов (А), экспрессию БТШ70 на поверхности живых и апоптозных тимоцитов (Б) и на программированную гибель тимоцитов (В).

В отличие от адреналина дексаметазон в этой модели ингибяровал синтез БТШ70, Так, цитофлуориметрические измерения показали, что при концентрации

дексаметазона 10"4 М и сроке инкубации тимоцитов 4 часа внутриклеточное содержание БТШ70 у живых и апоптозных тимоцитов достоверно уменьшается (рис. 20). Эти данные говорят о возможной вовлеченности БТШ в иммуномодулирующие эффекты нейроэвдокринных медиаторов стресса.

8 О

|| го. _

&Е во- ____

1и11 и. 1 ■

Контроле Дексямвпэон

Рис. 20. Сравнение содержания внутриклеточных БТШ70 у апоптозных и живых тимоцитов после 4 часовой инкубации с дексаметазоном в концентрации 10"* М.

5. Феномен экзоцитоза БТШ70 в культурах активированных лимфоидных клеток

Результаты анализа изменения содержания БТШ70 в лимфоидных клетках в процессе их программированной гибели указывали иа возможность продукции внеклеточного пула этих протеинов в культурах лимфоидных клеток. Для проверки данного предположения мы протестировали присутствие БТШ70 в образцах кондиционированного супернатанта, полученных из культур клеток лимфомы ЕЬ-4,

Вестерн-блот-анализ содержания БТШ70 в кондиционированной питательной среде культуры клеток ЕЬ-4 выявил внеклеточный пул этих протеинов в данной модели (рис. 21), Эти результаты подтверждают наше предположение о возможном сбрасывании БТШ с поверхности погибающих клеток ЕЬ-4 в межклеточное пространство.

Внеклеточная форма БТШ70 была обнаружена также в кондиционированном супернатанте культуры КонА-активированных Т-лимфоцитов. Электрофорез в ПААГ выявлял в приготовленных образцах мажорную фракцию с молекулярной массой около 70 кДа (рис. 22, А), а иммунохимическое окрашивание этой фракции, перенесенной на нитроцеллюлозную мембрану, с использованием анти-БТШ70 монокло-нальных антител достоверно свидетельствовало о присутствие в ней БТЩ70 (рис. 22, Б). Таким образом, эти эксперименты показали, что продукция внеклеточной формы

БТШ70 свойственна не только трансформированным лимфошшым клеткам, но н нормальными активированными лимфоцитами.

& Б

• БТШ70

20кДа 14 кДа

г е-

о о * о

а.

Рис. 21. В естсрн-бл от-ан ал из кондиционированного супернатанта культуры клеток EL-4 на содержание БТШ70. Представлены результаты гель-электрофореза (А) и иммуноблоттинга (Б); контроль - неспецифическое связывание антител.

205 кДа

116 кДа 97,4 кДа

66 кДа — ЩЩ БТШ70

45 кДа

29 кДз

Маркеры Супернатант Лизат

Рис. 22. Результаты Вестерн-блот-анализа содержания БТШ70 в образцах супернатанта культуры активированных Т-лимфоцитов мыши. А - электрофорез образца супернатанта в ПААГ. Б - окрашивание блага фракции 70 кДа мо» о кл опальны мм антителами к БТШ70. В - электрофорез I¡адосадка суспензии активированных Т-лимфоиитов, разрушенных замораживай кем-оттаивай нем.

Механизмы экзоцитоза БТШ70 лимфоидными клетками не известны. Как описано выше, мы предполагаем, что формирование внеклеточного пула БТШ70 связано

со сбрасыванием в межклеточное пространство БТШ70 с поверхности клеток, погибающих по программе апоптоза. Однако, вероятнее всего, это не единственная н не основная причина появления БТШ70 в межклеточной среде, В работах, посвященных этому явлению в культурах клеток нелнмфондного происхождения, показано, что секреция БТШ70 может осуществляться живыми клетками, причем неклассическим, аппарат Гольджи независимым путем. Мы предполагаем, что и в нашей модели продукция внеклеточного пула БТШ70 может быть связана не только со сбрасыванием эгнх протеинов с поверхности апоптозных клеток, но и с активной секрецией БТШ70 живыми клетками. Для выявления механизмов такой продукции БТШ70 лимфоидны-ми клетками мы »троан ализирояал и влияние ингибиторов классического пути секреции монексина и брефелдина А на содержание БТШ70 в сунеркатанте культуры лимфомы Е1.-4.

Результаты Вестерн-бдот-анадиза образцов супернатанта свидетельствовали, как и в опытах с поверхностными БТШ70, о парадоксальном действии моненсина и брсфедднна А, Оказалось, что эти ингибиторы не только не препятствовали экзошто-зу БТЩ70 клетками ЕЬ-4, но и значительно стимулировали этот процесс (рис. 23). Следовательно, в культуре клеток лимфомы ЕЬ-4 продукция БТШ70 в межклеточное пространство осуществляется некласснчеекнм. аппарат Гольджи независимым путем. Использование монокяонал.ьных антител к индуцируемой и конститутивной формам БТШ70 позволил установить, что обусловленный ингибиторами рост размера внеклеточного 1тула БТШ70 происходит в основном за счет конститутивной формы данных п роге ¡шов (рис. 23).

5 3 е

6 1 $ 5 I I

м 3 ш

Окрашивание антителами к двум изоформам БТШ70

Окрашивание антителами к конститутивным 5ТШТ0

Рис. 23, Вестери-блот-анализ содержания внеклеточных БТ1Х170 в супернатакте культуры клеток лимфомы ЕЬ-4, проинкубированных 24 часа в присутствии рабочих доз моненсина и брефелдина А, Контроль -- супернзтант клеточной культуры, проинкубированной без добавления ингибиторов секреции протеинов.

С целью элиминации примеси сывороточного альбумина в опытах по анализу внеклеточного пула БТШ70 мы провели серию экспериментов с выделением БТ11170 из супернатанта с помощью аффинной хроматографии. Этот подход основан на способности молекул БТШ70 к очень прочному связыванию с молекулами АТФ, что используется для аффинного выделения этих протеинов из различных биологических жидкостей на колонке с АТФ-агарозой. Полученный нами с помощью данного методического подхода препарат БТШ70 из супернатанта клеток лимфомы ЕЬ-4 не содержал примеси БСА, что позволило идентифицировать в данном препарате как кон-сшпушвную, так и индуцируемую формы БТШ70 (рис. 24). Измерение концентрации белка в данных образцах показало, что 1 млн. клеток ЕЬ-4 продуцируют в нормальных условиях за 24 часа около 5-10 мкг внеклеточных БТШ70. Такое значимое количество секретируемых БТ1Ц70 указывает на выполнение этими протеинами существенных функций в данном клеточном сообществе.

Конститутивная форма БТШ70 Индуцируемая форма БТШ70

Рис. 24. Вестерн-бл от-анализ пула внеклеточных БТШ70, выделенного с помощью аффинной хроматографии с использованием АТФ-агарозы из супернатанта культуры клеток лимфомы ЕЬ-4. В этих образцах проявляются две изоформы Б'! Ш70, незначнтельно различающиеся но молекулярной массе. Приведены иммуноблоты, полученные для двух образцов супернатанта клеток, прокультивированных в стандартных условиях.

Анализ наших результатов и литературных данных указывает на то, что продукция клетками ВТШ70 в окружающую среду не является уникальным феноменом, а скорее всего сопутствует процессу жизнедеятельности различных клеточных популяций. в частности популяций лимфоцитов. Механизмы такой продукции в настоящее время не установлены, хотя в литературе имеются сообщения о присутствии БТШ70 в зкзосомах. выбрасываемых в межклеточное пространство некоторыми типами клеток. Продукция клетками экзосом является сравнительно недавно обнаружен!¡ой разновидностью клеточного экзоцитоза, осуществляемого в обход аппарата Гольджи. Мы проверили возможность такого пути экзоцитоза БТШ70 в культуре клеток Е1.-4. Ока-

залось, что в кондиционированном супер натайте культуры клеток £1.-4 действительно присутствуют очень мелкие частицы, образующие осадок при 100000 Вестерн-блот-аналнз этого осадка выявил в нем фракцию БТШ70 (рис. 25), Эти данные можно рассматривать как свидетельство продукции экзосом, содержащих БТШ70. клетками лимфомы ЕЬ-4, однако мы не исключаем, что данный подход мог выявить в суперна-танте не только экзосомы. но и крупные агрегаты («пэтчп») БТШ70, сбрасываемые в межклеточное пространство с поверхности клеток в результате «шедяинга».

» я 2 £

« £

«2 2 «о

3 g Ь

sl * . # £

2- * f £ по « »

X X

л <1 I

а о

¡О Г- - "

aS ° о * »

5" * с С о »

JL" ш в с w

Y fc о I ю q п

ВС н Ч к С

« « К £ I ¡1

«о s 5 I а, о е х с

J * £

I J 4"

»> О I 2-

| ® Г с

* С * №

s 5 J a

190 кДа -

МкДа-1

67 кДа-*0 43 кД* - ff

БТШ70 \ /

Рис, 25, Электрофорез в ПААГ и им.муноблотинг препарата экзосом, выделенных из кондиционированного супернатанта культуры клеток Е1.-4, В качестве положительного контроля на присутствие БП1170 использовался лнзат клеточной массы лимфомы ЕЬ-4.

6. Взаимодействие БТШ70с лимфоиднымн клетками

Как было установлено в наших экспериментах, сообщества лимфоидных клеток, культивируемые in vitro, характеризуются присутствием в межклеточном пространстве растворимой формы БТШ70. Учитывая литературные данные, демонстрирующие существование внеклеточного пула БТИ170 в сыворотке крови больных и доноров, мы рассматриваем явление продукции внеклеточной формы этих протеинов как нормальный физиологический процесс, сопровождающий функционирование

различных систем организма, в частности иммунной системы. Очевидно, что молекулы внеклеточного пула БТШ70 выполняют определенные функции. Мы провели серию экспериментов для проверки взаимодействия внеклеточных БТШ70 с клетками лимфоидного ряда. В опытах использовали свежевыделенные клетки лимфоидных органов мыши, а также КонА-акгивнрованные Т-лимфоциты и клетки лимфомы ЕЬ-4. В качестве внеклеточной формы БТШ70 использовали биотинилнрованные рекомби-нантные БТШ70 человека.

Оказалось, что экзогенные БТШ70 быстро связываются с поверхностью всех использованных типов клеток. Это было установлено с помощью шпофлуориметри-ческого анализа клеток после их инкубации с экзогенными БТШ70 при ^С в присутствии азида натрия и последующего окрашивание конъюгатом стрептавидин-ФИТЦ (рис. 26).

Э в

л £ 8 '

Iх

Рис. 26. Связывание биотннилированных рекомбинантных БТШ70 с поверхностью клеток разных типов. Приведены данные цитофлуориметричеекмх измерений среднего уровня флуоресценции живых клеток, последовательно обработанных экзогенными бнотиншшрованными БТШ70 и конъюгатом стрептавидин-ФИТЦ.

Наряду с этим, были проведены опыты с культивированием клеток в присутствии Ю мкг/мл рекомбинантных биотннилированных БТШ70 в нормальных физиато-гических условиях, не препятствующих эндоцитозу. С помощью цитофлуориметри-ческого анализа в этих экспериментах было обнаружено, что биогинилированные БТШ70 проникают во внутриклеточное пространство (рис. 27), что говорит об интер-нализации данными клетками экзогенных БТШ70. Таким образом, наши результаты свидетельствуют о возможности поглощения лимфоцитами из окружающей среды внеклеточного пула БТШ70. Причем оказалось, что внеклеточные БТШ70 поглощаются не только активно метаболирующими клетками (клетками лимфомы ЕЬ-4 и Ко-

н КонА-шастами). но и покоящимися лимфоцитами разного органного происхождения, в том числе и тнмоцитами.

Кон-А^ласты Е1--4

КМ СплсНч

Рис. 27. Интерналпзация экзогенных БТШ70 разными типами клеток. Приведены результаты щггомегрических измерений относительного содержания бнотшш-лировакных БТШ70 в цитоплазме клеток, проинкубированных 4 часа в нормальных условиях в присутствии 10 и кг/мл рекомбшшгшых биотииилнроаанных БТШ70.

Следующая серия наших зкепернмеотов была посвящена проверке протектявного антиапоптозного эффекта экзогенных БТШ70 в культуре тимошгтов. Оказалось, чгто ннкубаштя тимоиитов в присутствии БТ11170 существенно снижает в указанных культурах интенсивность спонтанного апогпоза (рис. 28).

В опытах с 10-дневными Кои-А-бластами был также зарегистрирован анти-апоптозныГ] эффект экзогенных БТШ70. Обнаружено, что 12-часовое присутствие в культуре этих клеток ре комбинат гных БТШ70 (1 мкг/мл) достоверно препятствует процессу спонтанного а потом в данной модели. Так, процентное содержание апоп-тоэных клеток в культурах, обработанных БТШ70, было в среднем на 12% ниже, чем в контроле. Подобного протектнвного эффекта экзогенных БТШ70 не наблюдалось в модели спонтанного анотггша клеток лимфомы что может быть связано с достаточно высокой концентрацией эндогенного пула внеклеточных БТШ70 в этой модели.

Результаты, полученные в этих экспериментах, подтверждают наше предположение о взаимодействии внеклеточного пула БТШ70 с Т-лимфоцитами. Как уже упоминалось, в литературе есть работы, демонстрирующие такое взаимодействие для других типов клеток, однако мы получали свидетельство о возможности влияния экзогенных БТШ70 на популяцию Т-лимфоцитов. Наши данные указываю? на то, что иммуностимулирующие функции экзогенных БТШ70 связаны не только с активацией

ангагенпредставляющнх клеток, но и с влиянием этих протеинов на Т-клеточное звено иммунной системы.

25-1 20 -

□ Споит.

ШДекс.

О 0,5 1 5 10

концентрация БТШ70, ынг/ил

Рис. 28. Протективное действие разных концентраций экзогенных БТШ70 в моделях спонтанного и дексаметазон-нндуцированного аноптоза тимоцитов.

Продемонстрированное в описанных экспериментах протективное действие экзогенных БТ1Ш0 можно отнести к одной из возможных функций внеклеточного пула этих протеинов, присутствующего в различных тканях. Однако наши данные позволяют также предположить, что циркулирующий в организме внеклеточный пул БТШ70 выполняет еще одну функцию, имеющую непосредственное отношение к системе иммунологического надзора. Это следует из результатов уже упоминавшихся экспериментов по анализу взаимодействия экзогенных БТШ с клеточной поверхностью. В этой серии экспериментов было обнаружено, что биотинилированны е реком-бинантные БТШ70 связываются с поверхностью не только живых тимоцитов, но и тимоцитов, префнксированных параформальдегидом (3%, 30 мин). Причем денатурация мембранных протеинов параформальдегидом приводила к более интенсивной адсорбции экзогенных БТШ70 на клеточную поверхность по сравнению с живыми клетками (рис. 29, В). Подобные различия взаимодействия биотинилнрованных БТШ70 с поверхностью живых и фиксированных клеток наблюдались и в опытах со спленоцитами мыши (рис. 29, Б) и с клетками мышиной лимфомы ЕЬ-4 (рис. 29, А). Наряду с этим, в опытах с культурой клеток ЕЬ-4, характеризующейся спонтанным апогггозом, было обнаружено, что экзогенные БТШ70 особенно интенсивно адсорбируются на поверхности алоптозных клеток (рис. 29, А). Зарегистрированная в перечисленных экспериментах выраженная аффинность БТШ70 к клеткам, экспонирующим на своих плазматических мембранах денатурированные протеины, и к поверхности алоптозных клеток позволяет предположить, что внеклеточные циркулирующие

БПШО могут являться для иммунной системы своеобразным зондом, маркирующим клетки, подлежащие элиминации. Действительно, известно, что кяетки-мищени, на поверхности которых представлены БТИ170, распознаются цитотоксическими эффекторами иммунной системы. В наших экспериментах было также обнаружено, что БШ170, присутствующие на поверхности клеток лимфомы ЕИ, распознаются популяцией цитотоксическнх лимфоцитов селезенки и способствуют усиленному лизису данными эффекторами опухолевых клеток.

в70 § во

¡б 50 | 40

| 20 | 10

Г%

¡я;

.ПД.—.

живы» ал«тг. ЛФ ил «тки линии ЕЫ

| 5 ш 4 I 3

Г|

БчЧТнЧ -—1

ПФ

Спленоциты

- да

ад

__П£3—.— ^ЗйУ-

ПФ Тимоциты

Рис. 29. Встраивание экзогенных БТШ70 в плазматическую мембрану живых, алогттадных и префиксироваииых (ПФ) клеток линии ЕЬ-4 (А), спленоцигов (Б), ти-моцитов (В).

Обнаруженное нами явление спонтанной экспрессии БТШ на поверхности клеток лимфомы ЕЬ-4 позволяет использовать данную клеточную линию для анализа реакции цитотоксическнх эффекторов иммунной системы на БТШ, экспонированные на поверхности клеток-мишеней. Механизмы распознавания поверхностных БТШ иито-токсическими лимфоцитами до сих пор не раскрыты. В литературе также не описана реакция циютоксических эффекторов иммунной системы на поверхностные БТШ в мышиной модели. Мы провели исследование вовлеченности поверхностных БТШ70 в распознавание и элиминацию клеток мышиной лимфомы ЕЬ-4 дитотоксическими лимфоцитами селезенки мьгшн. В этих экспериментах спленоциты мышей линии С57ВЬ/б продемонстрировали существенную циготоксичность по отношению к клеткам-мишеням линии ЕЬ-4 (сингенная модель). Это было установлено с помощью МТТ анализа и оценке циготоксичности по высвобождению из разрушенных клеток лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (рис, 30, А). В аллогенной ситуации (спленоциты мышей линии СВА и ВАЬВ/с) был зарегистрирован аналогичный цитотоксический эффект.

ей -

£ Л

I 40 -

24 часа

20 - С часов

20 -

ЛДГ-анали4

20 10 5

Отношение эффектор/мишень

24 чеса

- ГЧ

- 6 часа*1

20 10 $ Отношение эффестэр/мишень

Рис. 30. Цишгоксичность эффекторных клеток селезенки мыши С57В176 по отношению к клеткам лимфомы ЕЬ-4, зарегистрированная с помощью МТТ-анализа и ЛДГ-анализа для 6-часового и 24-часового периода инкубации смеси клеток с разным соотношением эффектор/мишень. А - спленоцнгы получены от интактной мыши. Б -спленоцигы получены от мыши, привитой лимфомой ЕЬ-4 за 10 дней до эксперимента.

Отношение эффектор/мишень Отношение эффектор/мишень

Рис. 31. Влияние обработки клеток-мишеней линии ЕЬ-4 моноклон ал ьны ми антителами к БТШ70 (А, В), к молекулам первого класса ГКГС (Къ/Оь) (Б) и к антигену ТЪу1,2 (Г) на цитотоксичность эффекторов (клеток селезенки). Приведены данные, полученные в сингенной (А, Б, Г - эффекторы выделены из мышей С57ВЬ/б) и аллогенной (В - эффекторы выделены из мышей СВА) моделях.

.Для доказательства вовлеченности Б711]70, экспонированных на поверхности клеток ЕЬ-4, в цигготоксическую реакцию эффекторов, мы использовали клетки-мишени, обработанные анти-БТШ70 монокловальными антителами. Оказалось, что спленоциты мышей С57В176 обладают существенно сниженной цитотоксичностью по отношению к таким клеткам-мишеням (рис. 31, А). Ингибнруюший эффект анти-БТШ70 антител был зарегистрирован также в аллогенной ситуании при использовании в качестве эффекторов спленоцитов мышей СВА (рис. 31, В) и ВАЬВ/с. В противоположность описанному ингибирующему эффекту анти-БТШ70 антител, предобработка клеток ЕЬ-4 анти-Н-2й антителами приводила к усилению цитсгтоксичностн эффекторов (рис. 31, Б). Использованные в качестве контрольных анти-ТЬу-1.2 антитела не оказывали влияния на результат исследуемой цитотоксической реакции (рис. 31,

п.

Отношение эф ф ектор/кищ ен ь

Рнс. 32. Влияние элиминации CD8+ клеток из популяции эффекторных клеток (спленоцитов мыши CS7BL/6) на их цитогоксичность по отношению к клеткам EL-4, обработанных и необработанных моноклональными анти-БТШ70 антителами,

В отдельной серии экспериментов мы оценили вовлеченность в данную цито-токсическую реакцию NK-клеток. В типичном случае популяция эффекторных спле-ноцнтов, используемая в наших экспериментах, содержала примерно 10% NK1,1+ клеток. С помощью магнитных мшфосфер, покрытых анш-CDS антителами, мы элиминировали из популяции спленоцитов цитотоксические CDS* Т-лимфоциты. Оставшиеся спленоциты содержали примерно 25% NKI.1+ клеток. Таким образом было проведено обогащение суспензии эффекторов NK-клетками. В результате такой мо-

дификации популяции спленоцитов мы зарегистрировали достоверное увеличение щгтотоксической активности эффекторов. При этом сохранялся ингбирующий цито-токсичность эффект обработки клеток-мишеней антн-БТШ70 антителами (рис. 32), Следовательно лизис клеток ЕЬ-4 в данной тест-системе обусловлен в основном СО$-негативными лимфоцитами, вероятнее всего МК-клетками, причем циготоксическая реакция эффекторов прямо зависит от присутствия на поверхности мишеней молекул БТШ70.

ВЫВОДЫ

1. Уровень экспрессии БТШ70 лимфоцитами мыши характеризуется существенными индивидуальными различиями и зависит от органной локализации клеток; он увеличивается в ряду тимоцитьКселезенка<пимфатические узлы<костный мозг.

2. КонА-активация Т-лимфоцитов приводит к значительному увеличению внутриклеточного содержания БТШ70 и появлению этих протеинов на клеточной поверхности.

3. Процесс программированной гибели лимфоидных клеток сопровождается усилением уровня экспрессии БТШ и транслокацией цитоплазм этических БТШ на клеточную поверхность.

4. Транспорт БТШ70 на клеточную поверхность осуществляется неклассическим путем, в обход аппарата Гольджи.

5. Уровень экспрессии БТШ70 лимфоцитами изменяется под действием адреналина и дексаметазона; адреналин усиливает, а дексаметазон подавляет экспрессию этих протеинов,

6. Клетки лимфомы Е1--4 и КонА-активированные Т-лимфоциш продуцируют БТШ70 в межклеточное пространство.

7. Секреция БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток осуществляется аппарат Гольджи независимым путем и может быть связана с продукцией клетками экзосом.

8. Внеклеточные БТШ70 интерналнзуются лимфондными клетками и оказывают прогективное действие, защищая эти клетки от апоптоза и стрессирующих факторов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сапожников А.М., Пономарёв Е.Д., Баев Д.В., Фролова Э.Г. Анализ роли белков теплового шока в гфоцессе программированной клеточной гибели. Материалы IV чтений, поев, памяти акад. Ю.А.Овчинникова. Москва-Пущино, 1998, с. 15.

2. Пономарёв Е.Д., Куприянова М.А., Сапожников A.M. Цитогоксический эффект интраэпителиалъных лимфоцитов мыши по отношению к клеткам тимомы EL-4. Матер. 2-го контр, «Совр. проблемы аллергологии, клинич. иммунологии и имму-нофармакологин» (Москва, 21-24 сентября 1998 г.), М„ ВИНИТИ, 1998, с. 406.

3. Poiiomarev E.D., Frolova E.G., Sapozhnikov A.M. Spontaneous apoptosis and expression of cell surface heat shock proteins in cultured EL-4 lymphoma cells. Im Fourth John Humphrey advanced summer programme in immunology. Pushchino, 1998, p. 63.

4. Baev D.V., Gusarova G.A., Ponomarev E.D., Sapozhnikov A.M. Chloride-channel blockers and removal of external chloride inhibit energy metabolism of lymphoid cells. Immunologtsl, 1998, Suppl. 1, p, 393.

5. Kupriyanova M.A., Ponomarev E.D., Sapozhnikov A.M. Use of the MTT assay for study of cytolytic function of murine intestinal intraepithelial lymphocytes. Immunologist, 1998, Suppl. l,p. 296.

6. Ponomarev E.D., Frolova E.G., Sapozhnikov A.M. The phenomenon of the simultaneous apoptosis and expression of cell surface heat shock proteins in cultured murine lymphoma EL-4 cells. Immunologist, 1998, Suppl. 1, p. 544.

7. Ponomarev E.D., Frolova E.G., Sapozhnikov A.M. Spontaneous apoptosis and the expression of surface heat shock proteins in cultured EL-4 lymphoma cells. Immunology, 1998, v. 95, Suppl. l,p. 115.

8. Сапожников A.M., Баев Д.В., Гусарова Г.А., Пономарёв Е.Д., Молотковская И.М. Влияние трансмембранных потоков хлора на энергетический метаболизм активированных лимфоцитов и клеток костного мозга мыши. Иммунология, 1999, Ка 4, с. 37-41.

9. Sapozhnikov A.M., Ponomarev E.D., Tarasenko T.R, Telford G,W, Spontaneous apoptosis and expression of cell surface heat shock proteins in cultured EL-4 lymphoma cells. Cell proliferation, 1999, v. 32, p. 363-378.

10. Баев Д.В., Гусарова Г.А., Сапожников А.М. Супрессия спонтанного и индуцированного апоптоза клеток лимфомы EL-4 ингибиторами хлорных каналов. Медицинская иммунология, 1999,т. l,>fs3-4, с. 95,

П.Пономарёв Е.Д., Тарасенко Т.Н., Сапожников А.М. Различия экспрессии белков теплового шока на поверхности живых и апоптозных клеток лимфомы EL-4. Медицинская иммунология, 1999, т. 1, № 3-4, с. 108-109.

12. Сапожников A.M., Пономарёв Е.Д., Гусарова Г,А. О взаимосвязи апоптоза клеток лимфомы EL-4 с экспрессией белков теплового шока. Доклады Академии Наук, 2000, т. 375, № 4, с. 576-579.

13. Ponomarev E.D., Tarasenko T.N., Sapozhnikov A.M. Splenic murine cytotoxic celts recognize surface HSP70 on culture-adapted EL-4 lymphoma cells. Immunol. Lett., 2000, v. 74, p. 133-139.

14. Сапожников A.M., Пономарёв Е.Д„ Гусарова Г.А., Тарасенко Т.Н. Особенности экспрессии и транслокации белков теплового шока в процессе апоптоза лнмфоид-ных клеток. Материалы V чтений, поев, памяти акад. Ю.А.Овчинникова «Биоор-ганика-2000», 2000, Москва-Пущи но, с. 41.

15. Тарасенко Т.Н., Пономарёв Е.Д., Сапожников A.M. Спонтанный апоптоз тимоци-тов иг vitro сопровождается появлением белков теплового шока на поверхности погибающих клеток. Медицинская иммунология, 2000, т. 2, № 2, с. 140.

16. Пономарёв Е.Д., Тарасенко Т.Н., Сапожников A.M. Белки теплового шока 70 на поверхности клеток-мишеней распознаются NK-клетками мыши. Медицинская иммунология, 2000,т. 2,№2,с, 136,

17. Гусарова Г.А., Пономарёв Е.Д., Сапожников А.М. Культивирование in vitro клеток тимомы EL-4 приводит к появлению в межклеточном пространстве протектнвных белков теплового шока 70. Медицинская иммунология, 2000, т. 2, № 2, с, 126-127.

18. Баев Д.В., Гусарова Г.А., Сапожников A.M. Ингибиторы хлорных каналов плазматических мембран усиливают экспрессию белков теплового шока на поверхности клеток тимомы EL-4. Медицинская иммунология, 2000, т. 2, № 2, с. 120.

19. Ponomarev E.D., Tarasenko T.N., Gusarova G.A., Sapozhnikov A.M. A correlation between apoptosis and heat shock protein expression in EL-4 lymphoma cells. In*. Fifth John Humphrey advanced summer programme and lecture series in immunology. Push-cbino, 2000, p. 74.

20. Ponomarev E.D., Tarasenko T.N., Sapozhnikov A.M. Splenic murine cytotoxic cells recognize HSP70 on the surface of EL-4 mouse lymphoma cells. In: Fifth John Humphrey advanced summer programme an4 lecture series in immunology. Pusbchino, 2000, p. 75.

21. Gusarova G.A., Ponomarev E.D., Tarasenko T.N., Sapozhnikov A.M. Expression and localization of Bcl-2 and HSP70 in EL-4 cells during development of apoptosU. In: Fifth John Humphrey advanced summer programme and lecture series in immunology. Push-chin o, 2000, p. 32.

22. Baev D.V., Gusarova G.A., Sapozhnikov A.M. Chloride channel blockers protect EL-4 lymphoma cells from hypotonic stress. In: Fifth John Humphrey advanced summer programme and lecture series in immunology. Piishchino, 2000, p. 6.

23. Gusarova G., Tarasenko Т., Sapozhnikov A. Plasma membrane associated HSP70 is released into extracellular milieu in EL-4 lymphoma cell culture in vitro. Scand. J. Immunol. 2001, v. 54, SuppI, 1, W 1,20.

24. Гусарова Г„А., Тарасенко Т.Н., Мурашко Д.А., Сапожников A.M. Программированная гибель клеток лнмфомы EL-4 сопровождается синхронными изменениями активности каспазы-3 и экспрессии белков теплового шока 70. Матер, 4-го контр. «Совр. проблемы аллергологии, хлинич. иммунологии и им му но фармакологии» (Москва, 29-31 мая 2001 г.), М., ВИНИТИ, 2001, т. If, с. 55.

25. Баев Д.В., Сапожников A.M. Влияние осмотического стресса на экспрессию про-тсктявных белков теплового шока 70 на поверхности клеток лнмфомы EL-4, Матер. 4-го конгр. «Совр. проблемы аллергологии, клинич. иммунологии и иммуно-фармакологии» (Москва, 29-31 мая 2001 г.), М., ВИНИТИ, 2001,т. II, с. 130.

26. Гусарова Г.А., Тарасенко Т.Н., Мурашко Д А,, Сапожников AJvi. Анализ продукции белков теплового шока 70 клетками лимфомы EL-4. Медицинская иммунология, 2001,т. 3,.№>2,с. 122.

27. Баев Д.В., Сапожников АЛ!. Протегогоный эффект ингибиторов хлорных каналов в модели осмотического стресса клеток лимфомы EL-4 связан с увеличением уровня экспрессии белков теплового шока 70. Медицинская иммунология, 2001, т. 3, №2, с. 120.

28. Sapozhnikov A.M., Gusarova G.A., Ponomarev E.D., Telford W.G. Translocation of cytoplasmic HSP70 onto the surface of EL-4 cells during apoptosis. Cell Proliferation, 2002, v. 35, p. 193-206.

29. Сапожников A.M., Баев Д.В., Гусарова Г.А. Вовлеченность белков теплового шока в феномен защиты клеток от алоптоза ингибиторами хлорных каналов плазматических мембран. Доклады Академии Наук, 2002, т. 384, № 5, с. 712-714.

30. Баев Д.В., Гусарова Г.А., Сапожников A.M. Взаимосвязь протективного эффекта ингибиторов хлорных каналов с экспрессией белков теплового шока 70 в моделях алоптоза и осмотического стресса клеток лимфомы EL-4, Биол. мембраны, 2002, т. 19, № 4, с, 275-282.

31. Пономарёв АД., Гусарова Г.А., Моисеева Е.В., Сапожников A.M. Разработка нового подхода к созданию противоопухолевых вакцин на основе белков теплового шока. Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2002, Na 3, с. 3-8.

32. Баев Д.В., Сапожников A.M. Влияние ингибиторов хлорных каналов на экспрессию гтротектнвных белков теплового шока 70 на поверхности клеток лимфомы EL-4 в условиях осмотического стресса. Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии, Москва, 2002, с. 101.

33. Гусарова Г.А., Мурашко Д.А., Сапожников A.M. Ингибиторы секреции усиливают транслокацию БТШ70 на поверхность клеток лимфомы EL-4 и продукцию этих протеинов в межклеточное пространство. Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии, Москва, 2002, с. 102,

34. Сапожников A.M., Гусарова Г.А., Тарасенко Т.Н., Пономарёв А.Д., Баев Д.В., Му-рашко ДА. Феномен локализации белков теплового шока на клеточной поверхности и в межклеточном пространстве: возможные механизмы и функции в популяциях лимфоидных клеток. Материалы VI чтений, поев, памяти акад. Ю.А.Овчинникова, Москва-Пущи но, 2002, с. 68,

35. Tarasenko T.N., Gusarova G.A., Murashko D.A., SapozhnJkov A.M. Con-A activated mouse splenicytes release HSP70 into intercellular milieu. In: Six John Humphrey advanced summer programme and lecture series in immunology. Pushchino, 2002,

36. Baev D.V., Sapozhnikov A.M. Increased expresión of surface HSP70 plays the main role in anti-hypotinic stress effect of chloride channel blockers. In: Six John Humphrey advanced summer programme and lecture series in immunology. Pushchino, 2002.

37. Gusarova OA, Murashko D.A., Sapozhnikov AJVL A paradoxal effect of protein secretion blockers on the level of cell surface HSP70 expression and HSP70 exocytosis in EL4 lymphoma culture. In: Six John Humphrey advanced summer programme and lecture series in immunology. Pushchino, 2002.

38. Ponomarev A.D., Gusarova G.A., Moiseeva E.V., Sapozhnikov A.M. Anti-cancer effect of vaccination with HSP70 released from tumor cells: a model of EL4 lymphoma. In: Six John Humphrey advanced summer programme and lecture series in immunology. Pushchino, 2002.

3?, Пономарёв А.Д., Гусарова ГА, Моисеева Е.В., Сапожников A.M. Вакцинация белками теплового шока 70, секретерусмыми клетками лкмфомы EL4 in vitro, подавляет развитие этой опухоли in vivo. Медицинская иммунология, 2002, т. 4, № 2, с. 306.

40. Гусарова Г.А., Тарасенко Т.Н., Пономарев А.Д., Луценко Г.В., Сапожников A.M. Взаимодействие белков теплового шока 70 с поверхностью лимфоидных клеток. Матер. 5-го конгр. «Совр. проблемы аллергологии, клинич. иммунологии и имму-нофармакологии» {Москва, 12-14 ноября 2002 г.), М., ВИНИТИ, 2002, т. П, с. 42.

41. Пономарёв А.Д., Гусарова Г.А., Тарасенко Т.Н., Мурашко Д.А., Сапожников А.М, Активация перитонеальных макрофагов мыши препаратами белков теплового шока 70. Матер. 5-го контр. «Совр, проблемы аллергологии, клинич. иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 12-14 ноября 2002 г.), М., ВИНИТИ, 2002, т. П, с. 115,

42. Тарасенко Т.Н., Гусарова Г.А., Пономарёв А.Д., Мурашко Д.А., Сапожников A.M. Анализ экспрессии белков теплового шока 70 в процессе апоптоза тимоцитов. Матер. 5-го конгр. «Совр. проблемы аллергологии, клинич. иммунологии и иммуно-фармакологии» (Москва, 12-14 ноября 2002 г.), М., ВИНИТИ, 2002, т. П, с. 156,

43. Сапожников A.M., Тарасенко Т.Н., Пономарёв А.Д., Гусарова Г.А., Мурашко Д.А., Петров Р.В. Адреналин-опосредованная активация экспрессии белков теплового шока 70 кДа в популяции тимоцитов. Доклады Академии Наук, 2003, т. 392, № 2, с. 277-279.

44. Гусарова Г.А., Тарасенко Т.Н., Пономарёв А.Д., Мурашко Д.А„ Сапожников A.M. Феномен интернализацнн экзогенных белков теплового шока 70 кДа лнмфоидны-ми клетками. Медицинская иммунология, 2003, т. 5, № 3-4, с. 199.

Принято к исполнению 16/03/2004 Исполнено 19/01/2004

Заказ Ка 9 Тираж; 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 \vww.aiitoreferat. га

Оглавление диссертации Сапожников, Александр Михайлович :: 2003 :: Москва

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. СИСТЕМА БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА

ГЛАВА 2. КЛЕТОЧНЫЙ СТРЕСС, БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО

ШОКА И АПОПТОЗ

ГЛАВА 3. БТШ И ИММУННЫЙ ОТВЕТ

ГЛАВА 4. ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ ПУЛ БТШ ВОЗМОЖНЫЕ ПРОДУЦЕНТЫ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ БТШ И ПРЕДПОЛАГАЕМЫЕ ФУНКЦИИ ЭТИХ ПРОТЕИНОВ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 6. ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА ЛИМФОИДНЫМИ КЛЕТКАМИ

6.1. Экспрессия БТШ в популяциях тимоцитов, спленоцитов, клеток лимфатических узлов и костного мозга мыши

6.2. Экспрессия БТШ70 активированными Т-лимфоцитами

6.3. Экспрессия БТШ линиями лимфоидных клеток

ГЛАВА 7. ФЕНОМЕН ТРАНСЛОКАЦИИ БТШ НА

ПОВЕРХНОСТЬ АПОПТОЗНЫХ КЛЕТОК

7.1. Явление спонтанного апоптоза в культуре клеток лимфомы EL

7.2. Экспрессия БТШ на поверхности апоптозных клеток в культуре лимфомы EL

7.3. Влияние плотности клеточной культуры на уровень экспрессии поверхностных БТШ в пулах живых и апоптозных клеток EL

7.4. Влияние стресса на процессы апоптоза и экспрессии БТШ в культуре клеток EL

7.5. Транслокация БТШ на поверхность тимоцитов мыши в процессе их программированной гибели

7.6. Влияние физиологических медиаторов стресса на апоптоз и экспрессию БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток

7.7. Взаимосвязь основных внутриклеточных событий процесса апоптоза с экспрессией БТШ

7.7.1. Модель спонтанного апоптоза в культуре клеток лимфомы EL-4 in vitro

7.7.2. Модель спонтанного апоптоза тимоцитов мыши

ГЛАВА 8. ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ТРАНСЛОКАЦИИ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА НА ПОВЕРХНОСТЬ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК

8.1. Влияние ингибиторов транспорта и секреции внутриклеточных протеинов на транслокацию БТШ на поверхность клеток лимфомы EL

8.2. Экспрессия поверхностных БТШ70 в моделях гипертонического и гипотонического стресса клеток EL-4 и в условиях блокирования хлорных каналов плазматических мембран

8.3. Экспрессия поверхностных БТШ70 клетками EL-4, стрессированными повреждающими значениями рН среды

8.4. Возможные причины и механизмы транслокации БТШ70 на клеточную поверхность в процессе апоптоза лимфоидных клеток

ГЛАВА 9. ФЕНОМЕН ЭКЗОЦИТОЗА БТШ70 В КУЛЬТУРАХ АКТИВИРОВАННЫХ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК 9.1. Присутствие БТШ70 в супернатанте культуры EL

9.2. Внеклеточный пул БТШ70 в культуре

КонА-активированных Т-лимфоцитов мыши

9.3. Влияние ингибиторов секреции протеинов на интенсивность экзоцитоза БТШ70 в культуре клеток лимфомы EL

9.4. Возможные механизмы экзоцитоза БТШ лимфоидными клетками

ГЛАВА 10. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭКЗОГЕННЫХ БТШ70 С ЛИМФОИДНЫМИ КЛЕТКАМИ

10.1. Взаимодействие БТШ70 с клеточной поверхностью и интернализация этих протеинов различными типами лимфоидных клеток

10.2. Протективный эффект экзогенных БТШ70 в культурах лимфоидных клеток

10.3. Возможные функции внеклеточного пула БТШ

ГЛАВА 11. МОДЕЛЬ ИММУННОГО ОТВЕТА НА

ПОВЕРХНОСТНЫЕ И СЕКРЕТИРУЕМЫЕ БТШ

11.1. Цитотоксическая реакция лимфоцитов на поверхностные БТШ70 опухолевых клеток

11.2. Возможные подходы к созданию противоопухолевых вакцин на основе секретируемых БТШ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации по теме "Аллергология и иммулология", Сапожников, Александр Михайлович, автореферат

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Семейство белков теплового шока (БТШ) состоит из большой группы высококонсервативных протеинов, способствующих выживанию клеток в неблагоприятных условиях и интенсивно экспрессирующихся под действием разнообразных стрессирующих факторов. Защитное действие БТШ обусловлено их протективными свойствами, направленными на сохранение нормальной конформации и функциональной активности внутриклеточных протеинов, предотвращение их денатурации и агрегации. В нормальных условиях, в отсутствии стрессирующих воздействий, в клетках синтезируется значительно меньшее количество молекул БТШ. Эти, постоянно присутствующие в клетках, конститутивные БТШ выполняют в основном так называемые шаперонные, вспомогательные функции, обеспечивая процессы фолдинга, транспорта, репарации и утилизации внутриклеточных протеинов.

БТШ экспрессируются всеми типами клеток. У млекопитающих уровень экспрессии БТШ в разных тканях различается и не является стабильным, а зависит от широкого спектра факторов. Вариации уровня экспрессии БТШ могут быть связаны как с процессами нормальной жизнедеятельности клеток, так и с их защитными реакциями на те или иные, периодически возникающие изменения внешней среды. Очевидно, что лимфоидная ткань, характеризующаяся интенсивным клеточным обновлением и постоянным присутствием пулов мигрирующих и циркулирующих клеток, подвержена значительным метаболическим перестройкам и регулярным воздействиям изменяющихся условий микроокружения, в том числе и неблагоприятным для жизнедеятельности. С этих позиций очевидно, что для клеток лимфоидной ткани роль БТШ, обеспечивающих нормальное протекание большинства внутриклеточных процессов и обладающих протективными функциями, весьма значительна. Наряду с этим известно, что

БТШ обладают регулирующим действием на развитие программированной клеточной гибели, поэтому значимость функций БТШ в популяциях лимфоцитов связана также с важностью процессов апоптоза лимфоидных клеток для нормального функционирования иммунной системы.

Актуальность анализа вовлеченности БТШ в процессы, протекающие в лимфоидной ткани, связана не только с функциями внутриклеточного пула этих протеинов. В настоящее время существует много свидетельств о локализации БТШ на клеточной поверхности. Поверхностная локализация БТШ зарегистрирована, в частности, у инфицированных, трансформированных и апоптозных лимфоцитов. Было продемонстрировано, что БТШ, экспонирующиеся на клеточной поверхности, активируют цитотоксические эффекторы иммунной системы, т.е поверхностные БТШ могут являться для системы иммунологического надзора маркерами клеток, подлежащих элиминации. Причины и механизмы транслокации БТШ на клеточную поверхность пока не установлены, однако не вызывает сомнений, что появление в организме таких поверхностных протеинов вызывает реакцию иммунной системы, в частности лимфоидных клеток. Кроме этого, наряду с явлением необычной локализации БТШ на плазматической мембране, в настоящее время установлено, что во многих случаях БТШ могут находиться вне клеток в виде растворимого пула, попадающего в том числе и в кровоток. Вместе с тем известно, что экзогенные, внеклеточные БТШ способны взаимодействовать с клетками и проникать во внутриклеточное пространство. Причем, такие интерпализованные БТШ сохраняют свои протективные функции и защищают клетки от гибели. В связи с этим очевидно, что наряду с внутриклеточными и поверхностными БТШ, внеклеточная форма этих протеинов также может оказывать влияние на функционирование популяций лимфоидных клеток.

В настоящее время интенсивно изучается иммуномодулирующее действие экзогенных БТШ в связи с обнаружением у этих протеинов уникальных адъювантных и иммуностимулирующих свойств. Установлено, что один из механизмов данного эффекта БТШ связан с активацией антигенпредставляющих клеток. В то же время, анализ описанных эффектов БТШ указывает на то, что зарегистрированные иммуномодулирующие свойства экзогенных БТШ могут быть связаны с действием этих протеинов не только на антигенпредставляющие клетки, но и на популяции лимфоцитов.

Таким образом, накопленные в последнее время данные свидетельствуют о том, что молекулы БТШ участвуют во многих иммунных процессах, в том числе связанных с функционированием популяций лимфоидных клеток, и обладают при этом полифункциональной активностью. Однако в настоящее время эта тематика остается малоизученной. С целью расширения существующих представлений о функциях, выполняемых БТШ в лимфоидной ткани, и механизмах реализации данных функций в настоящей работе были проведены исследования вовлеченности БТШ в процессы, протекающие в популяциях лимфоцитов. Основное внимание уделялось одному из главных представителей большого семейства БТШ, протеину с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70).

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ вовлеченности БТШ в процессы активации и программированной гибели лимфоидных клеток, выявление поверхностного и внеклеточного пулов БТШ в культурах лимфоцитов и изучение взаимодействия этих протеинов с клетками иммунной системы.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. Проанализировать изменение уровня экспрессии БТШ70 в процессе активации лимфоцитов.

3. Провести сравнение содержания БТШ в живых и апоптозных лимфоидных клетках.

6. Изучить влияние физиологических медиаторов стресса - катехоламинов и глюкокортикоидов на уровень экспрессии БТШ70 лимфоидными клетками.

8. Охарактеризовать возможные функции внеклеточного пула БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые было продемонстрировано различие уровня экспрессии БТШ70 в популяциях лимфоидных клеток различной органной локализации. Обнаружено изменение уровня экспрессии БТШ70 в лимфоцитах под действием физиологических медиаторов стресса катехоламинов и глюкокортикоидов, а также охарактеризовано изменение этого уровня при воздействии на клетки различными стрессирующими факторами микроокружения. Разработан оригинальный цитофлуориметрический подход к анализу последовательных этапов апоптоза лимфоидных клеток, и с помощью данного подхода изучена взаимосвязь экспрессии БТШ70 с основными внутриклеточными событиями на разных стадиях развития программированной гибели лимфоцитов. Проанализирован процесс транслокации цитоплазматических БТШ70 на поверхность лимфоцитов. Наряду с перечисленными данными, характеризующими внутриклеточный и поверхностный пулы БТШ, были получены свидетельства о продукции БТШ70 в межклеточное пространство в культурах активированных Т-лимфоцитов и опухолевых лимфоидных клеток. Обнаружено парадоксальное влияние ингибиторов аппарат Гольджи зависимой секреции протеинов на экзоцитоз БТШ70 и их транслокацию на поверхность лимфоидных клеток, свидетельствующее о неклассическом пути транспорта и секреции этих протеинов. Впервые продемонстрировано взаимодействие внеклеточных экзогенных БТШ70 с лимфоцитами различного органного происхождения, заключающееся в адсорбции этих протеинов на клеточной поверхности и их последующей интернализации живыми клетками. Получены свидетельства о протективных свойствах внеклеточных БТШ70 в популяциях лимфоцитов.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Полученные результаты расширяют существующие представления о роли БТШ в функционировании иммунной системы. Высоким уровнем значимости для экспериментальной и клинической иммунологии обладают оригинальные данные о регулирующем действии адреналина и дексаметазона на интенсивность синтеза БТШ70 в популяции лимфоцитов. Зарегистрированные эффекты свидетельствуют о вовлеченности БТШ70 в механизмы нейроэндокринной регуляции иммунной системы. Весьма существенным для практической значимости данной работы является охарактеризованный процесс транслокации внутриклеточных БТШ на поверхность погибающих клеток и полученные свидетельства о выходе этих протеинов в межклеточное пространство. Эти результаты, вместе с существующими сведениями об участии БТШ в развитии целого ряда аутоиммунных патологий, могут лечь в основу создания новых подходов к диагностике и терапии различных иммунологических заболеваний. Значительный интерес для возможного практического применения имеют также полученные в работе данные о продукции БТШ70 активированными лимфоцитами в окружающую среду. Они указывают на один из возможных источников внеклеточного пула БТШ70, обладающих выраженным влиянием на развитие иммунных реакций. Можно предположить, что направленный контроль экзоцитоза БТШ70 лимфоидными клетками будет служить основой для разработки нового подхода к проблеме иммунорегуляции. Наряду с этим, охарактеризованное в работе взаимодействие экзогенных БТШ70 с лимфоидными клетками, может явиться основой для использования данных протеинов с целью направленной коррекции иммунного ответа.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Уровень экспрессии БТШ лимфоидными клетками зависит от их органной локализации и изменяется под действием активации лимфоцитов, физиологических медиаторов стресса и стрессирующих факторов микроокружения. По уровню содержания БТШ70 клетки разных лимфоидных органов различаются и характеризуются увеличением этого показателя в ряду тимус<селезенка<лимфатические узлы<костный мозг. Кон-А активация Т-лимфоцитов сопровождается усилением экспрессии БТШ70. Физиологические медиаторы стресса адреналин и глюкокортикоиды изменяют уровень экспрессии БТШ70 лимфоцитами, причем адреналин стимулирует синтез этих протеинов, а дексаметазон его ингибирует.

2. Процесс программированной гибели лимфоидных клеток сопровождается транслокацией цитоплазматических БТШ на клеточную поверхность. Клетки лимфомы EL-4 и КонА-активированные Т-лимфоциты, исходно экспрессирующие поверхностные БТШ, значительно усиливают уровень этой экспрессии в процессе апоптоза. Неактивированные лимфоциты, выделенные из разных лимфоидных органов, характеризуются присутствием БТШ только на поверхности клеток, погибших по программе апоптоза. Уровень экспрессии внутриклеточных и поверхностных БТШ70 различается для разных стадий клеточной гибели, достигая максимума на необратимом этапе апоптоза, характеризующемся деполяризацией митохондрий. Это свидетельствует об участии БТШ в реализации программы клеточной гибели на ее терминальных стадиях.

3. Клетки лимфомы EL-4 и КонА-активированные Т-лимфоциты продуцируют БТШ70 в межклеточное пространство. Об этом свидетельствует присутствие данных протеинов в супернатанте культур данных клеток. Продукция внеклеточного пула БТШ70 является активным процессом и не связана с возможной примесью в культуре разрушенных некротических клеток. Интенсивность экзоцитоза БТШ70 клетками EL-4, культивируемыми в стандартных условиях, равна примерно 5-10 мкг на 106 клеток за 24 часа. Пул внеклеточных БТШ70 содержит как конститутивную, так и индуцируемую форму этих протеинов.

4. Ингибиторы аппарат Гольджи зависимого пути секреции протеинов моненсин и брефелдин А не блокируют, а существенно усиливают транслокацию БТШ70 на клеточную поверхность и интенсивность экзоцитоза данных протеинов. Это свидетельствует о неклассическом, аппарат Гольджи независимом пути транспорта цитоплазматических БТШ70 из клеток. Механизм формирования внеклеточного пула БТШ70 может быть связан со сбрасыванием («шеддингом») этих протеинов с клеточной поверхности в окружающую среду и с продукцией лимфоидными клетками в межклеточное пространство экзосом.

5. Поверхностные и внеклеточные БТШ70 взаимодействуют с клетками иммунной системы. Об этом свидетельствует направленная реакция цитотоксических лимфоцитов на опухолевые клетки, экспонирующие на своей поверхности БТШ70, а также связывание и последующая интернализация экзогенных БТШ70 различными типами лимфоидных клеток. Интернализация внеклеточных БТШ70 защищает лимфоциты от спонтанного и индуцированного апоптоза и от стрессирующего воздействия дефицита аутокринных факторов. Активное взаимодействие внеклеточного пула БТШ70 с популяциями лимфоидных клеток является одним из механизмов иммуномодулирующего действия данных протеинов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации доложены на 10-м международном иммунологическом конгрессе (Дели, 1998), на шестом ежегодном конгрессе Британского иммунологического общества (Лондон, 1998), на 2, 4 и 5 конгрессах «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 1998, 2001, 2002), на чтениях, посвященных памяти Ю.А.Овчинникова (Москва, 1998, 2000, 2002), на международных иммунологических летних школах им. Дж. Хэмфри (Пущино, 1998, 2000, 2002), на научных конференциях "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003), на школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), на 11-ом международном иммунологическом конгрессе (Стокгольм, 2001), на школах-конференциях «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2001, 2002).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 44 научных работы.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзора литератур (главы 1-4), материалы и методы (глава 5), результаты исследований и их обсуждение (главы 6-11), выводы, список литературы. Работа изложена на 224 страницах машинописного текста, содержит 55 рисунков, 4 таблицы. Список литературы включает 257 источников, из которых 253 иностранных.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертационного исследования на тему "Функции белков теплового шока в популяциях лимфоидных клеток"

выводы

1. Уровень экспрессии БТШ70 лимфоцитами мыши характеризуется существенными индивидуальными различиями и зависит от органной локализации клеток; он увеличивается в ряду тимоциты<селезенка<лимфатические узлы<костный мозг.

3. Процесс программированной гибели лимфоидных клеток сопровождается усилением уровня экспрессии БТШ и транслокацией цитоплазматических БТШ на клеточную поверхность.

4. Транспорт БТШ70 на клеточную поверхность осуществляется неклассическим путем, в обход аппарата Гольджи.

5. Уровень экспрессии БТШ70 лимфоцитами изменяется под действием адреналина и дексаметазона; адреналин усиливает, а дексаметазон подавляет экспрессию этих протеинов.

6. Клетки лимфомы EL-4 и КонА-активированные Т-лимфоциты продуцируют БТШ70 в межклеточное пространство.

8. Внеклеточные БТШ70 интернализуются лимфоидными клетками и оказывают протективное действие, защищая эти клетки от апоптоза и стрессирующих факторов.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2003 года, Сапожников, Александр Михайлович

1. Петров Р.В. Иммунология. М., Медицина, 1982, 368 с.

2. Хаитов P.M., Лесков В.П. Иммунитет и стресс. Росс. Физиол. журнал им. Сеченова, 2001, т. 87, № 8, с. 1060-1072.

3. Луценко Г.В., Дьячкова Л.Г. Роль энергетического метаболизма клеток цитотоксической линии CTLL-2 в механизме контроля их выживания аутокринными факторами. Биол. Мембраны, 2003, т. 20, № 5, с. 402-409.

4. Сапожников A.M. Исследование связи иммуномодулирующих свойств поликатионов с параметрами их адсорбции на поверхности иммунокомпетентных клеток. М., Дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н., 1987, 129 с.

5. Alder G.M., Austen В.М., Bashford C.L., Mehlert A., Pasternak C.A. Heat shock proteins induce pores in membranes. Biosci. Rep., 1990, v. 10, N 6, p. 509518.

6. Ali A., Bharadwai S., O'Carroll R., Ovenek N. HSP90 interacts with and regulate the activity of heat shock factor 1 in Xenopus oocytes. Mol. Cell. Biol., 1998, v. 18, p. 4949-4960.

7. Altmeyer A., Maki R.G., Feldweg A.M., Heike M., Protopopov V.P., Masur S.K., Srivastava P.K. Tumor-specific cell surface expression of the KDEL containing, endoplasmic reticular heat shock protein gp96. Int. J. Cancer, 1996, v. 69, p. 340-349.

8. Anderson K., Cresswell P. A role of calnexin (IP90) in the assembly of class IIMHC molecules. EMBO J., 1994, v. 13, p. 675-682.

9. Anderton S.M., van der Zee R., Noordzij A., van Aden W. Differential mycobacterial 65-kDa heat shock protein T cell epitope recognition after adjuvant arthritis-inducing or protective immunization protocols. J. Immunol., 1994, v. 152, p. 3656.

10. Arata S., Hamaguchi S., Nose K. Effects of the overexpression of the small heat shock protein, HSP27, on the sensitivity of human fibroblast cells exposed to oxidative stress. J. Cell. Physiol., 1995, v. 163, p. 458.

11. Arispe N., De Maio A. ATP and ADP modulate a cation channel formed by Hsc70 in acidic phospholipid membranes. J. Biol. Chem., 2000, v. 275, N40, p. 30839-30843.

12. Arnold-Schild D., Hanau D., Spehner D., Schmid C., Rammensee H-G., de la Salle H., Schild H. Receptor-mediated Endocytosis of Heat-Shock Proteins by Professional Antigen-Presenting Cells. J. Immunol., 1999, v. 162, p. 3757-3760.

13. Asea A., Kabingu E., Stevenson M.A. et al. HSP70 peptide-bearing and peptide-negative preparations act as chaperokines. Cell Stress Chaperones, 2000, v. 5, N5, p. 425-431.

14. Basu S., Binger R., Ramalingam Т., Srivastava P. CD91 is a common receptor for heat shock protein gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin. Immunity, 2001, v. 14, p. 303-313.

15. Basu S., Srivastava P.K. Heat shock proteins: the fountainhead of innate and adaptive immune responses. Cell Stress Chaperones, 2000, v. 5, p. 443-451.

16. Basu S., Binder R.J., Suto R. et al. Necrotic but not apoptotic cell death releases heat shock proteins, wich deliver a maturation signal to dendritic cells and activate the NFkB pathway. Int. Immunol., 2000, v. 12, N 11, p. 1539-1546.

17. Beck S., De Maio A. Stabilization of protein synthesis in termotolerant cells during heat shock. Association of heat shock protein-72 with ribosomal subunits of polysomes. J. Biol. Chem., 1994, v. 269, p. 21803-21811.

18. Beck F.X., Grunbein R., Lugmayr K., Neuhofer W. Heat shock proteins and the cellular response to osmotic stress. Cell. Physiol. Biochem., 2000, v. 10, p. 303306.

19. Beere H.M. Stressed to death: regulation of apoptotic signaling pathways by heat shock proteins. Sci. STKE, 2001, N 93, RE1.

20. Beer H.M., Green D.R. Stress management heat shock protein-70 and the regulation of apoptosis. TRENDS Cell Biol., 2001, v. 11, p. 6-10.

21. Beere H., Wolf В., Cain K., Mosser D., Mahboubi A., Kuwana Т., Tailor P., Morimoto R., Cohen G., Green D. Heat shock protein 70 inhibits apoptosis by preventing recruitment of procaspase-9 to Apaf-1 apoptosome. Nat. Cell. Biol., 2000, v. 2, p. 469-475.

22. Beere H.M., Hickman J.A., Morimoto R.I., Parmar R., Newbould R., Waters C.M. Changes in hsc70 and c-myc in HL-60 cells engaging differentiation or apoptosis. Mol. Cell. Diff., 1993, v. 1, p. 323.

23. Benjamin I.J., McMillan D.R. Stress protein in cardiovascular system. Circ. Res., 1998, v. 83, p. 117-132.

24. Bharadwaj S., Ali A., Ovsenek N. Multiple components of the HSP90 chaperone complex function in regulation of heat shock factor 1 in vivo. Mol. Cell. Biol., 1999, v. 19, p. 8033-8041.

25. Binger R., Han D., Srivastava P. CD91: a receptor for heat shock protein gp96. Nat. Immunol., 2000, v. l,p. 151-155.

26. Blachere N.E., Srivastava P.K. Heat shock protein-based cancer vaccines and related thoughts on immunogenicity of human tumors. Semin. Cancer Biol., 1995, v. 6, N 6, p. 349-355.

27. Blachere N.E., Udono H., Janetzki S. et al. Heat shock protein vaccines against cancer. J. Immunother., 1993, v. 14, N 4, p. 352-356.

28. Bonnerot C., Marks M., Cosson P., Robertson E., Bikof E., Germain R., Bonifacino J. Association with Bip and aggregation of class II MHC molecules synthesized in the absence of invariant chain. EMBO J., 1994, v. 13, p. 934-944.

29. Breloer M., Fleischer В., Bonin A. In vivo and in vitro activation of T cells after administration of Ag-negative heat shock proteins. J. Immunol., 1999, v. 162, p. 3141.

30. Bruey J., Ducasse C., Bonniaud P., Ravagnan L., Susin S., Diaz-Latoud C., Gurbuxani S., Arrigo A., Kroemer G., Solary E., Garrido C. Hsp27 negatively regulates cell death by interacting with cytochrome C. Nat. Cell. Biol., 2000, v. 2, p. 645-652.

31. Bucher J. HSP90 and Co.-a holding for folding. TIBS, 1999, v. 24, p. 136141.

32. Buttke T.M., Sandstrom P.A. Oxidative stress as a mediator of apoptosis. Immunol. Today, 1994, v. 15, p. 7-10.

33. Buttyan R., Zakeri Z., Lockshin Q., Wolgemuth D. Cascade induction of c-fos, c-myc and heat shock protein 70 transcripts during regression of the rat ventral prostate gland. Mol. Endocrinol., 1988, v. 2, p. 650.

34. Buzzard K.A., Giaccia A.J., Killender M., Anderson R.L. Heat shock protein 72 modulates pathways of stress-induced apoptosis. J. Biol. Chem., 1998, v. 273, N 27, p. 17147-17153.

35. Chant I.D., Rose P.E., Morris A.G. Susceptibility of AML cells to in vitro apoptosis correlates with heat shock protein 70 (HSP70) expression. British J. Haematol., 1996, v. 93, p. 898-902.

36. Chen D., Androlewicz M. Heat shock protein 70 moderately enhances peptide binding and transport by the transporter associated with antigen processing. Immunol. Lett., 2001, v. 75, p. 143-148.

37. Cleary M.L., Smith S.D., Sklar J. Cloning and structural analysis of cDNAs for bcl-2 and a hybrid bcl-2/immunoglobulin transcript resulting from the t( 14; 18) translocation. Cell, 1986, v. 47, p. 19.

38. Cohen D.M., Wasserman J.C., Gullans S.R. Immediate early gene and HSP70 expression in hyperosmotic stress in MDCK cells. Am. J. Physiol., 1991, v. 261, p. C594-C601.

39. Cohen G.M. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem. J., 1997, v. 326 (Pt l),p. 1-16.

40. Cowley B.D., Muessel M.J., Douglass D., Wilkins W. In vivo and in vitro osmotic regulation of HSP-70 and prostaglandin synthasegene expression in kidney cells. Am. J. Physiol., 1995, v. 269, p. F854-F862.

41. Craig E.A., Weissman J.S., Horwich A.L. Heat shock proteins and molecular chaperones: mediators of protein conformation and turnover in the cell. Cell, 1994, v. 78, p. 365-372.

42. Creagh E., Cotter T. Selective protection by Hsp 70 against cytotoxic drug-but not Fas-induced T-cell apoptosis. Immunology, 1999, v. 97, p. 36-44.

43. Dardalhon V., Geminard C., Reggio H., Vidal M., Sainte-Marie J. Fractionation analysis of the endosomal compartment during rat reticulocyte maturation. Cell Biol. Int., 2002, v. 26, N 8, p. 669-678.

44. Darzynkiewicz Z., Bruno S., Del Bino G. et all. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry, 1992, v. 13, N 8, p. 795-808.

45. Decker Т., Lohmann-Matthes M.L. A quick and simple method for the quantitation of lactate dehydrogenase release in measurements of cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor (TNF) activity. J. Immunol. Methods, 1988, v. 115,N l,p. 61-69.

46. Del Giudice G. Hsp70: a carrier molecule with built-in adjuvanticity. Experientia, 1994, v. 50, N 11-12, p. 1061-1066.

47. Demand J. et al. The carboxy-terminal domain of Hsc70 provides binding sites for a distinct set of chaperone cofactors. Mol. Cell. Biol., 1998, v. 18, p. 20232028.

48. Der S.D., Yang Y.L., Weissmann C., Williams B.R. A double-stranded RNA-activated protein kinase-dependent pathway mediating stress-induced apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, p. 3279-3283.

49. Dimmeler S. et al. Suppretion of apoptosis by nitic oxide via inhibition of IL-lbetta-converting enzime (ICE)-like and cystein protease protein (CPP)-32 like proteases. J. Exp. Med., 1997, v. 185, N 4, p. 601.

50. Dinter A., Berger E.G. Golgi-disturbing agents. Histochem. Cell Biol., 1998, v. 109, N5-6, p. 571-590.

51. Drexler H. C. A. Activation of the cell death program by inhibition of proteasome function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, p. 855-860.

52. Dukan S., Farewell A., Ballesteros M., Taddei F., Radman M., Nystrom T. Protein oxidation in response to increased transcriptional or translational errors. PNAS, 2000, v. 97, p. 5746-5749.

53. Eden W., Ruurd Z., Paul A.G.A., Prakken B.J., Wendling U., Anderton, S.M., Wauben H.M. Do heat shock proteins control the balance of T-cell regulation in inflammatory diseases? Immunol. Today, 1998, v. 19, p. 303.

54. Ellis J. Proteins as molecular chaperones. Nature, 1987, v. 328, p. 378-379.

55. Erkeller-Yeksel F., Isenberg D., Dhillon V., Latchman D., Lydyard P. Surface expression of heat shock protein 90 by blood mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus. J. Autoimmun., 1992, v. 5, p. 803-814.

56. Ernani F., Teale J. Release of stress proteins from Mesocestoides corti is a brefeldin-A inhibitable process: evidence for active export of stress proteins. Infect. Immunol., 1993, v. 61, p. 2596-2601.

57. Fadok V.A., Voelker D.R., Capbell P.A., Cohen J.J., Bratton D.L., Henson P.M. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J. Immunol., 1992, v. 148, p. 2207.

58. Feder M.E., Hofmann G.E. Heat-shock proteins, molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology. Annu. Rev. Physiol., 1999, v. 61, p. 243-282.

59. Fenteany G., Standaert R.F., Lane W.S., Choi S., Corey E.J., Schreiber S.L. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification lactacystin. Science, 1995, v. 268, p. 726.

60. Ferranini M., Heltai S., Zocchi M.R., Rugarli C. Unusial expression and localization of heat shock proteins. Int. J. Cancer, 1992, v. 51, p. 613.

61. Ferrero R., Thiberge J-M., Kansau I., Wuscher N., Huerre M., Labigne A. The groES homolog of Helicobacter pylori confers protective immunity against mucosal infection in mice. PNAS, 1995, v. 92, p. 6499-6503.

62. Fillipovich I., Sorokina N., Khanna K.K., Lavin M.F. Biochem. Biophis. Res. Commun., 1994, v. 198, N 1, p. 257.

63. Finkel Т., Holbrook N. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature, 2000, v. 408, p. 239-247.

64. Freedman M., Buu N., Ruijs Т., Williams K., Antel J. Differential expression of heat shock proteins by human glial cells. J. Neuroimmunol., 1992, v. 41, p. 231238.

65. Fujihara S., Nadler S. Intranuclear targeted delivery of functional NF-kB by 70kDa heat shock protein. EMBO J., 1999, v. 18, N 2, p. 411-419.

66. Gabai V., Meriin A., Mosser D., Caron A., Rits S., Shifrin V., Sherman M. HSP 70 prevents activation of stress kinases. A novel pathway of cellular thermotolerance. J. Biol. Chem., 1997, v. 272, N 29, p. 18033-18037.

67. Gabai V.L., Zamulaeva I.V., Mosin A.F., Makarova Y.M., Mosina V.A., Budagova K.R., Malutina Y.V., Kabakov A.E. Resistance of Ehrlich tumor cells to apoptosis can be due to accumulation of heat shock proteins. FEBS Letters, 1995, v. 375, p. 21-26.

68. Garrido C., Gurbuxani S., Ravagnan L., Kroemer G. Heat shock proteins: endogenous modulators of apoptotic cell death. Biochem. Biophis. Res. Commun., 2001, v. 286, p. 433-442.

69. Gordon S., Hoffman R., Simmons R. Induction of Heat Shock Protein 70 protects Thymocytes Against Radiation-Induced Apoptosis. Arch. Surg., 1997, v. 132, p. 1277-1282.

70. Gorman A.M., Heavey В., Creagh E., Cotter T.G., Samali A. Antioxidant-mediated inhibition of the heat shock response leads to apoptosis. FEBS Lett., 1999, v. 445, p. 98-102.

71. Guidon P.T., Hightower L.E. Purification and initial characterization of the 71-kilodalton rat heat-shock protein and its cognate as fatty acid binding proteins. Biochemistry, 1986, v. 25, p. 3231-3239.

72. Guppy M, Greiner E, Brand K. The role of the Crabtree effect and an endogenous fuel in the energy metabolism of resting and proliferating thymocytes. Eur. J. Biochem., 1993, v. 212, N 1, p. 95-99.

73. Guzhova I., Kislyakova K., Moskaliova O. et al. In vitro studies show that Hsp70 can be released by glia and that exogenous Hsp70 can enhance neuronal stress tolerance. Brain Res., 2001, v. 914, N 1-2, p. 66-73.

74. Hantschel M., Pfister K., Jordan A. et al. Hsp70 plasma membrane expression on primary tumor biopsy material and bone marrow of leukemic patients. Cell Stress Chaperones, 2000, v. 5, N 5, p. 438-442.

75. Harada M., Kimura G., Nomoto K. Heat shock proteins and the antitumor T cell response. Biotherapy, 1998, v. 10, N 3, p. 229-235.

76. Hartl F. Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature, 1996, v. 381, p. 571-579.

77. Haunstetter A., Izumo S. Apoptosis. Basic mechanisms and implications for cardiovascular disease. Circ. Res., 1998, v. 82, p. 1111.

78. He L., Fox M.H. Variation of heat shock protein 70 through the cell cycle in HL-60 cells and its relationship to apoptosis. Exp. Cell Res., 1997, v. 232, p. 64.

79. Hightower L., Guidon P. Selective release from cultured mammalian cells of heat -shock (stress) proteins that resemble glia-axon transfer proteins. J. Cell Physiol., 1989, v. 138, N 2, p. 257-266.

80. Hightower L.E., Hendershot L.M. Molecular chaperones and the heat shock response at Cold Spring Harbor. Cell Stress Chaperones, 1997, v. 2, N 1, p. 1-11.

81. Hiromatsu K., Yoshikai Y., Matsuzaki G., Ohga S., Muramatori K., Matsumoto K., Bluestone J., Nomoto K. A protective role of y5 T cells in primary infection with Listeria monocytogenes in mice. J. Exp. Med., 1992, v. 175, p. 49-56.

82. Hochstrasser M. Ubiquitin, proteasomes, and the regulation of intracellular protein degradation. Curr. Opinion Cell Biol., 1995, v. 7, p. 215.

83. Hockenbery D.M., Oltvai Z.N., Yin X.M., Milliman C.L., Korsmayer S.J. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis. Cell, 1993, v. 75, p. 241251.

84. Hoeger P., Tepper M., Faith A., Higgins J., Lamb J., Geha R. Immunosupressant deoxyspergualin inhibits antigen processing in monocytes. J. Immunol., 1994, v. 153, p. 3908-3916.

85. Houenou L., Li L., Kent C., Tytel M. Exogenous heat shock cognate protein Hsc70 prevents axotomy-induced death of spinal sensory neurons. Cell Stress Chaperones, 1996, v. l,p. 161-166.

86. Hurst N.P. Stress (heat shock ) proteins and rheumatic disease. New advance or just another band wagon? Rheumatol. Int., 1990, v. 9, N 6, p. 271-276.

87. Ichijo H. at al. Induction of apoptosis by ASK1, a mammalian MAPKKK that activates SAPK/JNK and p38 signaling pathways. Science, 1992, v. 257, p. 90.

88. Imani F., Soloski M. Heat shock proteins can regulate expression of the Tla region-encoded class lb molecule Qa-1. PNAS, 1991, v. 88, p. 10475-10479.

89. Jaatela M. Heat shock proteins as cellular lifeguards. Ann. Med., 1999, v. 32, p. 261-271.

90. Jaattela M., Wissing D., Kokholm K., Kallunki Т., Egeblad M. Hsp70 exerts its anti-apoptotic function downstream of caspase-3-like proteases. EMBO J., 1998, v. 17, N21, p. 6124-6134.

91. Jin Т., Gu Y., Zanusso G., Sy M., Kumar A., Cohen M.,Gambetti P., Singh N. The chaperone protein BiP binds to a mutant prion protein and mediates its degradation by the proteasome. J. Biol. Chem., 2000, v. 275, p. 38699-38704.

92. Jolly C., Morimoto R. Role of heat shock response and molecular chaperones in oncogenesis and cell death. J. Natl. Cancer Inst., 2000, v. 92, p. 1564-1572.

93. Johnson T.M., Yu Z.X., Ferrans V.J., Lowenstein R.A., Finkel T. Reactive oxygen species are downstream mediators of p53-dependent apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v. 93, N 21, p. 11848-11852.

94. Jurivich D.A., Sistonen L., Kroes R.A., Morimoto R.I. Effect of sodium salicylate on the human heat shock. Science, 1992, v. 255, p. 1243-1245.

95. Kanei-Ishii C., Tanikawa J., Nakai A., Morimoto R.I., Ishii S. Activation of heat shock factor 3 by c-Myb in the absence of cellular stress. Science, 1997, v. 277, p. 246-248.

96. Katon S, Mitsue Y, Kitani K, Suzuki T. Hyperoxia induces the neuronal differentiated phenotype of PC 12 cells via a sustained activity of mitigen-activated protein kinase induced by Bcl-2. Biochem. J., 1999, v. 338, p. 465-470.

97. Kaufmann S. Heat shock proteins and the immune response. Immunol. Today,1990, v. 11, p. 129-136.

98. Kaufmann S., Vath U., Thole J., van Embden J., Emmrich F. Enumeration of T-cells reactive with Mycobacterium tuberculosis organisms and specific for recombinant mycobacterial 64-kDa protein. Eur. J. Immunol., 1987, v. 17, p. 351357.

99. Kerr J.F., Wyllie A.H., Curric A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer, 1972, v. 26, p. 239257.

100. Keyse S., Tyrell R. Heme oxygenase is the major 32-kDa stress protein induced in human skin fibroblasts by UVA radiation, hydrogen peroxide and sodium arsenite. PNAS, 1989, v. 86, p. 99-103.

101. Kim D., Li G. Proteasome inhibitors lactacystin and MG132 inhibit the dephosphorylation of HSF1 after heat shock and suppress thermal induction of heat shock gene expression. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, v. 264, p. 352-358.

102. Kim J., Nueda A., Meng Y.H., Dynan W.S., Mivechi N.F. Analysis of phosphorilation of human heat shock transcription factor-1 by MAP kinase family members. J. Cell Biochem., 1997, v. 67, N 1, p. 43-54.

103. Knight C.R., Rees R.C., Griffin M. Apoptosis: a potential role for cytosolic transglutaminase and its importance in tumour progression. Biochim. Biophys. Acta,1991, v. 1096, p. 312-318.

104. Kol A., Lichtman A.H., Finberg R.W., Libby P., Kurt-Jones E.A. Heat shock protein (HSP) 60 activates the innate immune response: CD 14 is an essential receptor for HSP60 activation of mononuclear cells. J. Immunol., 2000, v. 164, p. 13-17.

105. Kroemer G., Zamzami, Susin A. Mitochondrial control of apoptosis. Immunol. Today, 1997, v. 18, N 1, p. 44.

106. Kyriakis J. M., Avruch J. Sounding the alarm: protein kinase cascades activated by stress andinflammation. J. Biol. Chem., 1996, v. 271, p. 24314.

107. Lactose A., De Cian M.C., Cueff A., Poulet S.A. Noradrenaline and alpha-adrenergic signaling induce the hsp70 gene promoter in mollusc immune cells. J. Cell Sci., 2001, v. 114, p. 3557-3564.

108. Lammert E., Arnold D., Nijenhuis M., Momburg F., Hammerling G., Brunner J., Stefanovic S., Rammensee H., Schild H. The endoplasmic reticulum-resident stress protein gp96 binds peptides translocated by TAP. Eur. J. Immunol., 1997, v. 27, p. 923-927.

109. Lang F., Busch G.L., Ritter M., Volkl H., Waldegger S., Gulbins E., Haussinger D. Functional significance of cell volume regulatory mechanisms. Physiol. Rev., 1998, v. 78, p. 247-306.

110. Leppa S., Pirkkala L., Chow S.C., Eriksson I.E., Sistonen L. Thioredoxin is transcriptionally induced upon activation of heat shock factor 2. J. Biol. Chem., 1997, v. 272, p. 30400-30404.

111. Li.Z., Menoret A., Srivastava P. Roles of heat shock proteins in antigen presentation and cross-presentation. Curr. Opinion Immunol., 2002, v. 14, p. 45-51.

112. Liossis S.N.C., Ding X.Z., Kiang J.G., Tsokos G.C. Overexpression of the heat shock protein 70 enhances the TCR/CD3- and Fas/Apo-l/CD95-mediated apoptotic cell death in Jurkat T cells. J. Immunol., 1997, v. 158, p. 5668-5675.

113. Lussow A.R., Barrios C., van Embden J. et al. Mycobacterial heat-shock proteins as carrier molecules, ur. J. Immunol., 1991, v. 21, N 10, p. 2297-2302.

114. Lutz N. The heat shock response of eukaryotic cells, iol. Zbl., 1984, v. 103, p. 357-435.

115. Lynch M.P. Evidence for soluble factors regulating cell death and cell proliferation in primary cultures of rabbit endometrial cells grown on collagen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, v. 83, p. 4784.

116. Mamelak D., Lingwood C. Expression and sulfogalactolipid binding specificity of the recombinant testis-specific cognate heat shock protein 70. Glycoconjugate J., 1997, v. 14, p. 715-722.

117. Marini M., Frabetti F., Franceschi C. Oxygen radicals induse stress protein and tolerance to oxidative stress in human lymphocytes. Int. J. Radiant. Biol., 1996, v. 70, N 3, p. 337-350.

118. Martin J., Ulrich F. Chaperon-assisted protein folding. Curr. Opinion Stuct. Biol., 1997, v. 7, p. 41-52.

119. Mathew A., Bell A., Johnstone R.M. Hsp-70 is closely associated with the transferrin receptor in exosomes from maturing reticulocytes. Biochem. J., 1995, v. 308 (Pt 3), p. 823-830.

120. Mathew A., Mathur S., Morimoto R. Heat shock response and protein degradation: regulation of HSF2 by the ubiquitin-proteasome pathway. Moll. Cell. Biol., 1998, v. 18, p. 5091-5098.

121. McCoubrey W.K., Huang T.J., Maines M.D. Isolation and characterization of cDNA from the rat brain that encodes hemoprotein heme oxigenase-3. Eur. J. Biochem., 1997, v. 247, p. 725-732.

122. McLennan N., Masters M. GroE is vital for cell-wall synthesis. Nature, 1998, v. 392, p. 139.

123. McMillan D.R., Xiao X., Shao L., Graves K., Beniamin M. Targeted disruption of heat shock transcription factor 1 abolishes thermotolerance and protection against heat-inducible apoptosis. J. Biol. Chem., 1998, v. 273, p. 75237528.

124. Mehlen P., Schulze-Osthoff K., Arrido A.P. Small stress proteins as novel regulators of apoptosis. J. Biol.Chem., 1996, v. 271, p. 16510.

125. Melnick J., Argon Y. Molecular chaperones and the biosynthesis of antigen receptors. Immunol. Today, 1995, v. 16, p. 243-250.

126. Menoret A., Chandawarkar R. Heat-shock protein-based immunotherapy: an idea whose time has come. Semin. Oncol., 1998, v. 25, p. 654-660.

127. Mizzen L. Immune responses to stress proteins: applications to infectious disease and cancer. Biotherapy, 1998, v. 10, p. 173-189.

128. Molotkovskaya I.M., Kholodenko R.V., Molotkovsky Ju.G. Influence of gangliosides on the IL-2- and IL-4-dependent cell proliferation. Neurochem. Sci., 2002, v. 27, p. 761-770.

129. Monney L., Otter I., Olivier R., Ozer H.L., Haas A.L., Omura S., Borner C. Defects in the ubiquitin pathway induce caspase-independent apoptosis blocked by bcl-2. J. Biol. Chem., 1998, v. 273, N 11, p. 6121.

130. Moorman J.P., Bobak D.A., Hahn C.S. Inactivation of the small GTP binding protein Rho induces multinucleate cell formation and apoptosis in murine lymphoma EL4. Immunol., 1996, v. 156, p. 4146.

131. Morimoto R.I. Regulation of the heat shock transcriptional response: cross talk between a family of heat shock factors, molecular chaperones, and negative regulators. Gen. Dev., 1998, v. 12, p. 3788-3796.

132. Morimoto R.I., Tissiers A., Georgopoulos C. (eds). The biology of heat shock response and molecular chaperones. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994, NY.

133. Mosser D., Caron A., Bourget L., Denis-Larose C., Massie B. Role of the human heat shock protein HSP70 in protection against stress-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol., 1997, v. 17, p. 5317-5327.

134. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods, 1983, v. 65, N 1-2, p. 55-63.

135. Multhoff G. Heat shock protein 72 (HSP72), a hyperthermia-inducible immunogenic determinant on leukemic K562 and Ewing's sarcoma cells. Int. J. Hyperthermia, 1997, v. 13, p. 39.

136. Multhoff G., Botzler C., Wiesnet M., Eissner G., Issels R. CD3- large granular lymphocytes recognize a heat-inducible immunogenic determinant associated with the 72-kD heat shock protein on human sarcoma cells. Blood, 1995, v. 86, p. 1374.

137. Multhoff G., Botzler C., Issels R. The role of heat shock proteins in the stimulation of an immune response. Biol. Chem., 1998, v. 379, p. 295-300.

138. Multhoff G., Botzler C., Jennen L., Schmidt J., Ellwart J., Issels R. Heat shock protein 72 on tumor cells: a recognition structure for natural killer cells. J. Immunol., 1997, v. 158, p. 4341-4350.

139. Multhoff G., Hightower L. Cell surface expression of heat shock proteins and immune response. Cell stress chaperones, 1996, v. 1, N 3, p. 167-176.

140. Munk M., Schoel В., Modrow S., Karr R., Youhg R., Kaufmann S. T lymphocytes from healthy individuals with specificity to self epitopes shared by the mycobacterial and human 65-kilodalton heat shock protein. J. Immunol., 1989, v. 143, p. 2844-2849.

141. Negulyaev Y.A., Vedernikova E.A., Kinev A.V., Voronin A.P. Exogenous heat shock protein hsp70 activates potassium channels in U937 cells. Biochim. Biophys. Acta, 1996, v. 1282, N 1, p. 156-162.

142. Nishina H., Fischer K.D., Radvanyi L., Shahinian A., Hakern R., Rubie E.A., Bernstein A., Мак T.W., Woodgett J.R., Penninger J.M. Stress-signalling kinase Sekl protects thymocytes from apoptosis mediated by CD95 and CD3. Nature, 1997, v. 385, p. 350.

143. Nobel C.S.I., Burgess D.H., Zhivotovsky В., Burkitt M., Orrenius S„ Slater A.F.G. Disulfiram is a potent inhibitor of proteases of the caspase family. Chem. Res. Toxicol., 1997, v. 10, p. 636.

144. Noll A., Roggenkamp A., Heeseman J., Autenreith I. Protective role for heat shock protein-reactive apTcells in murine yersiniosis. Infect. Immun., 1994, v. 62, p. 2784-2791.

145. Nosseri C., Coppola S., Ghibelli L. Possible involvement of poly(ADF-ribosyl) polymerase in triggering stress-induced apoptosis. Exp. Cell Res., 1994, v. 212, p. 367-373.

146. Ohmori H. Development of a serum-free medium for in vitro immune responses by using beta-cyclodextrin. Demonstration of the requirements for polyamines. J. Immunol. Methods, 1988, v. 112, N 2, p. 227-233.

147. Ohtsuka K., Suzuki T. Roles of molecular chaperones in the nervous system. Brain Res. Bull., 2000, v. 53, p. 141-146.

148. Okada Y. Volume expansion-sensing outward-rectifier CI- channel: fresh start to themolecular identity and volume sensor. Am. J. Physiol., 1997, v. 273, p. C755-C789.

149. Ortmann В., Androlewicz M., Cresswell P. МНС class I/p2 microglobulin complexes associate with the TAP transporter before peptide binding. Nature, 1994, v. 368, p. 864-867.

150. Parsell D.A., Lindquist S. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins. Annu. Rev. Genet., 1993, v. 27, p. 437-496.

151. Perraut R., Lussow A.R., Gavoille S. et al. Successful primate immunization with peptides conjugated to purified proteinderivative or mycobacterial heat shock proteins in the absence of adjuvants. Clin. Exp. Immunol., 1993, v. 93, N 3, p. 382386.

152. Poccia F., Piselli P., Vendetti S., Bach S., Amendola A., Placido R., Colizzi V. Heat-shock protein expression on membrane of T cells undergoing apoptosis. Immunology, 1996, v. 88, p. 6-12.

153. Pockley A.G., Shepherd J., Corton J.M. Detection of heat shock protein 70 (HSP70) and anti-HSP70 antibodies in the serum of normal individuals. Immunol. Inevst., 1998, v. 27, p. 367-377.

154. Polla B.S., Kantengowa S., Franois D., Salvioli S., Franceschi C., Marsac C., Cossarizza A. Mitochondria are selective targets for the protective effects of heat shock against oxidative injury. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v. 93, p. 64586469.

155. Przepiorka D., Srivastava P.K. Heat shock protein—peptide complexes as immunotherapy for human cancer. Mol. Med Today, 1998, v. 4, N 11, p. 478-484.

156. RaffM.C. Social controls on cell survival and cell death. Nature, 1992, v. 356, p. 397-400.

157. Rallu M. Loones M., Lallemand Y., Morimoto R., Morange M., Mezger V. Function and regulation of heat shock factor 2 during mouse embryogenesis. PNAS, 1997, v. 94, p. 2392-2397.

158. Richter C., Schweizer M., Cossarizza A., Franceschi C. Control of apoptosis by cellular ATP level. FEBS Lett., 1996, v. 378, N 2, p. 107-110.

159. Ritossa FA new puffing pattern indused by heat shock and DNA in Drosophila. Experientia, 1962, v. 18, p. 571-573.

160. Roman E., Moreno C. Synthetic peptides non-covalently bound to bacterial hsp70 elicit peptide-specific T-cell responses in vivo. Immunology, 1996, v. 88, N 4, p. 487-492.

161. Roman E., Moreno C. Delayed-type hypersensitivity elicited by synthetic peptides complexed with Mycobacterium tuberculosis hsp 70. Immunology, 1997, v. 90, p. 52-56.

162. Saleh A., Srinivasula S., Balkir L., Robbins P., Alnemri.E. Negative regulation of Apaf-1 apoptosome by Hsp70. Nat. Cell. Biol., 2000, v. 2, p. 476-483.

163. Slater A.F., Stefan C., Nobel I., van den Dobbelsteen D.J., Orrenius S. Signalling mechanisms and oxidative stress in apoptosis. Toxicol. Lett., 1995, v. 8283, p. 149-153.

164. Samali A., Cotter T.G. Heat shock proteins increase resistance to apoptosis. Exp. Cell Res., 1996, v. 223, p. 163-170.

165. Samali A., Cai J., Zhivotovsky В., Jones D.P., Orrenius S. Presence of pre-apoptotic complex of pro-caspase-3, HSP60 and HSP 10 in the mitochondrial fraction of Jurkat cells. EMBO J., 1999, v. 18, N 8, p. 2040.

166. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. "Molecular Cloning. A Laboratory Manual." 1989, Cold Spring Harbor, NY.

167. Sandstrom P.A. et al. Inhibition of activation-indused death in T cell hybridomas by thiol antioxidants: oxidative stress as a mediator of apoptosis. J. Leukoc. Biol., 1994, v. 55, p. 221.

168. Santoro M. Heat shock factors and the control of the stress response. Biochem. Pharmacol., 2000, v. 59, p. 55-63.

169. Sarzotti M., Baron S., Klimpel G.R. EL-4 metastases in spleen and bone marrow suppress the NK activity generated in these organs. Int. J. Cancer., 1987, v. 39, N 1, p. 118-125.

170. Sato S., Fujita N., Tsuruo T. Modulation of Akt kinase activity by binding to Hsp90. PNAS, 2000, v. 97, p. 10832-10837.

171. Scaffidi C., Schmitz I., Krammer P.H., Peter M.E. The role of c-FLIP in modulation of CD95-induced apoptosis. J. Biol. Chem., 1999, v. 274, p. 1541.

172. Schendel S.L., Xie Z., Montal M.O., Matsuyama S., Montal M., Reed J.C. Channel formation by antiapoptotic protein Bcl-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, p. 5113-5118.

173. Schild H., Arnold-Schild D., Lammert E., Rammensee H.G. Stress proteins and immunity mediated by cytotoxic T lymphocytes. Curr. Opin. Immunol., 1999, v. 11, p. 109-113.

174. Schirmbeck R., Reimann J. Peptide transporter-independent stress protein-mediated endosomal processing of endogenous protein antigens for major histocompatibility complex class I presentation. Eur. J. Immunol., 1994, v. 24, p. 1478-1486.

175. Schlesinger M. Heat shock proteins. J. Biol. Chem., 1990, v. 265, p. 1211112114.

176. Schoenberger S., van der Voort E., Krietemeijer G., Offringa R., Melief C., Toes R. Cross priming of CTL responses in vivo does not require antigenic peptides in the endoplasmic reticulum of immunizing cells. J. Immunol., 1998, v. 161, p. 3808-3812.

177. Seaton T.A., Cooper J.M., Schapira A.H. Free radical scavengers protect dopaminergic cell lines from apoptosis induced by complex I inhibitors. Brain Res., 1997, v. 777, p. 110.

178. Shi Y., Mosser D., Morimoto R. Molecular chaperones as HSF1-specific transcriptional repressors. Genes Dev., 1998, v. 12, p. 654-666.

179. Shinnick T. Heat shock proteins as antigens of bacterial and parasitic pathogens. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1991, v. 167, p. 145-160.

180. Slater A.F. et al. Nitrone spin traps and nitroxide antioxidant inhibit a common pathway of thymocyte apoptosis. Biochem. J., 1995, v. 306, p. 771.

181. Smith D.F., Whitesell L., Katsanis E. Molecular chaperones: biology and prospects for pharmacological intervention. Pharm. Rev., 1998, v. 50, N 4, p. 493513.

182. Solursh M. Formation of cartilage tissue in vitro. J. Cell Biochem., 1991, v. 45, N3, p. 258-260.

183. Srivastava P. Heat shock proteins in immune response to cancer: the fourth paradigm. Experientia, 1994, v. 50, p. 1054-1060.

184. Srivastava P. Roles of heat-shock proteins in innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol., 2002, v. 2, p. 185-194.

185. Srivastava P.K., Udono H. Heat shock protein-peptide complexes in cancer immunotherapy. Curr. Opin. Immunol., 1994, v. 6, N 5, p. 728-732.

186. Steinhoff U., Zugel U., Hengel H., Rosch R., Munk M., Kaufmann S.H. Prevention of autoimmune lysis by T cells with specificity for a heat shock protein by anti-sense oligonucleotide treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, v. 91, p. 5085-5088.

187. Suto R., Srivastava P. A mechanism of a specific immunogenicity of heat shock protein-chaperoned peptides. Science, 1995, v. 269, p. 1585-1588.

188. Suzue K., Young R. Adjuvant-free hsp70 fusion protein system elicits humoral and cellular immune responses to HIV-1 p24. J. Immunol., 1996, v. 156, p. 873-879.

189. Suzue K., Young R.A. Heat shock proteins as immunological carriers and vaccines. EXS., 1996, v. 77, p. 451-465.

190. Suzuki Y.J. et al. Oxidant as stimuli of signal transduction. Free Radical Biol. Med., 1997, v. 22, N 1-2, p. 269.

191. Swat W., Ignatowicz L., von Boehmer H., Kisielow P. Clonal deletion of immature CD4+8+ thymocytes in suspension culture by extrathymic antigen-presenting cells. Nature, 1991, v. 351, p. 150-153.

192. Tavaria M., Gabriele Т., Kola I., Anderson R.L. A hitchhiker's guide to the human HSP70 family. Cell Stress Chaperones, 1996, v. 1, p. 23-28.

193. Taylor D., Badiani P., Weston K. A dominant interfering Myb mutant causes apoptosis in T cells. Genes Dev., 1996, v. 10, N 21, p. 2732.

194. Telford W.G., King L.E., Fraker, P.J. Rapid quantitation of apoptosis in pure and heterogeneous cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Meth., 1994, v. 172, p. 1-16.

195. Terlecky S. Hsp70 and lysosomal proteolysis. Experientia, 1994, v. 50, p. 1021-1025.

196. Testi R. Sphingomyelin breakdown and cell fate. Trends Biochem. Sci., 1996, v. 21, p. 468.

197. Tissieres A., Mitchell N.K., Tracy U.M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila Melanogaster: relation of chromosome puffs. J. Mol. Biol., 1974, v. 84, p. 389-398.

198. Vanbuskirk A., Crump В., Margoliash E., Pierce S. A peptide binding protein having a role in antigen presentation is a member of the hsp70 heat shock family. J. Exp. Med., 1989, v. 170, p. 1799-1809.

199. Verbeke P., Fonager J., Clark В., Rattan S. Heat shock response and aging: mechanisms and applications. Cell Biol. Int., 2001, v. 25, N 9, p. 845-857.

200. Verheij M., et al. Requirement for ceramide-initiated SAPK/JNK signalling in stress-induced apoptosis. Nature, 1996, v. 380, p. 75.

201. Vigh L., Maresca В., Harwood J.L. Does the membrane's physical state control the expression of heat shock and other genes? TIBS, 1998, v. 23, p. 369-374.

202. Wadekar S.A., Li D., Periyasamy S., Sanchez E.R. Inhibition of heat shock transcription factor by GR. Mol. Endocrinol., 2001, v. 15, p. 1396-1410.

203. Wand-Wurttenberger A., Schoel В., Ivanyi J., Kaufmann S. Surface expression by mononuclear phagocytes of an epitope shared with mycobacterial heat shock protein 60. Eur. J. Immunol., 1991, v. 21, p. 1089-1092.

204. Wang J. F et al. Decreased production of reactive oxygen intermediates is an early event during in vitro apoptosis of rat thymocytes. Free Radical Biol. Med., 1996, v. 20, N 4, p. 533.

205. Wang X.Y., Kazim L., Repasky E.A. et al. Characterization of Heat Shock Protein 110 and Glucose-Regulated Protein 170 as Cancer Vaccines and the Effect of Fever-Range Hyperthermia on Vaccine Activity. J. Immunol., 2001, v. 166, N 1, p. 490-497.

206. Wei Y., Zhao X., Kariya Y., Teshigawara K., Uchida A. Inhibition of proliferation and induction of apoptosis by abrogation of heat-shock protein (HSP) 70 expression in tumor cells. Cancer Immunol. Immunother, 1995, v. 40, p. 73-78.

207. Welch W.J., Feramisco J.R. Disruption of the three cytoskeletal networks in mammalian cells does not affect transcription, translation, or protein translocation changes induced by heat shock. Mol. Cell Biol., 1985, v. 5, N7, p. 1571-1581.

208. Welch W.J. Mammalian stress response: cell physiology, structure/ function of stress proteins, and implications for medicine and disease. Physiol. Rev., 1992, v. 72, N4, p. 1063-1081.

209. Wells A., Rai S., Salvato M., Band H., Malkovsky M. Hsp72-mediated augmentation of MHC class I surface expression and endogenous antigen presentation. Int. Immunol., 1998, v. 10, p. 609-617.

210. White F. The synthesis and possible transport of specific proteins by cells associated with brain capillaries. J. Neurochem., 1980, v. 35, p. 88-94.

211. Wu Y., Lee L., Rollins D., Ching W. Heat shock- and alkaline pH-induced proteins of Campylobacter jejuni: characterization and immunological properties. Infect. Immunol., 1994, v. 62, p. 4256-4260.

212. Xanthoudakis S., Sophie R., Rasper D., Hennesey Т., Aubin Y., Cassady, Tawa P., Ruel R., Rosen A., Nicholson D.W. HSP60 accelerates the maturation of pro-caspase-3 by upstream activator proteases during apoptosis. EMBO J., 1999, v. 18, N8, p. 2049.

213. Xanthoudakis S., Nicholson D. Heat-shock proteins as death determinants. Nat. Cell. BioL, 2000, v. 2, p. E163-165.

214. Xu C., Meikrantz W., Schlegel R., Sager R. The human papilloma virus 16E6 gene sensitizes human mammary epithelial cells to apoptosis induced by DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, v. 92, p. 7829.

215. Xu Q., Schett G., Seitz C.S., Hu Y., Gupta R.S., Wick G. Surface staining and cytotoxic activity of heat-shock protein 60 antibody in stressed aortic endothelial cells. Circ. Res., 1994, v. 75, N 6, p. 1078-1085.

216. Zugel U., Kaufmann S.H. Role of Heat Shock Proteins in protection from and pathogenesis of infectious diseases. Clin. Microb. Rew., 1999, v. 12, N 1, p. 19-39.

217. Yang X., Khosravi-Far R., Chang H.Y., Baltimore D. Daxx, a novel Fas-binding protein that activates JNK and apoptosis. Cell, 1997, v. 89, p. 1067.

218. Yun J.K., McCormick T.S., Villabona C., Judware R.R., Espinosa M.B., Lapetina E.G. Inflammatory mediators are perpetuated in macrophages resistant to apoptosis induced by hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, N 25, p. 13903-13908.

219. Zhong M., Orosz A., Wu C. Direct sensing of heat and oxidation by Drosophila heat shock transcription factor. Mol. Cell. Biol., 1998, v. 2, p. 101-108.